JPH11505949A - 飛行時間型質量分析を利用した生体分子の分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試料分子の質量電荷比を測定する飛行時間型質量分析計について説明されている。イオン抽出の前、及び間に試料により体験される独立した電場の調節を提供する。本発明の原理を用いた質量分析計の方法がマトリックスバックグラウンドを減少させ、高速フラグメント化を誘導し、イオン抽出前にエネルギー移動を調節する。

Description

【発明の詳細な説明】 飛行時間型質量分析を利用した生体分子の分析発明の分野 本発明は全般に質量分析の分野に関する。特に、本発明は飛行時間型質量分析 のパルス化イオン源及び質量分析計の操作方法に関する。発明の背景 質量分析は分子量の正確な定量、化学構造の同定、混合物の組成及び定量的な 元素分析等のための分析技術である。操作において質量分析計は分析中に試料分 子のイオンを発生させ、それらの質量電荷比に従ってイオンを分離し各イオンの 相対的な量を測定する。 飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ）は発生したイオンが検出器に達するまでの時 間を測定することにより質量電荷比に従ってイオンを分離する。ＴＯＦ型質量分 析計は実質的に質量電荷比範囲に制限のない、比較的単純な高価でない機器であ るため有利である。ＴＯＦ型質量分析計は各イオン化時に発生したイオン全てを 記録するために走査機器より高感度になりうる。ＴＯＦ型質量分析計は従来型の 磁場質量分析計では感度不足の大きな有機分子の質量電荷比を測定するのに特に 有用である。ＴＯＦ型質量分析の先行技術としては、例えば、本明細書で参照す ることにより援用する米国特許番号５、０４５、６９４号及び５、１６０、８４ ０号に示されている。 ＴＯＦ型質量分析計には分析中に試料からイオンを発生させるためのイオン化 源がある。イオン化源にはイオンビームを加速し正確に方向付けをさせるために 一若しくはそれ以上の電極、又は電界レ ンズ(electrostatic lens)がある。最も単純な場合は電極はグリッドである。検 出器は時間の関数としてイオンを検出する最終グリッドから予め決められた距離 に配置される。一般にドリフト領域は最終グリッドと検出器の間にある。ドリフ ト領域はイオンが検出器に衝突する前に、イオンを自由飛行で予め決められた距 離を移動させる。 与えられた電位によって加速されたイオンの飛行時間はその質量電荷比に比例 する。このように、イオンの飛行時間は質量電荷比の関数で質量電荷比の平方根 におよそ比例する。単一電荷イオンのみが存在すると仮定するとイオンの最も軽 い群が最初に検出器に到達し、次にそれより重い質量群のものが続く。 しかしながら、実際には、等しい質量及び電荷のイオンが正確に同時に検出器 に到達するわけではない。これは主に発生したイオンの初期の時間的、空間的及 び運動エネルギーの分布によるものである。これらの初期の分布が質量スペクト ルのピークの幅を広くさせる。広がったスペクトルピークがＴＯＦ型分析計の分 解能に限界を与える。 初期の時間的分布はイオン形成の不確定性の結果である。イオン形成の時間は プラズマ脱着、レーザー脱着のようなパルスイオン化技術を利用することにより 、より確実にすることができる。これらの技術は非常に短い時間でイオンを発生 させることができる。 初期の空間分布は飛行軸に垂直に特定された平面で発生させられなかったイオ ンからのものである。気相試料から生成されたイオンは最大の初期空間分布を有 している。プラズマ脱着、若しくはレーザー脱着イオンのような脱着技術を利用 すれば、試料表面上のよく特定された範囲からイオンが発生し、イオン形成の初 期空間不確定 性が無視しうるので、最小の初期空間分布になる。初期エネルギー分布はイオン 形成時のイオンのエネルギーの不確定性の結果である。 イオンの初期運動エネルギー分布を補償することにより質量分解能を改善する ために、各種の技術が用いられている。二つの広く用いられている技術には、イ オン反射器（イオン鏡ともリフレクトロンとも呼ばれている）とパルスイオン抽 出が用いられている。 プラズマ脱着（ＰＤ）イオン化やレーザー脱着（ＬＤ）イオン化のようなパル スイオン化は空間及び時間の最小の不確定性を有するが、比較的広い初期運動エ ネルギー分布でイオンを発生させる。従来のＬＤは一般に時間不確定性を最小に するために十分短いパルス（しばしば、１０ナノ秒以下）を用いている。しかし ながら、ある場合にはレーザーパルスが終わった後、しばらくの間イオン発生が 続き、時間不確定性のために分解能を下げる。また、ある場合には、イオンを発 生させるレーザーパルスが所望される質量スペクトルピークの幅よりずっと長く なることがある（例えば、いくつかのＩＲレーザー）。より長いパルス長は質量 分解能を著しく制限する。ＬＤの性能はレーザーの波長で試料に有機マトリック ス分子を添加する、即ち非常に吸収性をよくすることにより、実質的に改善され る。 マトリックスは試料の脱着及びイオン化を容易にする。マトリックス補助レー ザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、１００、０００Ｄａを越える大きな生体 分子をそのままの状態での脱着及びイオン化を容易にする。 ＭＡＬＤＩで試料は通常平滑な金属表面に添着され、試料表面にパルスレーザ ービームを衝突させることにより気相に脱着される。このように、イオンはレー ザーパルスの時間におよそ相当する短い間隔で、蒸発するのに十分なエネルギー をレーザーから吸収する個 体マトリックスと試料の部分に相当する非常に小さい空間領域で生成される。こ れは、初期イオン速度も小さい場合には飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計の全く 理想的なイオン源になるであろう。残念ながら、これはそうではない。レーザー による早いマトリックスの除去はマトリックスと試料イオンを含有しているマト リックス分子の超音ジェットを生成する。電場がないとジェット中の分子種及び イオン種の全てがジェット中で起こる頻度の高い衝突の結果、殆ど同一の速度分 布に達する。 ＭＡＬＤＩのイオン放出過程についていくつかの研究グループで研究されてい る。ＲＣ Ｂｅａｖｉｓ、Ｂ．Ｔ．Ｃｈａｉｔ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ ．，１８１，１９９１，４７９．Ｊ．Ｚｈｏｕ、Ｗ．Ｅｎｓ，Ｋ．Ｇ．Ｓｔａｎ ｄｉｎｇ、Ａ．Ｖｅｒｅｎｔｃｈｉｋｏｖ，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓ ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，６，１９９２，６７１−６７８．電場がなければ、Ｍ ＡＬＤＩで生成されるペプチド及び蛋白質イオンの初期速度分布は分析対象の質 量やレーザー強度には殆ど全く依存しない。平均速度は約５５０ｍ／秒で２００ から１２００ｍ／秒に殆どのものが入る速度分布である。マトリックスイオンか らの速度分布は放射照度閾値に近いペプチド及び蛋白質のそれと本質的に同一で あるが、より高い放射照度では劇的に高速度側にシフトする。全イオン強度は閾 値近くではショット当たり１０⁴から高い放射照度では１０⁸以上の範囲でレーザ ー放射照度が増加するに従って速く増加する。電場があれば、イオンはイオンと 中性分子との衝突によるエネルギー損失を示す。このエネルギー損失はレーザー 強度及び電界強度とともに増加し、マトリックスイオンより高い質量の分析対象 物にとってより高い。 ＭＡＬＤＩにより生成されるイオンの初期速度分布が質量に殆ど依存しないと 云う観察結果は、初期運動エネルギー分布の幅が加速された場での中性粒子との 衝突から生じるエネルギー損失のみならず質量の平方根にもおよそ比例するとい うことを意味している。このように高い質量の場合、従来型のＭＡＬＤＩでは質 量分解能はイオンの質量電荷比の増加とともに減少する。高い加速電位（２５− ３０ｋＶ）を用いると加速電位の増加に直接的に比例して高い質量での分解能が 増大する。 初期運動エネルギー分布の好ましくない効果はパルスイオン抽出により部分的 に除去されることである。パルス化されまたは遅延化されたイオン抽出はイオン 形成と加速場使用の間に時間遅延が入る技術である。タイムラグの間イオンは初 期速度によって新しい位置に移動する。加速領域で遅延時間と電場を正しく選択 することにより、イオンの飛行時間を飛行時間が初期速度に一次に依存しないよ うに調節することができる。 質量分解能の著しい改善がＭＡＬＤＩイオン源でのパルスイオン抽出を用いる ことによって達成された。研究者が小さい蛋白質の高速フラグメント化のみなら ず改善された分解能を、Ｊ．Ｊ．Ｌｅｎｎｏｎ ＆ Ｒ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｐｒ ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４２ｎｄ ＡＳＭＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ ｅ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｔｏ ｐｉｃｓ、１９９４年５月２９日−６月３日、シカゴ、イリノイ州、５０１頁で 報告している。また、パルスイオン抽出のできる小型ＭＡＬＤＩ機器でより小さ い合成ポリマーを測定するときに著しい分解能の向上をＢｒｕｅｕｋｅｒ等によ り第１３回国際質量分析会議、１９９４年８月２９日−９月３日、ブタペスト、 ハンガリーで報告 されている。さらに、パルスイオン抽出ＭＡＬＤＩ源で低分子の蛋白質に関する 質量分解能を著しく改善していることを、Ｓ．Ｍ．Ｃｏｌｂｙ，Ｔ．Ｂ．Ｋｉｎ ｇ，Ｊ．Ｐ．ＲｅｉｌｌｙによりＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎ．，Ｍａｓｓ Ｓｐｅ ｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８，１９９４，８６５−８６８に報告されている。 イオン反射器（イオン鏡とリフレクトロンとも呼ばれている）は初期運動エネ ルギー分布の影響を補償するために試用される。イオン反射器は自由飛行領域の 最後に配置されている。イオン反射器は一若しくはそれ以上の均一な、遅延化の 、静電場からなる。静電場に関しては、イオンが反射器を透過するので場方向の 速度成分がゼロになるまでイオンは減速される。それで、イオンは方向を反転し 反射器を通じて後方に加速される。イオンは入ってきたエネルギーと同一のエネ ルギーでしかしながら反対方向の速度で反射器から放出される。より大きなエネ ルギーを持ったイオンはより深く反射器に侵入し、結果としてイオン反射器によ り長い時間、留まることになる。正しくデザインされた反射器では、電位は質量 及び電荷様のイオンが初期エネルギーにかかわらず同時に検出器に到達するよう にイオンの飛行経路を修飾するように選択される。 質量分析計の性能は質量分解能により部分的に特定される。他の重要な要素は 質量の精密さ、感度、シグナル／ノイズ比、動的範囲である。全体の性能を特定 する各種の要因の相対的重要度は試料及び分析目的で異なるが、一般的にはいく つかのパラメーターが特定され、同時に特定の応用のための満足すべき性能を得 ることができるよう最適化されなければならない。 残念なことに、従来技術を用いたＴＯＦ型質量分析計は多くの重要な型の化合 物の分析には不適切である。これらの不適切さは特に ＭＡＬＤＩでは明らかである。初期運動エネルギー分布と関連する質量分解能の 損失に加えてＴＯＦ型質量分析計の性能に限界を与えてしまういくつかのメカニ ズムがある。発生したマトリックスイオンの余剰のものが検出器を飽和させる原 因になる。多くの検出器の長い回復時間のために、飽和が、ＴＯＦスペクトルを 実質的に構成する入ってくるイオン流の時間的プロファイルの真の再生を、大き く阻害する。 フラグメント化プロセスは、ＭＡＬＤＩＴＯＦでは３つの異なる時間尺度で進 むことがＥ．Ｎｏｒｄｈｏｆｆ等、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，３０、１ ９９５、９９−１１２ に観察されている。極端に速いフラグメント化はイオン 化の時間の間に本質的に起こりうる。このプロセスは即時フラグメント化と云い 、そのフラグメントのイオンは連続イオン抽出ＭＡＬＤＩＴＯＦ測定での相関イ オンシグナルを与える。即ちフラグメントイオンはそれらがあたかも試料に存在 するかのように正確に挙動する。フラグメント化は加速段階でも、いくらか低い 比率で（一般的には１μ秒以下の特性時間で）起こりうる。この種のフラグメン ト化は高速フラグメント化という。イオンと中性分子間の高いエネルギー衝突（ 熱衝突より大きなエネルギー）もまた高速フラグメント化に貢献しうる。これら の衝突は除去された物質が密な円錐状の柱(plume)になったときイオン加速の初 期の段階で特に頻繁にある。高速フラグメント化プロセスからのフラグメントイ オンは即時フラグメント化のものとは反対に、それらは一つのよく特定された運 動エネルギーに加速されるもとの試料のイオンとは違って広い範囲の運動エネル ギーに加速されるので、関連しないノイズ（化学ノイズ）の原因になる。 試料イオンのフラグメント化はイオンの飛行時間と比較しうるよ り長い時間尺度で起こる自由飛行領域でも起こりうる。これは、好ましいことか どうか分からないが、飛行時間型質量分析から要求される特定の種類のデータに 依存する。一般的に、フラグメント化は真の分子イオンによるシグナルの強度を 減少させる。混合物の分析ではこれらのフラグメントイオンは問題のシグナルの 検出を干渉する化学ノイズを著しく発生させる。また、反射器内でのフラグメン ト化はさらに問題のシグナルの強度を減少させさらに干渉バックグラウンドシグ ナルを増加させる。 フラグメント化がドリフト領域で起こった場合、分離したフラグメントの非常 に小さい相対速度を除いてはイオンと中性フラグメントの両者とも、殆ど同じ速 度でもとのイオンとして動き続け、フラグメント化が起ころうが、起こるまいが 、本質的に同じ時間に無電界領域の末端に到達する。このように簡素化されたＴ ＯＦ型分析計は反射器もなく加速後のフラグメント化により分解能も感度も著し く低下する。 一方、反射分析計では事情が全く異なる。フラグメントイオンは本質的にもと のイオンとして、同じ速度を有するが、中性フラグメントの質量を損失し、比例 的に低エネルギーを有する。このようにフラグメントイオンは反射場の中のより 短い距離侵入し相当するもとのイオンよりも早く検出器に到達する。鏡エネルギ ーの適当な調節によりこれらのフラグメントは分子構造を決定するのに使用する ことができる高品質のポスト・ソース壊変（ＰＳＤ）スペクトルを作るために焦 点に集中される。 従って本発明の主たる課題は飛行時間型質量分析計の性能、特に表面からイオ ンを形成させることを含む応用に関して、分解能を改善し、質量精密さを上昇さ せ、シグナル強度を増大させ、バックグ ラウンドノイズを減少させることにより改善することである。他の課題はＭＡＬ ＤＩ飛行時間型質量分析計のマトリックスイオンシグナルを減少させることであ る。さらに他の課題は核酸、ペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチドのような生体 高分子の配列を化学的、若しくは酵素的に生じさせたはしご形混合物の分析によ り、迅速に知ることのできるＴＯＦ型質量分析計を提供することにある。さらに 、他の課題はオリゴヌクレオチド、炭水化物、糖結合体等の生体分子に関する構 造上の情報を得るために高速フラグメント化を利用する事にある。さらに他の課 題は高速フラグメント化の程度をパルスイオン抽出ＴＯＦ型質量分析計で最適の 実験条件を選択することにより調節することである。発明の要約 本発明は試料から発生したイオンの質量電荷比を測定するための飛行時間（Ｔ ＯＦ）型質量分析計を特徴とする。質量分析計は液体、若しくは固体試料からの イオン源を供給する試料保持器、試料イオンを形成させるためのイオン源をイオ ン化するイオン化器を含む。質量分析計はイオンを抽出する前に試料イオンにエ ネルギーを与える予め選択された非周期的、非ゼロ電場を調節しながら発生させ る手段、及びイオンを抽出する異なる電場を発生させる手段を含む。イオン化器 はパルス状エネルギーを発生させるレーザーであってもよい。 別の選択では質量分析計は試料保持器、試料イオンを発生させるために支持器 に置かれた試料をイオン化する手段、及び試料保持器から空間へ離れる第１の素 子を含む。質量分析計はドリフトチューブと検出器を含む。イオン化器はパルス 状エネルギーを発生させ、 それによって保持器に置かれた試料を照射しイオン化するレーザーでもよい。第 １の素子はグリッド若しくは電界レンズでもよい。電源は第１の素子と保持器と 電気的に接続していてもよい。その電源は第１の素子と保持器のエネルギーが独 立して可変である、第１の素子と保持器の各々に可変のエネルギーを発生させる 。保持器のエネルギーとともに第１の素子のエネルギーとが保持器と第１の素子 の間の電場を特定する。質量分析計はさらに保持器と第１の素子の間の電圧を比 較するための回路を含んでもよい。 質量分析計は試料イオンを加速する第１の素子から空間的に離れた電場を作る ための第２の素子を含むことができる。第２の素子は保持器と第１の素子のエネ ルギーとは独立した電気エネルギーと接続しうる。第２の素子は接地されている か電源に接続することができる。第２の素子はグリッド、若しくは電界レンズで もよい。第２の素子のエネルギーは第１の素子のエネルギーとともに第１と第２ の素子の間の電場を特定する。質量分析計は加速後のイオンのエネルギー分布を 補償する第１の素子から空間的に離れているイオン反射器を含むことができる。 質量分析計は電源、第１高電圧入力、第２高電圧入力、第１、若しくは第２入 力に接続できる高電圧出力からなる高速高電圧スイッチ、及びスイッチを操作す る制動器を含むことができる。出力は、制動器信号が制動器入力へ電位をかける 予め決められた時間、第１入力から第２入力へスイッチされる。第１及び第２高 電圧入力は少なくとも１ｋＶの電源と電気的に接続され、スイッチは１μ秒以下 の作動立ち上がり時間を有する。 質量分析計はパルス状エネルギーに同調する高速高電圧スイッチを操作する制 動器信号を発生させるスイッチの制動器入力に操作的 に接続するレーザー出力パルス状エネルギーに反応する遅延発生器を含むことが できる。この出力はスイッチの制動器入力に連結されていて，これは高速功電圧 スイッチを操作する制動器シグナルを出してパルス状エネルギーに連動する。レ ーザーはレーザーパルスに反応する光検出器により同調の調節を開始することが できる。若しくは、レーザー自身がパルス状エネルギーと同調した電気的信号を 発生する回路を含んでもよい（例えば，Ｐｏｃｋｅｌｓ電池ドライバー）。別の 選択として、遅延発生器はパルス状エネルギー及び制動器入力を開始することが できる。 質量分析計はイオン化器により発生させられたイオンを検出するイオン検出器 を含まねばならない。質量分析計は小面積の検出器を使うことができるようにイ オンビームの横断面積を制限する導線を含むことができる。質量分析計はコンピ ューターインターフェイス、電源や遅延発生器や特定の応用での最適電位や時間 遅延を計算するコンピューターアルゴリズムを制御するコンピューターを含むこ とができる。 本発明は飛行時間型質量分析計により試料の分子の質量電荷比を測定する方法 に特徴がある。本方法は第１電位を試料保持器にかける事が含まれる。第２電位 は、試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の電場を特定する試 料保持器から空間的に離れている第１素子にかける。第１素子の電位は試料保持 器の電位とは独立して可変である。 保持器に置かれた試料は試料イオンを発生させるためにイオン化される。この 方法は試料をレーザーで、若しくはパルス状エネルギーを発生する光源を含むこ とができる。第１、若しくは第２の少なくとも一つの電位を、飛行時間測定のた めにイオンを抽出する第１ 素子と試料保持器の間の第２の電場を特定するイオン化に続いて予め決められた 時間で変化させる。イオン化パルスと第２電場（抽出場）をかける間の最適時間 遅延は多くの因子に依存する；試料表面と第１素子との間の距離、第２電場の大 きさ、最適分解能が要求される試料イオンの質量電荷比、及びイオンの初期運動 エネルギーが含まれる。本方法は時間遅延や電場の最適値を計算するコンピュー ターアルゴリズム、電源や遅延発生器の出力を自動的に調節するためのコンピュ ーターやコンピューターインターフェイスの使用が含まれる。 本方法は試料保持器の電位から第１素子の電位を独立して変化させることが含 まれる。第１素子の電位はイオン抽出に先行して質量電荷比でイオンを空間的に 分離するために遅延した電場を確立するために試料保持器の電位から独立して変 化させることができる。 本方法は、イオンを加速する第１及び第２素子の間の電場を、第１素子の電位 とともに特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけるステ ップを含むことができる。本方法は、また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド 、若しくはその合成変種からなる群から選択される生物学的関心のある少なくと も一つの化合物、又はペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖蛋白質からなる 群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物からなる試料を分 析することが含まれる。試料は一若しくはそれ以上の分子の脱着及びイオン化を 容易にするレーザーパルスの波長で吸収するマトリックス物質を含むことができ る。 本方法を用いると、試料イオンの飛行時間に対する初期の時間的、及びエネル ギー的分布の効果を減少させる事により飛行時間型質量分析計の分解能を改善す る。本方法は第１、若しくは第２素子から 空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含む事ができる 。反射器を用いることによりイオンビーム中のエネルギー拡散を高次の修正がで き、本方法で含まれる場合は高質量分解さえ提供する。 本発明はイオン抽出中の高エネルギーの数を減少させる事により、レーザー脱 着／イオン化飛行時間型質量分析計の分解能を改善する方法としても特徴づけら れる。分析される一、若しくはそれ以上の分子からなる試料保持器に電位をかけ る。試料保持器と第１素子の間の第１電場を、試料保持器の電位とともに、特定 する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位をかける。保持器の近位 部に置かれている試料はレーザーでイオン化され、それでイオン雲を形成するパ ルス状エネルギーを発生させる。 試料と第１素子の間の第２電場を、試料保持器若しくは第１素子の電位ととも に、特定するイオン化に続く予め決められた時間に、第２電位を試料保持器若し くは第１素子にかける。第２電場は予め決められた時間後にイオンを抽出する。 予め決められた時間とは、抽出場が活性化されたとき、イオンや中性分子雲が多 くの高エネルギー衝突を実質的に減少させることができるのに十分な程度に拡散 するのを可能にするため十分に長いものである。予め決められた時間とは、円錐 状の柱の平均自由経路が加速領域のサイズより大きくなる時間より長い時間であ ってもよい。 本方法はイオンを加速する第１、及び第２素子の間の電場を、第１素子の電位 とともに、特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステッ プを含んでもよい。 第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける 間の時間遅延等のパラメーターは、レーザーパルスに 反応して生成された円錐状の柱の中性分子やイオンが、イオンと中性分子の更な る衝突が起こらないよう十分に真空中に拡散できるのに十分長いように遅延時間 が選択される。選択された試料イオンが最適質量分解能で検出されるのを確実に するようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュアルで、若しく はコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアル ゴリズムを用いて決定される。 本方法は、また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種 からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペ プチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学 的関心のある少なくとも一つの化合物からなる試料を分析することが含まれる。 試料は一若しくはそれ以上の分子の脱着及びイオン化を容易にするレーザーパル スの波長で吸収するマトリックス物質を含むことができる。 本方法は第１、若しくは第２素子と空間的に離れているイオン反射器をエネル ギー化するステップを含むことができる。反射器に電位をかけるとイオンビーム 中のエネルギー拡散の高次の修正ができ、本方法で含まれるとさらに高い質量分 解能さえ提供する。 本発明はマトリックス補助・レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析のマ トリックスイオンシグナルを減少させる方法にも特徴づけられる。本方法は試料 中にマトリックス分子を取り込ませることも含まれる。第１電位を試料保持器に かける。試料保持器と第１素子との間の第１電場を作るのに試料保持器から空間 的に離れた第１素子に電位をかける。保持器に近接して置かれた試料はパルス状 エネルギーを産生するレーザーで照射される。マトリックスはエネルギーを吸収 し、試料及びマトリックスの脱着とイオン化を容易に する。第１電場は遅延し、このようにしてイオンは試料表面に向かって加速する 。 パルス状エネルギーに続いて、試料表面から離れてゆくようにイオンを加速す る試料保持器と第１素子の間の第２電場を作る試料保持器に、第２電位が予め決 められた時間にかけられる。第１電場は試料から発生すイオンを遅延するために 選択される。この電場はイオンを減速し試料表面へもどるよううに方向付ける。 本方法はイオンを加速するために第１、及び第２素子の間の電場を作る第１素 子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。第 １及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の 時間遅延等のパラメーターは選択された質量より小さい質量のマトリックスイオ ンは抑制され、選択された質量より大きい質量の試料イオンが最適質量分解能で 検出されるように選択される。選択された試料イオンが最適質量分解能で検出さ れるのを確実にするようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュ アルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコン ピューターアルゴリズムを用いて決定される。 本方法は、また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種 からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペ プチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖蛋白質からなる群から選択される１若し くはそれ以上の生体分子からなる試料を分析することが含まれる。 本方法は第１、若しくは第２素子と空間的に離れているイオン反射器をエネル ギー化するステップを含むことができる。反射器に電位をかけるとイオンビーム のエネルギー拡散の高次の修正ができ、 本方法で含まれると高質量分解能さえ提供する。 本発明は高速フラグメント化プロセスをイオン抽出に先立って完了させる時間 を許容することによりマトリックス補助・レーザー脱着／イオン化飛行時間型質 量分析でバックグラウンド化学ノイズを減少させる方法にも特徴がある。マトリ ックス物質が一若しくはそれ以上の分子のそのままでの脱着、イオン化を容易に するように、分析される一、若しくはそれ以上の分子からなる試料の中にマトリ ックス分子は取り込まれる。試料保持器に電位をかける。試料保持器の電位とと もに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に 離れた第１素子に電位をかける。 保持器の近位部に置かれた試料を、マトリックス分子に吸収されるパルス状エ ネルギーを発生させるレーザーでイオン化される。第１素子の電位とともに、イ オン抽出するために、試料と第１素子の間の第２電場を特定するイオン化に続く 予め決められた時間に第２電位を試料保持器にかける。予め決められた時間とは 、高速フラグメント化プロセスが実質的に完了するのに十分長い時間である。 本発明は第１素子への電位とともに、イオンを加速するための第１素子と第２ 素子の間の電場を特定する、第１素子から離れて置かれた第２素子に電位をかけ るステップを含むこともできる。 第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける 間の時間遅延等のパラメーターは、時間遅延が高速フラグメント化プロセスが完 了するのに十分長いよう選択される。選択された質料イオンが最適質量分解能で 検出されるようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュアルで、 若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピュータ ーアルゴリズムを用いて決定される。 本方法は、また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種 からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペ プチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖蛋白質からなる群から選択される少なく とも一つの生体分子からなる試料を分析することが含まれる。 本方法は第１、若しくは第２素子と空間的に離れているイオン反射器をエネル ギー化するステップを含むことができる。反射器に電位をかけるとイオンビーム のエネルギー拡散の高次の修正ができ、本方法で含まれると高質量分解能さえ提 供する。 本発明はロングパルスレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の分解能 を改善する方法に特徴がある。第１電位は試料保持器にかけられる。試料保持器 の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器か ら空間的に離れている第１素子に、第２電位がかけられる。保持器に近接して置 かれる試料はロングパルスレーザーでイオン化される。パルス状エネルギーの時 間は５０ナノ秒より大きくてよい。 試料保持器に関する第１素子の電位を、イオン抽出に先立ってイオンの空間的 、及び速度の拡散を減少させるために、陽イオンを測定するためにより陽性に、 陰イオン測定のためにより陰性にすることができる。第１、若しくは第２の電位 の少なくとも一つは、飛行時間測定のためのイオン抽出する試料保持器と第１素 子の間の第２の異なる電場を特定するのに、イオン化に続く予め決められた時間 に変化させる。予め決められた時間とは、レーザーパルスの時間より長くてよい 。 本方法は、第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１、及び第２素子と の間の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第 ２素子に電位をかけるステップを含むことができる。 試料は試料分子の脱着及びイオン化を容易にするためにレーザーパルスの波長 で吸収するマトリックス分子を含有することができる。 サンプルはＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からな る群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペプチド 、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生 物学的関心のある少なくとも一つの化合物からなる。 本発明はマトリックス補助・レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計を 用いて、生体分子のフラグメント化を特定する配列を生じさせる方法に特徴があ る。本方法は分子の脱着、イオン化、励起を容易にするために分析される一、若 しくはそれ以上の分子からなる試料にマトリックス分子を取り込むことが含まれ る。試料に電位がかけられる。試料の電位とともに、試料及び第１素子の間の第 １電場を特定する試料から空間的に離れている第１素子に電位がかけられる。 マトリックスの吸収エネルギーに実質的に相当するパルス状レーザーを発生さ せるレーザーで分子はイオン化されフラグメント化される。イオン化に続く予め 決められた時間に第１素子の電位とともに、試料と第１素子の間の第２電場を特 定する試料に第２電位がかけられる。第２電場は予め決められた時間の後にイオ ンを抽出する。 本方法は、第１素子の電位とともに、第１素子、及びイオンを加速する第２素 子との間の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかける ステップを含むことができる。 第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける 間の時間遅延等のパラメーターは時間遅延が十長久手 高速フラグメントプロセスが完了するように選択される。これらのパラメーター はまた最適な質量分解能で選択した質量を検出できるように選択される。パラメ ーターは、マニュアルで、もしくはコンピューター、コンピューターインターフ ェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。 本方法は、生じた特定のフラグメントの配列の質量電荷比を検出するステップ 及び生体分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種から なる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物、 糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物 である試料中の生体分子の少なくとも一種類の配列を同定するステップを含むこ とができる。 本方法はイオン化の間に生体分子へのエネルギー移動を増加させることにより 生じるフラグメントの収率を増加させるステップを含むことができる。エネルギ ー移動は生体分子が吸収するレーザー波長を選択することにより増加できる。フ ラグメントイオンの収率はマトリックスに添加剤を取り込ませる事により増加で きる。添加剤はレーザーの波長で吸収するかも知れないししないかも知れないが 、それ自身としてはマトリックスとしては有効ではない。添加剤はマトリックス から試料へのエネルギー移動を容易にする事ができる。 マトリックスは特に生体分子のフラグメント化を促進するのに選択される。生 体分子はオリゴヌクレオチドでもよく、マトリックスは少なくとも２、５−ジヒ ドロキシ安息香酸とピコリン酸を含有することができる。生体分子はポリヌクレ オチドでもよい。 本方法は第１、若しくは第２素子から空間的に離れているイオン反射器をエネ ルギー化するステップを含むことができる。反射器に 電位をかけるとイオンビームのエネルギー拡散を高次に修正することを提供し、 本方法で含まれるときは高質量分解能さえも提供する。 本発明は特に本明細書にも引用している米国出願番号 （代理人書類番号 ：ＳＹＰ−１１５，本件とも同様に提出されている）に完全に記載され、請求さ れているように請求されている質量分析計の新規な型の試料保持器にも特徴があ る。簡単に云うと試料保持器はポリマー試料と加水分解剤の濃度比を変えながら 保持するように適合する空間的には分離された領域からなる。加水分解剤が各領 域、のポリマー試料のモノマー結合間を加水分解する適切なインキュベーション 時間の後で、種を含む領域の複数、一般的には質量分析計中で全部が順次イオン 化され、領域中の種の質量電荷比を表すデータが得られる。 他の態様では本発明は本明細書で引用している米国出願番号 （代理人書 類番号ＳＹＰ−１１５，本件とも同様に提出されている）に完全に記載され、請 求されている様に既知の質量の複数のモノマーからなるポリマーについての配列 情報を得る方法を提供する。 当業者は、ポリマーを分解し、一、若しくはそれ以上のモノマーが異なるフラ グメントの組を最初に提供する。少なくとも一組のフラグメント質量電荷比の差 が分析される。一若しくはそれ以上の異なるモノマーの既知の質量電荷比に相当 する平均質量電荷比が仮定される。仮定された平均は要求される信頼度のレベル で二つの値が統計的に差があるか、どうかを決定するために測定された平均と比 較される。統計的な差があれば、言明された平均の差を実際の測定値の差とする ことはできない。いくつかの態様では一組のフラグメントの間の差をさらに測定 し、測定された平均の差の精度を高める。ステップを一対のフラグメントの間の 単一差が全ての望ましいマイ クロ秒言明されるまで繰り返される。図面の簡単な説明 本発明の前述、及び他の課題、特徴、有用性については以下の本発明の好まし い実施の態様に関するより詳細な説明、添付した図面に示されているように明ら かになるであろう。本発明の原理を示すことを強調するために図面は必ずしも同 一の縮尺で描かれてはいない。 図１は先行技術のパルス２段階加速レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分 析計の概要図である。 図２は本発明のいくつかの原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間 型質量分析計の概要図である。 図３は本発明の原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析 計の一実施の態様である。 図４は本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計でオリゴヌク レオチドの質量分解能の改善を示したものである。図４ａは従来のＭＡＬＤＩＴ ＯＦ型の質量分析計で記録したＤＮＡ２２マー試料のスペクトルである。図４ｂ は本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で記録したＤＮＡ２ ２マー試料のスペクトルである。 図５は単一段階のイオン反射器を含む本発明の態様のレーザー脱着／飛行時間 型質量分析計の概要図である。 図６は図５で示された型のＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で記録したｍ／ｚ３ ８３９でのＲＮＡ１２マー試料の７、０００を越える質量分解、およびｍ／ｚ５ １５４でのＲＮＡ１６マーの約５、５００質量分解能を示している。 図７ａ−ｃは本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計でマト リックスシグナルをの減少と除去を示している。 図８ａ−ｃはフラグメントイオン型の命名法を含むＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分 析計でのオリゴヌクレオチドの構造的同定のために誘導されたフラグメントを示 している。 図９ａ−ｃは本発明の原理を取り入れた ＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で非常に複雑なオリゴヌクレオチドの混合物を分 析する能力を示したものである。詳細な説明 図１は先行技術のパルスイオン２段階加速レーザー脱着／飛行時間型質量分析 計の概要図である。高電圧電源１１が出力１３で可変の高電圧を発生させる。第 ２高電圧電源１０は高電圧電源１１の出力１３を参考にした出力１２で可変の高 電圧を発生させる。電力供給出力１２と１３はパルス発生器１６の入力１４と１ ５に接続されている。パルス発生器１６の出力を制御する制動器信号を発生させ る制御回路１８はパルス発生器１６の制動器入力２０に電気的に、若しくは任意 に接続されている。パルス発生器１６は制動器入力が作動していない時、電源１ １の高電圧出力をパルス発生器出力２２へと変えて伝える。パルス発生器は、制 動器入力が作動しているとき、予め決められた時間、パルス発生器出力２２で高 電圧電源１０の高電圧出力によりその振幅が決められる高電圧パルスを発生する 。 パルス発生器出力２２は保持器２４に電気的に接続されている。分析される試 料２６は保持器２４の平滑な表面２８に添着される。保持器２４は試料２６が一 般的に置かれている導電体である。パルス状エネルギーで試料２６を照射するレ ーザー３０は試料２６に向 けられた出力３２で配置されている。試料２６の分子は試料２６の表面にパルス レーザーを衝突させた結果、イオン化され気層にへ脱着される。レーザー３０の 波長で高度に吸収するマトリックス物質は試料２６の脱着とイオン化を容易にす るために試料に加えることができる。プラズマ脱着、粒子射突などの試料物質を イオン化させる他の方法も用いることができる。 電源出力１３は保持器２４から空間的に離れた第１素子３４にも接続されてい る。第１素子３４はグリッド、若しくは電界レンズでよい。保持器２４と第１素 子３４の電位は保持器２４と第１素子３４の間の電場を特定する。第１素子３４ と空間的に離れた第２素子３６は接地されている。第２素子はグリッド、若しく は電界レンズでよい。第２素子３６から空間的に離れている検出器３８は時間の 関数としてイオン化された試料物質を検出する。 操作では、制動器入力２０はパルス状エネルギーで試料２６をレーザー３０で 照射する前、及びしている間、作動しない。保持器２４と第１素子３４の電位は 電源電位と等しい。レーザーパルスに続く予め決められた時間に、制動器入力２ ０が作動し、パルス発生器１６が予め決められた振幅の高電圧パルスを保持器に 発生させる。パルスの間、保持器２４の電位は陽イオン、若しくは陰イオンのど ちらが分析されているかによって、第１素子３４より陽性か陰性の方向にずれて いる。保持器２４と第１素子３４の間の電場は非ゼロになりイオンは第２素子３ ６及び検出器３８の方向へ加速される。 このように従来技術のパルスイオンＬＤＴＯＦ型質量分析計では、試料イオン がイオン抽出する前に試料保持器２４と第１素子３４に同じ電位をかけられてい る領域で発生させられる。初期イオン形成に続く予め決められた時間遅延に予め 決められた振幅のパルスをか ける無場領域の場からイオンが抽出される。初期の運動エネルギー効果は予め決 められたパルス振幅及び時間遅延を適当に選択することにより減少させることが できる。 図２は本発明の原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析 計の概要図である。第１高電圧電源５０は第１出力５２で第１可変高電圧を発生 させる。第２高電圧電源５４は第２出力５６で第２可変高電圧を発生させる。第 １及び第２電源は独立していて、マニュアルで制御され、若しくはプログラムで きる電源であってもよい、若しくは単一で多出力可能なプログラムできる電源で あってもよい。 第１及び第２電源出力は高速高電圧スイッチ６２の第１入力５８と第２入力６ ０に接続されている。スイッチ出力６４は第１スイッチ入力５８と第２スイッチ 入力６０と接続が可能である。スイッチを作動させる制御信号を発生させる制御 回路６６はスイッチの制動器入力６８に電気的に接続されている。スイッチ出力 ６４は保持器７０に電気的に接続されている。 保持器７０は試料が置かれている導電体である。分析中の試料７２は保持器７ ０の平滑な表面７４に添着される。絶縁層（示されていない）を試料と保持器の 間に入れることができる。別の実施の態様では、試料は保持器で発生させられる 電場に直交するように位置される。 パルス状エネルギーで試料７２を照射するレーザー７６は試料７２の方に向け られた出力７８で配置される。試料７２は試料７２の表面にパルス状レーザービ ーム８０が衝突する結果イオン化され気層に脱着される。レーザー７６の波長で 高度に吸収するマトリックス物質は試料７２の脱着及びイオン化を容易にするた めに試料７２ に加えることができる。プラズマ脱着、粒子射突などの試料物質をイオン化させ る他の方法も用いることができる。 第３電源８２は保持器７０と空間的に離れた第１素子８４に電気的に接続され ており第３高電圧を発生させる。第１素子８４はグリッド、若しくは電界レンズ でよい。保持器７０と第１素子８４の電位は保持器７０と第１素子８４の間の電 場を特定する。第１素子８４と空間的に離れている第２素子８６は接地されてい る。第２素子８６グリッドが電界レンズである。第２素子８６から空間的に離れ ている検出器８８はイオン化された試料物質を時間の関数として検出する。 操作では、レーザー７６が試料７２をパルス状エネルギーで照射する前、及び している間は制動器入力６８は作動しない。保持器７０の電位は第１高電圧電源 により発生させられる第１高電圧と等しい。第１素子の電位は第３高電圧電源８ ２により発生させられた第３高電圧と等しい。第１高電圧と第３高電圧が異なる 場合は、保持器７０と第１素子８４の間は非ゼロ静電電場になるであろう。 パルスレーザーに続く予め決められた時間に、制御回路６６は制動器入力６８ を作動させるようにする。スイッチ６２は保持器７０から第１高電圧電源を切り 予め決められた時間保持器７０に第２高電圧電源５４を素早く接続させる。保持 器７０の電位は素早く第１高電圧から第２高電圧に変化する。第２高電圧は陽イ オン、若しくは陰イオンが分析されているかどうかによって、第３高電圧より陽 性、若しくは陰性の方向にずれている。保持器７０の電位が高いので保持器７０ と第１素子８４の間の電場は確立され、イオンを抽出し第２素子８６及び検出器 ８８の方向に加速する。 このように、本発明の原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化 飛行時間型質量分析計ではイオン抽出の前に保持器７０と第１素子８４の間の領 域に、変化し得る非ゼロ、非周期的電場ができる。本発明の質量分析計は、従っ て、イオン抽出の前でも最中でも発生したイオンにかける電場を制御する事がで きる。 図３は本発明の原理を取り入れたレーザー脱着飛行時間型質量分析計の一実施 態様を示している。この態様は三つの独立する電源と、イオン抽出の前及び間に 試料保持器と第１素子の電位を独立して制御できる高速高電圧スイッチを利用し ている。 第１電源１００は高速高電圧スイッチ１０４の第１入力１０２に電気的に接続 されている。スイッチはＢｅｈｌｋｅで製造され、Ｅｕｒｏｔｅｋ，Ｉｎｃ．， モーガンビル、ニュージャージー州より入手でき、約１５０ナノ秒の作動遅延、 約２０ナノ秒の立ち上がり時間、約１０マイクロ秒の作動時間のＨＴＳ３００− ０２を使用することができる。第２電源１０６はスイッチ１０４の第２入力１０ ８に電気的に接続されている。スイッチ１０４の出力１１０は第１入力１０２、 若しくは第２入力１０８のいずれとも接続可能であるが、制動器信号がなければ 通常は第１入力１０２と接続されている。 制動器入力１１２は第１電源１００をスイッチ出力１１０から切り、予め決め られた時間の間第２電源をスイッチ出力１１０に接続させる様にスイッチ１０４ を作動させる。スイッチ出力１１０は試料保持器１１４と電気的に接続されてい る。分析中の試料１１６は電気的に保持器と同調するように保持器の平滑な表面 に置かれる。レーザー１２０の波長によく吸収されるマトリックス物質を試料１ １６の脱着及びイオン化が容易になるように試料１１６に加えることができる。 試料をパルス状エネルギーで照射するレーザー１２０は試料１１ ６の方に向けられた出力１２２を配置する。レーザーパルスはパルスエネルギー と時間的に同調された電気信号を発生させる光検出器１２４で検出される。遅延 発生器１２６は同調された信号に反応する入力１２８及びスイッチ１１２の制動 器入力と電気的に接続された出力１３０有する。遅延発生器１２６は同調された 信号に関しては予め決められた時間により遅延制動器信号を発生させる。このよ うにパルスエネルギーに合わせてスイッチ１０４はスイッチ出力１１０から第１ 電源１００を切り放し、予め決められた時間の間スイッチ出力１１０に第２電源 １０６を接続する。 第３高電圧を発生させる第３電源１３０は保持器１１４から空間的に離れてい る第１素子１３２と電気的に接続されている。第１素子１３２はグリッド、若し くは電界レンズであってもよい。保持器１１４と第１素子の電位は保持器１１４ と第１素子１３２の間の電場を特定する。第１素子と空間的に離れている第２素 子は接地されている。第２素子はグリッド、若しくは電界レンズであってもよい 。 第２素子１３４から空間的に離れているチャンネルプレート検出器のような検 出器１３６はイオン化された試料物質を時間の関数として検出する。第１及び第 ２素子について質量分析の操作に重要なことは保持器１１４の特定の電位ではな く、相対的な電位であることに注意する必要がある。 比較回路１３８は第１電源１００と第３電源１３０の電圧を測定し、比較し第 １と第３の電圧差を指示する。電圧差はイオン抽出前の保持器１１４と第１素子 の間の電場強度を表している。 操作ではレーザー１２０で試料を照射する前に保持器１１４はスイッチを通じ て第１高圧電源１００と電気的に接続され、第３高圧電源１３０は第１素子１３ ２と電気的に接続されている。このよう に、イオン化前に第１電場は保持器１１４と第１素子の間に確立される。電場は 比較回路１３８により指示され第１及び第３電圧を変化させることにより調節可 能である。 質量電荷の測定を開始するのにレーザー１２０は試料１１６をパルス状エネル ギーで照射する。レーザー１２０はパルス状エネルギーに時間的に同調した電気 信号を発生する。遅延発生器１２６は信号に反応する。信号に続いて予め決めら れた時間に遅延発生器１２６は制動器信号を発生する。高速高電圧スイッチは制 動器信号に反応しスイッチ１０４を素早く第１電源１００から切り、予め決めら れた時間の間素早く第２電源１０６をスイッチ出力１１０に接続する。予め決め られた時間の間、保持器１１４、若しくは第１素子１３２の電位の大きさが変化 し、イオンを第２素子１３４及び検出器１３６の方向へ加速させる電場を作る。 本発明は本発明の原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分 析計を用いて試料中の分子の質量電荷比を測定する方法にも特徴がある。本方法 は分析される一、若しくはそれ以上の分子を含む試料保持器の近位部に置かれた 試料を有する試料保持器に第１電位をかける事が含まれる。試料保持器の電位と ともに、試料保持器と第１素子の間の電場を特定する試料保持器から空間的に離 れている第１素子に第２電位をかける。第１素子の電位は試料保持器の電位から 独立して変化させることができる。試料はイオン化され試料イオンを生じる。こ の方法はパルス状エネルギーを発生するレーザーまたは光源で試料をイオン化す ることを含んでもよい。第１若しくは第２電位の少なくとも一つをイオンを飛行 時間測定するために抽出する試料保持器と第１素子の間の第２電場を特定するイ オン化に続き予め決められた時間に変化させる。 イオン化パルスと第２電場に電圧をかける間の最適時間遅延は試料表面と第１ 素子の間の距離、第２電場の大きさ、最適分解能が要求される試料イオンの質量 電荷比、及びイオンの初期運動エネルギー等の多数のパラメーターに依存する。 もし第１電場が第２と比較して小さい場合は初期速度のある時全飛行時間での変 化を最小限にする時間遅延は概略 △＝144.5 d_a(m/V_a)^1/2[1/w +(V₀/V)^1/2] (1) で与えられる。そこで時間はナノ秒で、試料と第１素子の間の距離ｄはミリメー タで、質量ｍはダルトンで、電位差Ｖはボルト、質量イオンの初期運動エネルギ ーｍはＶ電子ボルトである。無次元パラメーターＷはＴＯＦ分析機の幾何学に依 存する。ＴＯＦ分析機の幾何学的パラメーターはｗが一単位より大きくなるよう に選択されなければならない。飛行時間分析機が試料板、第１素子、無場ドリフ ト空間、検出器のみからなる場合はｗの値は、 ｗ＝d/d_a- 1 (2) であたえられる。ここでｄは第１素子と検出器の間の無場領域の長さである。 本方法は初期の時間分布、エネルギー分布が試料イオンの飛行時間は及ぼす影 響を減少させることにより飛行時間型質量分析計の分解能を改善する。本方法は 、第１素子の電位とともに、第１素子とイオンを加速する第２素子の間の電場を 特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけるステップが含 まれる。 この場合、時間遅延は式(1)により与えられるが幾何学的パラメーターは、 ｗ＝( χ/ 1+χ)^3/2[(d/2d_a)-(d₀/d_a)(1 + x)] + χ(d₀/d_a)- 1 (3) で与えられる。ここでχ＝Ｖ_a／Ｖ、Ｖは第１及び第２素子との電位差でｄ₀は第 １素子と第２素子の間の距離である。試料イオンの初期時間分布が比較的広がっ ている時、例えば、比較的長いレーザーパルスを使用したときには、時間遅延が 全イオン化時間より長いことが必要である。特定の質量についてＶ_a値を減じれ ばこれはできる。このように、特定の質量荷電比のイオンに与えられた初期時間 、及びエネルギー分布については、そしてあたえられたＴＯＦ分析機幾何学につ いては、第２電場の大きさと試料にレーザーパルスをかけるのと第２電場をかけ るのとの時間差を最適質量分解能を得るために決定することができる。 第１電場は遅延し、イオンを試料表面に加速する。この電場の大きさは自由に 選んでよい。第１電場Ｅ１でのおよその最適値は E₁＝5 mv／△ｔ (4) で与えられる。ここで、ｍは問題の最小の質量をダルトンで、ｖ０は最も確率の 高い初期速度をメーター／秒で、△ｔはイオン化パルスと第２電位をかける間の 遅延時間をナノ秒で表したものである。遅延方向へかけられた第１電場のこの大 きさで、最も確率の高い速度の半分に等しい速度を有する選択された質量のイオ ンは第２電位がかけられたときに止められる。最も確率の高い速度の四分の一以 下の速度のイオンは試料表面に戻り中性化される。ＭＡＬＤＩでは、ほんの僅か の分画のイオンしか最も高い確率の速度の四分の一以下の速度を有しない。この ように、選択された高い質量のイオンは高い効率で抽出され、検出される。一方 、選択された質量の約四分の一以下より小さい質量のイオンは、それらは第２電 場がかけられる前に試料に戻り中性化されるために、殆ど完全に抑制される。 本方法は電場や時間遅延の最適な値を計算するコンピューターア ルゴリズム、電源や遅延発生器の出力を自動的に調整するコンピューターやコン ピューターインターフェイスの利用も含まれる。 本方法は、生体分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、若しくはその合成 変種からなる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖 結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つ の化合物からなる試料を測定することが含まれる。試料はレーザーパルスの波長 で吸収するマトリックス物質を一、若しくはそれ以上の分子の脱着及びイオン化 を容易にするために含むことができる。 性能の最も重要な改善はオリゴー、もしくはポリヌクレオチドのような非常に 極性の高い生体高分子で観察される。この改善された分解能はＤＮＡ配列はしご の質量分析計での評価には必須である。 図４ａ−ｂは本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計でオリ ゴヌクレオチドの質量分解能の改善を示したものである。図４ａは従来のＭＡＬ ＤＩＴＯＦ型の質量分析計で記録したＤＮＡ２２マー試料のスペクトルである。 ２８１という質量分解能が得られた。図４ｂは本発明の原理を取り入れたＭＡＬ ＤＩＴＯＦ型質量分析計で記録したＤＮＡ２２マー試料のスペクトルである。図 ４ｂの質量分解能は同位元素の限られた値に相当する。同じ分子質量５００、若 しくは６００の小さい蛋白質には、従来型のＭＡＬＤＩ質量分析計での質量分解 能がきまりきっている。このように、本発明の原理を取り入れることにより、Ｄ ＮＡや炭水化物のＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計の分解能に著しい改善がみられ る。 本発明の特徴を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計の一つの有利な点は 質量分析計についているイオン反射器を用いて操作パラメーターを選択すること により初期運動エネルギーの広がりを高 次に修正することができる点である。 図５は本発明の原理を取り入れ、一段階イオン反射器１５０を含むレーザー脱 着／飛行時間型質量分析計の概要図である。この実施例は保持器１５４がある二 場イオン源１５２と第一素子１５６と第二素子１５８が含まれる。電源（示され ていない）は保持器１５４、第１素子１５６と第２素子１５８に、図２と関連す るテキストに説明してあるようにイオン抽出前に第１素子１５６と第２素子の間 の電場が可変になるように、電気的に接続されている。この実施例は試料イオン をイオン化し、脱着するレーザー１５９を含んでいる。試料１６０は保持器１５ ４に添着される。試料１６０はレーザー１５８の波長でよく吸収するマトリック ス分子を含有することができる。マトリックスは試料１６０の脱着とイオン化を 容易にする。 イオン反射器１５０は無場ドリフト領域１６２の末端に配置され、初期運動エ ネルギー分布の効果をイオンの飛行経路を変化させることによりうめあわせるの に利用される。第１検出器１６４は脱エネルギー化されたイオン反射器でイオン を検出するのに使用される。第２検出器１６６はエネルギーを与えられたイオン 反射器１５０とともにイオンを検出するのに使用される。 イオン反射器１５０は無場ドリフト領域１６２の末端で、第１検出器１６４の 前に配置される。イオン反射器１５０は加速電圧より僅かに大きいレベルまで増 加させる電位でバイアスをかけられた一連のリング１６８からなっている。操作 では、イオンが反射器に侵入すると、場の方向の速度がゼロになるまで減速され る。速度ゼロのところでイオンは方向を反転し、反射器１５０を通って後ろに加 速される。イオンははいってきたエネルギーと同一のエネルギーをもって反対方 向の速度を持って反射器１５０から放出される。より 大きなエネルギーを有するイオンは反射器により深く侵入し結果として反射器の 中により長時間留まることになる。質量及び電荷様イオンが第２検出器１６６に 同時に到達するようにイオンの飛行経路を変えるのに電位を選択する。 図６ａ−ｂは反射器を有し、本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質 量分析計で記録されたＲＮＡ １２マーの試料の約８、０００の質量分解能を、 ＲＮＡ １６マー試料の約５、５００の質量分解能を示したものである。これら の例で観察された分解能は低いほうの限度であった、というのは検出器のエレク トロニクスのデジタル化速度がこの分解範囲での本当のピークプロファイルを検 出するのに十分でなかったからである。同様の結果がペプチドや蛋白質について 得られた。本発明はこのように全ての種類の生体高分子の分解能を改善する。こ れは、従来型のオリゴヌクレオチドの分解能や感度がペプチドや蛋白質と比較し て著しく劣っているＭＡＬＤＩとは対照的である。 本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計の他の有利な点は高 エネルギー衝突の数を減少させることができることである。連続イオン抽出下で イオンはイオン化の直後に除去された物質の比較的密な円錐状の柱を通して抽出 される。高エネルギー（熱エネルギーより高い）衝突は相関性のないイオンシグ ナルを生じる加速過程での高速フラグメント化プロセスという結果をひきおこす 。 この相関性のないイオンシグナルは質量スペクトルに著しくノイズを増加させ る。本発明の原理を質量分析計に取り入れることによりイオン抽出前、及びその 間の電場や、抽出遅延時間のようなパラメーターは除去された物質の円錐状物が 高エネルギー衝突の数を減少させるのに十分なように拡散するように選択するこ とができる。 本発明はイオン抽出の間に起こる高エネルギー衝突の数を減少させることによ りＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計の分解能を改善する事にも特徴がある。試料保 持器の近位部に置かれた試料を有している試料保持器に電位をかける。試料は分 析される一若しくはそれ以上の分子からなる。試料保持器の電位とともに、試料 保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている 第１素子に電位がかけられる。試料はイオンや中性分子の雲を除去するためのパ ルス状エネルギーを発生させるレーザーでイオン化される。 試料保持器、若しくは第１素子の電位とともに、試料と第１素子の間の第２電 場を特定するイオン化に続く予め決められた時間に第２電位を試料保持器、若し くは第１素子にかけられる。第２電場は予め決められた時間の後にイオンを抽出 する。予め決められた時間は、イオン抽出の間イオンに衝突エネルギーを付加す るのを実質的に除去するのに十分に、イオン及び中性分子の雲を拡散させるのに 十分な時間である。予め決められた時間とは、雲中のイオンの平均自由経路が保 持器と第１素子の間の距離を超える時間より大きくてもよい。 本方法は、第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１及び第２素子の間 の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子へ電位をかけるステップ を含むことができる。 第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける 間の時間遅延等のパラメーターはレーザーパルスに反応して生成された円錐状の 柱の中性分子やイオンが、イオンと中性分子の更なる衝突が起こらないよう十分 に真空中に拡散できるのに遅延時間が十分長いよう選択される。選択された質量 の試料イオン が最適質量分解能で検出されるのを確実にするようにパラメーターは選択される 。パラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターイ ンターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。 本方法は、生体分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、若しくはその合成 変種からなる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖 結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つ の化合物である試料を分析することを含むことができる。試料は生体分子の脱着 及びイオン化を容易にするためにレーザーパルスの波長で吸収するマトリックス 物質を含有することができる。 本発明はマトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計でマ トリックスシグナルの強度を減少させる方法にも特徴がある。本方法は試料にマ トリックス分子を取り込む事も含まれる。 第１電位は試料保持器にかけられる。抽出パルスの前に試料に逆バイアスをか ける試料保持器と第１素子の間の第１電場を作るために試料保持器から空間的に 離れている第１素子に電位がかけられる。逆バイアスは試料保持器と比較して第 １素子の電位を陽イオンを測定する場合はより陽性に、陰イオンを測定する場合 はより陰性にすることで達成できる。 保持器の近位部に置かれた試料はパルス状エネルギーを発生するレーザーで照 射される。マトリックス物質はエネルギーを吸収し、試料とマトリックスの脱着 及びイオン化を容易にする。第１電場は試料から生成したイオンを減速するよう に選ばれる。この場は殆ど均一な初期速度で試料表面にもどるようにイオンを方 向付け、減速する。最小の質量電荷比を有する最も軽いマトリックスは最初に方 向転換し試料保持器に戻ってきて中性化するのに対し、生体分子からのより重い イオンが質量分析のために抽出されうる。 試料表面からイオンが離れてゆくように加速する試料保持器と第１素子の間の 第２電場を作るパルス状エネルギーに続く予め決められた時間に試料保持器に第 ２電位がかけられる。レーザーパルスと第２電位をかける間の時間は本質的にマ トリックスイオンの全てがそれらが中性化させられる試料表面に戻ってくるよう に選択される。 このようにマトリックスイオンは抑制され、試料イオンが抽出される。 本方法はイオンを加速する第１素子と第２素子の間の電場を作る第１素子から 空間的に離れている第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。第１ 及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時 間遅延等のパラメーターは選択された第２質量より大きな質量を有する試料イオ ンが最適質量分解能で検出でき、一方選択された第１質量より小さい質量を有す るマトリックスイオンが抑制されるように選択される。パラメーターは、マニュ アルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコン ピューターアルゴリズムを用いて決定される。 本方法は、生じた特定のフラグメントの配列の質量電荷比を検出するステップ 及び生体分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種から なる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物、 糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物 を含む試料を分析することを含むことができる。 本方法は第１若しくは第２素子から空間的に離れているイオン反 射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器を用いることによ りイオンビームのエネルギー拡散に高次の修正を提供し、本方法で含まれるとよ り高質量分解能さえ提供する。 図７ａ−ｃは本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計でマト リックスシグナルをの減少と除去を示している。図７ａは試料の電位がおよそグ リッドの電位に相当する殆ど無場状態を示している。 試料ピークは２８６７と５７３４で標識されている。４００以下の質量電荷比 のピークはマトリックスイオンに相当する。図７ｂは、試料電位が第１グリッド と比較して２５Ｖ逆バイアスされている。この結果、質量電荷比２００以下のよ り軽いマトリックスイオンの量が見えるほど減少している。図７ｃは、試料電位 が第１グリッドと比較して５０Ｖ逆バイアスされている。この結果マトリックス イオンシグナルが完全に除去された。 本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計の他の利点は高速フ ラグメント化のバックグラウンドノイズと質量分解能にたいする影響を除去する 事ができることである。高速フラグメント化は連続イオン抽出条件下での加速の 間起こるフラグメント化を特定する。高速フラグメント化の時間尺度は一般的に は１マイクロ秒以下である。高速フラグメント化はエネルギーが特定できないイ オンや関係のないイオン（化学ノイズ）を生成させる。 本発明は実質的に全ての高速フラグメント化をイオン抽出前に完了させること によりマトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計のバック グラウンド化学ノイズを減少させる方法にも特徴がある。マトリックス物質が脱 着及びイオン化を容易にするように、分析される一若しくはそれ以上の分子を含 有する試料に マトリックス分子を取り入れる。試料保持器に電位がかけられる。試料保持器の 電位とともに、試料と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的 に離れている第２素子に電場がかけられる。 マトリックスがレーザーの波長で吸収するパルス状エネルギーを発生させるレ ーザーで試料はイオン化される。第１素子の電位とともに、イオンを抽出する試 料保持器と第１素子の間の第２電場を特定する試料保持器にイオン化に続く予め 決められた時間に第２電位がかけられる。予め決められた時間とは実質的に全て の高速フラグメント化プロセスが完了するのに十分長い時間である。 本方法は第１素子の電位とともに、イオンを加速するために第１素子と第２素 子の間の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるス テップを含むことができる。 第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける 間の時間遅延等のパラメーターは実質的に全てのフラグメント化プロセスが完了 するのに遅延時間が十分長いよう選択される。選択された質量の試料イオンが最 適質量分解能で検出されるのを確実にするようにパラメーターは選択される。パ ラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインタ ーフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。本方法は、 生体分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド若しくはその合成変種からなる群 から選択される、、又はペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物、糖蛋 白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物であ る試料を分析するステップを含むことができる。 本方法は第１若しくは第２素子から空間的に離れているイオン反 射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器を用いることによ りイオンビームのエネルギー拡散に高次の修正を提供し、本方法で含まれるとよ り高い質量分解能を提供する。本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＣ型質 量分析計の他の利点は高速フラグメント化に関するイオンシグナルを発生するこ とができる。 本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計の他の利点はイオン 抽出前の試料保持器と第１素子の間の逆バイアス電場、エネルギーレーザーパル スとイオン抽出との間の遅延時間、及びレーザーエネルギー密度等の実験的パラ メーターを正しく選択することにより高速フラグメントイオンの収率を増加でき る事である。これは、抽出前にイオン源のイオン前駆体の保持時間を増加させた り、高速フラグメント化を受けている試料分子にさらにエネルギー移動を促進さ せることにより達成できる。イオン前駆体の保持時間は電場抽出を適当に調整す ることにより引き延ばすことができる。一般的には、より低い抽出場はより長い 最適抽出遅延ができ従ってより長い保持時間になる。試料へのエネルギー移動は 非常に高いレーザーエネルギー密度を使用することにより高めることができる。 遅延イオン抽出は従来のＭＡＬＤＩより過剰なレーザー照射により耐性である。 マトリックス物質と、場合によっては添加剤の適当な選択も試料分子へのエネル ギー移動に影響する。 本発明はマトリックス補助レーザー脱着・イオン化飛行時間型質量分析計を使 用する高速フラグメント化プロセスから生じる生体分子の配列決定用のフラグメ ントイオンの収率を増加させる方法にも特徴がある。本方法は分析される一若し くはそれ以上の分子を含有する試料の中に分子の脱着、イオン化及び励起が容易 になるようにマトリックス分子を取り込むことを含むことができる。試料保持器 に電位がかけられる。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の 第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位がかけら れる。 分子はマトリックスにより吸収されるパルス状エネルギーを発生させるレーザ ーでイオン化されフラグメント化される。第１素子の電位とともに、試料保持器 と第１素子の間の第２電場を特定する試料保持器に、イオン化に続く予め決めら れた時間に、第２電位がかけられる。第２電場は予め決められた時間の後にイオ ンを抽出する。予め決められた時間とは実質的に全ての高速フラグメント化を完 了するのに十分長い時間である。 本方法は第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１及び第２素子の間の 電場を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子２電位をかけるステッ プを含むことができる。 第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける 間の時間遅延等のパラメーターは実質的に全てのフラグメント化プロセスが完了 するのに遅延時間が十分長いよう選択される。選択された試料イオンが最適質量 分解能で検出されるのを確実にするようにパラメーターは選択される。パラメー ターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェ イス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。 本方法は生じる配列特異的フラグメントの質量電荷比を検出するステップ、及 び生体分子がＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド及びその合成変種からなる群か ら選択された試料中の少なくとも一つの生体分子、若しくはペプチド、蛋白質、 ＰＮＡ，炭水化物及び当蛋白質からなる群から選択された少なくとも一つの生体 分子の配列を同定するステップを含むことができる。 本方法はイオン化の間生体分子にエネルギー移動を増加させることにより生じ るフラグメントの収率を増加させるステップを含むことができる。エネルギー移 動は生体分子が吸収する波長におよそ等しいレーザー波長を選択することにより 増加できる。エネルギー移動はマトリックスに添加剤を取り込むことにより増加 できる。 マトリックスは特に生体分子のフラグメント化を促進するように選択される。 生体分子はオリゴヌクレオチドであってもよく、マトリックスは少なくとも２、 ５−ジヒドロキシ安息香酸及びピコリン酸を含有することができる。第２物質を マトリックスにフラグメント化を促進するために加えることができる。添加物は レーザーの波長で吸収するが、マトリックスそれ自身として必ずしも有効である 必要はない。別の選択としては、添加剤はレーザーの波長で吸収しなくてもよく 、マトリックス自身として有効でなくともよいが、マトリックスから試料へのエ ネルギー移動を促進し、これによりフラグメント化を促進する。 本方法は第１及び第２素子から空間的に離れているイオン反射器をエネルギー 化するステップを含むことができる。反射器を用いることによりイオンビームの エネルギー拡散の高次の修正を提供し、本方法に組み込まれたときにはより高い 質量分解能を提供する。 図８ａは本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で記録され た殆ど一つ及び二つの電荷を持ったそのままのイオンを発生させる１１マーのＤ ＮＡ試料を示しており、ここでの課題はフラグメント化を抑制し、最小のフラグ メント化で高分解能、及び高感度を得ることである。 図８ｂはフラグメントイオンの収率を増加させるために、本発明の原理を取り 入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で記録した１１ マーのＤＮＡ試料を示している。試料は比較的長い抽出遅延（５００ナノ秒）及 び比較的高いレーザーエネルギー密度を許容するイオン抽出の前に試料保持器と 第１素子の間の逆バイアス電場で測定される。フラグメント化はさらに２、５− ジヒドロキシ安息香酸を使用すると促進される。これらの実験的パラメーターは 大量のフラグメントイオンを発生させる。このフラグメントイオンスペクトルの 解釈でオリゴヌクレオチドの配列がわかる。”ｗ”イオンシリーズは殆ど完全で 、最も右の二つの残基まで配列を特定し、また、そのジヌクレオチド片の組成（ 配列ではないが）をも提供する。図８ｃはフラグメントイオンの命名法を説明し ている。 当業者ではイオン化に赤外レーザーを利用する有利な点があるＭＡＬＤＩＴＯ Ｆ型質量分析計の重要な応用がある。残念ながら、ＣＯ２レーザーのような好ま しい特性を有する多くの赤外レーザーはパルス幅が１００ナノ秒より長いもので ある。一般的に、従来型のＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計でそのような長いパル スを使用すると、質量スペクトルピークがより長いイオン形成プロセスのために 過剰に広くなり好ましくない結果となる。しかしながら、遅延抽出型のＭＡＬＤ ＩＴＯＦ型質量分析計を使用すると長いイオン化レーザーパルスの好ましくない 効果を除去できる。レーザーパルスの初期相で形成されるイオンは遅い相のレー ザーパルスで形成されるものより早く試料表面から放出される。抽出の間、初期 相イオンは遅い相のイオンより試料表面から遠く離れている。結果として遅い相 のイオンは抽出パルスで少し高エネルギー側に加速されるであろう。最適条件下 では遅い相のイオンは検出器で初期相イオンに追いつく。 本発明の特徴を取り入れたＭＬＤＩＴＯＦ型質量分析計の他の利点はロングパ ルス赤外レーザーを利用して高質量分解能を達成する ことができることである。ロングパルスとは検出されるときイオン束の好ましい ピーク幅より長い長さのパルスとして定義される。パルス化されたイオン抽出装 置で、好ましいピーク幅は、一般的には５−１００ナノ秒である。好ましいピー ク幅はイオンの質量電荷比で変化する、例えば、同位元素的に分解した小さいペ プチドには５ナノ秒、質量電荷比３０、０００の蛋白質には１００ナノ秒のよう に。 本発明はロングパルスレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計で分解能 を改善する方法にも特徴がある。試料保持器に第１電位がかけられる。試料保持 器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器 から空間的に離れている第１素子に第２電位がかけられる。試料保持器の近位部 に置かれた試料は長時間パルス状エネルギーを発生させる赤外レーザーでイオン 化されイオンを形成する。パルス状エネルギーの時間は５０ナノ秒以上である。 試料保持器と比較して、第１素子の電位はイオン抽出前に質量により空間的に 分離するため、陽イオンを測定するときはより陽性に、陰イオンを測定するとき にはより陰性にすることができる。少なくとも第１、若しくは第２電位は飛行時 間測定のためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第２の異なる電場 を特定するために、イオン化に続く予め決められた時間で変化する。予め決めら れた時間とはレーザーパルスの時間より長い時間である。 本方法は第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１及び第２素子の間の 電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステップを 含むことができる。 試料は試料分子の脱着とイオン化を容易にするレーザーパルスの 波長を吸収するマトリックス物質を含有することができる。試料はＤＮＡ，ＲＮ Ａ，ポリヌクレオチド、及びそれらの変種からなる群から選択された生物学的に 関心のある少なくとも１化合物、若しくはペプチド、蛋白質、ＰＮＡ，炭水化物 、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択された生物学的関心のある少なくとも １化合物を含有することができる。 図９ａ−ｃは本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で非常 に複雑なオリゴヌクレオチド混合物を分析することができる事を示したものであ る。図９ａは従来型のＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で記録された配列特異的な 不純物を含有する６０マーＤＮＡ試料の質量スペクトルである。配列は読めない 。 図９ｂは本発明の原理を取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で記録され た配列特異的な不純物を含有する６０マーＤＮＡ試料の質量スペクトルである。 配列の半分以上がスペクトルから読みとれる。図９Ｃは図９ｂで示された質量ス ペクトルの拡大部分を示す。図９ｃに示された性能のレベルは一バイアルのＤＮ Ａ配列用はしご状化合物を分析するのに適している。このように本発明の原理を 取り入れたＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析計で４シリーズが全て存在するサンガー 混合物を分析することができる。不純物のあるＤＮＡの配列を分析する能力はＤ ＮＡ配列分析用混合物をプロファイルする可能性には必須である。 本発明は質量分析計でＤＮＡの配列を測定する方法にも特徴がある。本方法は 未知の配列のＤＮＡ片を含有する試料保持器に第１電位をかける事が含まれる。 試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子との間の第１電場を特定する 試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位がかけられる。試料はイ オン化され試 料イオンを形成する。第１若しくは第２電位の少なくとも一つが飛行時間を測定 するためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第２の異なる電場を特 定するためイオン化に続く予め決められた時間に変化させられる。発生したイオ ンの測定された質量電荷比はＤＮＡ片の配列を得るために使用される。 試料中のＤＮＡは分解され一群のＤＮＡフラグメントになり、それぞれ共通の オリジンを持ちＤＮＡ配列に沿った特定の塩基端で終わっている。試料は試料の 脱着及びイオン化を容易にするレーザーパルスの量子エネルギーに実質的に相当 する波長で吸収するマトリックス物質と混合された異なる群のＤＮＡフラグメン トの群れを含有含有していてもよい。一群のＤＮＡフラグメントの１ピークの検 出された分子量と他の群のＤＮＡフラグメントの１ピークとを比較して質量差が 決定される。 本発明はレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の核酸の質量の分解能 をイオン抽出の間、高エネルギー衝突とイオン電荷交換を減少させることにより 改善する方法にも特徴がある。核酸を含有する試料保持器に電位がかけられる。 試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試 料保持器から空間的に離れている第１素子に電位がかけられる。試料はパルス状 エネルギーを発生させるレーザーでイオン化されイオン雲を形成する。第１素子 の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特定し、イオン化に続 く予め決められた時間に試料保持器に第２電位をかけ、予め決められた時間の後 にイオンを抽出する。第１素子の電位とともに、第１、及び第２素子の間の電場 を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけてもよい。 予め決められた時間はイオン抽出の間衝突エネルギーの付加とイ オンからの電荷移動を実質的に除去するのに十分なように、イオン雲を拡散する のに十分な長さが選択される。予め決められた時間は、雲の中のイオンの平均自 由経路が保持器と第１素子との間の距離におよそ等しくなる時間より長いように 選択される。予め決められた時間は実質的に全ての高速フラグメント化が完了す る時間より長いように選択される。 試料は試料の脱着及びイオン化が容易になるようにレーザーパルスの波長で吸 収するマトリックス物質を含有することができる。 本発明はＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析の正確な分子量を得る方法にも特徴があ る。ＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析の主要な問題は未知化合物を含有する試料に対 して既知化合物を含有する内部標準を使用しないで正確な分子量を得ることは難 しいことである。残念ながら、異なる試料では感度が大きく異なって反応するの で、内部標準の適正な量を含有する試料を調整できるまでに、何回も試みること が必要になる。また、内部標準は未知の試料と同じ質量のイオンを生じることに より測定を干渉することもある。このようにＭＡＬＤＩＴＯＦ型質量分析の多く の応用には内部標準を用いないで測定された飛行時間を非常に高精度で正確に質 量に変換する事ができることが重要なことである。 原理的には、どのような質量のイオンの飛行時間も電位や距離のような関連パ ラメーターの様に正確に計算することは可能である。しかし、従来のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ型質量分析計では、正確な計算は加速後のイオン速度が正確には分からな いので一般的には可能ではない。試料表面から脱着した物質の円錐状の柱の中で イオンと中性分子の間の衝突するためにこの不確定性が生じる。そのような衝突 で損失するエネルギーはレーザー強度及び質量のようなパラメータ ーで変化する。このように、測定された飛行時間と質量の相関性はスペクトル毎 に異なる。正確な質量を得るためには、スペクトルを正確に測定し未知の質量を 決定するために未知試料の質量と類似の質量を有する既知の化合物が含まれるこ とが必要である。 本発明では、イオンは電場が弱いかゼロの領域で最初イオンを産生する。初期 の場はイオンが最終的に抽出され検出される方向とは反対の方向にイオンを加速 する。この方法で、衝突による著しいエネルギー損失をなくすように、円錐状柱 が十分なくなるように抽出場に電位をかけるのを遅らせる。結果として、質量分 析計のいかなる位置の、いかなるイオンの速度も正確に計算でき質量と飛行時間 との相関性も正確に分かり、スペクトルの内部標準が不必要になる。 パルス化 イオン抽出で、イオンの質量は以下の式で非常に高度の近似で与えられる： M^1/2= A₁(t + A₂)(1-A₃△t + A₄t + A₅t²) (5) ここでｔは測定されたナノ秒の飛行時間である。Ａ１はイオンの初期速度がゼ ロの時、質量と飛行時間を相関する比例常数である。Ａ２はレーザーパルスと一 時的なディジタル化のはじめの間の遅延時間でナノ秒で表される。Ａ３は遅延走 査が用いられたとき以外は小さい。遅延時間△ｔはレーザーパルスと誘導場２電 位をかける間の時間である。他の用語は初期速度、第１素子の電圧、及び装置の 幾何学にのみ依存する補正である。 上記の係数は以下の方法で装置パラメーターで説明できる： A₁= V^1/2(1 + αGw)/4.569D_c ] (6) D_c = Dzg(y) (7) ここでVはキロボルトでの電源電圧、Dはmmでの無場距離、Gwは導線セッティン グ（％電源電圧）、αは実験的に決定された常数。 g(y)= 1 + 2y^1/2[d_a/D +(d₀ ^/DD)(1 +｛y^1/2 + 1｝] (8) z = 1+(2d_m/D)(V)(V_s/V_m)｛[1+(V_m/V_s)]1/2-1｝ (9) ｄ_aはmmでの最初のイオン加速領域、d₀はmmでの第２加速領域、ｄ_mは電子増強機 の前面の加速領域の長さ、V_mは電子増強機の前面にかける電圧をキロボルトで表 している。 y=＝V_s/(V_s-V_g)=100/(100-G_R) (10) G_R電源電圧の％でのグッリドセッティング。 導線補正は線のまわりのイオンの 最も確率の高い軌道に依存する。正確に導線電位でのドリフトチューブを通って 移動するイオンに相当するδの最大値は０．００５である。δの実際値はこれよ りいくらか小さくレーザー設定に依存する。高次の補正項は A₃= v₀wy^1/2/2D_e (11) で与えられる。 A₄= v₀d_ay/2D_e (12) A₅= v₀ ²d_awy^3/2/8D_e ³ (13) v₀はミリメーター／ナノ秒での初期速度で、wは w=y^3/2[(D/2d_s-(d₀/d_a)(1+x)]+x(d₀/d_a)-1 (14) で与えられここで x=(V_s-V_g)/V_g=(100-G_R)/G_R (15) これらの値は誘導パルスをかける前にゼロの最初の場で操作するときにのみ厳 密に利用できる。 イオン検出器を用いた場合、有効なドリフト距離は D = Dzg(y)+4d_R/R (16) ここでd_Rはmmで鏡の長さ、Ｒは電源電圧に対する鏡電圧の比である。反射器の 通常操作では量wは w=x(d₀／d_a)-1 (17) これらの変化で較正式は線形分析で使用されるものと全く同じである。ｙとｗ は反射器については一般的にはずっと小さく、このように補正項もまた小さい。 等価物 本発明は特定の好ましい実施の態様で特に示され、説明されているが、添付され ているクレームにより特定されるように本発明の真意及び範囲から離れることな く形式や詳細の各種の変化ができるのは当業者には理解できることである。例え ば、パルスレーザーがイオン源として説明されているが、他のパルスイオン源も 本発明の真意及び範囲から離れないで用いることができることは留意すべきであ る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年７月３日 【補正内容】 ＷＯ９２／１３６２９はＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析計を用いてそのような 生物学的試料を分析する方法が示されている。この方法で、レーザーで蒸発した 試料の分子は、試料と共有結合した発色団に吸収されるレーザー波長に暴露され てイオン化する。イオンは抽出され、多チャンネル検出器の方へイオン反射器に より反射される。米国特許５、２８８、６４４はＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析 計を用いてＤＮＡの配列分析をする方法を示している。この方法では、酵素的、 若しくは化学的分解配列分析技術により作られた試料がレーザー波長を吸収する マトリックスに分散される。マトリックスと試料は照射されその結果蒸発した試 料が質量分析計に導入される。試料が構成されるフラグメントの質量が決定され 、この情報から、配列情報が得られる。 ＭＡＬＤＩで試料は通常平滑な金属表面に添着され、試料表面にパルスレーザ ーを衝突させた結果として気相に脱着される。このように、イオンはレーザーパ ルスの時間におよそ相当する短い間隔で、蒸発するのに十分なエネルギーをレー ザーから吸収する個体マトリックスと試料の部分に相当する非常に小さい空間領 域で生成される。これは、初期イオン速度も小さい場合には飛行時間型（ＴＯＦ ）質量分析計の全く理想的なイオン源になるであろう。残念ながら、これはそう ではない。レーザーによる早いマトリックスの除去はマトリックスと試料イオン を含有しているマトリックス分子の超音ジェットを生成する。電場がないとジェ ット中の分子種及びイオン種の全てがジェット中で起こる頻度の高い衝突の結果 、殆ど同一の速度分布に達する。 ＭＡＬＤＩのイオン放出過程についていくつかの研究グループで研究されてい る。ＲＣ Ｂｅａｖｉｓ、Ｂ．Ｔ．Ｃｈａｉｔ，Ｃｈ ｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１８１，１９９１，４７９．Ｊ．Ｚｈｏｕ、Ｗ． Ｅｎｓ，Ｋ．Ｇ．Ｓｔａｎｄｉｎｇ、Ａ．Ｖｅｒｅｎｔｃｈｉｋｏｖ，Ｒａｐｉ ｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，６，１９９２，６７１−６ ７８．電場がなければ、ＭＡＬＤＩで生成されるペプチド及び蛋白質イオンの初 期速度分布は分析対象の質量やレーザー強度には殆ど全く依存しない。平均速度 は約５５０ｍ／秒で２００から１２００ｍ／秒に殆どのものが入る速度分布であ る。マトリックスイオンからの速度分布はイラディアンス閾値に近いペプチド及 び蛋白質のそれと本質的に同一であるが、より高いイラディアンスでは劇的に高 速度側にシフトする。全イオン強度は閾値近くではショット当たり１０４から高 イラディアンスでは１０８以上の範囲でレーザーイラディアンスが増加するに従 って早く増加する。電場があれば、イオンはイオンと中性分子との衝突によるエ ネルギー損失を示す。このエネルギー損失はレーザー強度及び電界強度とともに 増加し、マトリックスイオンより高い質量の分析対象物にとってより高い。 ＭＡＬＤＩにより生成されるイオンの初期速度分布が質量に依存しないと云う 観察結果は初期運動エネルギー分布の幅が加速された場での中性分子との衝突か ら生じるエネルギー損失のみならず質量の平方根にもおよそ比例するということ を意味している。このように高い質量での従来型のＭＡＬＤＩでの質量分解能は イオンの質量電荷比とともに減少する。高い加速エネルギー（２５−３０ｋＶ） を用いると加速エネルギーの増加に直接的に比例して高い質量での分解能が増大 する。 初期運動エネルギー分布の好ましくない効果はパルスイオン抽出により部分的 に除去できる。パルス化され遅延化されたイオン抽出 はイオン形成と加速場使用の間に導入される。加速領域で遅延時間と電場を正し く選択することにより、イオンの飛行時間を飛行時間が初期速度に一次に依存し ないように調節することができる。 Ｅ．Ｗ．ＢｌａｕｔｈがＤｙｎａｍｉｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅ ｒｓ，１９６６、Ｅｌｓｖｉｅｒ 出版社、アムステルダム、ではイオンビーム を空間的、エネルギー的に焦点を絞る飛行時間型質量分析計について議論されて いる。電子衝突により作られたイオンは、一般に、イオンがパルス電場をかけら れ放出するまで無場空間領域に留まっている。 質量分解能の著しい改善がＭＡＬＤＩイオン源でのパルスイオン抽出を用いる ことによって達成された。研究者が小さい蛋白質の高速フラグメント化のみなら ず改善された分解能を、Ｊ．Ｊ．Ｌｅｎｎｏｎ ＆ Ｒ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｐｒ ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４２ｎｄ ＡＳＭＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ ｅ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｔｏ ｐｉｃｓ、１９９４年５月２９日−６月３日、シカゴ、イリノイ州、５０１頁で 報告している。また、パルスイオン抽出のできる小型ＭＡＬＤＩ機器でより小さ い合成ポリマーを測定するときに著しい分解能の向上をＢｒｕｅｕｋｅｒ等によ り第１３回国際質量分析会議、１９９４年８月２９日ー９月３日、ブタペスト、 ハンガリーで報告されている。さらに、パルスイオン抽出ＭＡＬＤＩ源で低分子 の蛋白質に関する質量分解能を著しく改善していることを、Ｓ．Ｍ．Ｃｏｌｂｙ ，Ｔ．Ｂ．Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．ＲｅｉｌｌｙによりＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎ．， Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８，１９９４，８６５−８６８に報告さ れている。 本発明は特に本明細書にも引用している米国出願番号０８／７９６、５９８（ 代理人書類番号：ＳＹＰ−１１５，本件とも同様に提出されている）に完全に記 載され、請求されているように請求されている質量分析計の新規な型の試料保持 器にも特徴がある。簡単に云うと試料保持器はポリマー試料と加水分解剤の濃度 比を変えながら保持するように適合された空間的には分離された領域からなる。 加水分解剤が各領域、のポリマー試料のモノマー結合間を加水分解する適切なイ ンキュベーション時間の後で、種を含む領域の複数、一般的には全部がイオン化 され、一般的には順次、質量分析計で領域の種の質量電荷比の代表的なデータが 得られる。 他の態様では本発明は本明細書で引用している米国出願番号０８／４４７、１ ７５（代理人書類番号ＳＹＰ−１１５，本件とも同様に提出されている）に完全 に記載され、請求されている様に既知の質量の複数のモノマーからなるポリマー についての配列情報を得ることができる方法を提供する。当業者は、ポリマーを 分解し、各組は一、若しくはそれ以上のモノマーで異なる一組のフラグメントを 最初に提供する。少なくとも一組のフラグメント質量電荷比の差が分析される。 一若しくはそれ以上の異なるモノマーの既知の質量電荷比に相当する平均質量電 荷比が仮定される。仮定された平均は要求される信頼度のレベルで二つの値が統 計的に差があるか、どうかを決定するために測定された平均と比較される。統計 的な差があれば、言明された平均の差は実際の測定された差と帰せられない。い くつかの態様では一組のフラグメントの間の差をさらに測定し、測定された平均 の差の精度を高める。方法のステップを一対のフラグメントの間の単一差が全て の要求されるマイクロ秒言明されるまで繰り返される。 等価物 本発明は特定の好ましい実施の態様で特に示され、説明されているが、添付され ているクレームにより特定されるように本発明の真意及び範囲から離れることな く形式や詳細の各種の変化ができるのは当業者には理解できることである。 請求の範囲 １．以下の構成からなる飛行時間型質量分析計： ａ）液体、若しくは固体試料からイオン源を供給する試料保持器 ｂ）試料イオンを形成するイオン源をイオン化するイオン化器 ｃ）試料イオンにエネルギーを課す第１の予め選択された非周期的、非ゼロ 電場を調節下に発生させる手段；及び ｄ）イオン抽出する第２の電場を発生させる手段。 ２．当該第１電場を調節可能なように発生させる手段及び当該第２電場を発生さ せる手段が： ａ）試料保持器から空間的に離れている第１素子；及び ｂ）ｉ）第１素子及び保持器電位がイオン抽出前に独立して変化しうる第１ 素子、及び保持器のいずれにも可変電位をかけ、そして ｉｉ）第１素子と保持器電位が独立して変化しうる第１素子と保持器のい ずれにもイオン抽出のために第２の可変の電位をかける、 ように第１素子と保持器に電気的に接続されている電源、 とからなる請求項１記載の質量分析計。 ３．イオン抽出前に遅延電場を確立する電源を調節するための手段を含む請求項 ２記載の質量分析計。 ４．第１素子の電位を保持器の電位と比較して、陽イオンを測定するときはより 陽性に、陰イオンを測定するときはより陰性にセットする電源を調節するための 手段をさらに含む請求項２記載の質量分 析計。 ５．試料イオンを加速するために、電場を発生させる第１素子とは空間的に離れ ている第２素子をさらに含む請求項２記載の質量分析計。 ６．第１素子から空間的に離れているイオン反射器をさらに含む請求項２または ５記載の質量分析計。 ７．イオン化器がパルス状エネルギーを発生するレーザーである請求項２記載の 質量分析計。 ８．当該第１非ゼロ電場を調節可能なように発生させる当該手段及び第２電場を 発生させる当該手段が以下の構成からなる請求項１記載の質量分析計 ａ）保持器から空間的に離れている第１素子 ｂ）第一素子から空間的に離れている第２素子；そして ｃ）パルス状エネルギーに反応し、第１素子、第２素子、及び保持器の各々 に電位をかけるために第１素子、第２素子、及び保持器に電気的に接続された電 源、ここで ｉ）第１素子と保持器の間の電位が第１電場を特定し、第２素子と第１ 素子の間の電位が第２電場を特定する、 ｉｉ）第１素子と保持器の電位はイオン抽出前に独立して可変である、 ｉｉｉ）第１素子、第２素子及び保持器の電位はパルス状エネルギーの発 生に続いて予め決められた時間にイオン抽出を開始する。 ９．第１素子の電位を保持器の電位と比較して、陽イオンを測定するときはより 陽性に、陰イオンを測定するときはより陰性にセットする電源を調節するための 手段をさらに含む請求項８記載の質量分 析計。 １０．当該電源の高速高電圧スイッチのスイッチの制動器入力に操作的に接続さ れた出力のパルスエネルギーに応答する遅延発生器をさらに含み、当該遅延発生 器が、スイッチをパルス状エネルギーに合わせて操作する制動器信号を発生させ る請求項９記載の質量分析計。 １１．レーザーが遅延発生器を調節する手段を含む請求項１０記載の質量分析計 。 １２．保持器と第１素子の間の電圧を比較する回路をさらに含む請求項８記載の 質量分析計。 １３．第２素子が接地されている請求項８記載の質量分析計 １４．飛行時間型質量分析計により、試料中の分子から発生したイオンの質量電 荷比を測定する方法であって； ａ）試料保持器へ第１電位をかけ； ｂ）試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位をかけ、試料保 持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する； ｃ）保持器の近位に置かれた試料をイオン化し、試料イオンを形成する、そ して ｄ）ステップｃに続き、予め決められた時間に第１若しくは第２電位の少な くとも一つを変化させ、飛行時間測定のためにイオンを抽出する試料保持器と第 １素子の間の第２の異なる電場を特定することを含む方法。 １５．第１素子の電位および試料保持器の電位を独立して変化させることを含む 請求項１４記載の方法。 １６．質量電荷比によりイオンを空間的に分離する遅延電場を確立 するために、第１素子の電位および試料保持器の電位を独立して変化させること を含む請求項１４記載の方法。 １７．イオン抽出前にそれらの質量で空間的に分離するために、試料保持器の電 位と比較して第１素子の電位を陽イオンを測定するときはより陽性に、陰イオン を測定するときにはより陰性である請求項１４記載の方法。 １８．試料がパルス状エネルギーを発生するレーザーでイオン化され、試料がパ ルス状エネルギーに実質的に相当する波長で照射を吸収するマトリックス物質を 含有し、マトリックスが分子の脱着及びイオン化を容易にするする請求項１４記 載の方法。 １９．第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけるステップをさら に含み、第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１素子と第２素子の間の 電場を特定する請求項１４記載の方法 ２０．第１電場がゼロと等しい請求項１４記載の方法。 ２１．第１、若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させるステップが、イオ ン化に続く予め決められた時間に試料保持器、若しくは試料のいずれかに第２電 位をかけるステップを含み： ｉ）第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特 定し；そして ｉｉ）イオン抽出の間の過剰な衝突エネルギーを与えるのを実質的に除去 するのに十分なように、イオン雲を拡散させるのに十分長い時間である予め決め られた時間の後イオンを抽出する、 請求項１４記載の方法。 ２２．予め決められた時間がイオン雲の中のイオンの平均自由経路が保持器と第 一素子の間の距離より大きくなる時間より大きい請求項２１記載の方法。 ２３．マトリックス物質が１若しくはそれ以上のイオンの脱着及びイオン化を容 易にするように、分析される１若しくはそれ以上の種類の分子からなる試料に、 当該マトリックス化合物を取り込むステップをさらに含む請求項１８記載の方法 。 ２４．予め決められた時間とは実質的にイオンの全てがフラグメント化する時間 より大きい請求項２１記載の方法。 ２５．マトリックスに添加剤を取り込むことにより、イオン化の間に生体分子に エネルギー移動を増加させることにより生じるフラグメントの収率を増加させる ステップを含む請求項１８記載の方法。 ２６．第１電場は、イオンが試料保持器の方へ、式により与えられるおよそ最適 の大きさＥ₁で加速されるように、遅延する請求項１４記載の方法。 Ｅ₁＝５ｍｖ₀／△ｔ ここで ｍは問題の最小質量（ダルトン）、ｖ₀は最も確率の高い初期速度（メータ ー／秒）、△ｔは、イオン化と抽出の間遅延時間（ナノ秒）である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の構成からなる飛行時間型質量分析計： ａ）液体、若しくは固体試料からイオン源を供給する試料保持器 ｂ）試料イオンを形成するイオン源をイオン化するイオン化器 ｃ）試料イオンにエネルギーを課す予め選択された非周期的、非ゼロ電場を 調節下に発生させる手段；及び ｄ）イオン抽出する異なる電場を発生させる手段。 ２．イオン化器が、要求される質量分解能に相当する時間より実質的に長い時間 のパルス状のエネルギーを発生させるレーザーである請求項１記載の質量分析計 。 ３．以下の構成からなる、試料から発生させられるイオンの質量電荷比を測定す る飛行時間型質量分析計： ａ）試料保持器 ｂ）保持器に置かれた試料からパルス状の試料イオンを発生させる試料イオ ン化器 ｃ）試料保持器から空間的に離れている第１素子；及び ｄ）以下のために、第１素子と保持器に電気的に接続されている電源 ｉ）第１素子及び保持器電位がイオン抽出前に独立して変化しうる第１素 子、及び保持器のいずれにも可変の電位をかけ、そして ｉｉ）第１素子と保持器電位が独立して変化しうる第１素子と保持器のい ずれにもイオン抽出のために第２の可変の電位をかける。 ４．イオン抽出前に遅延電場を確立する電源を調節するための手段からなる請求 項３記載の質量分析計。 ５．第１素子の電位を保持器の電位と比較して、陽イオンを測定するときはより 陽性に、陰イオンを測定するときはより陰性にセットする電源を調節するための 手段をさらに含む請求項３記載の質量分析計。 ６．試料イオンを加速するために電場を発生させる、第１素子とは空間的に離れ ている、第２素子をさらに含む請求項３記載の質量分析計。 ７．第１素子から空間的に離れているイオン反射器をさらに含む請求項３、若し くは６記載の質量分析計。 ８．イオン化器がパルス化光源である請求項３記載の質量分析計。 ９．イオン化器がパルス状エネルギーを発生するレーザーである請求項３記載の 質量分析計。 １０．試料が分析される１、若しくはそれ以上の分子とパルス状エネルギーに実 質的に相当する波長で吸収するマトリックス物質からなり、マトリックスが分子 の脱着及びイオン化を容易にする、保持器に電気的に接続された試料をさらに含 む請求項９記載の質量分析計。 １１．試料がＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド、及びそれらの合成変種からな る群から選択される生物学的関心のある少なくとも１化合物からなる請求項１０ 記載の質量分析計。 １２．試料がペプチド、蛋白質、ＰＮＡ，炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からな る群から選択された少なくとも１生体分子からなる請求項１０記載の質量分析計 。 １３．第１素子がグリッドからなる請求項３記載の質量分析計。 １４．第１素子が電界レンズからなる請求項３記載の質量分析計。 １５．以下の構成からなる試料から発生させられたイオンの質量電荷比を測定す る飛行時間型質量スペクトル： ａ）試料保持器 ｂ）保持器に置かれた試料を照射し、イオン化するためのパルス状エネルギ ーを発生させるレーザー ｃ）保持器から空間的に離れている第１素子 ｄ）第１素子から空間的に離れている第２素子 ｅ）パルス状エネルギーに反応し、第１素子、第２素子、及び保持器の各々 に電位をかけるために第１素子、第２素子、及び保持器に電気的に接続された電 源、ここで ｉ）第１素子と保持器の間の電位が第１電場を特定し、第２素子と第１素 子の間の電位が第２電場を特定する、 ｉｉ）第１素子と保持器の電位はイオン抽出前に独立して可変である、 ｉｉｉ）第１素子、第２素子及び保持器の電位はパルス状エネルギーの発 生に続いて予め決められた時間にイオン抽出を開始する。 １６．第１素子の電位を、保持器の電位と比較して、イオン抽出する前に、陽イ オンを測定するときはより陽性に、陰イオンを測定するときはより陰性にセット する電源を調節する手段をさらに含む請求項１５記載の質量分析計。 １７．電源が以下の構成からなる高速高電圧スイッチをさらに含む請求項１５記 載の質量分析計： ａ）第１高電圧入力； ｂ）第２高電圧入力； ｃ）第１、若しくは第２入力に接続可能な高電圧出力；及び ｄ）出力が制動器信号が制動器入力にかけられたとき予め決められた時間で 第１入力から第２入力に切り換えられるスイッチを操作する制動器入力。 １８．第１及び第２高電圧入力が電気的に少なくとも３ｋＶの電源に電気的に接 続されスイッチが２００ナノ秒以下の作動立ち上がり時間である請求項１７記載 の質量分析計。 １９．電源が少なくとも１ｋＶでスイッチが１マイクロ秒以下の作動立ち上がり 時間を有する請求項１７記載の質量分析計。 ２０．スイッチをパルス状エネルギーに合わせて操作するための制動器信号を発 生させる、その出力がスイッチの制動器入力に操作的に接続されたパルスエネル ギーに応答する遅延発生器をさらに含む請求項１７記載の質量分析計。 ２１．ここでレーザーが遅延発生器を調節する手段からなる請求項２０記載の質 量分析計。 ２２．パルス状エネルギーとスイッチの制動器入力を開始する遅延発生器をさら に含む請求項１７記載の質量分析計。 ２３．第１素子から空間的に離れているイオン反射器をさらに含む請求項１５記 載の質量分析計。 ２４．試料が分析される１、若しくはそれ以上の分子とパルス状エネルギーに実 質的に相当する波長で吸収するマトリックス物質からなり、マトリックスが分子 の脱着及びイオンかを容易にする、保持器に電気的に接続された試料をさらに含 む請求項１５記載の質量分析計。 ２５．試料がＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド、及びそれらの合成変種からな る群から選択される生物学的関心のある少なくとも１ 化合物からなる請求項２４記載の質量分析計。 ２６．試料がペプチド、蛋白質、ＰＮＡ，炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からな る群から選択された少なくとも１生体分子からなる請求項２４記載の質量分析計 。 ２７．第１素子がグリッドからなる請求項１５記載の質量分析計 ２８．第１素子または第２素子の少なくとも１つが電界レンズからなる請求項１ ５記載の質量分析計。 ２９．保持器と第１素子の間の電位を比較する回路をさらに含む請求項１５記載 の質量分析計。 ３０．レーザーで発生させられ、第２素子で加速されたイオンを検出するイオン 検出器をさらに含む請求項１５記載の質量分析計。 ３１．検出器へイオンを引きつける導線をさらに含む請求項３０記載の質量分析 計。 ３２．第２素子が接地されている請求項１５記載の質量分析計。 ３３．以下の構成からなる飛行時間型質量分析計のより試料中の分子から発生し たイオンの質量電荷比を測定する方法、 ａ）試料保持器へ第１電位をかけ； ｂ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特 定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位をかけ； ｃ）試料イオンを形成する保持器の近位に置かれた試料をイオン化し；そし て ｄ）飛行時間測定のためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第 ２の異なる電場を特定するためステップｃに続く予め決められた時間に第１、若 しくは第２電位の少なくとも一つ変化させる。 ３４．第１素子の電位を試料保持器の電位とは独立して変化させることからなる 請求項３３記載の方法。 ３５．質量電荷比によりイオンを空間的に分離する遅延電場を確立するために第 １素子の電位を試料保持器の電位とは独立して変化させることからなる請求項３ ３記載の方法。 ３６．イオン抽出前にそれらの質量で空間的に分離するために、試料保持器の電 位と比較して第１素子の電位を陽イオンを測定するときはより陽性に、陰イオン を測定するときにはより陰性にする請求項３３記載の方法。 ３７．試料がパルス状エネルギーを発生するレーザーでイオン化される請求項３ ３記載の方法。 ３８．試料がパルス状エネルギーに実質的に相当する波長で吸収されるマトリッ クス物質を含有し、マトリックスが分子の脱着及びイオン化を容易にするする請 求項３７記載の方法。 ３９．第１素子の電位とともに、イオンを加速するための第１素子と第２素子の 間の電場を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけるス テップをさらに含む請求項３３記載の方法。 ４０．試料がＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド、及びそれらの合成変種からな る群から選択される生物学的に関心のある少なくとも１化合物からなる請求項３ ３記載の方法。 ４１．試料がペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物及び糖蛋白質から なる群から選択される少なくとも１生体分子からなる請求項３３記載の方法。 ４２．第１電場がゼロに等しい請求項３３記載の方法。 ４３．以下の構成からなる、イオンの初期速度分布を少なくとも２ 次に補償することにより飛行時間型質量分析計の質量分解能を改善する方法： ａ）試料保持器に電位をかけ； ｂ）試料保持器の電位とともに、イオン抽出前にそれらの質量でイオンを空 間的に分離させる試料保持器と第１素子の第１電場を特定する試料保持器から空 間的に離れている第１素子に空間的に作用する電位をかけ； ｃ）試料イオンを形成するように保持器の近位に置かれた試料をイオン化し ； ｄ）イオン化後予め決められた時間の後に第１素子の電位とともに、試料保 持器と第１素子の間の電場を特定する第２電位を、試料保持器、若しくは第１素 子のいずれかにかけ、予め決められた時間後に第１素子からイオンを抽出し；そ して ｅ）第１素子から空間的に離れているイオン反射器にエネルギーをかけ、第 １電場、第２電場及び予め決められた時間を、反射器から検出器までの質量様電 荷比の似ている抽出されたイオンの飛行時間が２次の初期速度に依存しないよう に選択する。 ４４．第１素子の電位が、試料保持器の電位と比較して、イオン抽出前に陽イオ ンを測定するときはより陽性に、陰イオンを測定する時はより陰性である請求項 ４３記載の方法。 ４５．イオンを加速する第１素子と第２素子との間の電場を作る第１素子と反射 器の間の第２素子に電位をかけるステップをさらに含む請求項４３記載の方法。 ４６．第１電場がゼロである請求項４３記載の方法。 ４７．試料がパルス状エネルギーを発生するレーザーでイオン化される請求項４ ３記載の方法。 ４８．試料がパルス状エネルギーに実質的に相当する波長の照射を吸収するマト リックス物質を含有し、そのマトリックスが分子の脱着及びイオン化を容易にす る請求項４３記載の方法。 ４９．以下の構成からなる、イオン抽出の間の高エネルギー衝突の数を減少させ ることによりレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の分解能を改善する 方法： ａ）試料保持器へ電位をかけ； ｂ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の電位を特定す る試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位をかけ； ｃ）パルス状エネルギーを発生するレーザーでイオン雲を形成する保持器の 近位部に置かれた試料をイオン化し；そして ｄ）イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器、若しくは試料のいず れかに第２電位をかける： ｉ）それは、第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２ 電場を特定し；そして ｉｉ）予め決められた時間の後イオンを抽出する、そこで予め決められた 時間とは、イオン抽出の間の過剰な衝突エネルギーを与えるのを実質的に除去す るのに十分なように、イオン雲を拡散させるのに十分長い時間である。 ５０．予め決められた時間が雲の中のイオンの平均自由経路が保持器と第一素子 の間の距離より大きくなる時間より大きい請求項４９記載の方法。 ５１．第１素子の電位が、試料保持器と比較して、イオン抽出前にそれらの質量 を空間的に分離するのに、陽イオン測定の時はより陽性に、陰イオン測定の時に はより陰性である請求項４９記載の方法。 ５２．試料がパルス状エネルギーに実質的に相当する波長の照射を吸収するマト リックス物質を含有し、そのマトリックスがイオンの脱着及びイオン化を容易に する請求項４９記載の方法。 ５３．第１素子の電位とともに、第１素子と第２素子との間のイオンを加速する 電場を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけるステッ プをさらに含む請求項４９記載の方法。 ５４．試料が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド及びそれらの合成変種からな る群から選択された生物学的に関心のある少なくとも１化合物を含有する請求項 ４９記載の方法。 ５５．試料が、ペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物及び糖蛋白質か らなる群から選択される少なくとも１生体分子を含有する請求項４９記載の方法 。 ５６．以下の構成からなる、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間 型質量分析計においてマトリックスシグナルを減少させる方法： ａ）試料にマトリックス分子を取り入れ； ｂ）試料保持器に第１電位をかけ； ｃ）試料保持器と第１素子の間の第１電場を作る試料保持器から空間的に離 れている第１素子に電位をかけ、そこでは第１素子の電位は、試料保持器の電位 より、陽イオン測定するときにはより陽性で、陰イオン測定するときにはより陰 性である； ｄ）試料やマトリックスの脱着及びイオン化を容易にするためにマトリック ス分子により吸収されるパルス状エネルギーを発生するレーザーで保持器の近位 部に置かれた試料を照射する。ここでは、第１電場がマトリックスイオンから試 料イオンをそれらの質量電荷比により空間的に分離し、より軽いマトリックスイ オンはそれらが その表面で中性化される試料の表面へと後戻りする；そして ｅ）パルス状エネルギーに続く予め決められた時間に試料保持器か第１素子 のいずれかに、第２電位が試料保持器と第１素子の間のイオンを抽出するための 第２電場を作るように、第２電位をかける。 ５７．第１素子及び第２素子の間のイオンを加速するための電場を作る第１素子 から空間的に離れている第２素子に電位をかけるステップをさらに含む請求項５ ６記載の方法。 ５８．第１素子の電位が、陽イオンを測定するときに約０．１−５．０％試料保 持器の電位より大きく、陰イオンを測定するときには約０．１−５．０％試料保 持器の電位より低い請求項５６記載の方法。 ５９．試料が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド及びそれらの合成変種からな る群から選択された生物学的に関心のある少なくとも１化合物を含有する請求項 ５６記載の方法。 ６０．試料が、ペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物及び糖蛋白質か らなる群から選択される少なくとも１生体分子を含有する請求項５６記載の方法 。 ６１．以下の構成からなる、イオン抽出によりマトリックス補助レーザー脱着／ イオン化飛行時間型質量分析計でのバックグラウンド化学イオン化ノイズを減少 させる方法： ａ）マトリックス物質が１若しくはそれ以上の分子の脱着及びイオン化を容 易にするように、分析される１若しくはそれ以上の種類の分子からなる試料にマ トリックス化合物を取り込み； ｂ）試料保持器に電位をかけ； ｃ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の 第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位をかけ； ｄ）マトリックス分子に吸収されるパルス状エネルギーを発生させるレーザ ーで保持器の近位部に置かれた試料をイオン化し；そして ｅ）イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器、若しくは第１素子に 第２電位をかける、ここで ｉ）第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特 定し、 ｉｉ）イオン抽出するが、予め決められた時間とは、全ての高速フラグメ ント化プロセスが実質的に完了するのに十分長い時間である。 ６２．イオン抽出前にそれらの質量で空間的に分離するために、試料保持器と比 較して、第１素子の電位は陽イオンを測定するときはより陽性に、陰イオンを測 定するときはより陰性である請求項６１記載の方法。 ６３．第１素子の電位とともに、第１素子と第２素子の間のイオンを加速するた めの電場を特定する、第１素子から空間的に離れた第２素子へ電位をかけるステ ップをさらに含む請求項６１記載の方法。 ６４．予め決められた時間とは実質的にイオンの全てがフラグメント化する時間 より大きい請求項６１記載の方法。 ６５．予め決められた時間とは５０ナノ秒より大きい請求項６１記載の方法。 ６６．試料が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド、及びその合成変種からなる 群から選択された生物学的に関心のある少なくとも１化合物からなる請求項６１ 記載の方法。 ６７．試料が、ペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物及び糖蛋白質か らなる群から選択される少なくとも１生体分子からなる請求項６１記載の方法。 ６８．以下の構成からなる、ロングパルス・レーザー脱着／イオン化飛行時間型 質量分析計の分解能を改善する方法： ａ）試料保持器に第１電位をかける； ｂ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特 定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位をかけ； ｃ）長時間パルス状エネルギーを発生するレーザーで保持器の近位部に置か れた試料をイオン化してイオンを形成し；そして ｄ）飛行時間測定のためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第 ２の異なる電場を特定するためにステップｃに続く予め決められた時間に第１、 若しくは第２電位の少なくとも一つ変化させる。 ６９．パルス状エネルギーの時間が５０ナノ秒より大きい請求項６８記載の方法 。 ７０．予め決められた時間とはパルス状エネルギーの時間より大きい請求項６８ 記載の方法。 ７１．イオン抽出の前にそれらの質量で空間的にイオンを分離するために、試料 保持器の電位と比較して、第１素子の電位が、陽イオン測定時はより陽性に、陰 イオン測定時はより陰性である請求項７１記載の方法。 ７２．試料がパルス状エネルギーに実質的に相当する波長での照射を吸収するマ トリックス物質からなり、マトリックスが分子の脱着及びイオン化を容易にする 請求項７１記載の方法。 ７３．第１素子の電位とともに、第１素子と第２素子の間のイオンを加速するた めの電場を特定する、第１素子から空間的に離れた第２素子へ電位をかけるステ ップをさらに含む請求項６８記載の方法。 ７４．試料が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド、及びその合成変種からなる 群から選択された生物学的に関心のある少なくとも１化合物からなる請求項６８ 記載の方法。 ７５．試料が、ペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物及び糖蛋白質か らなる群から選択される少なくとも１生体分子からなる請求項６８記載の方法。 ７６．以下の構成からなる、イオン抽出によりマトリックス補助レーザー脱着／ イオン化飛行時間型質量分析計を用いて、高速フラグメント化から生じる生体分 子の配列を特定するフラグメントイオンの収率を上昇させる方法： ａ）分子の脱着及びイオン化を容易にするように分析される１若しくはそれ 以上の生体分子からなる試料にマトリックス化合物を取り込み； ｂ）試料に近接して置かれている試料保持器に電位をかけ； ｃ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特 定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位をかけ； ｄ）マトリックスに吸収されるパルス状エネルギーを発生させるレーザーで 分子をイオン化し、フラグメント化し；そして ｅ）イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器、若しくは第１素子第 ２電位をかける、ここで ｉ）第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特 定し、 ｉｉ）イオン抽出するが、予め決められた時間とは、全ての高速フラグメ ント化プロセスが実質的に完了するのに十分長い時間である。 ７７．イオン抽出前にそれらの質量により空間的に分離するために第１素子の電 位は、試料保持器と比較して、陽イオン測定時にはより陽性に、陰イオン測定時 にはより陰性である請求項７６記載の方法。 ７８．第１素子の電位とともに、第１素子と第２素子の間のイオンを加速するた めの電場を特定する、第１素子から空間的に離れた第２素子へ電位をかけるステ ップをさらに含む請求項７６記載の方法。 ７９．生じる配列特異的フラグメントの質量を検出することをさらに含む請求項 ７６記載の方法。 ８０．試料中の少なくとも一つの生体分子の配列を同定することからなる請求項 ７９記載の方法。 ８１．試料が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド、及びその合成変種からなる 群から選択された生物学的に関心のある少なくとも１化合物からなる請求項７６ 記載の方法。 ８２．試料が、ペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物及び糖蛋白質か らなる群から選択される少なくとも１生体分子からなる請求項７６記載の方法。 ８３．イオン化の間生体分子へのエネルギー移動を増加させることにより生じる フラグメントの収率を増加させることからなる請求項７６記載の方法。 ８４．生体分子が吸収するレーザー波長を選択することにより、エネルギー移動 を増加させる請求項８３記載の方法。 ８５．マトリックスに添加剤を取り込むことによりエネルギー移動 を増加させる請求項８３記載の方法。 ８６．添加剤がレーザーパルスの波長で吸収するがそれ自身がマトリックスとし ては有効ではない請求項８５記載の方法。 ８７．添加剤がレーザーの波長で吸収せず、それ自身、マトリックスとしても有 効ではない請求項８５記載の方法。 ８８．マトリックスが特に生体分子のフラグメント化を促進するように選択され る請求項７６記載の方法。 ８９．生体分子がオリゴヌクレオチドであり、マトリックスが２、５−ジヒドロ キシ安息香酸か、ピコリン酸の一つである請求項８８記載の方法。 ９０．生体分子がポリヌクレオチドである請求項７６記載の方法。 ９１．以下のステップからなる質量分析計によるＤＮＡを配列する方法： ａ）未知の配列の一片のＤＮＡのフラグメントを含有する試料保持器に第１ 電位をかけ； ｂ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特 定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位をかけ； ｃ）試料イオンを形成するために保持器の近位部に置かれた試料をイオン化 し； ｄ）飛行時間測定のためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第 ２の異なる電場を特定するステップｃ２続く予め決められた時間に第１、若しく は第２電位の少なくとも一つを変化させ；そして ｅ）生じたイオンの質量電荷比を得、ＤＮＡ片の配列を得るためにその比を 利用する。 ９２．試料中のＤＮＡがフラグメント化され１セットのＤＮＡフラグメントを生 成し、各々は共通の起源を持ち、ＤＮＡ配列に沿った特定の塩基で終わる請求項 ９１記載の方法。 ９３．試料が、試料の脱着及びイオン化を容易にするパルスの量子エネルギーに 実質的に相当する波長で吸収するマトリックス物質と混合された異なるセットの ＤＮＡフラグメントからなる請求項９２記載の方法。 ９４．一片のＤＮＡの配列を得るステップ（ｅ）が以下のことからなる請求項９ １記載の方法： ａ）ＤＮＡフラグメントセットの一つのピークとＤＮＡフラグメントセット の他のピークとを比較して検出された分子量の絶対質量差を決定する。 ９５．以下の構成からなる、イオン抽出の間の衝突とイオン電荷交換を減少させ ることによりレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計での核酸分析の分解 能を改善する方法： ａ）核酸を含有する試料保持器に電位をかける； ｂ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特 定する、試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位をかけ； ｃ）保持器に近位部に置かれた試料をパルス状エネルギーを発生するレーザ ーでイオン化してイオン雲を形成させ；そして ｄ）イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器に第２電位をかける、 そこでは、 ｉ）第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特 定し；そして ｉｉ）予め決められた時間の後にイオンを抽出する、そこで 予め決められた時間とはイオン抽出の間の衝突エネルギー及び電荷移動の付加を 実質的に除去するのに十分長い様にイオン雲を拡散させるのに十分長い時間であ る。 ９６．予め決められた時間とは雲の中のイオンの平均自由経路が保持器と第１素 子の間の距離とほぼ等しい時間より大きい請求項９５記載の方法。 ９７．予め決められた時間が実質的に高速フラグメント化の全てが完了する時間 より大きい請求項９５記載の方法。 ９８．試料が、試料の脱着及びイオン化を容易にするパルスの量子エネルギーに 実質的に相当する波長で吸収するマトリックス分子からなる請求項９５記載の方 法。 ９９．第１素子の電位とともに、第１素子と第２素子との間のイオンを加速する ための電場を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかける ステップをさらに含む請求項９５記載の方法。 １００．以下の構成からなる、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時 間型質量分析計でのマトリックスノイズを減少させる方法： ａ）核酸を含有する試料にマトリックス分子を取り込み； ｂ）試料保持器に第１電位をかけ； ｃ）試料保持器と第１素子の間の第１電場を作る試料保持器から空間的に離 れている第１素子に電位をかけ、そこでは、第１素子の電位は試料保持器の電位 より、陽イオン測定時には、より陽性に、陰イオン測定時にはより陰性である ｄ）試料とマトリックスの脱着Ｔ及びイオン化を容易にするマトリックス分 子の吸収エネルギーに実質的に相当するエネルギーを 有するパルス状のエネルギーを発生させるレーザーで保持器の近位部に置かれた 試料を照射し、第１電場がマトリックスイオンと試料イオンをその質量で空間的 に分離する；そして ｅ）第２電位が試料保持器と第１素子の間のイオンを抽出するための第２電 場を作るように、パルス状エネルギーに続く予め決められた時間に試料保持器か 第１素子のいずれかに第２電位をかける。 １０１．以下の構成からなる、イオン抽出前にフラグメントかを誘導して、核酸 のマトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計でのバックグ ラウンド化学ノイズを減少させる方法： ａ）マトリックス物質が、１若しくはそれ以上の分子の脱着及びイオン化を 容易にするように、分析される１若しくはそれ以上の核酸分子からなる試料にマ トリックス分子を取り込み； ｂ）試料保持器に電位をかけ； ｃ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特 定する、試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位をかけ； ｄ）保持器の近位部に置かれた試料をマトリックス分子の吸収エネルギーに 実質的に相当するパルス状エネルギーを発生するレーザーでイオン化、フラグメ ント化し；そして ｅ）イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器に第２電位をかける、 そこでは、 ｉ）第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特 定し；そして ｉｉ）予め決められた時間の後にイオンを抽出する、そこで予め決められ た時間とはすべての高速フラグメント化が完了するのに十分長い時間である。 １０２．以下の構成からなる、実質的に衝突によるエネルギー損失がないように 円錐状のイオンが賞賛するのに十分な時間イオン抽出を遅延させることによりマ トリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計により正確な分子 量を求める方法： ａ）核酸を含有する試料保持器に電位をかける； ｂ）試料保持器の電位に実質的に等しい、試料保持器から空間的に離れてい る第１素子に電位をかけ； ｃ）保持器に近位部に置かれた試料をパルス状エネルギーを発生するレーザ ーでイオン雲を形成させるのにイオン化し；そして ｄ）イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器、若しくは試料に第２ 電位をかける、そこでは、 ｉ）第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特 定し；そして ｉｉ）予め決められた時間の後にイオンを抽出する、そこで予め決められ た時間とはイオン抽出の間の衝突エネルギー及び電荷移動の付加を実質的に除去 するのに十分長い様にイオン雲を拡散させるのに十分長い時間である。 １０３．検出器までの飛行時間を測定し、飛行時間測定から質量電荷比を計算す るステップをさらに含む請求項１０２記載の方法。 １０４．試料が、パルス状エネルギーに実質的に相当する波長での照射を吸収す るマトリックス物質を含有し、マトリックスが分子の脱着及びイオン化を容易に する請求項１０２記載の方法。 １０５．第１素子の電位とともに、第１素子と第２素子の間のイオンを加速する ための電場を特定する、第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけ るステップをさらに含む請求項１０２記載の方法。 １０６．イオン抽出前にそれらの質量により空間的にイオンを分離するのに第１ 素子の電位が試料保持器と比較して、陽イオン測定時にはより陽性で、陰イオン 測定時にはより陰性である請求項１０２記載の方法。 １０７．試料が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド、及びその合成変種からな る群から選択された生物学的に関心のある少なくとも１化合物からなる請求項１ ０２記載の方法。 １０８．試料が、ペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物及び糖蛋白質 からなる群から選択される少なくとも１生体分子からなる請求項１０２記載の方 法。 １０９．以下の構成からなる、飛行時間型質量分析計による試料中の分子から発 生するイオンの質量電荷比を決定する方法： ａ）試料保持器に第１電位をかけ； ｂ）試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の電場を特定す る、試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位をかける、ここで、第１ 電場は、イオンが式により与えられるおよそ最適の大きさＥ₁を有する試料保持 器の方へ加速されるように、遅延する E₁=5mv₀/△t、 ここで mは問題の最小質量をダルトンで、v₀は最も確率の高い初期速度をメーター／秒 で、△tは、イオン化と抽出の間の、遅延時間をナノ秒で表したものである、 ｃ）保持器の近位部に置かれた試料をイオン化し、試料イオンを形成し；そ して ｄ）飛行時間測定のためにイオンを抽出するための試料保持器と第１素子第 ２の異なる電場を特定するようにステップｃに続く予 め決められた時間に第１、若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させる。 １１０．第１素子の電位を試料保持器の電位とは独立して変化させることからな る請求項１０９記載の方法。 １１１．パルス状エネルギーを発生させるレーザーにより試料がイオン化される 請求項１０９記載の方法 １１２．試料が、パルス状エネルギーに実質的に相当する波長の照射を吸収する マトリックス物質を含有し、マトリックスが分子の脱着及びイオン化を容易にす る請求項１０９記載の方法。 １１３．第１素子の電位とともに、第１素子と第２素子の間のイオンを加速する ための電場を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかける ステップをさらに含む請求項１０９記載の方法。 １１４．試料が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド、及びその合成変種からな る群から選択された生物学的に関心のある少なくとも１化合物からなる請求項１ ０９記載の方法。 １１５．試料が、ペプチド、蛋白質、ＰＮＡ、炭水化物、糖結合物及び糖蛋白質 からなる群から選択される少なくとも１生体分子からなる請求項１０９記載の方 法。