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Die
Erfindung betrifft Betrieb und Ausführungsform eines Flugzeitmassenspektrometers
für die
Aufnahme von Primär-
oder Tochterionenspektren hoher Massengenauigkeit mit Ionisierung
durch Laserdesorption, insbesondere durch matrixunterstützte Laserdesorption
(MALDI), mit Verbesserung des Auflösungsvermögens durch verzögertes Einschalten
der Ionenbeschleunigung, gegebenenfalls mit Erzeugung der Tochterionen
durch Zerfall nach Verlassen der Ionenquelle (Post Source Decay; PSD)
oder durch Stoßfragmentierung
(Collisionally Induced Decomposition; CID), mit Auswahl der Eltern-
und Tochterionen durch einen Elternionenselektor und mit Nachbeschleunigung
der Ionen vor Erreichen des Reflektors.
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Die
Erfindung besteht darin, zur Vermeidung von Einstellzeiten von elektrischen
und thermischen Gleichgewichten alle im Massenspektrometer – in der
Ionenquelle und gegebenenfalls im Elternionenselektor und in der
Nachbeschleunigungseinheit – verwendeten
periodischen Potentialfolgen dauernd mit einer festen Basisfrequenz
laufen zu lassen, unabhängig
davon, ob in der betreffenden Periode ein Spektrum genommen wird
oder nicht, wobei das Problem des Zündverzugs des Lasers durch
Umschalten des Taktgebers gelöst
wird. Außerdem
sind die Potentialfolgen – wiederum
zur Vermeidung von Einstellzeiten – so zu gestalten, dass ihre
Spannungen und Verzögerungszeiten
völlig
unabhängig
von der Masse der Elternionen werden, was durch eine zeitliche Formung
des verzögerten
Abzugspulses für
die Beschleunigung sder Ionen erreicht werden kann.
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In
der Biochemie ist es oft nicht nur aus Gründen der Zeit- und Kostenersparnis
wünschenswert,
einen hohen Durchsatz an Analysen zu erzielen; in manchen Anwendungsgebieten
erzwingt auch die Labilität
der Proben eine schnelle Abfolge analytischer Vorgänge. Steht
bei der kombinatorischen Chemie der Zeitgewinn bei der Analyse von
Zehntausenden von Proben im Vordergrund, so ist bei der Proteomik
zu beachten, dass die Proteine eines Proteoms nach ihrer (beispielsweise
gelelektrophoretischen) Trennung, Aufreinigung und weiteren Probenvorbereitung
anfällig
werden für
oxidative, thermische oder andersartige Zersetzungen, da sie nicht mehr
im Verband mit anderen Proteinen und in biologischer Lösungsumgebung
vor diesen Zersetzungen geschützt
sind. So sind die Tausende von Proteinen eines Proteoms nach ihrer
Trennung in möglichst
24 Stunden, maximal 48 Stunden zu analysieren.
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Es
besteht also nicht nur Bedarf, sondern sogar Zwang für einen
hohen Probendurchsatz in der biochemischen Analytik.
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Für viele
biochemische Analysen, ganz vorzugsweise für Proteinanalysen, werden heute
Massenspektrometer eingesetzt. Im Vordergrund stehen hier Flugzeitmassenspektrometer
mit einer Ionisierung der Proben durch Laserdesorption. Heutige Massenspektrometer
dieser Art sind zwar mit Probeneinlasssystemen ausgestattet, die
auf Probenträgern
eine Vielzahl von Proben, beispielsweise 384, 764 oder sogar 1536
Proben, aufnehmen können, der
schnellen Analyse dieser Proben stehen aber noch verschiedenartige
Probleme gegenüber,
die einen hohen Durchsatz an Analysen verhindern. Unter diesen Problemen
befinden sich sowohl technische Probleme der beteiligten Massenspektrometer
und der benutzten Verfahren wie auch Probleme mit der reproduzierbaren
Präparation
der Proben für
ihre Ionisierung.
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In
der Proteomforschung kommt es vordringlich darauf an, die einzelnen
Proteine möglichst schnell
zu identifizieren, dann aber auch Differenzen zu schon bekannten
Proteinen herauszuarbeiten. Die Identifizierung wird gewöhnlich durch
die Messnug der präzisen
Massen der durch einen enzymatischen (vorzugsweise tryptischen)
Verdau entstehenden Peptide erreicht, wobei das Gemisch der Verdaupeptide
einer MALDI-Analyse unterworfen wird und ein so genanntes "Fingerprintspektrum" ergibt. Die Liste der
so gemessenen präzisen
Massen wird dann mit Hilfe von speziellen Suchalgorithmen mit einer
Proteinsequenzdatenbank verglichen, wodurch häufig bereits eindeutige Identifizierungen
erhalten werden. Ergeben sich dann noch Ungewissheiten durch Mehrdeutigkeiten
oder nicht genau zugeordnete Massen, so folgt eine Untersuchung
der in Frage stehenden Peptide durch eine Tochterionenanalyse, die in
der Regel zu eindeutigen Antworten führen.
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Die
hier meist eingesetzte Art der Flugzeitmassenspektrometrie besteht
darin, Ionen einer Analytsubstanz in einer Ionenquelle in Form eines
kurzen Laserpulses zu erzeugen, sie in einer Beschleunigungsstrecke
zwischen Ionenquelle und Grundelektrode auf eine hohe Energie zu
beschleunigen, durch eine feldfreie Flugstrecke fliegen zu lassen
und zeitaufgelöst
mit einem Ionendetektor zu messen. Aus der so gemessenen Flugzeit
der Ionen kann wegen gleicher Energie aller Ionen die Masse m der
Ionen, genauer ihr Masse-zu-Ladungs-Verhältnis m/z, bestimmt werden.
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Anmerkung:
Im Folgenden wird der Einfachheit halber immer nur von der Masse
m gesprochen, auch wenn es sich in der Massenspektrometrie immer
nur um die Messung des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses
m/z handelt, wobei z die Anzahl der Elementarladungen ist, die das
Ion trägt.
Da viele Ionisierungsarten, wie zum Beispiel die hier vorzugsweise
benutzte matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI), ganz überwiegend
nur einfach geladene Ionen liefern (z = 1), fällt für diese der Unterschied praktisch
fort.
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Da
in einem einzigen MALDI-Prozess nur relativ wenige Ionen erzeugt
werden, erfordert es die massenspektrometrische MALDI-Analyse einer
Probe, etwa 50 bis 200 Einzelspektren zu addieren, um ein gut auswertbares
Summenspektrum zu erhalten. Es sind also durch 50 bis 200 Laserschüsse jedes Mal
Ionen zu erzeugen, die jeweils unabhängig als Einzelspektrum gemessen
und zum Summenspektrum addiert werden. Die oben erwähnten Probleme bestehen
nun im Wesentlichen in drei Bereichen:
- 1) Die
unten geschilderten komplizierten Potentialverläufe, die sich im Takt mit den
Laserschüssen wiederholen
müssen,
können
bisher nicht einfach für
die Aufnahme der Spektren ein- und für die Vorbereitung zur nächsten Probenanalyse
ausgeschaltet werden, ohne dass sich dabei eingestellte Gleichgewichte
elektrischer oder thermischer Art verändern. Die Gleichgewichte allein
garantieren aber eine vollkommene Reproduzierung aller Potentialverläufe, und
diese wiederum sind für
die Qualität
der Spektren ausschlaggebend.
- 2) Es ist bisher für
die Aufnahme von Tochterionenspektren notwendig, die Ionenquellenpotentiale
von Probe zu Probe, ja sogar für
die mehreren Tochterionenspektren aus verschiedenen Elternionen
einer Probe, jeweils neu einzustellen, um eine optimale Massenauflösung der
Elternionenselektion zu erreichen. Auch diese Justierung stört jedes
Mal das eingestellte Gleichgewicht der Elektronik.
- 3) Es muss erreicht werden, dass die Präparation der Proben auf den
Probenträgern
so gleichmäßig und
durch die Probe hindurch so homogen wird, dass die Vorgänge der
quasi-explosiven Verdampfung und Ionisierung der Probe durch den Laserschuss
völlig
reproduzierbar werden, dass also die 50 bis 200 Einzelspektren alle
die gleiche Qualität
haben und es keine Verschiebungen der Flugzeiten gibt.
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Zur
Lösung
des ersten Problembereichs liegt es nahe, die Wiederholung der Potentialverläufe mit einem
Grundtakt immer weiter laufen zu lassen. Der Potentialverlauf in
der Ionenquelle (und alle anderen Potentialverläufe) werden aber durch den
Laserschuss selbst getriggert, um die an sich dramatische Auswirkung
des leicht unregelmäßigen Zündverzugs des
Lasers auf die Spektren auszuschalten. Andererseits ist es auch
nicht zweckmäßig, den
Laser einfach in einer hohen Taktrate dauernd laufen zu lassen,
nur, um die Elektronik im Gleichgewicht zu halten. Nicht nur, dass
die Proben auf dem Probenträger Schaden
nehmen können,
auch der Laser hat nur eine begrenzte Lebensdauer, die durch einen
solchen Dauerbetrieb herabgesetzt wird und mit der gerade bei Hochdurchsatzverfahren
zu geizen ist.
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Die
durch Laserdesorption erzeugten Ionen besitzen häufig Anfangsgeschwindigkeiten,
die nicht für
alle Ionen gleich sind. Daher hat sich für ein hohes Massenauflösungsvermögen ein
geschwindigkeitsfokussierendes Verfahren mit einem Ionenreflektor nach
Mamyrin durchgesetzt, dem eine zweite feldfreie Flugstrecke folgt.
In der Regel ist der Ionenreflektor zweistufig. In der ersten Stufe
werden die Ionen stark abgebremst, in der zweiten nur schwach. In das
lineare, relativ schwache Bremsfeld der zweiten Stufe des Reflektors
dringen schnellere Ionen weiter ein als langsamere und legen daher
einen längeren Weg
zurück,
der bei richtigem Ver hältnis
der beiden Bremsfelder zueinander die schnellere Fluggeschwindigkeit
genau kompensieren und somit das Massenauflösungsvermögen erhöhen kann.
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Eine
der meist verwendeten Ionenquellen benutzt die matrixunterstützte Laserdesorption
zur Ionisierung (MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization).
Die Analytmoleküle
befinden sich in einer Matrixsubstanz eingebettet auf einer Probenträgerplatte.
Die durch einen Laserlichtpuls von 1 bis 5 Nanosekunden Dauer erzeugte
Wolke aus Matrix- und Analytmolekülen breitet sich adiabatisch
in das umgebende Vakuum aus; die Moleküle in der Wolke erlangen dabei
eine größere Streuung
der Geschwindigkeiten. In der Wolke werden laufend Analytmoleküle durch
Ionen des Matrixmaterials durch Protonenübertragung ionisiert, die Analytionen besitzen
daher nicht nur eine Streuung der Geschwindigkeiten, sondern auch
eine Streuung ihrer Entstehungszeiten.
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Diese
gleichzeitig vorliegende Streuung der Geschwindigkeiten und Entstehungszeiten
kann von einem Reflektor nicht fokussiert werden. Daher hat sich
für MALDI
eine weitere Methode zur Verbesserung der Massenauflösung durchgesetzt,
die in einer verzögert
einsetzenden Beschleunigung besteht. Das Grundprinzip für diese
Erhöhung
des Massenauflösungsvermögens unter
Bedingungen der reinen Energiestreuung der Ionen ist schon seit über 40 Jahren
bekannt. Die Methode ist in der Arbeit W. C. Wiley and I. H. McLaren, "Time-of-Flight Mass
Spectrometer with Improved Resolution", Rev. Scient. Instr. 26, 1150, 1955
veröffentlicht
worden. Es handelt sich um eine Methode, die von ihren Autoren "time lag focusing" (TLF) genannt wurde.
Sie wird in jüngster
Zeit unter verschiedenen Namen, beispielsweise "space-velocity correlation focusing" (SVCF;
US 5,510,613 A ; Reilly, Colby
und King) oder "delayed extraction" (
US 5,625,184 A , Vestal und
Juhasz) auf die MALDI-Ionisierung angewandt und auch in kommerziell
erhältlichen
Flugzeitmassenspektrometern angeboten.
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Das
Grundprinzip dieser Methode ist einfach: Die Moleküle und Ionen
der Wolke werden zunächst
für eine
kurze Zeit in einem feldfreien Raum ohne jede elektrische Beschleunigung
fliegen gelassen. Die schnelleren Moleküle und Ionen entfernen sich
dabei weiter von der Probenträger-Elektrode
als die langsamen, aus der Geschwindigkeitsverteilung der Moleküle und Ionen
ergibt sich dabei eine Ortsverteilung. In dieser Zeit wird auch
die Ionisierung durch Protonierung abgeschlossen; auch die später aus
den Molekülen
entstandenen Ionen besitzen eine strenge Korrelation aus Geschwindigkeit
und Ort. Erst dann wird die Beschleunigung der Ionen durch ein homogenes
Beschleunigungsfeld mit linear abfallendem Beschleunigungspotential
eingeschaltet. Die schnelleren Ionen befinden sich dann weiter von
der Probenträger-Elektrode
entfernt, somit auf einem etwas geringeren Beschleunigungspotential, das
ihnen eine etwas geringere Endgeschwindigkeit für die Driftstrecke des Flugzeitspektrometers
vermittelt als den zu Beginn langsameren Ionen. Bei richtiger Wahl
der Verzögerungszeit
("time lag" oder "time delay") und des Potentialabfalls
(also der Stärke
des Beschleunigungsfeldes) können
die zu Beginn langsameren, aber nach Beschleunigung schnelleren
Ionen die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleunigung langsameren
Ionen an einem einstellbaren Ort, dem Zeitfokus, wieder einholen.
Es werden somit Zonen in diesem Zeitfokus in bezug auf die Masse dispergiert,
aber bei gleicher Masse in bezug auf die Flugzeit recht exakt fokussiert.
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Die
Potentiale der Ionenquelle müssen
nach Abzug aller Ionen wieder auf die Potentiale zurückgestzt
werden, die bei der Ionisierung durch den Laserschuss herrschen
müssen.
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Für ein lineares
Flugzeitmassenspektrometer ohne Reflektor wird der Zeitfokus durch
Wahl der Verzögerungszeit
und des Potentialabfalls an die Stelle des Detektors gelegt. Damit
erreicht man eine hohe Massenauflösung in einem linearen Flugzeitmassenspektrometer.
Leider ist der Zeitfokus leicht massenabhängig, so dass die maximale
Auflösung nur
für einen
Teilbereich des Spektrums erreicht werden kann und im übrigen Teil
des Spektrum merklich schlechter ist.
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Im
Patent
DE 196 38 577
C1 (Franzen) ist ein Verfahren bekannt geworden, wie man
die Massenabhängigkeit
der Zeitfokussierung am Ort des Detektors eines linearen Massenspektrometers durch
eine zeitliche Veränderung
des Beschleunigungsfeldes nach Einschalten der Beschleunigung weitgehend
beseitigen kann, so dass man Spektren guten Massenauflösungsvermögens über den
ganzen Massenbereich hinweg erhält.
Das Beschleunigungsfeld ist nach dem Einschalten des Abzugspulses
nach einer stetigen Funktion zu einem Grenzwert hin zu erhöhen. Dieses
Verfahren werde hier als Verfahren "mit zeitgeformtem Abzugspuls" oder auch als "Pulsform-Fokussierung" bezeichnet.
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Für ein Flugzeitmassenspektrometer
mit Reflektor legt man den Zeitfokus der verzögert einschaltenden Beschleunigung
(ohne Anwendung der Pulsform-Fokussierung) zwischen Ionenquelle
und Reflektor (
US 5,654,545
A , Holle, Köster
und Franzen), den geschwindigkeitsfokussierenden Reflektor stellt man
sodann so ein, dass er die Ionen gleicher Massen, die diesen Zeitfokus
gleichzeitig, aber mit leicht verschiedenen Geschwindigkeiten verlassen,
wieder in Bezug auf die Geschwindigkeiten auf den Detektor zeitfokussiert.
Die Fokuslänge
des Reflektors für
Ionen verschiedener Geschwindigkeiten ist wiederum leicht von der
Masse der Ionen abhängig.
Mit dem oben erwähnten
Verfahren der "Pulsform-Fokussierung" kann man auch hier
erreichen, dass das Massenspektrum eine gleichmäßige Schärfe über den ganzen Massenbereich
besitzt. Dabei liegt der zwischen Ionenquelle und Reflektor liegende
Zwischenzeitfokus allerdings nicht für Ionen aller Massen an der
gleichen Stelle.
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Der
Reflektor des Flugzeitmassenspektrometers wird auch zur Untersuchung
von Tochterionen (auch "Fragmentionen" genannt) verwendet,
die durch metastabile oder stoßinduzierte
Zerfälle
von Ionen einer bestimmten Ausgangssorte erzeugt werden. Diese Ausgangssorte
wird häufig "Mutterionen" oder "Elternionen" genannt (englisch: "parent ions" oder auch "precursor ions"). Anmerkung: Im
Weiteren wird die Aufnahme der Massenspektren von unzerfallenen
Ionen des MALDI-Prozesses als Aufnahme der "Primärspektren" bezeichnet, im gegensatz zu
den Fragment- oder Tochterionenspektren. Die Primärspektren
enthalten somit die Signale aller Elternionen, von denen jeweils
Tochterionenspektren generiert werden können.
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Im
MALDI-Prozess der Ionisierung unterliegen die Ionen in der durch
den Laserpuls erzeugten Dampfwolke sehr vielen Stößen, die
die innere Energie der Ionen durch vielfache, aber milde Anregung von
Schwingungen erhöht.
Abhängig
von der Energiedichte im Fokus des Laserschusses, werden eine kleinere
oder größere Anzahl
dieser Ionen "metastabil", das heißt, diese
Ionen zerfallen mit einer Halbwertszeit in der Größenordnung
von einigen Mikrosekunden, so dass ein Nachweis der Fragmentionen
im Massenspektrometer möglich
wird. Ein Nachweis solcher Fragmentionen, die in der ersten feldfreien Flugstrecke
des Massenspektrometers entstehen, durch den Reflektor eines Flugzeitspektrometers
ist als PSD-Methode bekannt geworden (PSD = Post Source Decay).
Es können
die Mutterionen aber auch eine mit Stoßgas gefüllte Zelle im feldfreien Raum
durchlaufen und so stoßinduzierte
Fragmentionen bilden, die in gleicher Weise nachgewiesen werden
können
(CID = Collisionally Induced Decomposition).
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Werden
Fragmentionen durch einen Zerfall der Mutterionen nach der Beschleunigung
erzeugt, so fliegen alle Fragmentionen weiterhin mit der gleichen
Geschwindigkeit ν wie
ihre Mutterionen, haben aber durch ihre geringere Masse eine kleinere
kinetische Energie Ek = mv2/2.
Sie dringen daher in das zweite Bremsfeld des Reflektors entsprechend
ihrer geringeren kinetischen Energie weniger weit ein, kehren daher
früher
zurück
und können
am Ende der zweiten feldfreien Flugstrecke getrennt nach Masse gemessen
werden.
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Ein
zweistufiger Ionenreflektor kann aber immer nur einen eingeschränkten Teil
des gesamten Tochterionenspektrums messen. So ist es für einen sonst
sehr günstigen,
energie- und raumwinkelfokussierenden, gitterfreien Reflektor notwendig,
das Tochterionenspektrum in beispielsweise 14 nacheinander aufgenommenen
Spektrensegmenten zu messen und die Spektrensegmente dann aneinanderzustückeln. Das
erhöht
Probenverbrauch und Spektrenaufnahmezeit in unzumutbarerer Weise.
Eine Lösung
ist in Offenlegungsschrift
DE
198 56 014 A1 (Holle, Köster
und Franzen) durch eine Nachbeschleunigung der Ionen durch ein plötzliches
Anheben des Potentials der Ionen während ihres Fluges durch eine
kleine Potentialzelle angegeben (Verfahren der Tochterionenspektrenaufnahme
mit "Potentialfahrstuhl" oder "Potentiallift").
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Um
das Spektrum dieser Fragmentionen einer Ionensorte nicht durch andere
Ionensorten und deren Zerfallsprodukte zu überlagern, ist es notwendig,
die anderen Ionensorten auszublenden. Dazu benutzt man einen elektrischen
Ablenkkondensator zwischen Ionenquelle und Reflektor, zwischen dessen
Platten der Ionenstrahl hindurchfliegt. Durch eine Spannung an den
Kondensatorplatten wird ein Ablenkfeld erzeugt, das unerwünschte Ionen
seitlich ablenkt und so davon abhält, den Ionendetektor zu erreichen.
Für den
Durchlass der erwünschten
Ionen wird die Spannung des Kondensators kurzzeitig weggenommen,
so dass diese Ionen unabgelenkt passieren können. Nach Passieren der Ionen
wird die Spannung wieder eingeschaltet, weitere Ionen können nicht
mehr den Detektor erreichen. Die Massenauflösung einer solchen Einrichtung
liegt bei etwa R = 60 bis 80, das heißt, für Ionen der Masse von etwa 1000
atomaren Masseneinheiten ist das Durchlassfenster etwa 12 bis 15
Masseneinheiten breit.
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Eine
starke Verbesserung des Auflösungsvermögens kann
durch bipolares Schalten erreicht werden, indem eine positive Ablenkspannung
zunächst
für den
Durchflug der zu selektierenden Elternionen auf Null und dann auf
negative Werte geschaltet wird. Das so erreichbare Auflösungsvermögen liegt
(in Verbindung mit günstigen
Ausführungsformen
des Kondensators) bei R = 200 bis 1000, ausreichend für fast alle
Anwendungsfälle.
Die Versorgungseinheit für
das Ablenkfeld muss es daher erlauben, das Ablenkfeld von einer
Richtung innerhalb sehr kurzer Zeit (einigen Nanosekunden) abzuschalten
und nach einem vorgeben kurzen Schaltzeitintervall (einige Zehn
Nanosekunden) in entgegengesetzter Ablenkrichtung wieder einzuschalten.
Zwischen den Spektrenaufnahmen muss die Spannung wieder zurückgeschaltet
werden, um für
jede Spektrenaufnahme gleiche Verhältnisse zu haben.
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Für ein hohes
Massenauflösungsvermögen des
Selektors ist es notwendig, den Zeitfokus der verzögert einschaltenden
Beschleunigung genau in den Selektor zu legen. Da der Zeitfokuspunkt
massenabhängig
ist, muss man die Parameter der verzögert einschaltenden Beschleunigung,
also die Verzögerungszeit
und vor allem die Beschleunigungsfeldstärke, je nach Masse der auszuwählenden
Ionen umstellen, um eine optimale Auflösung des Elternionenselektors
zu bekommen. Dieses ist das zweite der oben kurz vorweg geschilderten
Probleme, die noch gelöst
werden müssen.
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Die
Ionen können
durch den Ionenselektor in der ersten feldfreien Flugstrecke vor
oder auch nach ihrem Zerfall selektiert werden. Die Ionen ändern bei einem
Zerfall ihre Geschwindigkeit nicht (oder nur unbedeutend), so dass
die Mutterionen zusammen mit ihren Tochterionen gleicher Geschwindigkeit
gemeinsam selektiert werden.
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Besondere
Anwendung findet die Aufnahme von Tochterionenspektren in der Proteomik,
bei der zunächst
so genannte Fingerprintspektren von Peptidgemischen aufgenommen
werden, wobei die Peptidgemische jeweils durch enzymatischen Verdau
eines Proteins unter Untersuchung gewonnen werden, und dann bei
Bedarf und zur Bestätigung
Tochterionenspektren von ausgewählten
Verdaupeptiden gemessen werden. Die Verdaupeptide besipielsweise aus
tryptischem Verdau haben Längen
von etwa 500 bis 4000 atomaren Masseneinheiten.
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Wie
oben geschildert, ist es für
die Güte
des Elternionenselektors (englisch: precursor ion selector) ganz
wesentlich, den Fokus der verzögert
einsetzenden Beschleunigung genau in den Elternionenselektor zu
legen. Da aber die Methode der verzögert einsetzenden Beschleunigung
eine massenabhängige
Fokuslänge
besitzt, müssen
die Einstellparameter der verzögert
einsetzenden Beschleunigung, also die Verzögerungszeit und die Beschleunigungsfeldstärke, so
eingestellt werden, dass der Zeitfokus für die zu selektierende Ionenmasse
(von beispielsweise 500 bis 4000 atomaren Masseneinheiten) immer
genau im Elternionenselektor liegt. Diese Veränderungen der Ionenquellenpotentiale
und Schaltzeiten führt
aber wieder zu Driften aller Potentiale, die bis zum Einstellen
eines neuen Gleichgewichts abgewartet werden müssen, was einem hohen Probendurchsatz
hinderlich ist.
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Ein
modernes Flugzeitmassenspektrometer hat also – wie leicht ersichtlich – eine recht
komplizierte Elektronik, die viele im Takt durch den Laser getriggerte
Spannungsabläufe
und entsprechende Rücksetzungen
liefern muss. In der Ionenquelle haben wir den zeitgeformten Abzugspuls
nach einer Verzögerungszeit
gegenüber
dem Laserlichtblitz, und das Rücksetzen
der Spannungen neben einer kontinuierlich anliegenden Gesamtbeschleunigungsspannung.
Im Ionenselektor haben wir ein zeitlich äußerst präzise gesteuertes bipolares
Schalten und Rücksetzen.
In der Nachbeschleunigungseinheit ist wiederum ein präzise verzögertes Potentialschalten und
ein zeitgeformter Abzugspuls nebst Rückschalten zu managen. Die
Genauigkeitanforderungen an die Schaltzeiten sind sehr streng, sie
liegen bei Bruchteilen von Nanosekunden. Die Anforderungen an die
Reproduzierbarkeit der Spannungen sind ebenfall sehr hoch, sie liegen
für kritische
Spannungen bei Bruchteilen eines Volts. Nach bisheriger Betriebsweise
kommt erschwerend hinzu, dass die Potentiale der Ionenquelle in
Abhängigkeit
von der Elternionenmasse von Probe zu Probe umjustiert werden müssen.
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Die
Flugzeiten der Ionen müssen
auf Bruchteile einer Nanosekunde genau ermittelt werden können. Diese
Anforderung stellt extrem hohe Ansprüche an die Konstanz aller Zeitverzögerungen,
Beschleungungsspannungen und deren Pulsformen. Es ist bekannt, dass
die thermischen Verhältnisse
sowohl auf die Zeiten wie auch auf die Spannungen von Spannungsverläufe durchschlagen.
Aber auch elektretische Effekte in Kondensatoren (durch sich erholende
Restspannungen bewirkt) stören
die Reproduzierbarkeit von elektrischen Abläufen, so lange diese nicht
in recht genau gleichen Abständen
wiederholt ablaufen.
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Der
dritte Problemkreis betrifft die homoge und reproduzierbare Präparation
der Proben für
die MALDI-Ionisierung. Moderne Verfahren der MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie
haben inhomogene Proben in Kauf genommen und die dadurch gegebenen
Probleme dadurch zu lösen
versucht, dass jedes Einzelmassenspektrum aus dem Transientenrekorder
ausgelesen, auf seine Güte
hin überprüft, und
nur bei akzeptabler Güte
zum Summenspektrum hinzuaddiert wurde. Gleichzeitig wurden die Daten
der Spektren mit mangelnder Güte
zu einem Rücksteuern
des MALDI-Prozesses verwendet. Das Rücksteuern betraf dabei sowohl
die Laserenergiedichte wie auch die Auswahl der Stelle auf der Probe,
die durch den Laserfokus verdampft wurde. Die Präparationen wiesen so genannte "hot Spots" auf, die besonders
günstig
für die
Spektrenaufnahme waren. Der Aufnahmetakt für die Einzelspektren war dabei auf
etwa 3 Hertz beschränkt.
Für zukünftige Verfahren
mit hohem Probendurchsatz ist ein solches Vorgehen nicht tragbar.
Rücksteuerungen
dürfen
nur in Ausnahmefällen
zugelassen werden.
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Eine
Lösung
dieser Probleme ist aber auch in Sicht. Durch das Patent
DE 197 54 978 C2 (Schürenberg
und Franzen) ist eine Präparationsmethode bekannt
geworden, die auf besonderen Probenträgern mit hydrophilen Ankern
in hydrophober Umgebung eine genaue Lokalisation und eine zugeschneiderte
Form der Proben mit feiner, homogener Kristallstruktur erzielt.
In Verbindung mit automatischem Probentröpfchenauftrag durch Pipettierroboter
gelingt es, recht homogene Probenpräparationen zu erhalten, dabei
ist eine extrem genaue Einhaltung von Re zepturen erforderlich. Eine
solche Probenpräparation
ist Grundlage für
eine Spektrennehme mit hohem Probendurchsatz.
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, einen möglichst hohen Durchsatz von
Primärionen-
und Tochterionenspektrenmessungen mit jeweils gleich hoher, sehr
guter Qualität
zu erzielen.
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Für dieses
Ziel ist jede Störung
der elektrischen oder thermischen Einstellgleichgewichte der elektronischen
Versorgungseinheiten zu vermeiden, gleich ob die Störungen durch
Pausen im Ablauftakt oder durch notwendige Spannungsjustierungen
bedingt sind.
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Es
werde vorausgesetzt, dass die Qualitätsprobleme der Spektren durch
inhomogene Probenpräparationen
anderweitig gelöst
werden können.
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Beschreibung
der Erfindung
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Eine
erste Grundidee der Erfindung besteht darin, den Potentialverlauf
an den Beschleunigungselektroden der Ionenquelle, also den zeitverzögerten Abzugspuls
mit seiner Zeitformung, gesteuert durch einen Taktgeber mit einer
festen Basisfrequenz dauernd periodisch ablaufen zu lassen, unabhängig von jeder
Spektrenaufnahme, und zwar so, dass der Taktgeber im Fall ohne Spektrenaufnahme
den Potentialverlauf direkt triggert, im Falle einer Spektrenaufnahme
aber den Laser triggert, dessen Lichtblitz dann seinerseits wiederum
zum Triggern des Potentialablaufs benutzt wird. Auf diese Weise
ist es möglich, ohne
Verlust des Einstellgleichgewichts Pausen zu überbrücken, zum Beispiel solche Pausen,
die durch das Bewegen des Probenträgers entstehen, um eine neuen
Probe in den Laserfokus hineinzufahren. Es hat sich dabei herausgestellt,
dass die durch den Jitter des Lasers erzeugten winzigen unregelmäßigen Phasenunterschiede
von einigen Zehn Nanosekunden im periodischen Ablauf der Potentialfolgen,
ja sogar längere
Zeitverzüge
von einigen Mikrosekunden, vernachlässigt werden können, weil
sie ohne Einfluss auf das eingestellte Gleichgewicht sind.
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Der
Taktgeber wird dazu beispielsweise auf eine Frequenz eingestellt,
die der schnellsten Schussfrequenz des Lasers entspricht, kann aber auch
auf ein mehrfaches dieser Frequenz eingestellt werden. Für die meisten
MALDI-Verfahren sind etwa 20 Hertz die obere Grenze für die Schussfolge,
da sonst die Proben überhitzt
werden. Das Verfahren ist aber auch für wesentlich schnellere Schussfolgen einsetzbar,
wenn diese nutzbringend eingesetzt werden können.
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Es
ist durch diese Erfindung auch möglich, die
Spektrenaufnahmefrequenz von der Basisfrequenz zu entkoppeln, indem
nicht in jeder elektrischen Periode eine Spektrenaufnahme stattfindet. Beträgt die Basisfrequenz
beispielsweise 20 Hertz, so kann die Frequenz der Spektrenaufnahmen
auf beispielsweise 10 oder 5 Hertz herabgesetzt werden, indem nur
jede zweite oder vierte Periode der Basisfrequenz benutzt wird,
falls die Probe oder der Messverlauf ein solches Vorgehen erfordern.
Bei einer Basisfrequenz, die einem mehrfachen der schnellsten Laserschussfrequenz
entspricht, können
auch Zwischenabstufungen, die nicht sofort einer Her abstufung um
einen Faktor 2 entsprechen, eingestellt werden. Auch unregelmäßige Auswahlen
der elektrischen Perioden für
die Spektrenaufnahmen sind möglich.
Es können
auch einzelne oder mehrere Perioden ausgelassen werden, wenn das
für ein
Abholen von Spektren aus dem Transientenrekorder oder für das Berechnen
von Rücksteuerungsmaßnahmen notwendig
ist.
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Schädliche Spannungsjustierungen
während der
Aufnahme von Primärspektren
können
durch die Pulsform-Fokussierung nach
DE 196 38 577 C1 vermieden werden, mit dem
die simultane Zeitfokussierung aller Ionenmassen auf den Detektor
und damit ein gleichmäßig gutes
Massenauflösungsvermögen über das
ganze Spektrum hinweg erzielt wird. Dadurch kann jede probenabhängige Justierung
von Spannungen in der Ionenquelle vermieden werden. Das Verfahren
der Pulsform-Fokussierung ist damit unabdingbare Voraussetzung für einen
hohen Spektrendurchsatz. Es hat sich herausgestellt, dass in vielen
Fällen
dazu eine relativ einfache Exponentialfunktion ausreicht (speziell
bei Benutzung einer Mittelelktrode wie in
1), bei der die Spannung des Abzugspulses
exponentiell in eine Grenzspannung einläuft. Ein solcher Spannungsverlauf
kann mit einem einfachen R-C-Glied erreicht werden.
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Im
Sinne eines hohen Durchsatzes an Spektrenmessungen ist es weiterhin
zweckmäßig, zunächst die
Primärspektren
einer großen
Anzahl von Proben, vorzugsweise aller Proben, auf einer Probenplatte
zu messen, dann eine Umstellung auf die Messung der Tochterionenspektren
vorzunehmen, und dann, soweit analytisch erforderlich, die Tochterionenspektren
dieser Proben zu messen. Um diese Verfahrensweise durchführen zu
können,
sind die Primärspektren
direkt nach ihrer Aufnahme (in so genannter Echtzeit) einem Expertensystem
zuzuführen, das
die Notwendigkeit von Tochterionenspektren ermittelt und die zugehörigen Elternmassen
für die Tochterionenspektren
berechnet. Die Notwendigkeit wird dabei anhand der analytischen
Aufgabe definiert.
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Die
Tochterionenspektren werden unter Herabsetzung der Beschleunigung
in der Ionenquelle mit Hilfe eines Elternionenselektors und einer
Nachbeschleunigungseinheit gemessen, die beide zwischen der Ionenquelle
und dem Reflektor angebracht sind. Sie können für die Aufnahme der Primärspektren
aus dem Strahlengang der Ionen ausgefahren werden.
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Für die Messung
der Tochterionenspektren ergibt sich die bisher nicht gelöste Aufgabe,
die Justierungen der Ionenquellenspannungen von Spektrum zu Spektrum
zu vermeiden. Diese werden dadurch erzwungen, dass die Tochterionen
von immer wieder anderen Elternionen gemessen werden, deren Zeitfokus
jeweils in den Elternionenselektor gelegt werden muss.
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Es
ist daher eine weitere Grundidee der Erfindung, durch eine neue
Betriebsart der "Pulsform-Fokussierung", die bisher immer
auf eine gleichmäßige Auflösung im
gesamten Spektrum ausgerichtet war, den Zeitfokusort im Elternionenselektor massenunabhängig zu
machen. Dadurch wird es möglich,
den Potentialverlauf des verzögert
einschaltenden, zeitgeformten Abzugspulses der Ionenquelle auch
für die
Tochterionenspektren von Spektrum zu Spektrum ohne jede zusätzliche
Justierung genau gleich ablaufen zu lassen, völlig unabhängig von der zu selektie renden
Masse der Elternionen. Dazu muss der Abzugspuls einen zeitlich ansteigenden Potentialverlauf
bekommen, der experimentell so zu ermitteln ist, dass die Massenunabhängigkeit
der Fokuslage im Elternionenselektor erreicht wird. Auch hier hat
sich herausgestellt, dass dazu eine relativ einfache Exponentialfunktion
ausreicht, bei der die Spannung des Abzugspulses exponentiell in
eine Grenzspannung einläuft.
Auch dieser Spannungsverlauf kann mit einem einfachen R-C-Glied
erreicht werden, dessen Zeitkonstante allerdings anders ist als
die für
die Aufnahme der Primärspektren.
Zwischen der Aufnahme der Primär-
und der Tochterionenspektren muss also zwischen den R-C-Gliedern umgeschaltet
werden.
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Die
leichte Abhängigkeit
der Fokuslänge
des Reflektors von der Masse der Ionen kann durch einen zeitgeformten
Abzugspuls der Nachbeschleunigungseinheit ausgeglichen werden, wie
grundsätzlich
in der Patentanmeldung
DE
100 34 074 A1 beschrieben. Auch hierdurch ergibt sich ein
konstant wiederholbarer Ablauf aller Potentialverläufe ohne die
Notwendigkeit einer Justierung zwischen den Spektrenaufnahmen.
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Auch
die Spannungsverläufe
am Elternionenselektor und an der Nachbeschleunigungseinheit (dem
Potentialfahrstuhl) werden mit der Basisfrequenz laufen gelassen.
Für die
Selektion der Massen ist die Laufzeit der Ionen von der Ionenquelle
bis zum Elternionenselektor maßgebend,
also der zeitliche Verzug der Durchlassperiode des Selektors gegen die
Startzeit der Ionen in der Ionenquelle. Diese Veränderung
der Verzögerung
der Durchlassperiode gegenüber
der Startzeit ist eine kleine, aber präzise Phasenverschiebung der
Potentialverläufe,
die ohne wesentliche Störung
des elektronischen Gleichgewichts vorgenommen werden kann. Die Phasenverschiebung
beträgt
nur wenige Mikrosekunden bei einer Basistaktrate von beispielsweise
50 Millisekunden; die Phasenverschiebung muss allerdings auf Nanosekunden
genau eingestellt werden können.
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Ähnliches
gilt für
die Nachbeschleunigungseinheit mit ihrem weit komplizierteren Potentialverlauf
auch hier wird nur eine geringe, aber präzise Phasenverschiebung vorgenommen.
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Der
Reflektor befindet sich stets auf konstantem Potential.
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Die
Fragmentierung der Elternionen muss aber nicht unbedingt durch die
Erzeugung von metastabilen Ionen durch den MALDI-Prozess selbst
initiiert werden. Es kann auch zwischen Ionenquelle und Elternionenslektor
oder zwischen Elternionenselektor und Nachbeschleunigungseinheit
eine mit Stoßgas
gefüllte
Stoßkammer
einegebaut werden, die über
Stoßfragmentierung
(CID = Collisionally Induced Decomposition) die Tochterionen erzeugt.
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Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt ein Beispiel eines
Flugzeitmassenspektrometers, eingerichtet für die Aufnahme von Primärspektren.
Der Übersichtlichkeit
halber ist der Laser für
die Desorption und Ionisierung der Proben weggelassen. Auf einer
Trägerplatte
(1) befindet sich eine große Anzahl von Proben. Die Trägerplatte
befindet sich auf einem konstanten Potential von 25 Kilovolt, dem
Beschleunigungspotential. Ein kurzzeitiger Laserpuls von etwa 3
Nanosekunden Dauer erzeugt eine Ionenwolke, die sich zu einer Mittelelektrode
(2) hin ausbreitet. Die Mittelelektrode (2) befindet
sich zunächst
auch auf dem Beschleunigungspotential. Nach einer Verzögerungszeit
gegenüber
dem Laserpuls wird nun das Potential der Mittelelektrode (2)
so geschaltet, dass die Ionen beschleunigt werden. Das Potential
der Mittelelektrode (2) ist aber nicht konstant, es wird
ein zeitlich geformter Abzugspuls so angelegt, dass der durch die
verzögerte
Beschleunigung erzeugte Zeitfokus unabhängig von der Masse der Ionen
auf dem Ionendetektor (10) liegt. Nach Passieren der Mittelelektrode
(2) wird die Beschleunigung der Ionen zur geerdeten Grundelektrode
(3) hin vollendet. Die beschleunigten Ionen fliegen nun
mit massenabhängigen
Geschwindigkeiten durch die erste Flugstrecke auf den Reflektor
zu, in dessen Bremsfeld (8) sie zunächst stark abgebremst werden.
Im homogenen Reflektorfeld (9) werden sie geschwindigkeitsfokussiert,
da die schnelleren Ionen (nicht sichtbar) ein wenig weiter eindringen,
so eine längere
Flugbahn haben, und die langsameren Ionen genau am Detektor (10)
wieder einholen.
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2 zeigt dasselbe Flugzeitmassenspektrometer,
nunmehr aber eingerichtet für
die Aufnahme von Tochterionenspektren ausgewählter Elternionen. Die Probenträgerplatte
(1) befindet sich nun auf einem viel niedrigeren Poential
von nur 5 Kilovolt. Auch hier bildet sich durch den Laserschuss
eine Ionenwolke, die sich im Raum zwischen Trägerplatte (1) und
Mittelelktrode (2) frei ausbreiten kann, weil sich die
Mittelelektrode (2) zunächst
auf dem gleichen Potential wie die Probenträgerplatte (1) befindet.
Nach einer Verzögerungszeit
findet auch hier ein Schalten des Potentials an der Mittelelktrode
(2) statt. Durch Verzögerungszeit
und Spannung wird dabei der Zeitfokus für Ionen einer Masse genau in
den Elternionenseparator (4) gelegt, und durch die Formgebung des
Abzugspulses wird dafürgesorgt,
dass dieser Fokuspunkt unabhängig
von der Masse an der gleichen Stelle liegt. Der Elternionenselektor
(4) ist zunächst so
geschaltet, dass alle Ionen seitlich abgelenkt werden und den Detektor
(10) nicht erreichen können. Nähern sich
aber nun die ausgewählten
Elternionen (zusammen mit den aus ihnen entstandenen Tochterionen,
die mit der gleichen Geschwindigkeit fliegen), so wird die Ablenkspannung
ausgeschaltet. Nach Durchflug der erwünschten Ionen wird die Ablenkspannung
in entgegengesetzter Richtung wieder eingeschaltet, dadurch werden
Ablenkungen im Streufeld beim Anflug hier wieder im Abflug kompensiert.
Die Elternionen und ihre Tochterionen treten dann in den Potentiallift
(5) ein. Sind sie eingetreten, so wird das Potential des
Lifts (5) und der Mittelektrode (6) um 20 Kilovolt
erhöht.
Die Ionen passieren nun den Potentiallift (5) und treten
in den Raum zwischen Lift (5) und der Mittelelktrode (6)
ein. Sodann wird die Mittelelektrode (6) mit einem Abzugspuls
geschaltet, der den Beginn der Beschleunigung einleitet und eine Zeitfokussierung
am Detektor (10) ergibt. Die weitere Beschleunigung findet
zwischen Mittelelektrode (6) und Grundelektrode (7)
statt. Eine Formgebung des Abzugspulses macht den Ort dieser Zeitfokussierung massenunabhängig. Der
Reflektor dient jetzt als Tochterionenanalysator, da die Tochterionen
eine massenproportional geringere Energie haben als ihre Eltern.
Es werden dabei alle Tochterionen von kleinsten Massen bis zur Masse
der Elternionen in einer einzigen Spektrenaufnahme gemessen.
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3 zeigt einen Ionenselektor,
der als Kondensatorgitter nach Bradbury-Nielsen ausgelegt ist.
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Besonders
bevorzugte Ausführungsformen
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Eine
besonders bevorzugte Ausführungsform
wird hier auf das besondere Anwendungsgebiet der Proteomik ausgerichtet,
ist aber für
den Fachmann leicht auf andere Anwendungsgebiete umsetzbar.
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Auf
eine Probenträgerplatte
in der Größe einer
Mikrotiterplatte mit beispielsweise 384 hydrophilen Probenstellen
in jeweils hydrophober Umgebung (
DE 197 54 978 C2 ; Schürenberg und Franzen) werden
zunächst
die Verdaupeptidgemische aus vielen Proteinen aufgebracht, jeweils
versehen mit einer präzise
abgemessenen Menge an sauberer Matrixsubstanz für die nachfolgende MALDI-Ionisierung. Die
Gemische wurden durch enzymatischen Verdau je eines Proteins gewonnen,
beispielsweise durch einen tryptischen Verdau. Die Proteine entstammen beispielsweise
einer 2D-gelelektrophoretischen Auftrennung eines Proteoms, also
aller Eiweiße
einer Zellgewebeart. Das gesteuerte Trocknen der aufpipettierten
Probentröpfchen
ergibt homogene Kristallgemische, die die Analytsubstanzen, also
jeweils alle Peptide der Verdaugemische, gleichmäßig verteilt enthalten.
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Die
Probenträgerplatte
wird in das Flugzeitmassenspektrometer eingebracht. Es werden nun zunächst die
Primärspektren
gemessen, hier die so genannten Fingerprintspektren der Proteine,
da sind die Spektren der Verdaugemische, die die Massen der einzelenen
Verdaupeptide zeigen.
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Dazu
wird in der ersten Beschleunigungsstrecke der Ionenquelle zwischen
der Probenträgerplatte
(1) und der Mittelelektrode (2) ein verzögerter, zeitgeformter
Abzugspuls so gewählt,
dass im Spektrum von leichten bis zu schweren Ionenmassen eine gleichmäßige, hohe
Schärfe
der Ionensignale mit gutem Massenauflösungsvermögen erhalten wird. Die Beschleunigung
der Ionen beträgt
hier für
gewöhnlich
20 bis 30 Kilovolt. Die gleichmäßige Schärfe erlaubt
eine gute Massenbestimmung für
alle Ionenmassen des Spektrums.
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Für die Pulsformung
mit einem zeitlichen Ansteigen der Beschleunigungsfeldstärke hat
sich eine Exponentialfunktion, die sich an einen Grenzwert anschleicht,
bestens bewährt.
Diese exponentielle Änderung
der Spannung zwischen Probenträgerplatte (
1)
und Mittelelektrode (
2) folgt der folgenden Funktion:
wobei die Beschleunigungsspannung
U
1 zur Zeit t = 0 einsetzt und sich mit
der Zeitkonstante t
1 dem Grenzwert V
1 annähert.
Eine solche Exponentialfunktion kann leicht durch eine elektrische
Kondensatorschaltung (ein so genanntes R-C-Glied) ohne komplizierte
weitere Steuerung hergestellt werden. Die Verzögerungszeit, das Grenzpotential
V
1 und Zeitkonstante t
1 werden
experimentell ermittelt.
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Es
ist dabei zu bemerken, dass durch den zeitgeformten Abzugspuls auch
die Beschleunigungsspannung zwischen Mittelelktrode (2)
und Grundelektrode (3) zeitlich verändert wird, erst das Zusammenwirken
beider Beschleunigungsstrecken mit ihren zeitabhängigen Beschleunigungen bewirkt die
Massenunabhängigkeit
der Fokuslänge.
Die Massenskala, die in einem einfachen Flugzeitmassenspektrometer
eine lineare Funktion der Masse vom Quadrat der Flugzeit sein sollte,
wird durch die Anfangsgeschwindigkeit der Ionen aus dem MALDI-Prozess
und durch diese Zeitformung des Abzugspulses leicht gekrümmt und
muss daher experimentell bestimmt werden. Diese experimentell aufgenommene
Kalibrierkurve wird für
die Berechnung der Massen aus den Flugzeiten verwendet.
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Bereits
für diese
Aufnahmen der Fingerprintspektren werden die Potentialverläufe in der
Ionenquelle in einem gleichmäßigen Basistakt
betrieben, unabhängig
davon, ob gerade ein Spektrum aufgenommen wird oder nicht. Dieser
Takt für
die Potentialperioden wird beipielsweise auch beibehalten, wenn die
Probenträgerplatte
verfahren wird, um eine andere Probe in den Laserfokus zu bringen.
Ist die Probe im Laserfokus angekommen, so kann die Spektrenaufnahme
beginnen. Der Taktgeber, der die Potentialperiode triggerte, wird
nun auf das Triggern des Lasers umgeschaltet, der Laser zündet, erzeugt MALDI-Ionen
und triggert seinerseits nun den Potentialablauf in der Ionenquelle
und die Spektrenaufnahme mit einem addierenden Transientenrekorder.
Aufeinanderfolgende Perioden ergeben jeweils Einzelspektren, die
zu den vorhandenen Spektren synchron hinzuaddiert werden. Als Ergebnis
erhält
man ein Summenspektrum aus einer vorgewählten Anzahl von Einzelspektren,
beispielsweise 50 oder 100 Einzelspektren.
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Nach
Beendigung der Spektrenaufnahme für eine Probe, also der Aufnahme
und Summierung der beispielsweise 100 Einzelspektren, wird der Trigger wieder
auf den Taktgeber umgeschaltet, das Summenspektrum wird abgeholt
und seiner Verarbeitung zugeführt,
und die nächste
Probe wird in den Laserfokus gefahren.
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Das
Summenspektrum, das codiert in seinen Ionensignalen die Flugzeiten
(und Intensitäten)
der Ionen enthält,
wird währenddessen
durch Signalverarbeitung und durch Benutzung einer Kalibrierkurve in
eine Liste der Ionenmassen und Ionenintensitäten umgerechnet und einem Expertensystem
zugeführt, das
eine Identifizierung des Proteins anhand von Spektrendatenbanken
oder von Proteinsequenzdatenbanken übernimmt. Im Falle von nicht-eindeutigen Identifizierungen
oder von Unstimmigkeiten beliebiger Art, beispielsweise durch ein
Peptid, das nicht der erwarteten Masse entspricht, wird für diese
Probe die Aufnahme von Tochterionenspektren von einem oder mehreren
der Peptide vorgesehen, wobei das Expertensystem auch die Peptide
festlegt, von denen diese Tochterionenspektren genommen werden sollen.
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Sind
alle Proben der Probenträgerplatte
vermessen, so wird die Messung der Tochterionenspektren vorbereitet.
Die Fingerprintspektren der Verdaugemische wurden mit einer sehr
geringen Laserenergiedichte im Laserfokus gemessen, um möglichst wenig
Ionenfragmentierung zu erzeugen. Durch Rücknahme der Laserlichtabschwächung in
einem steuerbaren Abschwächer
wird jetzt die Energiedichte im Fokus erhöht, um für die Tochterionenspektren die
Zahl der metastabilen Ionenzerfälle
zu erhöhen. Die
hohe Beschleunigungsspannung in der Ionenquelle wird auf eine niedrige
Beschleunigungsspannung von etwa drei bis sechs Kilovolt zurückgefahren.
Dabei wird die Spannungsversorgung der Ionenquelle auf die neuen
Werte eines verzögerten,
zeitgeformten Abzugspulses umgestellt. Dabei kann kann beispielsweise
die Zeitkonstante der Exponentialfunktion durch Umschalten des R-C-Glieds
umgestellt werden.
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Zudem
werden der Elternionenselektor und die Nachbeschleunigungseinheit
in den Strahlengang der Ionen eingefahren. Da diese durch ihre Gitter
den Ionenstrahl leicht abschwächen,
waren sie aus dem Strahlengang für
die Aufnahme der Fingerprintspektren entfernt.
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Auch
die periodischen Potentialverläufe
am Ionenselektor und an der Nachbeschleunigungseinheit werden eingeschaltet.
Vor der Tochterionenspektrenaufnahme wird jetzt einige Minuten gewartet,
um alle elektronischen Versorgungseinheiten in ihr neues elektrisches
und thermisches Gleichgewicht zu bringen. Erst dann beginnt die
Tochterionenspektrenaufnahme der ersten Probe.
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Nach
jeder Tochterionenspektrenaufnahme wird zunächst vom Rechner bestimmt,
welche Elternionenmasse für
das nächste
Tochterspektrum gefordert ist. Über
Kalibrierkurven werden die dazu gehörigen Phasenverschiebungen
für die
Potentialabläufe
am Selektor und an der Nachbeschleunigungseinheit bestimmt und eingestellt.
Erst dann wird die Probe in den Laserfokus gefahren und die Spektrennahme
begonnen. So können
sich winzige Ungleichgewichte, die durch die Phasenänderung
vorkommen könnten,
noch ausgleichen.
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Die
gegenüber
den Fingerprintspektren erhöhte
Laserenergiedichte erzeugt eine wesentlich höhere Anzahl von metastabilen
Ionen pro Laserschuss, also von Ionen, die noch im Massenspektrometer
zerfallen. Die nach der Beschleunigungsstrecke (1, 2, 3),
aber vor der Nachbeschleunigungseinheit (5) zerfallenden
Ionen können
als Tochterionen nachgewiesen werden. Die höhere Ionendichte stört etwas
das Massenauflösungsvermögen; da
jedoch für
Tochterionenspektren nicht eine so hohe Massengenauigkeit erforderlich
ist wie für
Fingerprintspektren, ist das hier nicht hinderlich.
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Eine
optimale Ausführungsform
eines Elternionenselektors (4) beruht auf einem Kondensatorgitter
in Anordnung nach Bradbury-Nielsen (3), das
statt eines einfachen Kondensators im Flugzeitspektrometer eingesetzt
ist.
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Die
Spannung an den Kondensatorplatten dieses Gitters wird zu einer
Zeit t2 ausgeschaltet, zu der die erwünschten
Ionen gerade in das Hauptablenkfeld der einzelnen, parallelen Ablenkkondensatoren
eintreten. Das Bündel
der erwünschten
Ionen wird dadurch überhaupt
nur im schwachen Streufeld abgelenkt. Die Spannung muss mit umgekehrter
Polarität
zu einer Zeit t3 wieder eingeschaltet werden,
zu der die Ionen gerade aus dem Hauptablenkfeld wieder austreten.
Die leichte Ablenkung aus dem Eingangsstreufeld wird dann im Ausgangsstreufeld
wieder rückgängig gemacht.
Unerwünschte
Ionen, die sich in Abständen
von nur einigen Zehntel Millimeter vor oder hinter den erwünschten
Ionen befinden, erleben hier bereits eine Gesamtablenkung, die sie vom
Erreichen des Detektors abhält.
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Der
Selektor (4) sperrt also normalerweise den geraden Weg
der Ionen, die Ionen werden leicht seitlich abgelenkt und können den
Ionendetektor (10) nicht erreichen. Zu dem Zeitpunkt, zu
dem die auszuwählenden
Ionen (in unserem Beispiel die Ionen eines bestimmten Peptids) im
Selektor (4) ankommen, hat der Selektor gerade durch Abschalten
der Ablenkspannung den geraden Durchgang freigegeben. Die unzerfallenen
Elternionen wie auch die gleich schnell fliegenden Tochterionen
(und deren neutrale Gegenbruchstücke)
fliegen nun durch den Selektor hindurch. Sind sie soeben hindurchgeflogen,
macht der der Selektor (4) durch Einschalten der Ablenkspannung
entgegengesetzter Polarität
den geraden Durchgang wieder zu. Beim zeitlichen Durchflug der erwünschten
Ionen durch den Selektor sind die Ionen durch die Zeitverzögerung,
die Spannung und die besondere Form des Abzugpulses in der Ionenquelle
alle zeitfokussiert; sie passieren den Selektor alle zur gleichen
Zeit. So wird ein hohes Massenauswahlvermögen erhalten.
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Die
erwünschten
und ausgewählten
Ionen fliegen nun nach einer weiteren kleinen feldfreien Flugstrecke
in die Nachbeschleunigungseinheit ein. Sind sie in ihrem Flug gerade
in den kleinen, umschlossenen Raum des Potentialfahrstuhls eingetreten,
so wird das Potential dieses Fahrstuhls sehr schnell auf ein Nachbeschleunigungspotential
angehoben. Beim Verlassen des Fahrstuhls oder Lifts erleben sie
(zwischen zwei oder drei Gittern) eine Nachbeschleunigung, die ihnen
eine zusätzliche
kinetische Energie von beispielsweise 20 Kiloelektronenvolt vermittelt.
Dabei kann durch ein verzögertes Einschalten
der Nachbeschleunigung zwischen Fahrstuhl (5) und Mittelelektrode
(6) wiederum eine zeitliche Fokussierung für Ionen
einer Masse, jedoch leicht verschiedener Geschwindigkeit erreicht
werden. Durch eine pulsgeformte Veränderung der Spannung nach dem
Einschalten kann auch hier eine Massenunabhängigkeit der Fokuslänge und
damit eine gute Massenauflösung über den
gesamten Massenbereich hinweg erzielt werden. Bei einer Beschleunigung
in der Ionenquelle von fünf
Kilovolt und einer Nachbeschleunigung von 20 Kilovolt haben die Tochter-
und Elternionen jetzt kinetische Energien zwischen minimal 20 bis
maximal 25 Kilovolt, je nach ihrer Masse. Sie können alle vom Reflektor (8, 9)
reflektiert und im Detektor (10) in einer einzigen Spektrenaufnahme
gemessen werden. Im Tochterionenspektrum sind so also alle Tochterionen
von kleinsten Massen bis zur Elternionenmasse vorhanden.
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Im
Allgemeinen werden gute Fingerprintspektren wie auch gute Tochterionenspektren
mit jeweils 100 Einzelspektren gewonnen. Bei einer Basisfrequenz
für die
Spektrenaufnahme von 20 Hertz braucht eine Spektrenaufnahme etwa
fünf Sekunden.
Rechnet man jeweils eine halbe Sekunde für das Verfahren der Probe und
für das
Abholen der Spektrendaten aus dem Transientenrekorder, so werden
für jede
Spektrennahme, gleich ob für
ein Fingerprint- oder ein Tochterionenspektrum, etwa 6 Sekunden
benötigt.
Werden für
jede Probe genau ein Fingerprintspektrum und im Durchschnitt zwei
Tochterionenspektren (von durchschnittlich zwei verschiedenen Peptiden)
gemessen, so erfordert das etwa zwei Stunden für 384 Proben einer Probenplatte.
Mit einer Automatik zum Nachlegen und Laden der Probenträgerplatten
können
in 24 Stunden etwa 4600 Proben gemessen werden, wobei insgesamt
etwa 13800 Spektren erhalten werden.
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Die
Probenmenge in den einzelnen Probenpräparationen reicht um Allgemeinen
jeweils für
ein Primärspektrum
und zwei bis drei Tochterionenspektren aus. Sollen mehr Tochterionenspektren
gemessen werden, so empfiehl es sich, auf eine Probenträgerplatte
von einer Probe jeweils mehrere Tröpfchen auf mehrere hydrophile
Anker aufzutragen.
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Es
hat sich gezeigt, dass bestimmte Proben einen Beschuss mit erhöhter Laserenergiedichte
und 20 Hertz Wiederholrate nicht vertragen. Die Proben erhitzen
sich zu stark und leiden an Zersetzungen der Probe in der MALDI-Präparation
auf der Probenplatte. In diesem Fall kann die Laserschussrate auf
zehn oder fünf
Hertz herabgesetzt werden, ohne dass die Basisfrequenz der Potentialperiode
in der Ionenquelle, im Selektor und in der Nachbeschleunigungseinheit
verändert
werden müsste.
Die Herabsetzung der Laserschussrate ist oben geschildert.
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Es
hat sich dabei gezeigt, dass sich ein solcher Betrieb gar nicht
einmal auf die Gesamtdauer der Spektrenaufnahme auswirken muss.
Eine Probe, die ein Herabsetzen der Laserschussfrequenz auf zehn
Hertz erfordert, liefert auch häufig
eine erhöhte Ausbeute
an metastabilen Ionen; es reicht damit eine Summierung von nur 50
Einzelspektren aus und die Aufnahmezeit bleibt gleich. Das gilt
jedoch nicht für alle
Arten von Proben.
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Eine
Variante des Messverfahrens für
Tochterionenspektren nimmt erst einmal nur die Summe aus jeweils
etwa 10 Einzelspektren. Dieses erste Summenspektrum wird auf seine
Qualität
untersucht und führt
gegebenenfalls zu einer Rückregelung,
beispielsweise zu einer leichten Veränderung der Laserenergiedichte.
Wird dieser Rückregelungsvorgang ein-
bis zweimal pro Tochterionenspektrum ausgeführt, so erhöht sich die Spektrenaufnahmenzeit
etwa um drei Sekunden, die Anzahl von Proben geht von 4600 auf etwa
3000 Proben mit insgesamt 9000 Spekten pro 24 Stunden herunter.
Gegenüber
bisherigen Rückregelungsverfahren,
die bei etwa 3 Hertz Aufnahmetakt 40 Sekunden Aufnahmedauer für das Summenspektrum
benötigen,
ist das ein großer
Fortschritt.
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In
einem Proteom befinden sich etwa 3000 bis 10000 trennbare und erkennbare
Proteine. Die Proteine sind allerdings nach ihrer Trennung sehr empfindlich
gegen Oxidationen und Zersetzungen, sie müssen möglichst innerhalb von 48 Stunden
verarbeitet sein. Rechnet man 24 Stunden allein für die Probenaufbereitung,
so reichen mit dieser Erfindung nunmehr wenige parallel eingesetzte
Massenspektrometer für
eine solche Proteomanalyse aus.
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Werden
die Ionen nicht bereits durch den MALDI-Erzeugungsvorgang genügend metastabil, so
können
sie optional auch in einer gasgefüllten Stoßzelle fragmentiert werden,
die sich entweder zwischen der Grundelektrode (3) der Ionenquelle
und dem Elternionenselektor (4) oder zwischen dem Elternionenselektor
(4) und dem Potentiallift (5) befinden kann.
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Selbstverständlich können auch
ganz andere Ausführungsformen
von Flugzeitmassenspektrometern mit der erfindungsgemäß dauerbetriebenen Elektronik
und mit der erfindungsgemäß massenunabhängigen Einstellung
der Potentialabläufe
ausgestattet werden, beispielsweise Flugzeitspektrometer mit mehr
als einem Reflektor. Jedem massenspektrometrisch tätigen Fachmann
werden in Kenntnis dieser Erfindung solche Anpassungen möglich sein.
