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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf Flugzeit-Massenspektrometer, in denen
das Masse/Ladung-Verhältnis
(m/z) einer Anzahl von Ionen aus der Zeitspanne hergeleitet werden
kann, die die Ionen benötigen,
eine gegebene Strecke mittels eines geeigneten Beschleunigungsfeldes,
wie z. B. eines elektrostatischen Feldes, vorangetrieben zu werden.
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Hintergrund der Erfindung
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Ein
Beispiel eines Flugzeit-Spektrometers ist ein grundsubstanzunterstütztes Laserdesorbtionsionisation-Flugzeit-(MALDI-TOF)-Spektrometer
(MALDI-TOF = Matrix
Assisted Laser Desorption Ionisation Time Of Flight).
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Ein
solches Spektrometer wird gewöhnlich verwendet,
um Substanzen mit hohem Molekulargewicht zu analysieren, insbesondere
biochemische Stoffe, wobei es einen kurzen Impuls von Laserenergie
nutzt, um Moleküle
eines Analyts aus Kristallen, die innerhalb einer Grundsubstanz
gehalten werden, die aus kleinen organischen Molekülen gebildet
ist, die die einfallende Laserstrahlung absorbieren, ausstößt und ionisiert.
Die Grundsubstanz absorbiert resonierend diese Strahlung, was dementsprechend eine
Ablösung
eines Bereiches der Grundsubstanz, eines Analytgemisches, sowie
die Ausbildung eines Expansionsstrahls über der Oberfläche hervorruft, wobei
innerhalb dieses Strahls Ionen/Molekül-Reaktionen stattfinden. Moleküle und Ionen
können
aus der Grundsubstanz mit zahlreichen unterschiedlichen kinetischen
Energien ausgestoßen
werden.
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Die
so erzeugten Ionen werden anschließend in Richtung zu einem Detektor
beschleunigt, normalerweise mittels eines elektrostatischen Feldes.
Die kinetische Energie KE eines Partikels der Masse m, der mit einer
Geschwindigkeit v fliegt, ist gegeben durch die Gleichung: KE = 1/2mv2
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Somit
fliegt jeder Partikel mit der Geschwindigkeit, die entsprechend
seiner Masse mittels der Gleichung eingestuft wird:
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Wenn
dementsprechend ein Impuls aus Ionen gebildet wird, was den Zeitpunkt
0 definiert, der eine bestimmte Strecke zum Detektor fliegt, werden leichtere
Ionen früher
am Detektor ankommen. Folglich repräsentiert das Detektorsignal
als Funktion der Zeit ein m/z-Spektrum von Partikeln einer gegebenen Ladung.
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Flugzeit-Massenspektrometer
haben zwei bedeutende Vorteile gegenüber anderen Typen von Massenspektrometern:
- 1. sie weisen eine sehr hohe Empfindlichkeit
auf, da ein Großteil
der erzeugten Ionen am Detektor erfasst wird, im Gegensatz zu abtastenden
Spektrometern, in denen nur Ionen eines gegebenen m/z auf dem Detektor
zu einem beliebigen Zeitpunkt fokussiert werden; und
- 2. mittels eines TOF-Spektrometers kann ein sehr großer Massebereich
erreicht werden, der nur durch die Effizienz der Detektion von Ionen
mit hoher Masse begrenzt ist.
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Einer
der wichtigsten Faktoren jedoch, der die Genauigkeit von Massenmessungen
beschränkt, die
mittels eines MALDI-TOF-Spektrometers erhalten werden, ist die Schwankung
der Ionenextraktionszeitpunkte aus dem Bereich der Quelle. Es wird angenommen,
dass dies durch die Schwankungen der anfänglichen Geschwindigkeiten
von Ionen und der Positionen, an denen die Ionen in Folge von Laserimpulsen
gebildet werden, von Impuls zu Impuls hervorgerufen wird.
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Eine
Möglichkeit,
zu versuchen, den Effekt dieses Problems zu reduzieren, besteht
darin, sehr starke Extraktionsfelder zu verwenden, um die Ionen in
Richtung zum Detektor zu beschleunigen. Dies behebt jedoch nicht
das Problem selbst, wobei die Massengenauigkeit und die Massenauflösung weiterhin begrenzt
sind.
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Es
ist bekannt, ein Spektrometer mit einem Reflektron auszustatten,
um die Massenauflösung des
Spektrometers zu erhöhen.
Das Reflektron reflektiert die Ionen, um die Bahnlängen von
der Quelle zum Detektor zu erhöhen,
während
energiereichere Ionen (eines gegebenen m/z) veranlasst werden, eine
weitere Strecke zu fliegen als die energieärmeren Ionen, um die unterschiedlichen
Ionengeschwindigkeiten zu kompensieren. Das Reflektron kann somit
die schneller bewegten Ionen hinten den Ionen mit langsameren Geschwindigkeiten
positionieren. Wenn dies geschieht, holen die schnelleren Ionen schließlich die
langsamer bewegten Ionen ein und überholen diese an einem zeitlichen
Brennpunkt des Spektrometers.
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Außerdem ist
bekannt, Verzögerungsextraktionstechniken
zu verwenden, wodurch ein Verzögerung
zwischen dem Abfeuern des Laserimpulses und dem Anlegen des Beschleunigungsfeldes
eingeführt wird,
so dass dann, wenn das Feld angelegt wird, Ionen mit einer höheren Anfangsgeschwindigkeit
weiter von der Probenplatte abgetrieben sind als diejenigen einer
niedrigeren Anfangsgeschwindigkeit.
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Die
letzteren Ionen werden somit bis zu einem größeren Ausmaß beschleunigt als diejenigen, die
ursprünglich
eine höhere
Energie hatten. Die Ionen mit den niedrigeren Anfangsgeschwindigkeiten holen
zu den anderen Ionen an einem weiteren zeitlichen Brennpunkt auf
und überholen
diese schließlich.
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Es
wurde ferner von einer Variation der verzögerten Extraktion berichtet,
bei der ein kleines Verzögerungsfeld
zwischen der Probenplatte und der ersten Extraktionsplatte während der
Verzögerungsperiode
besteht, bevor der Extraktionsimpuls angewendet wird. (US-Patent
Nr. 5.625.184).
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Selbst
wenn jedoch diese Techniken kombiniert werden, können die Schwankungen der anfänglichen
kinetischen Energien immer noch die Massengenauigkeit des Spektrometers
deutlich reduzieren. Die Massengenauigkeit wird ferner durch Schwankungen
der Stromversorgungsspannungen (aus denen die Beschleunigungsspannungen
hergeleitet werden), eine Temperaturdrift und andere Faktoren, die
die Flugzeiten der Ionen zum Detektor beeinflussen können, beeinträchtigt.
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Eine
bekannte Möglichkeit,
die Massengenauigkeit des Spektrometers weiter zu verbessern, ist
die Verwendung interner Standards. Ein interner Standard ist eine
bekannte Verbindung (oder eine Anzahl von Verbindungen), die mit
der zu analysierenden Probe gemischt wird (werden) und mit dem Analyt
ionisiert wird (werden). Es wird angenommen, dass die gleichen Schwankungen
der Anfangsbedingungen sowohl bei der/den bekannten Verbindung(en)
und dem Analyt auftreten, so dass der interne Standard verwendet
werden kann, um das vom Detektor erhaltene Massenspektrum zu rekalibrieren. Es
kann jedoch schwierig sein, den internen Standard zu veranlassen,
gleichmäßig mit
den analysierten Verbindungen gemeinsam zu kristallisieren.
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Überblick über die Erfindung
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Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung wird ein Flugzeit-Massenspektrometer
nach Anspruch 1 geschaffen.
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Es
wird angenommen, dass für
die Zwecke dieser Beschreibung die zu messenden Eigenschaften z.
B. das Ladung/Masse-Verhältnis
oder dessen Kehrwert umfassen können.
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Schwankungen
der anfänglichen
Geschwindigkeiten oder der Ionisationszeitpunkte der Partikel beeinflussen
die Ausgangssignale beider Detektoren. Diese Schwankungen weisen
jedoch eine ähnliche
Wirkung auf die Detektorausgangssignale auf, so dass ein Detektor
wirksam verwendet werden kann, um das Ausgangssignal des anderen
Detektors zu kalibrieren. In ähnlicher
Weise beeinflussen Schwankungen irgendwelcher anderer Parameter, wie
z. B. der Beschleunigungsspannungen, die Ausgangssignale beider
Detektoren.
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Typischerweise
weist das Ausgangssignal jedes Detektors ein oder mehrere Spitzen
auf. Folglich kann die Analyse der Detektorausgangssignale das Identifizieren
entsprechender Spitzen in den Detektorausgangssignalen und das Berechnen
der Differenz ihrer jeweiligen Auftrittszeitpunkte umfassen.
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Das
Spektrometer enthält
vorzugsweise zeitliche Fokussierungsmittel, um wenigstens teilweise irgendeine
Streuung der anfänglichen
kinetischen Energien von Partikeln eines gegebenen m/z zu kompensieren,
um somit zwei zeitliche Brennpunkte zu schaffen, wobei jeder Detektor
an einem entsprechenden zeitlichen Brennpunkt angeordnet ist. Das Fokussierungsmittel
kann auf eine oder mehrere verschiedene Arten funktionieren. Zum
Beispiel können Partikel
mit höheren
kinetischen Energien veranlasst werden, entlang längerer Bahnen
zu fliegen als diejenigen mit niedrigeren kinetischen Energien,
und/oder können
bis zu einem geringeren Ausmaß beschleunigt
werden als die langsameren Partikel.
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Das
Spektrometer ist vorzugsweise so betreibbar, dass es einen Strahl
der Partikel erzeugt, wobei der Strahl beide Bahnen enthält.
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In
diesem Fall kann das Fokussierungsmittel vorteilhaft Reflexionsmittel
umfassen, um die Partikel im Strahl zu reflektieren, derart, dass
mit höherer
kinetischer Energie von Partikeln gegebener Ladung und Masse die
Bahn dieser Partikel durch das Reflexionsmittel länger wird,
wobei das Reflexionsmittel in der Bahn des Strahls zwischen den
zwei Detektoren angeordnet ist.
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Das
Fokussierungsmittel umfasst vorzugsweise ferner Reflexionsmittel,
die in der Bahn des Strahls zwischen der Probe und dem ersten der
Detektoren angeordnet sind, so dass der Strahl im Wesentlichen eine
gewundene Form aufweist.
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Das
Spektrometer enthält
günstigerweise
einen Laser zum Freisetzen der ionisierten Partikel von der Probe.
Alternativ kann das Spektrometer andere Mittel zum Erzeugen von
Ionen verwenden, z. B. die Elektrospray-Ionisation, die Elektronenstoßionisation,
die chemische Ionisation, MALDI mit erhöhtem Druck, und dergleichen.
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Das
Fokussierungsmittel kann ferner ein Verzögerungsmittel zum Verzögern der
Operation des Beschleunigungsmittels für eine festgelegte Zeitspanne
nach der Operation des Lasers umfassen, wobei das Beschleunigungsmittel
so angeordnet ist, dass mit zunehmender Flugstrecke eines Partikels von
der Probe, bevor das Beschleunigungsmittel aktiviert ist, die Beschleunigung
des Partikels geringer ist.
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Das
Spektrometer enthält
vorzugsweise ein Datenverarbeitungsmittel, das mit beiden Detektoren verbunden
ist und so betreibbar ist, dass es entsprechende Abschnitte der
Detektorausgangssignal identifiziert und das Differenzmaß zwischen
den Zeitpunkten, zu dem die Abschnitte aufgetreten sind, identifiziert.
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Die
Abschnitte umfassen vorzugsweise Spitzen in den Ausgangssignalen
der Detektoren.
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Das
Spektrometer ist vorzugsweise ein MALDI-TOF-Spektrometer, obwohl
das Prinzip auf andere Typen von Massenspektrometern angewendet
werden kann, wie z. B. Orthogonalextraktions-TOF-Massenspektrometer,
Vierpol-TOF- oder Sektor-TOF-Massenspektrometer. Das Prinzip ist
sowohl auf Ionenzählungs-
als auch Analogerfassungssysteme anwendbar.
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Das
Spektrometer enthält
vorzugsweise ein Einfangmittel zum vorübergehenden Einfangen von Partikeln,
die von der Quelle freigesetzt worden sind, in einer Zone neben
der Probe vor der Beschleunigung der Partikel.
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Das
Einfangmittel trägt
dazu bei, die Schwankungen der Partikelextraktionszeitpunkte von einer
Probe zu kompensieren.
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Das
Einfangmittel enthält
vorzugsweise ein Mittel zum Injizieren eines Gases in diese Zone,
um mit den Partikeln zu wechselwirken.
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Das
Einfangmittel ist ein Beispiel eines Ionentransportmittels zwischen
der Ionenquelle und dem Beschleunigungsbereich. In anderen Ausführungsformen
des hier beschriebenen Doppeldetektorprinzips kann der Ionenquellenbereich
durch andere Formen von Ionentransportmittel getrennt sein. Das
Ionentransportmittel kann z. B. eine differenziell gepumpte Grenzfläche oder
irgendeine andere Anzahl von Vorstufen der Massenspektrometrieanalyse enthalten.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren der Flugzeit-Spektrometrie gemäß Anspruch
14 geschaffen.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Im
Folgenden wird die Erfindung lediglich beispielhaft mit Bezug auf
die beigefügten
Zeichnungen beschrieben, in welchen:
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1 eine
schematische Seitenschnittansicht eines MALDI-TOF-Massenspektrometers
gemäß der Erfindung
ist;
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2 eine
genauere Seitenschnittansicht eines Detektors für das Spektrometer ist;
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3 ein
Diagramm ist, das die Bahnen von zwei Ionen durch einen Reflektor
des Spektrometers zeigt;
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4 und 5 vereinfacht
die Darstellungen von Signalen sind, die von zwei Detektoren des Spektrometers
erhalten werden;
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6 ein
Signal zeigt, das aus den Signalen von den Detektoren hergeleitet
wird; und
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7 eine
Seitenschnittansicht eines Teils einer modifizierten Version des
Spektrometers ist.
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Genaue Beschreibung
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Das
in 1 gezeigte Spektrometer weist ein Gehäuse 2 auf,
das eine Vakuumkammer 1 definiert und einen Endabschnitt 4 enthält, der
einen Probenverschluss enthält,
welcher eine Probenplatte 6 zum Halten einer zu analysierenden
Probe enthält. Der
Probenverschluss enthält
eine (nicht gezeigte) abdichtbare Tür, um Zugang zur Platte 6 von
außerhalb
des Gehäuses 2 zu
schaffen, wobei der Probenverschluss eine weitere Tür zum Abdichten
des Verschlusses vom Rest der Kammer 1 enthält, so dass ein
Probe auf der Platte 6 platziert oder von dieser entnommen
werden kann, ohne die Kammer 1 unter Druck zu setzen.
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Ein
Impulslaser 8 ist außerhalb
des Gehäuses 2 an
einer Position angeordnet, in der Licht vom Laser 8 durch
ein Fenster 10 in das Gehäuse 2 und auf die
Probenplatte 6 gelangt. Eine Folge von ringförmigen Elektroden 12 ist
zwischen der Probenplatte 6 und dem Hauptkörper des
Gehäuses 2 eingesetzt,
wobei die zentralen Öffnungen
der Elektroden 12 aufeinander ausgerichtet sind, so dass
die von der Probe 6 emittierten Ionen längs einer Bahn durch die Öffnungen
in den Elektroden 12 in den Hauptkörper des Gehäuses 2 gelangen
können.
Diese Bahn erstreckt sich durch eine ringförmige Linsen- und Beschleunigereinheit 14.
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Die
Linse/Beschleunigereinheit funktioniert im Normalbetrieb als Linse,
um für
eine gewisse Fokussierung des Strahls zu sorgen und die Transmission
durch das Instrument zu verbessern. Die Linse/Beschleunigereinheit
ist nach einem Ionengatter angeordnet. Das Ionengatter umfasst in
dieser Ausführungsform
Drähte,
die Spannungen wechselnder Polarität führen können, um den Ionenstrahl aus
der normalen Bahn auszulenken, so dass er die Detektoren nicht erreicht.
Wenn die Spannungen am Gate zu einem bestimmten Zeitpunkt abgeschaltet
werden, wenn Ionen eines bestimmten m/z-Verhältnisses am Gatter ankommen,
werden sie durch das Instrument gesendet. Das Gatter wird im Nachquellenabfall-(PSD)-Modus
(PSD, Post Source Decay) des Instruments betrieben. PSD bezieht
sich auf die Fragmentierung von Ionen, nachdem sie aus der Ionenquelle
extrahiert worden sind. PSD-Fragmentionen weisen
unterschiedliche kinetische Energien gegenüber dem Stammion aus, von dem
sie abgeleitet sind, fliegen jedoch mit nahezu der gleichen Geschwindigkeit.
Daher werden jedes m/z-Stammion und dessen PSD-Fragmentionen im
Wesentlichen zum gleichen Zeitpunkt am Ionengatter ankommen und
können
in das Instrument durchgelassen werden, während alle anderen m/z-Stammionen
zurückgewiesen
werden.
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Sobald
ein Ion vom Ionengatter ausgewählt worden
ist, kann es von seinen PSD-Fragmenten unterschieden werden, indem
alle Ionen elektrischen Feldern ausgesetzt werden. Im PSD-Modus
arbeitet die Linse/Beschleunigereinheit als Beschleuniger, um alle
Ionen auf eine hohe Energie zu beschleunigen. Das bedeutet, dass
die relative Energiedifferenz zwischen den PSD-Fragmentionen reduziert wird, um die
Massenauflösung
des aufgezeichneten Massenspektrum zu erhöhen. Die Kammer weist eine
Innenschicht in Form eines leitenden Mantels 28 auf, der
auf anderen Spannungen als derjenigen der Vakuumkammerwand schweben
kann. Im PSD-Betriebsmodus schwebt der Mantel auf hohen Spannungen
(negativen Spannungen im Fall von positiven Ionen), um die hohe
Energie der Ionen nach der Beschleunigung mittels der Linse/Beschleunigereinheit aufrechtzuerhalten.
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Die
Linsen- und Beschleunigereinheit 14 wird von einem zylindrischen
Mantel 16 getragen, dessen Achse auf ein Reflexionsmittel
ausgerichtet ist, das ein erstes Reflektron 18 umfasst.
Das Reflektron 18 nimmt die Form eines Zylinders an, der
definiert ist durch eine Folge von abwechselnden ringförmigen Elektrodenplatten
und ringförmigen
Isolationsabstandshaltern. Die Platten sind mit einer (nicht gezeigten)
Spannungsversorgung verbunden, die eine entsprechende Spannung an
jede Elektrodenplatte anlegt. Die an die Platten angelegten Spannungen weisen
die gleiche Polarität
auf wie die Ladung der vom Spektrometer zu analysierenden Ionen,
und nehmen schrittweise zu, so dass die Höhe der angelegten Spannung
am Ende des Reflektrons 18 näher an der Linsen- und Beschleunigereinheit 14 niedriger ist
als die Höhe
der Spannung, die an der Elektrodenplatte an gegenüberliegenden
Ende des Reflektrons 18 anliegt.
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Unmittelbar
jenseits dieses Endes des Reflektrons 18 ist ein Mikrokanalplattendetektor 20 angeordnet,
der erlaubt, das Spektrometer für
einen linearen Analysemodus zu verwenden (wenn das Reflektron 18 nicht
aktiv ist). Ein weiterer ähnlicher
Detektor 22 ist neben der Linse/Beschleunigereinheit 14 und
zwischen dem Reflektron 18 und einem weiteren identischen
Reflektron 24 angeordnet.
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Es
ist möglich,
ein Ionengatter zwischen den zwei Reflektrons hinzuzufügen, um
Stammionen für eine
anschließende
Fragmentierung vor dem Eintritt in das zweite Reflektron auszuwählen. Die
zwei Hälften
des Instruments, d. h. von der Quelle zum Detektor und vom ersten
Detektor zum zweiten Detektor, können
anschließend
als separate TOF-Massenspektrometer verwendet werden, um eine Tandem-Massenspektrometrie
(MS/MS) durchzuführen. In
diesem Fall können
zusätzliche
Mäntel
und Ionenoptiken bei Bedarf hinzugefügt werden.
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Der
Detektor 22 ist mit einer dünnen leitenden Abschirmung 26 verbunden.
Sowohl der Detektor 22 als auch die Abschirmung 26 sind
in 2 genauer gezeigt, aus der deutlich wird, dass
der Detektor und die Abschirmung auf einem zylindrischen Mantel 28 in
der Bahn montiert sind, die im Gebrauch von einigen der vom Spektrometer
zu analysierenden Ionen genommen wird. Aus 2 wird deutlich, dass
der Detektor 22 diese Ionen einfängt, während er den übrigen Ionen
erlaubt, weiter in Richtung des Reflektrons 22 zu fliegen,
wobei die Abschirmung den Detektor 22 daran hindert, die
Bahnkurven dieser Ionen zu beeinflussen.
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Ein
dritter Detektor 30, der zu den Detektoren 22 und 20 identisch
ist, ist an dem Ende des Gehäuses 2 gegenüberliegend
dem Reflektron 24 angeordnet, derart, dass er die von Letzterem
reflektierten Ionen einfängt.
Die Ausgänge
der Detektoren 20, 22 und 30 sind über ein
Datenerfassungssystem 32 mit einem Computer 34 verbunden.
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Im
Gebrauch wird eine zu analysierende Substanz, die in eine geeignete
Grundsubstanz eingebettet worden ist, auf der Probenplatte 6 platziert. Die
Tür des
Probenverschlusses 4 wird dann geschlossen.
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Der
Laser 8 feuert anschließend einen Impuls ultravioletten
Lichts mit der Wellenlänge
337 nm durch das Fenster 10 auf die Probe auf der Platte 6. Die
Grundsubstanz absorbiert resonierend das Laserlicht, was anschließend einen
Strahl an Material hervorruft, der das Analyt enthält und aus
dem Bereich der Probe ausbricht.
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Die
Moleküle
des Analyts, die in dem Strahl enthalten sind, fliegen von der Probe
mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten weg und werden zu zahlreichen
unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Auftreten des Impulses ionisiert.
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Nach
einer vorgegebenen Verzögerung
wird der Strahl durch Anlegen einer Spannung an die Elektroden 12 mit
einem beschleunigenden elektrostatischen Feld beaufschlagt. Wenn
dies geschieht, sind die Ionen, die mit hohen Geschwindigkeiten
ausgestoßen
worden sind, weiter von der Probenplatte 6 abgetrieben
und befinden sich näher
an den Elektroden 12 als diejenigen Ionen des Strahls,
die niedrigere Geschwindigkeiten aufweisen.
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Je
weiter die Ionen von den Elektroden 12 entfernt sind, wenn
das Feld angelegt wird, desto größer ist
deren Beschleunigung. Die Elektroden 12 erzeugen einen
Strahl, in welchem als Ergebnis die Ionen mit niedrigen Anfangsgeschwindigkeiten
(d. h. vor dem Anleger des Extraktionsfeldes) mit höheren Geschwindigkeiten
fliegen als die Ionen mit hohen Anfangsgeschwindigkeiten, weshalb
sie schließlich die
späteren
Ionen an einem ersten zeitlichen Brennpunkt einholen und überholen.
Es ist ferner möglich, ein
zeitveränderliches
elektrisches Feld nahe der Probenplatte vor dem Anwenden des Extraktionsimpulses
vorzusehen, um die Geschwindigkeit weiter zu korrigieren.
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In
1 ist
die vom Ionenstrahl genommene Bahn mit dem Bezugszeichen
36 bezeichnet,
woraus deutlich wird, dass der Strahl durch die Linsen- und Beschleunigereinheit
14 läuft und
auf das erste Reflektron
18 trifft, dessen Funktion im
Folgenden beschrieben wird. Die Massenauflösung eines von einem Detektor
in einem Flugzeit-Spektrometer erhaltenen Signals ist gegeben durch
die Formel:
wobei T die Gesamtflugzeit
bis zur Mitte der erfassten Spitze ist, und ΔT die Dauer der erfassten Spitze ist.
Die Auflösung
kann somit erhöht
werden, indem T erhöht
wird und/oder ΔT
verringert wird.
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Das
Erhöhen
von T wird erreicht durch Erhöhen
der Flugbahnlänge.
Ein einfaches Verdoppeln der Länge
der Flugbahn verdoppelt jedoch nicht unbedingt die Auflösung, da
aufgrund der Energiespreizung (und somit Geschwindigkeitsspreizung)
der Ionen im Strahl auch ΔT
mit zunehmenden Flugbahnlängen
tendenziell zunimmt.
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Das
Reflektron 18 erhöht
die Auflösung
des Spektrometers durch Erhöhen
der Fluglänge,
hält jedoch ΔT nahezu
auf dem gleichen Wert, wie er nach der Extraktion von der Probe
besteht. Ionen, die in das Reflektron 18 gelangen, werden
einem elektrischen Feld unterworfen, dessen Intensität progressiv zunimmt,
wenn die Ionen in Richtung zum Detektor 20 fliegen. Es
wird angenommen, dass mit höherer anfänglicher
kinetischer Energie eines Ions das Ion weiter in das Reflektron 18 fliegt,
bevor es stoppt und mittels des elektrischen Feldes zurück aus dem
Reflektron beschleunigt wird.
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Dieser
Effekt ist in 3 dargestellt, in welcher das
Bezugszeichen 38 ein Ion bezeichnet, das mit relativ niedriger
Geschwindigkeit in das Reflektron 18 fliegt, und das Bezugszeichen 40 ein
Ion bezeichnet, das mit höheren
Geschwindigkeit fliegt. Obwohl das Ion 38 mit niedriger
Geschwindigkeit das Reflektron 18 nach dem Ion mit höherer Geschwindigkeit
erreicht, folgt es einer kürzeren
Bahn zum Reflektor, die mit dem Bezugszeichen 42 bezeichnet
ist, und verlässt
somit das Reflektron 18 vor dem Ion 40 (das der
längeren
Bahn 44 gefolgt ist).
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Das
Ion 40 fliegt weiterhin mit einer höheren Geschwindigkeit als das
Ion 18 und holt schließlich das
letztere an einem zeitlichen Brennpunkt im Spektrometer ein und überholt
es. Der Detektor 22 ist an diesem Brennpunkt angeordnet
und ragt bis zur Hälfte
in den Strahl (in 2 mit dem Bezugszeichen 46 gezeigt),
um das Ion unterhalb der Achse dieses Strahls abzufangen. Andere
Mittel zum Auswählen eines
Teils des Strahls zur Erfassung auf dem Detektor 22, wie
z. B. ein Mehrfachelementablenker, sind ebenfalls möglich.
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In
dem in 4 gezeigten Graphen bezeichnet die horizontale
Achse die Zeit nach dem Abfeuern eines verzögerten Extraktionsspannungsimpulses, der
an die Elektroden 12 angelegt wird, um die Ionen zu Beschleunigen,
wobei der Ursprung der Zeitpunkt ist, zu dem der Impuls abgefeuert
wird, während
die vertikale Achse die Amplitude des vom Detektor erzeugten Signals
und somit die Anzahl der erfassten Ionen bezeichnet.
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Die
Ionen, die vom Detektor 22 nicht gezählt werden, laufen in einem
Strahl in das Reflektron 24, das eine ähnliche Funktion wie das Reflektron 18 hat und
die räumliche
Spreizung von Ionen (mit dem gleichen Masse/Ladung-Verhältnis) unterschiedlicher Geschwindigkeiten
reduziert und den Strahl in Richtung auf einen zweiten zeitlichen
Brennpunkt lenkt, bei dem der Detektor 30 angeordnet ist.
Die 4 und 5 sind vereinfachte Graphen,
die die Signale zeigen, die von den Detektoren 22 und 30 erzeugt würden, wenn
alle Ionen im Strahl das gleiche Verhältnis von Ladung zu Masse aufwiesen.
Wenn alle Ionen gleichzeitig von der gleichen Position auf der Probe
mit der gleichen Anfangsgeschwindigkeit freigesetzt würden, würde das
vom Detektor 22 erzeugte Signal eine einfache Spitze mit
einer unendlich kleinen Breite sein.
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Aufgrund
der Variation der anfänglichen
kinetischen Energien der Ionen und der Ionenextraktionszeitpunkte
umfasst das vom Detektor 22 erzeugte Signal einen allmählichen
Anstieg 47 auf ein Maximum 48, dem ein allmählicher
Abstieg 50 folgt. Der Anstieg, das Maximum und der Abstieg
eines Signals werden gewöhnlich
als eine Spitze bezeichnet, die daher eine endliche Breite aufweisen
kann.
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Die
gestrichelte Linienspur 52 zeigt das Signal, das von Ionen
erzeugt werden könnte,
die von der Probe mittels eines zweiten Laserimpulses freigesetzt
werden. Es wird deutlich, dass das vom Impuls zu Impuls erzeugte
Signal aufgrund unterschiedlicher Ejektionseigenschaften der Probe
verschoben sein kann.
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Der
Maximumabschnitt dieses Signals, mit dem Bezugszeichen 54 bezeichnet,
ist zeitlich relativ zur Spitze 48 verschoben, da der zweite
Laserimpuls den Ionen im Mittel niedrigere kinetischer Energien aufgeprägt hat als
der erste Impuls.
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Wie
jedoch im Graphen der 5 gezeigt ist, deren Achsen
denjenigen der 4 entsprechen, ist diese Verschiebung
auch in den vom Detektor 30 erzeugten Signalen vorhanden,
in denen die Spitzen 56 und 58 jeweils den Spitzen 48 und 54 entsprechen.
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Der
Computer 34 ist so programmiert, dass er die Spitzen von
den Ausgangssignalen der einzelnen Detektoren identifiziert und
die Maxima 48 und 56 sowie 54 und 58 korreliert.
Der Computer erzeugt anschließend
den in 6 gezeigten Graphen, in welchem die horizontale
Achse die Zeitverzögerung zwischen
entsprechenden Abschnitten von Signalen zeigt, die von den Detektoren 22 und 30 erzeugt
werden. Anschließend
wird die Verschiebung zwischen den Spitzen im Signal vom Detektor 22 mittels
der entsprechenden Verschiebung in den Signalen vom Detektor 30 aufgehoben,
um im Wesentlichen die gleiche Spitzenposition 60 für beide
Laserimpulse zu erhalten.
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Die
entsprechenden Spitzen auf den Detektoren 22 und 30 können aus
den Kalibrierungen der zwei Detektoren bestimmt werden. Sobald dies
bewerkstelligt worden ist, können
die Spitzen Punkt für Punkt
korreliert werden, um die neue(n) Spitze(n) zu zeichnen, die anhand
der Zeitdifferenz zwischen den jeweils korrelierten Punkten erzeugt
wird (werden).
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Die
Spitzen auf dem ersten Detektor (Detektor 22) werden mit
den Spitzen auf dem zweiten Detektor (Detektor 30) unter
Verwendung einer geeigneten Korrelationsfunktion korreliert, so
dass jeder Zeitkasten über
den Spitzen des Detektors 30 anschließend mit einem Zeitkasten über den
Spitzen auf dem Detektor 22 korreliert werden kann. Die Flugzeiten
an allen Punkten über
der Spitze auf dem Detektor 22 werden anschließend von
der Flugzeit der entsprechenden Punkte auf dem Detektor 30 subtrahiert.
Die Flugzeitdifferenzen werden anschließend in einem neuen Zeitgraphen
gezeichnet, der die Flugzeiten zwischen den zwei Detektoren darstellt. Da
die Spitzenbreiten der Spitzen auf den zwei Detektoren in der beschriebenen
Ausführungsform ähnlich sein
sollten, sind die gezeichneten Spitzen im Differenzspektrum viel
schmaler.
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Alternativ
kann (können)
der (die) Schwerpunkt(e) der Spitze(n) auf den Detektoren 22 und 30 berechnet
werden und die Zeitdifferenz zwischen den Schwerpunkten als Schwerpunkt
der Spitze im Differenzspektrum verwendet werden.
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Der
Prozess kann für
jeden aufeinanderfolgenden Impuls wiederholt werden, wobei die einzelnen
Impulse im Differenzspektrum akkumuliert werden. Alternativ kann
eine Anzahl von Impulsen akkumuliert und/oder gemittelt werden,
bevor irgendeine mathematische Prozedur verwendet wird, um das Differenzspektrum
zu bestimmen. Da das Zittern der Ankunftszeiten an den zwei Detektoren
in der gleichen Richtung stattfindet, ist die zeitliche Position des
Differenzmassenspektrums relativ unveränderlich, wobei Spitzenbreiten
schmal bleiben sollten. Schmale Spitzen bedeuten, dass die Genauigkeit
der den Spitzen zugewiesenen m/z-Werte hoch ist.
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Das
Differenzmassenspektrum wird zum Bestimmen der m/z-Werte mit hoher
Genauigkeit verwendet. Es spiegelt jedoch nicht die wahre Massenauflösung des
Massenspektrometers wider. Die wahre Massenauflösung des Instruments ist aus
individuellen Schüssen
auf den Detektor 30 offensichtlich. Die individuellen Schüsse auf
den Detektor 22 können
auch auf der Grundlage des Zitterns, das aus den Differenzmessungen
bestimmt worden ist, akkumuliert und zugeordnet werden.
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In
der Realität
kann die Probe Ionen unterschiedlicher Verhältnisse von Ladung zu Masse
erzeugen, so dass die Detektoren 22 und 30 Signale erzeugen,
von denen jedes eine Reihe von Spitzen aufweist. Das Spektrometer
kann jedoch auf einen vernünftig
hohen Grad der Genauigkeit kalibriert werden, so dass es möglich wäre, festzulegen,
welche Spitzen dem gleichen Masse/Ladung-Verhältnis auf den zwei Detektoren
entsprechen.
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7 zeigt
eine teilweise modifizierte Version des Spektrometers, das mit dem
in 1 gezeigten Spektrometer identisch ist, abgesehen
vom Einschluss eines Einfangmittels, das eine Einfangzelle 62 umfasst,
die zwischen der Probenplatte 6 und der ringförmigen Elektrode 12 angeordnet
ist.
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Die
Aufgabe der Zelle 62 ist, eine hohe Massengenauigkeit zu
bewirken durch Berücksichtigen von
Variationen der Flugzeiten auf Grund von z. B.
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Variationen
der Spannungen, der Ejektionsgeschwindigkeiten und dergleichen.
Im Fall der MALDI-TOF ist es wünschenswert,
eine gleichmäßige Probenvorbereitung
und eine gute Kontrolle über
die Laserleistung zu haben, um die beste Massenauflösung zu
erzielen. Schwankungen dieser Parameter werden bis zu einem gewissen
Grad durch eine verzögerte
Extraktion kompensiert. Es wäre
jedoch von Vorteil, die Ionenquellen-Extraktionszeitpunkte von der
Zeitsteuerung des TOF-Massenspektrometers entkoppeln zu können.
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Die
bevorzugte Ausführungsform
der Einfangzelle ist eine zylindrische symmetrische Einfangzelle 62,
die nach der Probenplatte 6 positioniert ist. Ionen werden
von der Quelle extrahiert und in die Falle 62 injiziert,
wo sie innerhalb eines begrenzten Raumbereiches mittels Hochfrequenzfeldern
gehalten werden, die durch Anlegen geeigneter Spannungen an drei
ringförmige
Elektroden 64, 66 und 68 erzeugt werden.
Ein Impuls des Gases wird anschließend in die Zelle über ein
gepulstes Ventil von zwei gegenüberliegenden
Seiten geleitet, um einen Strahl zu bilden. Der mittels der Elektrode 66 definierte
Zellenbereich wird über Öffnungen 70 und 72,
die mit einer Vakuumquelle verbunden sind, gepumpt und bleibt unter
Hochvakuum.
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Die
Ionen in der Falle 62 unterliegen mehrfachen Niedrigenergiekollisionen
mit dem Hintergrundgas und migrieren zum Zentrum der Falle während der
Zeitperiode, in der der hohe Druck besteht. Die Ionen werden anschließend aus
der Falle in das Massenspektrometer ausgestoßen, wie vorher, indem ein Spannungsimpuls
an die Elektroden 12 angelegt wird. Der Impuls initiiert
den Startzeitpunkt für
das TOF-Massenspektrometer. Es ist ferner möglich, eine solche Vorrichtung
mit einer Dauerstrahlionenquelle, wie z. B. einem Elektrospray,
zu verwenden, wobei die Falle für
eine Zeitperiode vor dem Abkühlen
und Ausstoßen
in das Massenspektrometer gefüllt
wird. Eine beliebige andere Konstruktion der Falle, z. B. eine vierpolige
Ionenfalle, kann ebenfalls verwendet werden.
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Es
wird angenommen, dass verschiedene Modifikationen am Spektrometer
vorgenommen werden können,
ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Somit kann z. B. das
Spektrometer nur ein Reflektron aufweisen. Außerdem kann das Spektrometer
alternative Typen eines Detektors verwenden, z. B. Channeltrons
(Kanalelektronenvervielfacher) oder Dynode-Elektronenvervielfacher oder eine Bildstromerfassung.
