DE112012005396B4

DE112012005396B4 - Verfahren zur Tandem-Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometer

Info

Publication number: DE112012005396B4
Application number: DE112012005396.6T
Authority: DE
Inventors: Alexander Alekseevich Makarov
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2019-03-14
Anticipated expiration: 2032-12-25
Also published as: DE112012005396T5; GB2511239A; US20190180994A1; US10224193B2; GB201409655D0; US9748083B2; WO2013093114A2; US10541120B2; US20170372882A1; US20140346345A1; WO2013093114A3; GB201122178D0; GB2511239B

Abstract

Verfahren der Tandem-Massenspektrometrie, wobei das Verfahren für einen n-ten Scanzyklus umfasst:
(a) das Erzeugen von Ionen in einer Ionenquelle;
(b) das Auswählen eines Bereichs von Masse-Ladungs-Verhältnissen [M_P ... M_Q], M_P < M_Q aus den von der Ionenquelle erzeugten Ionen;
(c) das Unterteilen des Bereichs [M_P ... in eine Vielzahl L von unterschiedlichen Segmenten (L>1), wobei jedes i-te Segment Ionen über einen Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen (m_i... m_i + Δ m_i) umfasst und eine Teilmenge des Bereichs M_P ... M_Q ausbildet;
(d) das Unterwerfen der Ionen innerhalb zumindest eines ersten L_i der L Segmente einem ersten, relativ geringeren Fragmentiergrad F_i, F_i >=0), während Ionen innerhalb zumindest eines zweiten L_j der L Segmente einem zweiten, relativ höheren Fragmentiergrad F_j (F_j>F_i) unterworfen werden, sodass eine Fragmentierung zumindest mancher der Vorläufer-Ionen in dem zweiten Segment L_j verursacht wird;
(e) das Massenanalysieren der Vorläufer- und Fragment-Ionen aus der Vielzahl von Segmenten in dem n-ten Scanszyklus, um ein zusammengesetztes Spektrum für die Vorläufer- und Fragment-Ionen aus dem Massenbereich [M_P ... aufzunehmen.

Description

Fachgebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Tandem-Massenspektrometrie.
Hintergrund der Erfindung
Verschiedene Verfahren wurden entwickelt für die gezielte und ungezielte Analyse komplexer Gemische unter Verwendung der Tandem-Massenspektrometrie (MS).
Der herkömmliche Ansatz für die ungezielte Analyse (das heißt, Analyse ohne Vorwissen) eines Analyten ist, eine datenabhängige Selektion eines geeigneten Vorläufer-Ions eines bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z) durchzuführen. Beispielsweise kann der oder einer der intensivere(n) Peak(s) im Massenspektrum, der bisher nicht analysiert wurde, ausgewählt werden. Dieser geeignete Vorläufer kann anschließend fragmentiert und die Fragmente in einem MS/MS-Analyseverfahren detektiert werden.
Die Selektion/Isolation des geeigneten Vorläufer-Ions wird üblicherweise durch einen Quadrupol-Massefilter oder Linearfallenanalysator erreicht. Die Fragmentierung des geeigneten Vorläufers kann üblicherweise durch die Kollision des Vorläufer-Ions mit Gas- oder Ionen-Ionen- oder Ionen-Molekül-Reaktionen erreicht werden. Die Detektion der resultierenden Fragmente kann durch einen Quadrupol-Scan-Filter oder, vorzugsweise, durch die Verwendung eines Gesamt-Ionen-Analysators, wie etwa eines Time-of-Flight(TOF)-, Orbitrap™- oder Fournier-Transform-lon-Cyclotron-Resoncance(FTICR)-Analysators.
Ein Nachteil der obigen Anordnung ist, dass nur eine beschränkte Anzahl verfügbarer Vorläufer ein entsprechendes MS/MS-Spektrum erzeugen wird, aufgrund von Einschränkungen bei der Transmission und der Komplexität der Gemische. Folglich ist die Analysetiefe komplexer Gemische, wie sie sich etwa in den Bereichen der Proteomik, der Umwelt, Lebensmittel, Arzneimittelstoffwechsel und anderen Anwendungen finden, erheblich verringert.
Eine Alternative zu diesem herkömmlichen Ansatz setzt MS/MS ein, aber spaltet den Ionenstrahl von der Ionenquelle gemäß ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses in Pakete auf. Ein bestimmtes Paket oder Pakete wird/werden ohne andere der Pakete zu verlieren oder, alternativ dazu, parallel zu anderen der Pakete fragmentiert. Dieses Aufspalten in Pakete kann durch eine Scanvorrichtung durchgeführt werden, die Ionen auf einem breiten Massenbereich, wie etwa einer 3D-Ionenfalle, wie etwa in WO 03/103010 A1 offenbart, oder einer Linearfalle mit radialem Ausstoß, wie etwa in US 7,157,698 B2 offenbart, speichert. Alternativ dazu kann Paketspaltung durch die Verwendung pulsierter Ionenmobilitätsspektrometrie erreicht werden und einige geeignete Apparate und Verfahren werden in WO 00/70335 A2 bzw. US 2003/0213900 A1 offenbart. Noch weitere Alternativen umfassen verlangsamte Linearmassenspektrometer, vgl. beispielsweise WO 2004/085992 A2 oder Multi-Reflexions-Time-of-Flight-Massenspektrometer, wie in WO 2004/008481 A1 .
In allen oben genannten Fällen folgt auf die erste Stufe der Massenanalyse eine Schnellfragmentierung, beispielsweise in einer Kollisionszelle (vorzugsweise mit einem axialen Gradienten), oder die Verwendung eines pulsierten Lasers. Die Fragmente werden anschließend analysiert, erneut wird die Verwendung eines weiteren TOF-Massenspektrometers auf einer schnelleren Zeitskala als die Scandauer bevorzugt (die Schnellanalysezeiten werden auf dem Gebiet der Erfindung als „geschachtelte Zeiten“ bezeichnet). Das Gesamtleistungsverhalten ist jedoch beeinträchtigt, da jedem Scan nur eine sehr beschränkte Zeiteinheit zugewiesen wird (üblicherweise nicht mehr als 10-20 Mikrosekunden).
Diese Ansätze der sogenannten „zweidimensionalen MS“ stellen offensichtlich einen verbesserten Durchsatz bereit, ohne die Empfindlichkeit zu beinträchtigen. Diesbezüglich sind sie einer Variante der herkömmlichen MS/MS überlegen, werden zu einer Mehrkanalkonfiguration, in der eine Reihe paralleler Massenanalysatoren (üblicherweise Ionenfallen) verwendet werden, um jeweils einen Vorläufer auszuwählen, erweitert und anschließend werden seine Fragmente zu einem individuell zugeordneten Detektor ausgescannt (z.B. die Ionenfallenanordnung aus US 5,206,506 A oder die Mehrfachfallen aus US 2003/089846 A1 ).
Dennoch leiden alle derzeit dem Stand der Technik entsprechenden 2D-MS-Verfahren unter einer relativ geringen Auflösung der Vorläuferselektion (üblicherweise nicht mehr als 1 zu mehreren Atommasseeinheiten, (u)). Sie neigen auch dazu, unter einer relativ niedrigen Auflösekraft der Fragmentanalyse zu leiden - üblicherweise nicht mehr als ein paar Hundert bis ein paar Tausend (und stellen dadurch eine schlechte Massegenauigkeit bereit). Darüber hinaus basieren die bekannten 2D-MS-Verfahren auf der Verwendung von Fallenvorrichtungen, um eine hohe Einschaltdauer bereitzustellen. Solche Vorrichtungen haben eine Gesamtzykluszeit, die durch die Zykluszeit des langsamsten Analysators im System definiert wird. Moderne Ionenquellen produzieren einen Ionenstrom von bis zu Hunderten von pA, das heißt über 10⁹ Elementarladungen pro Sekunde. Somit müssen solche Fallenvorrichtungen, wenn der Voll-Scanzyklus durch den gesamten interessierenden Massenbereich 5 Millisekunden beträgt, in der Lage sein, bis zu 5 Millionen Elementarladungen anzuhäufen und dennoch eine wirksame Vorläuferselektion zu ermöglichen. Diese Schwierigkeiten haben solche Ansätze davon ausgeschlossen, in die etablierte Methode, die praktische Massenspektrometrie, einzutreten.
Als Kompromiss wurde daher ein alternatives Verfahren auf der Grundlage des Time-of-Flight(TOF)-Analysators entwickelt und ist auf dem Markt unter der Bezeichnung MS^e verfügbar. In diesem Ansatz werden Vorläufer-Ionen veranlasst, durch eine Fragmentier- oder Reaktionsvorrichtung alternierend bei höherer oder niedrigerer Energie hindurchzutreten, was zur Bildung von Produkt-Ionen im vorigen Fall führt (vgl. beispielsweise US 6,586,727 B2 und US 6,982,414 B2 ). Dies kann durch die Verwendung eines Q-TOF-artigen Instruments einfach bewerkstelligt werden, indem ein Quadrupol-Massefilter im Nur-HF-Modus betrieben wird, um derart eine Massendekade in die Gaskollisionszelle mit höherer Kollisionsenergie zu transmittieren, die ausreicht, um die Fragmentierung auszulösen. Dieses Verfahren wird beispielsweise in Bateman et. al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 13, S. 792-803 (2002) dargelegt. Das orthogonale Time-of-Flight-Massenspektrometer zeichnet das Massenspektrum des resultierenden Gemisches von Vorläufer und Fragment-Ionen auf. Es ist nicht erforderlich, das Gas aus der Kollisionszelle zu entfernen. Somit ist es durch das Verändern der Kollisionsenergie (üblicherweise von weniger als 10 V auf zwischen 30 und 70 V) möglich, zwischen dem Aufzeichnen des Spektrums, das hauptsächlich Vorläufer-Ionen zeigt, und des Spektrums, das das Gemisch aus Vorläufer-Ionen und ihrer Fragment-Ionen zeigt, zu alternieren.
In einem alternativen Verfahren zum Ändern der Kollisionsenergie können Ionen bei einer geeigneten Energie in die Fragmentierzelle geleitet werden, sodass eine signifikante Fragmentierung von hier zur Analyse auftritt. Als eine weitere Alternative kann es Ionen erlaubt sein, den Analysator direkt entlang eines anderen Pfades zu betreten, auf dem keine signifikante Fragmentierung auftritt. Ein solches Verfahren wird in US 7,759,638 B2 beschrieben.
In dem ersten Modus, worin eine relativ geringe Kollisionsenergie eingesetzt wird, findet keine - oder im Wesentlichen keine - Ionenfragmentierung statt, sodass Vorläufer-Ionen im resultierenden Massenspektrum relativ intensiver sein werden. In dem zweiten Modus, worin eine in Relation höhere Kollisionsenergie eingesetzt wird, werden die meisten oder tatsächlich alle der Vorläufer-Ionen fragmentiert, sodass in diesem zweiten Modus im resultierenden Massenspektrum die Fragment-Ionen in Relation intensiver sind. Somit können durch die geeignete Anpassung der Kollisionsenergie in den zwei Betriebsmodi, Vorläufer- und Produkt-Ionen einfach unterschieden werden. Das Verfahren kann zudem durch die Verwendung der chromatographischen Separation von Analyten erweitert werden, was auch eine zeitliche Dimension einführt. Das heißt, das Verfahren kann die Abhängigkeit des Ionenstroms von der Retentionszeit nutzen. Daraus ist es möglich, Elutionsprofile von verschiedenen Fragment-Ionen, mit jenen von Vorläufern zu gruppieren, und somit ist es wiederum möglich, eine Familie von Vorläufer-Ionen mit ihren Fragmenten von einer anderen Familie von Vorläufer-Ionen zu trennen. Darüber hinaus macht die Verwendung von hochauflösenden/genauen Massenanalysatoren eine solche Gruppierung zuverlässiger.
Nichtsdestoweniger leidet der von Bateman und anderen vorgeschlagene MS^e-Ansatz unter einer Reihe von Einschränkungen. Erstens beschränkt die extrem hohe Anzahl von Vorläufern und der Bereich ihrer Konzentrationen in der modernen Massenspektrometrieanalyse die Anwendbarkeit dieses Verfahrens ausschließlich auf die intensivsten Peaks: die Spektren werden bei der Fragmentierung in den niedrigeren Intensitäten sehr dicht. Zweitens gibt es keine Möglichkeit koeluierende Peaks zu unterscheiden, was für komplexe Gemische zu einer erhöhten Anzahl falscher Identifikationen führt. Drittens und in Folge des oben Genannten funktioniert das Verfahren nicht für die Infusion, wenn keine chromatographischen Peaks ausgebildet werden. Viertens zeigen die Hochenergie-Fragmentierspektren deutlich mehr Peaks als die Niedrigenergie(Nicht-Fragmentier)-Spektren und können unter einer Überbesetzung der Spektren leiden. Letzteres ist besonders ausgeprägt, wenn eine einzelne Analytenklasse, wie etwa Peptide, analysiert wird, die alle aus gewöhnlichen Aminosäuren aufgebaut sind.
WO 2010/120496 A1 beschreibt eine Anordnung, in der eine Mehrfach-Hochenergie-Kollisionsdissoziation(HCD)-Zellfunktionalität oder eine C-Fallen-Zellfunktionalität eines massegenauen Massenanalysatorsystems eingesetzt wird, um die Durchführung eines separaten Vollscan-MS-Ereignisses zu vermeiden. Stattdessen wird ein Scan-Ereignis ersetzt, das alle Ionen, die aus Hoch- und Niedrigkollisionsenergiefüllungen stammen, gleichzeitig detektiert. Dieses simultane Analyseverfahren erlaubt, alle Gesamtionen-MS²-Experimente signifikant schneller auszuführen, als wenn einzelne Spektren bei festgelegter Kollisionsenergie erworben werden. Jedoch kann dieses Verfahren dennoch Spektren ergeben, die dichter als gewünscht sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, zumindest einige der vorangegangenen Probleme des bisherigen Stands der Technik anzusprechen.
In Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren der Tandem-Massenspektrometrie nach Anspruch 1 bereitgestellt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung behebt somit Einschränkungen im Stand der Technik an durch das Bereitstellen einer Segmentierung eines relativ großen Bereichs von Masse-Ladungs-Verhältnis-Ionen, die üblicherweise als quasi-kontinuierlicher Ionenstrom von der Ionenquelle in einer Vielzahl von Segmenten ankommt. Jedes Segment wird einem unabhängig ausgewählten Fragmentierungsgrad unterworfen. In den einfachsten Ausführungsformen wird gegebenenfalls jedes Segment fragmentiert oder nicht fragmentiert, sodass die Gesamtionenpopulation über den relativ großen Bereich, der die verschiedenen Segmente ausbildet, sowohl fragmentierte als auch unfragmentierte Segmente enthält. Die resultierende Population kann unter Verwendung eines hochauflösenden Massenanalysators massenanalysiert werden entweder als ein Gemisch oder separat, wobei die separaten Spektren zusammengeheftet werden.
Die Unterteilung des in Relation breiteren Massenbereichs in eine Vielzahl relativ schmälerer Segmente erlaubt der Ionenpopulation, die eine Kombination oder ein Gemisch aus jedem der resultierenden Vorläufer und Fragmente ist, in Hinblick auf die Einschränkungen der Analyse eingestellt oder optimiert zu werden. Beispielsweise ist es durch geeignete Segmentierung eines breiten Massenbereichs möglich, die Vorläufer-Ionen, die relativ höhere m/z in Relation zu den Vorläufern mit geringeren m/z zu „gewichten“, um die Überfragmentierung im Falle der kleineren m/z und/oder der höheren z zu kompensieren, und gleichermaßen eine Unterfragmentierung in Bezug auf Ionen mit höheren m/z zu kompensieren. Gleichermaßen ist es möglich, die Tatsache zu kompensieren, dass Hochenergie(Fragmentier)-Spektren üblicherweise signifikant mehr Peaks als Niedrigenergiespektren ohne Fragmentierung zeigen, da natürlich ein einzelner Vorläufer üblicherweise mehrere Fragmente produzieren wird. Sind nur manche der Segmente fragmentiert, wird die Gesamtanzahl der Fragment-Ionen in der Gesamtionenpopulation reduziert, da in Bezug auf zumindest einige der Segmente keine Fragmentierung stattfindet. Somit ist eine mögliche Überbesetzung der Peaks in den Spektren im Vergleich zu dem bekannten MS^e-Verfahren, bei dem Ionen in einem Spektrum über den Gesamtmassenbereich fragmentiert werden, reduziert.
Vorzugsweise ist die Segmentierung des relativ breiteren Massenbereichs datenabhängig. Beispielsweise kann ein Vorscan durchgeführt werden, um vorläufige Daten in Bezug auf den Inhalt des zu untersuchenden relativ breiten Massenbereichs zu erhalten. Dieser Vorscan kann anschließend eingesetzt werden, um die relative Breite eines jeden Segments (die der von anderen Segmenten nicht gleich sein muss), in Bezug auf den Bereich der Masse-Ladungs-Verhältnisse innerhalb eines jeden Segments, zu bestimmen. Andere Parameter können auch eingestellt werden, um mit Bezug auf jedes Segment eine bestimmte Anzahl von Ionen, die transmittiert werden sollen, festzulegen. In einem getrennten Schritt kann der Fragmentiermodus für jedes Segment ausgewählt werden - das heißt, ob die Fragmentierung stattfinden soll oder nicht. Während in einer bevorzugten Ausführungsform eine erste, relativ geringe Fragmentierenergie dazu führt, dass im Wesentlichen keine Vorläufer-Ionen fragmentiert werden, und während, wenn eine zweite, relativ hohe Fragmentierenergie beaufschlagt wird, während im Wesentlichen eine vollständige Fragmentierung stattfindet, können in Bezug auf einige der Segmente auch/stattdessen andere, partielle Fragmentierschemata eingesetzt werden. Auf jeden Fall ist der Grad der Fragmentierung bei Beaufschlagen der relativ höheren Fragmentierenergie größer, als wenn die relativ niedrigere Fragmentierenergie beaufschlagt wird. Die Einstellung der Fragmentierenergie auf diese Weise kann den Fragmentiermodus in Ausführungsformen, die die Kollisionsfragmentierung einsetzen, auswählen. Jedoch können in anderen Ausführungsformen andere Fragmentierverfahren eingesetzt werden, wie etwa die Elektronentransferdissoziation (ETD), Elektroneneinfangdissoziation (ECD); Elektronenionisierungsdissoziation (EID); ozoninduzierte Dissoziation (OzID), Infrarotmultiphotonendissoziation (IRMPD) oder UV-Dissoziation. In diesen Ausführungsformen kann der Fragmentiermodus für jedes Segment auf andere Arten als durch die Einstellung der Fragmentierenergie ausgewählt werden, wie etwa durch das Einstellen eines Elektronen-, Photonen-, Ionen- oder Reaktantenflusses in die Fragmentierzelle oder der Interaktionszeit, gegebenenfalls in Kombination mit dem Einstellen der Spannung der Fragmentierzelle.
In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen können mehrere Zyklen oder Scans eines bestimmten relativ breiten Massenbereichs durchgeführt werden, wobei in jedem Fall beispielsweise für die verschiedenen Segmente, verschiedene Fragmentierschemata, verschiedene Segmentierungsstrategien und so weiter, verwendet werden. Die Ergebnisse der vielen verschiedenen Segmentierungs- und Fragmentierschemata können miteinander verglichen werden, um das Dekodieren der Massenspektren und das Identifizieren der Vorläufer- und Fragment-Ionen zu erlauben. Es wäre von Vorteil, wenn jedes Spektrum dieselbe oder eine ähnliche Anzahl von Fragmenten und Vorläufern, mit unterschiedlichen Verteilungen von m/z und Intensitäten, aufweisen würde, wodurch die Überbesetzung von Hochenergiespektren vermieden würde, was ein oben im Abschnitt „Hintergrund“ beschriebenes Symptom des MS^e-Verfahrens ist. Eine solche gesteuerte zeitliche Verteilung der Intensitäten erlaubt, das Dekodieren unabhängig von der chromatographischen Separation durchzuführen. Somit können sogar koeluierende Analyten getrennt werden.
Die Analyse der resultierenden Ionenpopulation wird vorzugsweise unter Verwendung eines hochauflösenden Analysators, wie etwa einer kreisförmigen Falle, einer FT-ICR-Falle oder eines TOF-Massenanalysators oder einer beliebigen Kombination aus den dreien, durchgeführt.
In Übereinstimmung mit dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 20 bereitgestellt.
Verschiedene spezifische Kombinationen können eingesetzt werden, um den Massefilter und Massenanalysator bereitzustellen. Beispielsweise kann der Massefilter eine Quadrupol-Ionenfalle (3D-Ionenfalle) oder eine Linearfalle sein. Der Massenanalysator kann eine Time-of-Flight- oder eine kreisförmige Falle oder eine FT-ICR-Falle sein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die Fragmentierzelle abseits eines Pfades von der Ionenquelle, durch den Massefilter hin zum Massenanalysator angeordnet. Durch das Platzieren der Fragmentierzelle entlang eines Ausläufers oder einer „Sackgasse“ abseits des Pfades von der Ionenquelle über die Masseselektionsvorrichtung hin zum Massenanalysator können langsame Fragmentierverfahren, wie etwa Elektronentransferdissoziation (ETD), Elektroneneinfangdissoziation (ECD); Elektronenionisierungsdissoziation (EID) und dergleichen; ozoninduzierte Dissoziation (OzID), Infrarot-Multiphotonendissoziation (IRMPD) oder UV-Dissoziation eingesetzt werden.
Aspekte der vorliegenden Erfindung erlauben somit die parallele Modulation und die De-Multiplexierung multipler MS/MS-Spektren und erhöhen somit den Durchsatz im Vergleich zu herkömmlichen MS/MS-Verfahren deutlich.
Das Verfahren und der Apparat, die die vorliegende Erfindung verkörpern, sind besonders wirksam mit modernen Ionenquellen mit hoher Helligkeit, die üblicherweise Ionenströme von über 100 pA aufweisen.
Die Erfindung kann in einer Reihe von Arten und in verschiedenen Ausführungsformen in die Praxis umgesetzt werden und wird nun mit Bezug auf die beiliegenden Figuren beschrieben.
Figurenliste

1 zeigt eine erste Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers, das für die Implementierung der Erfindung geeignet ist;
2 zeigt eine zweite Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers für die Umsetzung von Aspekten der vorliegenden Erfindung;
3 zeigt eine dritte Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers, das Aspekte der vorliegenden Erfindung verkörpert;
4 zeigt eine vierte Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers, das Aspekte der vorliegenden Erfindung verkörpert;
5A und 5B zeigen eine fünfte und sechste Ausführungsform von Aspekten der vorliegenden Erfindung;
6 zeigt ein Flussdiagramm von Stufen, die einen Aspekt der vorliegenden Erfindung verkörpern;
7A und 7B zeigen eine Seiten- und Oberansicht einer siebten Ausführungsform von Aspekten der vorliegenden Erfindung, einschließlich eines nichtfangenden orthogonalen Ionenbeschleunigers;
8A und 8B zeigen alternative Anordnungen des orthogonalen Ionenbeschleunigers aus 7a und 7b;
9 zeigt ein vereinfachtes Beispiel drei separater Spektren, die jeweils über denselben relativ breiten Massenbereich abgeleitet wurden, aber verschiedene Segmentfragmentierungsprotokolle für die Entfaltung von Peaks verwenden; und
10 zeigt die resultierende Abhängigkeit der Ionenintensitäten von der Scanzahl, um die relativen Häufigkeiten unter Verwendung verschiedener Fragmentierprotokolle für verschiedene Segmente über mehrere Zyklen zu veranschaulichen.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die 1 bis 5, 7 bzw. 8 zeigen die erste bis siebente Ausführungsform von Tandem-Massenspektrometern, die für die Implementierung von Verfahren, die die vorliegende Erfindung verkörpern, geeignet sind. Während jede Ausführungsform ein Tandem-Massenspektrometer veranschaulicht, das, wenn es in Übereinstimmung mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren betrieben wird, gegenüber ähnlichen Tandem-Massenspektrometern, die in Übereinstimmung mit dem Stand der derzeitigen Technik entsprechenden Verfahren betrieben werden, Vorteile bietet, haben die nachfolgenden spezifischen Beispiele nichtsdestoweniger eine Hierarchie in der Bevorzugung. Insbesondere werden die fünfte, sechste und siebte Ausführungsform aus 5a, 5b, 7a, 7b, 8a und 8b gegenüber der vierten Ausführungsform aus 4 bevorzugt, welche wiederum stärker bevorzugt wird als die dritte Ausführungsform aus 3, dann die zweite Ausführungsform aus 2, wobei die erste Ausführungsform aus 1 die am wenigsten bevorzugte Ausführungsform darstellt. Die Ausführungsformen aus 7a, 7b, 8a und 8b stellen eine alternative und besonders bevorzugte Anordnung bereit, die eine ähnliche Funktion zu jener der Ausführungsformen aus 5a und 5b bereitstellt.
Bezugnehmend auf 1, wird eine erste Ausführungsform eines Apparates gezeigt, der für die Implementierung eines die vorliegende Erfindung verkörpernden Verfahrens geeignet ist. Die Anordnung aus 1 wird im Stand der Technik als Q-TOF bezeichnet.
Im Detail ist die Anordnung aus 1 ein Tandem-Massenspektrometer 10 mit einer Ionenquelle 20. Die Ionenquelle 20 ist in der abgebildeten Ausführungsform eine Elektrospray-Ionenquelle, kann aber jede andere geeignete Form von Ionenquelle, wie etwa z.B. eine MALDI-Ionenquelle, sein.
Ionen aus der Ionenquelle 20 treten durch eine Ionenoptik/Ionenführung 30 hindurch und in einen Quadrupol-Massefilter 40 ein. Der Quadrupol-Massefilter 40 ist in der Lage, ein relativ schmales Fenster von Masse-Ladungs-Verhältnissen von Ionen von der Ionenquelle zu selektieren, abhängig von den an die Quadrupol-Elektroden beaufschlagten Spannungen. Die Ionen in dem relativ schmalen Massefenster, die durch den Quadrupol-Massefilter 40 hindurchtreten gelassen werden, treten anschließend in eine zwischengeschaltete Fragmentierzelle 50 ein, wo sie gegebenenfalls fragmentiert werden, auf eine Art, die in Verbindung mit 6 untenstehend im Detail beschrieben werden wird. Vorläufer- und/oder Fragment-Ionen, die die Fragmentierzelle 50 verlassen, treten stromab in eine Ultrahochvakuumskammer ein, die einen Time-of-Flight(TOF)-Massenspektrometer 60 umfasst. Ionen bewegen sich durch eine Driftregion innerhalb des Time-of-Flight-Massenspektrometers und werden in Richtung eines Detektors 70 zurückreflektiert. Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sein wird, haben Ionen mit unterschiedlichen Masse-Ladungs-Verhältnissen unterschiedliche Flugzeigen durch das Time-of-Flight-Massenspektrometer 60, sodass die Ankunftszeit der Ionen bei dem Detektor 70 einen Hinweis auf ihr Masse-Ladungs-Verhältnis gibt.
Das Tandem-Massenspektrometer 10 wird von einer Steuereinheit 80 gesteuert, die insbesondere (aber nicht ausschließlich) den Quadrupol-Massefilter 40 und die Fragmentierzelle 50 steuert und einen Ausgabewert von dem Detektor 70 empfängt. Die Steuereinheit 80 kann zur Datenspeicherung und Vor- oder Nachbearbeitung mit einem externen Computer 90 kommunizieren.
Das Betreiben des Apparates aus 1, aber nicht das der Steuereinheit, und das Verfahren, mit dem er eingesetzt wird, werden ausführlich in US 6,586,727 B2 und US 6,982,414 B2 dargelegt.
Bezugnehmend auf 6 wird ein Flussdiagramm, das die Schritte eines die vorliegende Erfindung verkörpernden Verfahrens veranschaulicht, gezeigt. Die Verfahrensschritte werden in Verbindung mit 6 und mit Verweis auch auf 1 beschrieben.
In einem ersten Schritt 600 wird ein Vorscan der Ionen von der Ionenquelle 20 durch das angeordnete Tandem-Massenspektrometer 10 durchgeführt, um eine grobe Bewertung der Inhalte des Analyten innerhalb der Ionenquelle bereitzustellen. Basierend auf den Ergebnissen des Vorscans wird ein bestimmtes Schema oder ein Algorithmus für die Analyse der Ionen von der Ionenquelle ausgewählt. Dieses Schema oder Algorithmus, das/der in Zusammenhang mit den folgenden Schritten von 6 nachfolgend erklärt wird, kann entweder in Echtzeit erstellt werden oder kann alternativ dazu aus einer „Bibliothek“ voreingestellter Algorithmen ausgewählt werden.
Als Alternative zu einem Vorscan, insbesondere wenn ein bestimmter Analyt vermutet wird, kann eine Software, die innerhalb der Steuereinheit 80 oder des Computers 90 (oder andernorts) betrieben wird, einen voreingestellten Algorithmus auswählen.
Bei Schritt 610 wird eine Entscheidung über die Anzahl der Scanzyklen, die in Bezug auf einen bestimmten Analyten durchgeführt werden, getroffen. Beispielsweise kann ein einzelner Scanzyklus durchgeführt werden, sodass Ionen zwischen einer oberen und einer unteren Grenze eines Massenbereichs von der Ionenquelle nur einmalig analysiert werden. Alternativ dazu werden jedoch vorzugsweise mehrere Scanzyklen durchgeführt. In diesem Fall können mehrere Scanzyklen über einen ähnlichen Massenbereich von Ionen von der Ionenquelle durchgeführt werden oder über einen unterschiedlichen Massenbereich und so weiter. Das Durchführen von mehreren Analysezyklen von Ionen von einer Ionenquelle erlaubt die Dekonvolution von MS/MS-Spektren und dieses Verfahren wird nachfolgend mit Bezug auf 8 und 9 im Detail beschrieben.
Bei Schritt 620 aus 6 wird der zu analysierende relativ breite Massenbereich der Ionen von der Ionenquelle für den jeweiligen Scanzyklus (und für mehrere Scanzyklen, wenn die Durchführung einer solchen Mehr-Zyklus-Analyse vorgeschlagen wird) ausgewählt. In 6 wird dieser Massenbereich identifiziert als [M_P... M_Q].
Als nächstes wird dieser relativ breite Massenbereich in Schritt 630 für den n-ten Scan in L Segmente unterteilt, wobei L größer ist als 1. In anderen Worten wird der Massenbereich [M_P... M_Q] in zumindest zwei Segmente unterteilt.
In Schritt 640 wird jedes i-te Segment ausgewählt, Ionen in einem unterteilten Massenbereich [m_i... m_i + Δ m_i] (i = 1 ... L) von dem gesamten Massenbereich [M_P... M_Q] zu umfassen. Eine Transmissionszeit t_i des Massefilters wird ebenfalls für diesen unterteilten Massenbereich ausgewählt. Das Ziel ist es, eine Reihe von Ionen K_i zu identifizieren, die in Bezug auf das i-te Segment transmittiert werden sollen.
Ein Fragmentierstatuszeichen F_i wird mit Bezug auf ein i-tes der L Segmente auf 0 oder 1 gesetzt. In einer einfachsten Ausführungsform setzt das Fragmentierstatuszeichen die Fragmentierenergie innerhalb der Fragmentierzelle 50 entweder auf 0 Volt (Statuszeichen = 0, „geringe Fragmentierung“) oder eine einzelne, relativ höhere Fragmentierenergie E_i von etwa mehreren Dutzend Volt, beispielsweise 70-80 Volt (Statuszeichen = 1, „hohe Fragmentierung“). Dies garantiert, dass im Wesentlichen alle Vorläufer-Ionen durch die Fragmentierzelle 50 passieren, wenn das Fragmentierstatuszeichen auf 0 gesetzt wurde, während im Wesentlichen alle der Vorläufer-Ionen in Fragment-Ionen fragmentiert werden, wenn das Fragmentierstatuszeichen auf 1 gesetzt wurde. Wurde die Fragmentierenergie auf ein relativ höheres Niveau gesetzt, ist der Fragmentiergrad jedoch in jedem Fall höher als wenn die Fragmentierenergie auf ein relativ niedrigeres Niveau gesetzt wurde. Im Allgemeinen setzt das Statuszeichen 0 die Fragmentierenergie innerhalb der Fragmentierzelle auf eine relativ niedrigere Fragmentierenergie E_i (E_i≥0), beispielsweise von weniger als 10 Volt, während das Fragmentierstatuszeichen 1 die Fragmentierenergie auf eine relativ höhere Fragmentierenergie E_i von mehreren Dutzend Volt, z.B. 30-80 Volt, setzt. In einer weiteren Ausführungsform können jedoch mehrere Statuszeichen gesetzt werden, wie etwa F_i = 0, 1, ... s, wobei s kleiner oder gleich L ist. Dies erlaubt beispielsweise den Einsatz datenabhängiger Fragmentierenergien, sodass Ionen in bestimmten Segmenten eine unterschiedliche Fragmentierenergie erfahren, oder dennoch eine Fragmentierenergie ungleich null, im Vergleich zu Ionen in anderen Segmenten.
Zurückkehrend zu 6 kann die Zahl K_i unter Verwendung der automatischen Verstärkungsregelung (AGC) ausgewählt werden, wobei die Anzahl der ausgewählten Ionen von den Raumladungseffekten und so weiter abhängt. Ein solches Verfahren erlaubt beispielsweise die Kompensation der relativen Überfragmentierung von Ionen mit einem geringeren Masse-Ladungsverhältnis oder einer höheren z und der relativen Unterfragmentierung von Ionen mit höherem Masse-Ladungs-Verhältnis, um eine gleichmäßigere Verteilung von Vorläufer- und Fragment-Ionen über das gesamte Spektrum des ausgewählten Massenbereichs [M_P ... M_Q] zu ermöglichen.
Als Endstufe des Prozesses wird in Schritt 660 für einen gegebenen Scanzyklus n ein Spektrum von Intensität versus Masse-Ladungs-Verhältnis für jedes der L Segmente erhalten. Das gesamte Spektrum, das Vorläufer-Ionen von manchen der Segmente über den Massenbereich und Fragment-Ionen von anderen Segmenten über den Massenbereich (gegebenenfalls mit einer Kombination aus Vorläufer- und Fragment-Ionen aus manchen Segmenten) umfasst, wird innerhalb der Steuereinheit und/oder dem externen Computer 90 für eine nachfolgende Analyse gespeichert.
Das Gesamtmassen-MS/MS-Spektrum aus dem segmentierten Massenbereich kann auf eine Reihe von Wegen erhalten werden. In der Anordnung von 1 können beispielsweise Ionen eines ersten Segments i = 1 des gesamten zu analysierenden Massenbereichs [M_P ... über eine erste Zeitspanne t₁ durch den Quadrupol-Massefilter 40 hindurchtreten gelassen werden durch das Beaufschlagen geeigneter Spannungen durch die Steuereinheit 80 und die Stabelektroden des Quadrupol-Massefilters 40. Dieser relativ beschränkte Massenbereich wird gegebenenfalls anschließend fragmentiert, abhängig von dem durch die Steuereinheit 80 auf die Fragmentierzelle 50 gesetzten Statuszeichen, und an das Time-of-Flight-Massenspektrometer 60 zur Separation und Analyse weitergegeben. Während einer kurzen Zeitspanne Δt₁ können die an die Elektroden des Quadrupol-Massefilters 40 beaufschlagten Spannungen von der Steuereinheit 80 eingestellt werden und während dieses Zeitraumes können Ionen ausgeschieden werden (da sie ansonsten möglicherweise eine unbestimmte mittlere Fragmentierenergie erfahren könnten). Anschließend können während einer zweiten Transmissionszeit t₂ für das zweite Segment i = 2 Ionen eines zweiten untergeordneten Massenbereichs innerhalb des gesamten zu analysierenden Massenbereichs durch den Quadrupol-Massefilter 40 transmittiert werden, während andere Ionen ausgeschieden oder anderweitig nicht an die Fragmentierzelle 50 weitergegeben werden. Erneut können Ionen aus diesem zweiten untergeordneten Massenbereichs in Übereinstimmung mit dem von der Steuereinheit 80 auf sie gesetzten Statuszeichen, gegebenenfalls von der Fragmentierzelle 50 fragmentiert werden und diese Ionen werden anschließend an den TOF-Massenanalysator 60 weitergegeben. In diesem Sinne wird ein nahezu kontinuierlicher Strom aus Vorläufer- und/oder Fragment-Ionen von jedem der L Segmente abgenommen, unterbrochen nur durch kurze Zeitspannen Δt_i, in denen die Spannungen an die Elektroden des Quadrupol-Massefilters geändert werden.
Alternativ dazu können die von der Fragmentierzelle 50 ausgegebenen Ionen (ob unfragmentierte Vorläufer-Ionen, Fragmente oder eine Kombination aus beiden) jedoch in einem externen sekundären Ionenspeicher (nicht gezeigt in 1) stromab der Fragmentierzelle 50, aber stromauf des TOF-Massenanalysators gespeichert werden. Dies ermöglicht das gemeinsame Analysieren von Ionen aus mehreren Segmenten, wenn der sekundäre Ionenspeicher in den TOF-Massenanalysator entleert wird. Da jedoch einer der Vorzüge der Q-TOF-Anordnung aus 1 ist, dass sie quasi-kontinuierliche Massenanalyse erlaubt, wird eine externe Speicherung und die gemeinsame Analyse von Ionen aus mehreren Segmenten in dieser Ausführungsform nicht bevorzugt.
Zusätzlich oder alternativ dazu können die in WO 2005/093783 A2 beschriebenen Verfahren verwendet werden, um Spektren aus jedem oder einigen der Segmente L „zusammenzuheften“ um ein einziges, zusammengesetztes Spektrum auszubilden.
Sobald das zusammengesetzte Spektrum für Vorläufer- und Fragment-Ionen aus dem gesamten Massenbereich M_P ... M_Q für den n-ten Scanzyklus aufgenommen wurde, wird das Verfahren für einen (n+1)-ten Scanzyklus wiederholt. In diesem nachfolgenden Scanzyklus können, wie oben erwähnt, einer oder mehrere der Parameter eingestellt werden. Beispielsweise kann einer oder mehrere des Massenbereichs M_P ... M_Q, die Anzahl der Segmente L, die Breite eines jeden Segments (in Bezug auf die obere und untere Grenze des untergeordneten Massenbereichs), die Transmissionszeit für jedes Segment, etc. variiert werden. Die Schritte 620 bis 670 werden anschließend wiederholt, bis alle N Scanzyklen abgeschlossen wurden und alle Massenspektren gespeichert wurden. Das Verfahren für die Erfassung von Massenspektren wird anschließend beendet. Die Analyse und Dekonvolution der Spektren kann anschließend wie unten mit Verweis auf die 9 und 10 durchgeführt werden.
Der grundlegende Vorzug des die vorliegende Erfindung verkörpernden Verfahrens unter Verwendung des Apparates aus 1 ist, dass es im Verhältnis zum herkömmlichen Einzel-Vorläufer-MS/MS-Verfahren möglich ist, Spektren langsamer als die Verweildauer des Quadrupol-Massefilters 40 zu speichern. Die Verweildauer des Quadrupol-Massefilters 40 kann für moderne Ionenquellen mit hoher Helligkeit weniger als ein paar Millisekunden betragen. Das die vorliegende Erfindung verkörpernde Verfahren hat auch Vorzüge im Vergleich mit dem bekannten MS^e-Verfahren, bei dem nur ein einziges Massesegment (L=1), d.h. der gesamte Massenbereich, mit hoher und niedriger Fragmentierenergie analysiert wird.
Bezugnehmend nun auf 2 wird eine zweite Ausführungsform eines Apparates, der für die Verwendung im Verfahren der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, gezeigt.
In 2 weist ein Tandem-Massenspektrometer 100 eine Ionenquelle 20 auf, die wiederum als Elektrospray-Ionenquelle dargestellt wird, aber jede andere geeignete Form einer quasi durchgehenden oder pulsierten Ionenquelle haben kann.
Ionen aus der Ionenquelle 20 bewegen sich durch Ionenoptiken 30 und in eine Linearfalle 110. Die Linearfalle kann eine Quadrupol-Ionenfalle sein oder kann stattdessen Stabelektroden einer höheren Ordnung (sechsfach oder achtfach) aufweisen.
Die Linearfalle 110 speichert Ionen aus der Ionenquelle 20 innerhalb eines ausgewählten untergeordneten Massenbereichs (Segment) in Übereinstimmung mit dem ausgewählten Algorithmus (6, insbesondere Schritt 630). Gespeicherte Ionen des ausgewählten Segments werden anschließend durch Einstellen der Gleichspannung an den Endkappen davon in bekannter Weise aus der Linearfalle ausgestoßen, sodass die Ionen durch zweite Ionenoptiken 120 in eine gekrümmte oder C-Falle 130 hindurchtreten. Wie Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen hat die C-Falle 130 eine gekrümmte Längsachse. Ionen aus der Linearfalle 110 werden entlang der gekrümmten Längsachse der C-Falle 130 transferiert und passieren gegebenenfalls durch dritte Ionenoptiken 160 in die Fragmentierzelle 50, die sich somit in einer „Sackgassen-“ Position abseits des Pfades von der Quelle durch die Linearfalle 110 und C-Falle 130 in eine kreisförmige Falle, wie etwa ein Orbitrap™-Massenanalysator 150, befindet.
Für die Ionen eines Segments, in dem keine Fragmentierung vorgesehen ist (Fragmentierstatuszeichen F = 0), wird der Offset der Zelle 50 reduziert, sodass die Ionenenergie gering genug ist, um die Fragmentierung zu vermeiden. Für die Ionen eines Segments, in dem eine Fragmentierung vorgesehen ist (Fragmentierstatuszeichen F = 1), wird der Offset der Zelle 50 verändert, sodass die Ionenenergie hoch genug ist, um die Fragmentierung mit einer optimalen Abdeckung (üblicherweise bei 30-50 eV pro Vorläufer m/z 1000) zu gewährleisten. Da vorhergehende Ioneninjektionen in die Zelle 50 bereits in ihr thermalisiert wurden, werden sie weder verloren noch durch das Hinzufügen zusätzlicher Injektionen beeinträchtigt, da sie innerhalb der Zelle 50 verbleiben und somit von der Veränderung ihres Offsets nicht betroffen sind. Nachdem alle Segmente injiziert und fragmentiert oder nur gespeichert wurden, werden sie erneut durch optionale dritte Ionenoptiken 160 zurück in die C-Falle 130 ausgestoßen. Sie werden anschließend entlang der gekrümmten Längsachse der C-Falle 130 gespeichert bevor sie erneut orthogonal durch die Ionenlinse 140 in den Orbitrap™-Massenanalysator 150 ausgestoßen werden.
Ein von den Ionen erhaltener Bildstrom wird einer Fourier-Transformation unterworfen, um ein Massenspektrum nach Erkenntnissen auf dem Gebiet der Erfindung herzustellen.
Als eine Variante dieses Verfahrens könnten alle Segmente in zwei Schritten verarbeitet werden: in einem ersten Schritt werden nur jene Segmente mit F=1 in die Fragmentierzelle 50 injiziert, dort gespeichert und anschließend in die C-Falle 130 retourniert. In einem zweiten Schritt werden alle jene Segmente mit F=0 in die C-Falle transmittiert, ohne jemals in die Fragmentierzelle 50 einzutreten. Dieser Ansatz wird bevorzugt eingesetzt, wenn in der Fragmentierzelle 50 keine Kollisionsaktivierung, wie etwa Elektronentransferdissoziation (ETD), Elektroneneinfangdissoziation (ECD), Elektronenionsierungsdissoziation (EID) und dergleichen; ozoninduzierte Dissoziation (OzID), IRMPD, UV-Dissoziation und so weiter verwendet wird. Praktisch ist dieses Verfahren äquivalent zu der Spaltung der Fragmentierzelle 50 in zwei Regionen: eine frei von Aktivierung und eine weitere, der Aktivierung unterworfene.
Die verschiedenen Bestandteile des Tandem-Massenspektrometers 100 aus 2 werden erneut von einer Steuereinheit 80 gesteuert. Die Steuereinheit steuert die Linearfalle 110, um die Spannungen an den Stäben und die Gleichspannung an den Endkappen einzustellen, um wiederum einen bestimmten Massenbereich auszuwählen und diesen anschließend in die C-Falle auszustoßen. Die Steuereinheit steuert die C-Falle 130, um die empfangenen Ionen orthogonal zum Orbitrap™ 150 und/oder axial zu der Fragmentierzelle auszustoßen, in Übereinstimmung mit dem vorausgewählten Algorithmus. Die Steuereinheit steuert auch die Fragmentierzelle selbst, sodass eine geeignete Fragmentierenergie (oder -energien) an die Ionen in Bezug auf jedes Segment angewandt werden können. Letztendlich kann die Steuereinheit 80 dazu konfiguriert werden, die Daten von dem Bildstromdetektor des Orbitrap™-Massenanalysators 150 für die Verarbeitung und/oder Weiterübertragung auf einen externen Computer 90 zu erhalten.
Jeder der Bestandteile innerhalb des Tandem-Massenspektrometers 100 wird sich, selbstverständlich, in Vakuumkammern befinden, die unterschiedlich gepumpt werden können und das unterschiedliche Pumpen wird durch die Referenznummern 25 und 26 in 2 angedeutet.
Das Verfahren der Verwendung des Apparats aus 2 befolgt erneut die Schritte aus 6. Wie mit der Anordnung aus 1 kann sich ein zweites Speichermedium stromab der Fragmentierzelle 50 befinden, sodass die Ionen aus mehreren Segmenten vor der Analyse im Orbitrap™- Massenanalysator 150 in einer einzelnen Stufe zusammengefasst werden können.
Der Vorteil des die vorliegende Erfindung verkörpernden Verfahrens unter Verwendung des Apparats aus 2 ist darauf zurückzuführen, dass die Füllzeit für ein breites Massenbereichsspektrum üblicherweise mehr als 10-mal so kurz wie der kürzeste Detektionszyklus des Orbitrap™-Analysators sein wird. Aus diesem Grund kann diese „freie“ Zeit zum Füllen der C-Falle 130 oder der zweiten Ionenspeichervorrichtung mit unterschiedlichen Unterpopulationen von Ionen mit gesteuerten Intensitäten, Fragmentiergraden und so weiter genutzt werden.
Von einem praktischen Standpunkt aus ist es in der Anordnung aus 2 nutzbringend, die Segmentierung eines Massenbereichs auf weniger als 20 Segmente einzuschränken, wobei der gesamte zu analysierende Massenbereich (d.h. Mp ... M_Q) zwischen 10 und 100.000 u liegt, noch üblicher zwischen m/z 100 bis 2000. Schlussendlich wird eine Gesamttransmissionszeit Σt_i des Massefilters von weniger als 0,2 Sekunden bevorzugt. Mit dieser Anordnung gibt es im Vergleich zum herkömmlichen Einzelvorläufer-MS/MS-Ansatz, der durch die Erfassungsrate des Orbitrap™-Analysators beschränkt ist, einen großen Gewinn. Anstelle des Orbitrap™-Analysators 150 könnte darüber hinaus jede andere massenanalysierende elektrostatische Falle oder hochauflösender TOF oder FTICR verwendet werden.
3 zeigt eine dritte Ausführungsform eines Apparats, der für die Verwendung mit dem die vorliegende Erfindung verkörpernden Verfahren geeignet ist. Zusammengefasst ist dieser Apparat ein Quadrupol-/Orbitrap™-Hybrid, bei dem sich die Kollisonszelle wiederum in einer „Sackgassen-“ Position befindet. Der Apparat, aber nicht seine spezifische Steuerungsmethodologie, wird in größerem Detail in GB 2 490 958 A (Anmeldenummer GB 1108473.8 ), eingereicht am 20. Mai 2011 mit dem Titel „Method and apparatus for mass analysis“, beschrieben.
Im Detail umfasst ein Tandem-Massenspektrometer 200 in Übereinstimmung mit der Anordnung aus 3 eine Ionenquelle 20 (es wird wieder eine ElektrosprayIonenquelle schematisch gezeigt, aber andere Ionenquellen können eingesetzt werden). Ionen aus der Ionenquelle treten durch eine Nur-HF-S-Linse 210 in einen gekrümmten Flatapol 220. Diese Anordnung ist Nur-HF und die Amplitude der an den Flatapole 220 angelegten Spannung ist masseabhängig.
Ionen, die aus dem Flatapol 220 austreten, treten in einen Quadrupol-Massefilter 40 ein. Hier wird wie zuvor eine Teilmenge von Ionen für ein gegebenes i-tes Segment ausgewählt und diese werden anschließend axial in eine Fragmentierzelle 50 zur Fragmentierung oder Speicherung injiziert und kommen zur C-Falle 130 zurück, für einen erneuten orthogonalen Ausstoß dieser Fragment-Ionen in den Orbitrap™-Massenanalysator 150.
Eine Steuereinheit 80 steuert wieder die Spannungen an den Quadrupol-Massefilter 40, die C-Falle 130, die Fragmentierzelle 150 und die anderen Bestandteilen des Systems (aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht gezeigt). Die Ausgabe des Bildstromdetektors des Orbitrap™-Massenanalysators 150 ist zur Bearbeitung und/oder Transmission an einen externen Computer 90 an die Steuereinheit angeschlossen.
Die in Hinblick auf 3 verwendete Methodologie wird wiederum in Verbindung mit 6 beschrieben. Die Vorzüge der Anordnung aus 3 sind im Wesentlichen dieselben wie die oben in Verbindung mit 2 beschriebenen, nämlich dass die Füllzeit für ein breites Massenbereichsspektrum zumindest zehnmal kürzer ist als der kürzeste Detektionszyklus des Orbitrap™-Massenanalysators 150. Ein Massenbereich und eine Segmentanzahl, die den oben in Verbindung mit 2 erklärten ähnlich sind, wird bevorzugt und gleichsam eine ähnliche Gesamttransmissionsrate des Massefilters.
Einer der Vorzüge der „Sackgassen-“ Konfiguration der Reaktionszelle 50 wird in 2 und 3 gezeigt und erlaubt den Einsatz relativ langsamer Fragmentierverfahren, wie etwa Elektronentransferdissoziation (ETD), Elektroneneinfangdissoziation (ECD); Elektronenionisierungsdissoziation (EID) und dergleichen; ozoninduzierte Dissoziation (OzID), IRMPD, UV-Dissoziation und so weiter. Dies wiederum erhöht die Einsetzbarkeit des Verfahrens und des Apparats deutlich.
4 zeigt eine vierte Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers, das für die Umsetzung eines die vorliegende Erfindung verkörpernden Verfahrens geeignet ist. Die Anordnung aus 4 ist der aus 2 im weitesten Sinne insofern ähnlich, dass sie eine Linarfallen-Orbitrap-Hybridkombination umfasst. Im Gegensatz zu 2 verwendet die Anordnung aus 4 jedoch eine In-line-Kollisionszelle, wie nachfolgend erklärt wird, und nutzt darüber hinaus das Ionenselektions- und Taktungsverfahren, das in der Patentanmeldung mit der Nummer WO 2012/175517 A2 (PCT/ EP2012/061746 ) und dem Titel „Targeted analysis for tandem mass spectrometry“, beschrieben wird (Inhalte hierin durch Verweis aufgenommen).
In der Anordnung aus 4 erzeugt eine Ionenquelle 20 Musterionen. Die Ionenquelle kann wieder entweder eine Elektrospray-Ionenquelle, eine MALDIIonenquelle oder eine andere sein. Ionen aus der Ionenquelle 20 treten durch in 4 nicht gezeigte Ionenoptiken in eine Linearfalle 110 ein. Ionen werden innerhalb der Linearfalle 110 gesammelt. Im Gegensatz zu früheren Ausführungsformen ist die Linearfalle 110 jedoch vorzugsweise nicht dazu eingestellt, Segmente auszuwählen. Stattdessen sammelt und kühlt die Linearfalle Ionen über den gesamten Massenbereich von Interesse für einen bestimmten Zyklus, das heißt, den gesamten Massenbereich M_P ... M_Q. Sobald sich die Ionen über den Massenbereich in der Linearfalle 110 angesammelt haben, werden sie durch Einstellen der Gleichspannungen an den Endkappen der Linearfalle 110 durch weitere Ionenoptiken (nicht gezeigt) in eine zweite Linearfalle, die vorzugsweise eine C-Falle 130 ist, ausgestoßen.
Von hier werden die Ionen orthogonal in Richtung einer Fragmentierzelle 50 ausgestoßen. Jedoch befindet sich zwischen der C-Falle 130 und der Fragmentierzelle 50 eine Ionenschleuse 310 und eine Pulsiervorrichtung 320 (optional) zusammen mit einer Ionenschranke oder einem Elektrometer 330. Wie in der oben erwähnten Veröffentlichung WO 2012/175517 A2 (PCT/ EP2012/061746 ) ausführlich erklärt, kann die Ionenschleuse 310 beispielsweise eine Bradbury-Nielsen-Schleuse sein.
Die Ionen trennen sich zwischen der C-Falle 130 und der Ionenschleuse 310 zeitlich, sodass sie gemäß ihrer Masse-Ladungs-Verhältnisse in Paketen ankommen. Die Ionenschleuse 310 und/oder Pulsiervorrichtung 320 werden von einer Steuereinheit 80 gesteuert, um das Passieren von bestimmten Ionenpaketen von Interesse in die Fragmentierzelle 50 zu erlauben oder um Ionenpakete, die nicht von analytischem Interesse sind, aus dem Pfad zur Fragmentierzelle und stattdessen hin zur Ionenschranke oder zum Elektrometer 330 abzulenken.
Somit versteht sich, dass die Quelle 20, Linearfalle 110 und C-Falle 130 gemeinsam mit der Ionentrennvorrichtung bestehend aus Ionenschleuse 310, Pulsiervorrichtung 320 und Ionenschranke 330 das parallele Akkumulieren und Transmittieren aller L Segmente erlauben. Die Steuereinheit 80 unterteilt den Gesamtmassenbereich von Interesse für einen bestimmten Scanzyklus M_P ... M_Q in L Zeitsegmente und schaltet das Statuszeichen auf der Fragmentierzelle 50 unabhängig für jedes i-te Segment auf F_i = 0 oder F_i =1, abhängig vom gewünschten Fragmentierschema. Die Ionenschleuse 310 verhält sich in erster Linie als Steuerung der Ionenpopulation K_i für ein bestimmtes i-tes Segment, das heißt, die Steuereinheit betreibt die Ionenschleuse, um das Passieren zu erlauben oder Ionen von der Fragmentierzelle 50 abzulenken, sodass die geeignete Anzahl von Ionen in einem bestimmten Segment in die Fragmentierzelle eintritt. Die gesteuerte Ionenpopulation wird anschließend gegebenenfalls fragmentiert, in Abhängigkeit von dem Statuszeichen, das auf die Fragmentierzelle gesetzt wird.
Während die Schleuse 310 in erster Linie dazu verwendet wird, die transmittierte Anzahl von Ionen K_i zu steuern, wird das Umschalten des Fragmentiermodus von F=0 auf F=1 vorgenommen, indem die Offset-Spannung der Fragmentierzelle 50 geändert wird. Es gibt eine begrenzte Zeit, um die Spannung auf der Fragmentierzelle zu verändern und somit die Fragmentierenergie von Statuszeichen F=0 auf Statuszeichen F=1 einzustellen. Üblicherweise beträgt die Veränderungszeit des Spannungsoffsets ein paar zehn bis zu ein paar hundert Nanosekunden. Während der Änderungsperiode von F=1 auf F=0 oder von F=0 auf F=1 kann die Steuereinheit die Ionenschleuse 310 steuern, sodass im Wesentlichen keine Vorläufer-Ionen während der Umstellungszeitperiode in die Fragmentierzelle eintreten dürfen.
Beim Eintreten eines Ionenstroms aus den aufeinanderfolgenden Segmenten in die Fragmentierzelle 50 werden sie gegebenenfalls fragmentiert, wobei das Fragmentierschema unabhängig für jedes Segment angewandt wird und die Vorläufer- und/oder Fragment-Ionen verlassen die Fragmentierzelle 50 in axialer Richtung hin zu einer externen Ionenfallenvorrichtung 340, die eine zweite C-Falle sein kann. Vorzugsweise werden die Vorläufer- und/oder Fragment-Ionen von allen Segmenten L gemeinsam in der externen Ionenfallenvorrichtung 340 gespeichert, dies wird ebenfalls in WO 2012/175517 A2 (PCT/ EP2012/061746 ) detailliert erläutert. Anschließend wird das Gemisch aus Vorläufer- und Fragment-Ionen aus dem unterteilten Gesamtmassenbereich von Interesse für einen bestimmten Scanzyklus orthogonal hin zu einer kreisförmigen Falle 150, wie etwa einem Orbitrap™-Massenanalysator, zur Analyse ausgestoßen. Das daraus folgende transiente oder transformierte Massenspektrum wird dann in der Steuereinheit 80, auf einem externen Computer 90 oder andernorts für eine nachfolgende Analyse gespeichert.
Der Detektions- oder Additionszyklus in der kreisförmigen Falle 150 kann beträchtlich länger sein als die Zykluszeit der C-Falle 130. Somit ist in der Ausführungsform von 4 die Transmissionszeit t_i die Summe mehrerer potentieller Zyklen der C-Falle 130, aus der die Ionen eines i-ten Segments in die Fragmentierzelle 50 eintreten dürfen, um eine erforderliche Anzahl von Ionen K_i zu bilden. Das bedeutet, dass sogar innerhalb eines einzelnen Scanzyklus mehrere Zyklen aus Füllen und Ausstoßen aus der C-Falle 130 durchgeführt werden können, mit ähnlich vielen Füll- und Entleerzyklen der C-Falle 130 in nachfolgenden Scanzyklen, worin der zu untersuchende Massenbereich, die Anzahl der Segmente und so weiter verändert wird.
In der Ausführungsform von 4 ist es wünschenswert, jedoch nicht essentiell, dass die Segmentierung auf 100 Segmente oder weniger beschränkt ist. Der zu untersuchende Massenbereich beträgt vorzugsweise zwischen 50 und 2000 m/z. Die Transmissionszeit t_i beträgt vorzugsweise weniger als 0,1 Sekunden.
5A zeigt eine weitere, fünfte Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers 400, das ein Hybrid aus TOF und einer kreisförmigen Falle ist. Die Anordnung in 5A setzt eine In-line-Kollisionszelle ein und basiert auf der in der oben erwähnten Publikation WO 2012/175517 A2 (PCT/ EP2012/061746 ) beschriebenen Anordnung. Wie in der Anordnung aus 4 werden Ionen aus einer geeigneten Ionenquelle 20, wie etwa einer Elektrospray- oder MALDI-Ionenquelle, auf eine Linearfalle 110 ausgerichtet, die die Ionen über den gesamten Massenbereich von Interesse [M_P ... speichert und kühlt. Von hier aus bewegen sich die Ionen durch Ionenoptiken (nicht gezeigt) in eine Linearfalle, wie etwa eine C-Falle 130. Die Ionen werden aus der C-Falle 130 orthogonal ausgestoßen und treten durch einen optionalen elektrischen Sektor 350 entweder in einen Einzel- oder einen Multi-Reflexions-Time-of-Flight-Analysator (MR-TOF-Analysator) 360 ein, der die Time-of-Flight-Trennung von Ionen gemäß ihrer Masse-Ladungs-Verhältnisse erlaubt, bei gleichzeitigem Erhalt eines relativ kompakten Pakets. Obwohl eine Einzel- oder ein Multi-Reflexions-Time-of-Flight-Vorrichtung 360 beschrieben wird, versteht sich, dass, wie in WO 2010/136533 A1 beschrieben, alternativ dazu ein Multi-Sektor-Time-of-Flight-Analysator, wie etwa die „MULTUM-“ Vorrichtung oder ein kreisförmiger Time-of-Flight-Analysator stattdessen eingesetzt werden könnten.
Sobald die Ionen den MR-TOF 360 passiert haben, kommen sie bei der Ionenschleuse 310 an. Wie bei der Anordnung von 4 werden die Ionen an der Ionenschleuse gesteuert, sodass sie entweder in eine Fragmentierzelle 50 eintreten oder unter Verwendung der Ionenschleuse 310 und einer optionalen Pulsiervorrichtung 320 hin zu einer Ionenschranke 330 abgelenkt werden. Erneut soll die Anordnung aus 5A alle L Segmente parallel sammeln und analysieren, sodass die Ionenschleuse 310 vorzugsweise für die Ionenpopulationssteuerung innerhalb jedes Segments eingesetzt wird und auch zufällige Vorläufer-Ionen von der Fragmentierzelle 50 ableitet, während die Kollisionsenergie eingestellt wird. Die gesamte Steuerung stammt von einer Steuereinheit 80, die mit der Linearfalle 110, der gekrümmten Falle 130, dem MR-TOF 360 und der Ionenschleuse 310 kommuniziert. Wie schon bei der Anordnung aus 4 befindet sich stromab der Fragmentierzelle 50 eine externe Ionenfallenvorrichtung 340, wie etwa eine gekrümmte oder eine C-Falle, die die Ionen aus jedem Segment empfängt, die gegebenenfalls von der Fragmentierzelle 50 fragmentiert wurden, sie vorzugsweise alle zusammen akkumuliert und dann alle kombinierten Vorläufer- und/oder Fragment-Ionen zu einem kreisförmigen Massenanalysator 150 zur Analyse und Detektion ausstößt. Ein Computer 90 kann wiederum mit der Steuereinheit 80 für die Datenspeicherung und Nachbearbeitung kommunizieren. Mehrere Zyklen können mit dem Apparat aus 5A durchgeführt werden.
Eine sechste Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers 500, das für die Umsetzung des in Verbindung mit 6 oben beschriebenen Verfahrens geeignet ist, wird in 5B gezeigt. Die Anordnung aus 5B ist im Wesentlichen zu der Anordnung aus 5A identisch außer, dass die Analyse des Gemisches aus Vorläufer- und Fragment-Ionen aus der externen Ionenfallenvorrichtung 340 von einem Time-of-Flight-Massenanalysator 60 und nicht einer kreisförmigen Falle 150 durchgeführt wird. Da alle anderen Bestandteile von 5B exakt mit jenen aus 5A übereinstimmen, werden sie mit denselben Referenznummern bezeichnet und es wird keine weitere Beschreibung bereitgestellt.
Die oben erörterten Überlegungen mit Bezug auf die Anordnung aus 4 gelten gleichermaßen für die Anordnungen der 5A und 5B. Insbesondere, da der Detektions- oder Additionszyklus in der kreisförmigen Falle 150 aus 5A und des TOF-Massenanalysators 60 aus 5B üblicherweise deutlich länger ist als die Zykluszeit der C-Falle 130, ist t_i die Summe aller Zyklen der C-Falle 130, für die Ionen aus dem i-ten Segment in die Fragmentierzelle 50 eintreten dürfen, um die erforderliche Anzahl von Ionen K_i zu bilden. Darüber hinaus ist die Segmentierung (L) vorzugsweise in den Ausführungsformen aus 5A und 5B auf 100 oder weniger Segmente beschränkt und der Massenbereich liegt üblicherweise zwischen 50 und 4000 m/z. Die Transmissionszeit t_i von 0,1 Sekunden oder weniger wird ebenfalls bevorzugt.
Als eine Variante der Ausführungsformen aus 4, 5A und 5B kann die Ionenschleuse 310, statt die Ionen eines bestimmten Segments in die Zelle 50 zu leiten, wo keine Fragmentierung vorgesehen ist (F=0), sie direkt in eine externe Ionenfallenvorrichtung 340 leiten, anstatt sie ohne Fragmentierung durch die Fragmentierzelle 50 passieren zu lassen. Dies kann durch das Vorsehen von geeigneten Ionenführungen entlang eines Pfades außerhalb des Pfades, der in die Fragmentierzelle 50 eintritt, erreicht werden. Alternativ dazu kann sich die Fragmentierzelle 50 in einer „Sackgassen-“ Konfiguration hinter der externen Ionenfallenvorrichtung befinden; das heißt, die externe Ionenfallenvorrichtung 340 wird stromauf der Fragmentierzelle 50 platziert, sodass die Fragmentierzelle 50 sich nicht in direkter Linie zwischen der C-Falle 130, der Ionenschleuse 310, der externen Ionenfallenvorrichtung 340 und der kreisförmigen Falle 150 oder dem TOF-Massenanalysator 60 befindet. Ionen werden dann von der externen Ionenfallenvorrichtung 340, die wie erwähnt vorzugsweise eine C-Falle sein kann, entlang einer Längsachsenrichtung hin zur Sackgassen-Fragmentierzelle 50 ausgestoßen, wo die Fragmentierung stattfindet, und die Ionen werden anschließend wieder entlang einer Längsachsenrichtung an die externe Ionenfallenvorrichtung 340 für einen nachfolgenden orthogonalen Ausstoß hin zur kreisförmigen Falle 150 oder dem Time-of-Flight-Massenanalysator 60 zurückgegeben. Eine solche „Sackgassen-“ Konfiguration erlaubt die Kompatibilität mit den oben erwähnten relativ langsamen Fragmentierverfahren.
Bezugnehmend nun auf 7a, 7b, 8a und 8b wird eine siebte und besonders bevorzugte Ausführungsform eines die vorliegende Erfindung verkörpernden Apparates gezeigt. In diesen Fig. wird die Falle 130 durch einen nichtfangenden orthogonalen Beschleuniger ersetzt, der bei höheren Wiederholungsraten (vorzugsweise 20-100 kHz) läuft, um einen hochleistungsfähigen Zyklus und somit Transmission bereitzustellen. Dies erlaubt das Erreichen einer höheren Auflösung über dieselbe Länge des TOF-Separators, obwohl es striktere Anforderungen an die Schleuse 310 stellt. Vorzugsweise ist der orthogonale Beschleuniger wie in WO 01/11660 Albeschrieben gitterlos und eine optionale Linse wird eingesetzt, um die Ionen auf den Eingang der Speichervorrichtung zu fokussieren.
In weiterem Detail und bezugnehmend zuerst auf 7a und 7b, wird ein Tandem-Massenspektrometer gemäß einer siebten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gezeigt. Komponenten, die die Ausführungsformen von 1-5 und 7a/7b gemein haben, werden mit gleichen Referenznummern bezeichnet.
Ionen werden wie zuvor beschrieben in der Ionenquelle 20 erzeugt. Von dort werden sie in einen orthogonalen Beschleuniger 23 ausgestoßen. In der Ausführungsform von 7a ist der orthogonale Beschleuniger 23 als ein Paar paralleler Platten 24, 25 umgesetzt. Diese parallele Platte 24 dient als eine Extraktionsplatte mit einem Gitter oder, am meisten bevorzugt, einem Schlitz für die Extraktion eines Strahls, wie beispielsweise in WO 01/11660 A1 beschrieben. Ionen treten in den Beschleuniger 23 ein, wenn keine Gleichspannung darauf beaufschlagt ist. Nachdem ein Ionenstrahl von ausreichender Länge in den Beschleuniger 23 eingetreten ist, wird eine gepulste Spannung auf den Beschleuniger angelegt und die Ionen über Linsen 27 in einen TOF-Analysator 360 extrahiert. Abhängig von der Qualität der erforderlichen Isolation kann der TOF-Analysator 360 ein Multi-Reflexions-TOF, ein Multi-Deflexions-TOF oder ein Einzel-Reflexions-TOF sein. Abgebildet ist ein Einzel-Reflexions-TOF. Aufgrund der vorliegenden sehr hohen Ionenströme ist es sehr wünschenswert, dass innerhalb des TOF 360 keine Gitter im Ionenpfad vorliegen, um auf dem Ionenpfad von der Quelle zum Detektor die Präsentation von Metalloberflächen zu vermeiden, an denen sich Ionen ablagern können. 7b ist eine Seitenansicht des Tandem-Massenspektrometers gemäß der dritten Ausführungsform, wobei das Beispiel eines Einzel-Reflexions-TOF verwendet wird. Wie aus 7b hervorgeht, folgen die Ionen einer y-förmigen Flugbahn im Einzel-Reflexions-TOF 360, in einem gitterfreien Spiegel 32. Weitere Details der beispielhaften Anordnung von TOF 360, wie insbesondere in 7b gezeigt, werden in WO2009/081143 A2 bereitgestellt.
Auf dem Rückweg von dem TOF 360 werden die Ionen durch eine Ionenschleuse 310 geschleust, wobei die Ionen von Interesse in eine Fragmentierzelle 50 eintreten gelassen werden und unerwünschte Ionen werden zu einer Ionenschranke 330 abgelenkt. Vorzugsweise ist die Ionenschleuse 310 gitterlos und umfasst eine gepulste Elektrode 316, die von Öffnungen umgeben ist, die die Durchdringung des Feldes durch die gepulste Elektrode 316 vermeidet. Gegebenenfalls können auf diese Öffnungen zeitabhängige Spannungen angelegt werden, um eine Feldpenetration durch die gepulste Elektrode 316 zu kompensieren.
Nach der Auswahl auf Basis ihrer Ankunftszeit treten die Ionen in eine Verzögerungslinse 318 ein, in der ihre Energie auf einen gewünschten Wert reduziert wird. Obwohl es nicht gezeigt wird, können die Ionen auch vor dem Eintritt in die Fragmentierzelle 50 eine Verlangsamung erfahren. Üblicherweise kann die gewünschte Endenergie für die Fragmentierung auf zwischen 30-50 eV/kDa geschätzt werden, wobei Stickstoff oder Luft als Kollisionsgas eingesetzt wird. Diese geschätzten Endenergieskalen sind jedoch entgegengesetzt proportional zur Gasmasse, sodass die Endenergie 100-200 eV/1000u überschreiten kann, wenn Helium als Kollisionsgas verwendet wird. Ähnlich kann bei minimaler oder nicht vorliegender Fragmentierung die gewünschte Endenergie <10 eV/1000u betragen wenn das Kollisionsgas Stickstoff oder Luft ist und <30-50 eV/1000u wenn Helium als Kollisionsgas eingesetzt wird. Um die Verlangsamung auf so niedrige Energien zu ermöglichen wird bevorzugt, dass die Ionen gar nicht erst übermäßig beschleunigt werden - vorzugsweise um nicht mehr als 300-500 V.
Ein typisches Beispiel für eine geeignete Verzögerungslinse wird in P. O'Connor et al. J. Amer. Soc. Mass Spectrom., 2, 322-335, (1991) vorgestellt. Für einen Flugweg von 1 Meter im TOF 360 wird eine Selektionsauflösung von 500-1000 erwartet, was für die meisten Anwendungen als angemessen gilt. Aufgrund der y-Form der Ionenflugbahn kommen Ionen in der Ebene oberhalb des orthogonalen Beschleunigers 23 an, sodass ihre Anfangsenergie unabhängig von der Beschleunigungsenergie gewählt werden kann. Dies unterscheidet sich von herkömmlichen orthogonalen Beschleunigungs-TOFs und erlaubt eine Verbesserung in der Einschaltdauer und der Ionentransmission. Üblicherweise läuft der TOF 360 mit einer Wiederholungsrate von 10 kHz, sodass jeder Puls bis zu 105-106 Elementarladungen ausstößt.
Da die Ionenpakete üblicherweise als längliche Fäden bei der Fragmentierzelle 50 ankommen, sollte ein Design der Fragmentierzelle 50 in Erwägung gezogen werden, das das Empfangen solcher Pakete erlaubt. In derzeit bevorzugten Ausführungsformen wird dies durch die Umsetzung der Fragmentierzelle 50 als eine längliche Kollisionszelle mit differenziellem Pumpen erreicht, ähnlich zu der in WO 2004/083805 A2 und US 7,342,224 B2 beschriebenen Kollisionszelle.
Nach der Fragmentierung in der Fragmentierzelle 50 werden Ionen zusammengemischt und auf gleiche Weise wie oben mit Bezug auf die Anordnungen in 1-5a/5b beschrieben analysiert, durch den Ausstoß in eine optionale externe Ionenfallenvorrichtung 340 mit orthogonalem Ausstoß davon in einen Hochauflösungsmassenanalysator: entweder ein Einzel- oder ein Multi-Reflexions- oder ein Multi-Sektor-Time-of-Flight-Massenanalysator 60 kann verwendet werden, oder eine kreisförmige Falle 150 wie etwa ein Orbitrap 60.
8a und 8b zeigen die erste und zweite Anordnung nichtfangender orthogonaler Ionenbeschleuniger 23, die beide als Alternativen zu dem nichtfangenden orthogonalen Beschleuniger 23 aus 7a und 7b eingesetzt werden können. Der nichtfangende Ionenbeschleuniger aus 8a ist eine Gleichspannungsionenführung, während der aus 8b eine HF-Ionenführung ist.
In 8a kommen die Ionen von der Ionenquelle in einer Richtung „y“ an. Die Elektroden 25 und 24 (letztere davon hat einen mittigen Schlitz) werden auf derselben Gleichspannung gehalten bis die Extraktionsspannungsimpulse beaufschlagt werden, was dazu führt, dass die Ionen in Impulsen durch den Schlitz in Elektrode 24 in eine Richtung „z“ ausgestoßen werden, die zu der Eingangsrichtung „y“ orthogonal ist.
8b zeigt eine weitere alternative Anordnung, in der Ionen wiederum von der Ionenquelle in einer Richtung „y“ ankommen und in denen HF-Potentiale auf den Elektroden 25, 24 gleichgehalten werden, bis die Extraktionsimpulse beaufschlagt werden. Insbesondere umfasst der Beschleuniger 23 in 8b zusätzlich zu der Rückplatte und den vorderen Extraktionselektroden 25, 24 obere und untere Elektroden 24' und 24", die eine HF-Phase einsetzen, die zu der auf den Elektroden 24 und 25 entgegengesetzt ist. US 8,030,613 B2 beschreibt ein Verfahren für das Beaufschlagen einer umschaltbaren HF auf eine Ionenfalle. Das in dieser Veröffentlichung beschriebene Verfahren kann jedoch gleichermaßen auf die nichtfangende Nur-HF-Ionenführung aus 8b angewandt werden, sodass das HF gemäß der in diesem Dokument beschriebenen Prinzipien abschaltbar ist und Impulse auf die Elektrode 25 und/oder 24 beaufschlagt werden können, um die Ionen durch den Schlitz in der Elektrode 24 zu extrahieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Beschleuniger 23 aus 8b insbesondere mit einem Dämpfgas bereitgestellt werden, um die Energieausbreitung der Ionen zu reduzieren.
Eine Sackgassen-Fragmentierzellenkonfiguration ähnlich zu der in 3 gezeigten und als eine optionale Alternative zu der in 5A und 5B gezeigten In-line-Fragmentierzellenkonfiguration beschriebenen ist ebenfalls möglich.
Die hierin verkörperten Verfahren finden in vielen Bereichen der Forschung und kommerziellen Analyse praktische Anwendung, wie etwa die quantitative Analyse komplexer Gemische in der Proteomik, Metabolomik, in klinischen, nahrungsmitteltechnischen, Umwelt- und forensischen Anwendungen.
Nach der ausführlichen Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform eines Verfahrens und einer Reihe von Apparaten, die für die Umsetzung dieses Verfahrens eingesetzt werden können, wird nun ein spezifisches Beispiel des Verfahrens mit Verweis auf die 9 und 10 beschrieben, um die Art, auf die die Ergebnisse analysiert werden können, um die Dekonvolution der Spektren zu erlauben, weiter zu erläutern. Zuerst auf 9 Bezug nehmend werden drei Spektren, bezeichnet als Spektrum 1, Spektrum 2 und Spektrum 3, übereinander abgebildet. Jedes der Spektren stellt einen der N Scanzyklen aus den Schritten 610 und 620 aus 6 dar, das heißt N = 3. Aus Gründen der einfacheren Erklärung besteht jedes Spektrum aus vier Segmenten, das heißt, L = 4 und in jedem Fall ist der Gesamtmassenbereich [M_P ... M_Q] derselbe. Über diesen Massenbereich haben die Spektren aus 8 fünf Vorläufer.
In 9 werden die Vorläufer aus jedem Segment i unter Verwendung desselben Schraffiermusters (Kreuzschraffur, etc.) wie ihre Fragmente bezeichnet. Vorläufer erhalten auch den Index (i,0), während ihre Fragmente Indizes (i,j) aufweisen, wobei j mit m/z zunimmt. 9 listet auch das Statuszeichen F_i für jedes i-te Segment für jedes Spektrum. Es wird angemerkt, dass die Statuszeichenmuster für jedes Spektrum differieren (da natürlich jedes Spektrum in 9 im Wesentlichen identisch wäre, wenn das Statuszeichenmuster für jedes dasselbe wäre). Es ist vorteilhaft, wenn jedes Spektrum eine ähnliche Anzahl von Vorläufern und Fragmenten aufweist (jedoch unterschiedlich verteilt in Bezug auf m/z und Intensitäten), wodurch die Überbesetzung der Spektren vermieden wird, wie beim MS^e-Verfahren beobachtet.
Beim Untersuchen von 9 wird der erfahrene Leser erkennen, dass jeder Vorläufer innerhalb eines bestimmten Segments, das nicht der Fragmentierung unterworfen ist, in diesem Segment (und nur diesem Segment) offensichtlich bleibt. Beispielsweise ist in Spektrum 2 für Vorläufer (4,0) ein großer Peak (nur) in Segment 4 sichtbar, da in diesem Segment keine Fragmentierung (Statuszeichen F4=0) stattfindet.
Für jeden j-ten Massepeak in jedem i-ten Segment M_i,j wird die Abhängigkeit der Signalintensität von der Scanzyklusnummer I_i,j(n) aufgebaut. Das Dekodieren wird dann erreicht, indem logische Regeln auf die erhaltenen Daten angewendet werden. Der Prozess umfasst somit das Suchen nach einer Korrelation für diese Abhängigkeit I_i,j(n) mit den Scanabhängigkeiten für andere Massepeaks in allen Segmenten, die der Fragmentierung unterworfen wurden und die darüber hinaus theoretisch in der Lage sind, einen solchen Peak hervorzubringen. Beispielsweise kann die Software Regeln in der Suche anwenden, wie etwa, dass das Fragment keine höhere Masse als eine Vorläufermasse haben kann (wenn letztere auf eine einzelne Ladung zurückgerechnet wird), dass die Intensität eines jeden Fragments nicht höher sein kann als die Intensität des Vorläufers, von dem es abstammt, dass bestimmte Fragmente als Merkmal für einen bestimmten Vorläufer verwendet werden (z.B. Komplementärpaare, wo die Summe der Massen zweier Fragmente exakt die Vorläufermasse ergibt), etc. Zusätzliche Informationen über das Muster und die Regeln der Fragmentierung wie, ohne darauf beschränkt zu sein, Beziehungen zwischen Vorläufer- und Fragmentmassen, mögliche Fragmentierpfade, Ionenmobilitäten und Reaktivitäten können auch in der Analyse der Daten eingesetzt werden.
10 zeigt die resultierende Abhängigkeit der Intensitäten von der Spektrum(Scanzyklus)-Anzahl für die spezifischen Spektren aus 9. Es wird angemerkt, dass die Spektren für Segmente i = 1, 2 und 4 einfach dekonvolviert werden können, mit Ausnahme des Peaks (4,2), der mit (3,2) überlappt, da es nur einen Vorläuferpeak pro Segment gibt.
Die Spektren für i=3 können jedoch nur durch zusätzliche Zeitabhängigkeit der Peaks mit demselben Fragmentierstatuszeichen F dekonvolviert werden. Beispielsweise kann der Peak (3,1) mit dem Vorläufer (3,0/1) zusammenwachsen, während der Peak (3,3) gemeinsam mit dem Vorläufer (3,0/2) schrumpft. Der überlappende Peak (3,2)/(4,2) verändert sich anders als jeder der Vorläufer und daraus kann geschlossen werden, dass dies eine Überlagerung von zwei Peaks darstellt. Das wiederum kann durch den Erhalt weiterer Spektren aufgelöst werden (oder unerklärte, nichtkorrelierende Fragmente können stattdessen von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden).
Die Umsetzung des mit Bezug auf die Ausführungsformen aus 1 bis 3 oben beschrieben Verfahrens stellt eine durchschnittliche Einschaltdauer von 1/L bereit. Für die Ausführungsformen von 4, 5A, 5B, 7a, 7b, 8a und 8b kann die Einschaltdauer 50 % überschreiten. Daher können bei diesen späteren Ausführungsformen alle Daten zu jeder Zeit erworben werden und die Vielzahl möglicher Modulationsverfahren kann stark erweitert werden. Beispielsweise kann Segment 3 in 9 auf datenabhängige Weise in zwei Untersegmente aufgespalten werden, mit einer Reihe von Ionen K_i, die zeitvariabel auf verschiedene Arten für jedes der Teilsegmente sind.
Es sollte angemerkt werden, dass die Mindestanzahl von Scans N gleich eins ist, da sogar ein einziger Scan mit verschiedenen Segmenten analytisch nützliche Informationen liefern könnte (und möglicherweise besser als zwei Einsegmentscans bei verschiedenen Fragmentiergraden ist). Beispielsweise können neutrale Verlustinformation für ein Segment mit einem höheren Fragmentiergrad erhalten werden, während genaue Masseinformationen und Intensität des Vorläufers von einem anderen Segment erhalten werden können, wobei das letztere einen anderen Ladungszustand aufweist. Ein weiteres Beispiel ist zielgerichtete Analyse, bei der nur Segmente, die eine Zielverbindung enthalten, einem höheren Fragmentiergrad unterzogen werden. Da andere Verbindungen (insbesondere zahlenmäßig stark vertretene Matrix-Peaks) keiner Fragmentierung unterzogen werden, bleibt das Spektrum nicht überbesetzt. Dies erlaubt wiederum die Identifikation bekannter Segmente mit einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis. Diese können für die Bestätigung der Identität des Vorläufers verwendet werden. Inzwischen erlaubt die Kenntnis der Fragmentierbedingungen, sowie der Verhältnisse zwischen Vorläufer- und Fragmentintensitäten die Dekonvolution der ursprünglichen Intensität der Vorläufer, sodass folglich eine quantitative Analyse bereitgestellt werden kann.

Claims

Verfahren der Tandem-Massenspektrometrie, wobei das Verfahren für einen n-ten Scanzyklus umfasst: (a) das Erzeugen von Ionen in einer Ionenquelle; (b) das Auswählen eines Bereichs von Masse-Ladungs-Verhältnissen [M_P ... M_Q], M_P < M_Q aus den von der Ionenquelle erzeugten Ionen; (c) das Unterteilen des Bereichs [M_P ... in eine Vielzahl L von unterschiedlichen Segmenten (L>1), wobei jedes i-te Segment Ionen über einen Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen (m_i... m_i + Δ m_i) umfasst und eine Teilmenge des Bereichs M_P ... M_Q ausbildet; (d) das Unterwerfen der Ionen innerhalb zumindest eines ersten L_i der L Segmente einem ersten, relativ geringeren Fragmentiergrad F_i, F_i >=0), während Ionen innerhalb zumindest eines zweiten L_j der L Segmente einem zweiten, relativ höheren Fragmentiergrad F_j (F_j>F_i) unterworfen werden, sodass eine Fragmentierung zumindest mancher der Vorläufer-Ionen in dem zweiten Segment L_j verursacht wird; (e) das Massenanalysieren der Vorläufer- und Fragment-Ionen aus der Vielzahl von Segmenten in dem n-ten Scanszyklus, um ein zusammengesetztes Spektrum für die Vorläufer- und Fragment-Ionen aus dem Massenbereich [M_P ... aufzunehmen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren zudem das Wiederholen der Schritte (a) bis (e) in einem nachfolgenden (n+1)-ten Zyklus umfasst, aber worin in diesem nachfolgenden (n+1)-ten Zyklus einer oder mehrere der folgenden Parameter sich von denen im n-ten Zyklus eingesetzten unterscheiden: (i) der gewählte Massenbereich (M_P ... M_Q]; (ii) die Anzahl, L', von Segmenten, in die der ausgewählte Massenbereich unterteilt ist; (iii) der Massenbereich von einem oder mehreren der L' Segmente, in die der ausgewählte Massenbereich unterteilt ist; (iv) die Anzahl der Ionen in einem oder mehreren der L' Segmente; (v) das/die bestimmte(n) Segment(e) L'_i, dessen/deren Ionen dem ersten, relativ geringen Fragmentiergrad unterworfen werden und/oder das/die bestimmte(n) Segment(e) L'_j, dessen/deren Ionen dem zweiten, relativ hohen Fragmentiergrad unterworfen werden; und (vi) das Auflösungsvermögen der Massenanalyse.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Gesamtzahl der Vorläufer- und Fragment-Ionen, die massenanalysiert werden, im Wesentlichen dieselbe ist in dem n-ten und dem (n+1)-ten Zyklus, während sich die m/z und die Intensitätsverteilungen von jedem zwischen den unterschiedlichen Zyklen unterscheiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei der Schritt (d), in dem die Ionen in zumindest einem zweiten der Segmente, L_j, einem relativ höheren Fragmentiergrad F_j unterworfen werden, das Steuern der Ionen innerhalb dieses Segments zu einer Fragmentierzelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, worin der Schritt (d), in dem die Ionen in dem zumindest ersten der Segmente, L_i, einem relativ geringeren Fragmentiergrad, F_j, unterzogen werden, das Steuern der Ionen innerhalb dieses ersten Segments L_i hin zu derselben Fragmentierzelle, zu der die Ionen des zweiten Segments L_j gesteuert werden, zu einem anderen Zeitpunkt umfasst, und worin eine Spannung V_i auf die Fragmentierzelle mit Bezug auf das erste Segment L_i beaufschlagt wird, worin eine Spannung V_j auf die Fragmentierzelle mit Bezug auf das zweite Segment L_j beaufschlagt wird und worin V_i geringer ist als V_j und gegebenenfalls null ist, sodass weniger Vorläufer-Ionen oder keine fragmentiert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Verfahren zudem das Umschalten zwischen V_i und V_j umfasst, sobald das erste bzw. zweite Segment L_i, L_j zu der Fragmentierzelle gesteuert werden; und das Hindern der Ionen am Eintritt in die Fragmentierzelle während einer Umschaltzeit t_switch, in der V_i zu V_j wird oder V_j zu V_i wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Ionen in einer Vielzahl von Segmenten L_A jeweils einer entsprechenden unterschiedlichen Fragmentierenergie E_A (A≥3; E_A≠E_i,E_j) unterworfen werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei Schritt (d), in dem die Ionen in dem zumindest ersten L_i der Segmente einem relativ geringeren Fragmentiergrad unterworfen werden, das Steuern dieser Ionen in dieses oder diese Segment(e) L_i umfasst, um die Fragmentierzelle zu umgehen, sodass sie wie die Vorläufer-Ionen massenanalysiert werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Schritt (c), in dem der Bereich M_P ... M_Q in eine Vielzahl von L Segmenten unterteilt wird, das Steuern der Ionen von der Ionenquelle in einen Massefilter oder eine Massendispergiervorrichtung in Zeit und/oder Raum und das Setzen der Parameter des Massefilters oder der Massendispergiervorrichtung, damit die Ionenpopulation für zumindest manche der L Segmente gesteuert werden kann, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Verfahren zudem das Setzen zumindest eines der folgenden Parameter umfasst: die Transmissionszeit t_i des Massefilters, den transmittierten Massenbereich m_i ... m_i + Δ m_i des Massefilters und die Fragmentierenergie, um die Gesamtanzahl K_i der zu analysierenden Ionen und/oder den Fragmentiergrad in einem gegebenen Segment L_i zu steuern.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Verfahren zudem das Durchführen einer Vor-Scan-Massenanalyse eines Analyten umfasst; und das Setzen der Parameter basierend auf den Ergebnissen der Vor-Scan-Massenanalyse.
Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, wobei die Anzahl der Ionen K_i innerhalb zumindest mancher der Segmente durch das Steuern der Ionen innerhalb dieses oder dieser Segments/Segmente hin zu einer Schleusenvorrichtung und das Betreiben dieser Schleusenvorrichtung, um das Passieren nur einer Teilmenge der auftreffenden Ionen in diesem oder diesen Segment(en) zu erlauben, gesteuert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Verfahren zudem das Mischen der Vorläufer- und Fragment-Ionen von zwei oder mehreren der L Segmente vor der Massenanalyse des Gemisches umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Verfahren zudem das Mischen der Vorläufer- und Fragment-Ionen aus jedem der L Segmente vor einer Gesamtmassenanalyse von Ionen über den Massenbereich [M_P ... M_Q] umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Schritt der Massenanalyse das Steuern der Vorläufer- und Fragment-Ionen hin zu einer oder mehreren aus: kreisförmigen Falle(n), FT-ICR oder TOF-Massenanalysator(en) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 oder einem der vorangegangenen Ansprüche, wenn davon abhängig, wobei das Verfahren zudem umfasst: den Schritt, in dem die aus dem n-ten und dem (n+1)-ten Scanzyklus erhaltenen Massenanalysedaten verarbeitet werden, um die Identifikation von Massepeaks zu erlauben.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Schritt, in dem die Massenanalysedaten aus mehreren Zyklen verarbeitet werden, das Anwenden einer oder mehrerer logischer Bedingungen bei der Verarbeitung der Massenanalysedaten umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Schritt, in dem die Ionen einer relativ höheren Fragmentierenergie unterworfen werden, das Fragmentieren der Ionen umfasst durch das eine oder andere aus: Elektronentransferdissoziation (ETD); Elektroneneinfangdissoziation (ECD); Elektronenionisierungsdissoziation (EID); ozoninduzierte Dissoziation (OzID); IRMPD; UV-Dissoziation.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Verfahren zudem die folgenden Schritte umfasst: (f) das Wiederholen der Schritte (a) bis (e) in zumindest einem nachfolgenden Zyklus, wobei sie sich aber in Bezug auf das/die bestimmte(n) Segment(e) L'_i, das/die dem ersten, relativ niedrigen Fragmentiergrad unterworfen werden, und in Bezug auf das/die bestimmte(n) Segment(e) L'_j, das/die dem zweiten, relativ hohen Fragmentiergrad unterworfen werden, unterscheiden; (g) für jeden j-ten Massepeak in jedem i-ten Segment das Bestimmen einer Abhängigkeit der Signalintensität von der Scanzyklusnummer I_i,j(n); (h) das Bestimmen von Korrelationen zwischen I_j,j(n) und der Abhängigkeit der Signalintensität von der Scanzyklusnummer für andere Massepeaks in anderen Segmenten; (i) das Identifizieren aus besagten Korrelationen eines mit dem j-ten Massepeak assoziierten Vorläufer-Ions.
Tandem-Massenspektrometer, wobei das Tandem-Massenspektrometer umfasst: (a) eine Ionenquelle für das Erzeugen von Ionen von einem Analyten; (b) einen Massefilter oder eine Massendispergiervorrichtung, die dazu angeordnet ist, die von der Ionenquelle erzeugten Ionen zu empfangen und eine Teilmenge dieser empfangenen Ionen zu transmittieren; (c) eine Fragmentierzelle, die dazu konfiguriert ist, die Ionen von dem Massefilter oder der Massendispergiervorrichtung zu empfangen; (d) einen Massenanalysator für das Analysieren der Ausgabe der Fragmentierzelle; und (e) eine Steuereinheit, die dazu konfiguriert ist, um für einen n-ten Scanzyklus folgendes zu steuern: (i) den Massefilter oder die Massendispergiervorrichtung zu steuern, um sie zu veranlassen, eine Vielzahl L (L>1) von unterschiedlichen Masse-Ladungs-Bereichssegmenten, die jeweils aus einem relativ breiteren Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen [M_P ... M_Q] M_P < M_Q von den von der Ionenquelle erzeugen Ionen unterteilt wurden, auszuwählen, wobei jedes i-te Segment Ionen über einen Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen (m_i ... m_i + Δ m_i) umfasst und eine Teilmenge des relativ breiteren Bereichs M_P ... M_Q ausgebildet wird; (ii) das Steuern der Fragmentierzelle, sodass die Ionen innerhalb zumindest eines ersten L_i der L Segmente einem ersten, relativ niedrigen Fragmentiergrad F_i(F_i≥0) unterworfen werden, während die Ionen innerhalb zumindest eines zweiten L_j der L Segmente einem zweiten, relativ höheren Fragmentiergrad F_j (F_j>F_i) unterworfen werden, sodass zumindest manche der Vorläufer-Ionen in dem zweiten Segment L_j fragmentiert werden, und (iii) das Erzeugen eines zusammensesetzten Massenspektrums für die Vorläufer- und Fragment-Ionen aus dem Massenbereich [M_P ... M_Q] für den n-ten Scanzyklus.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 20, wobei die Steuereinheit zudem dazu konfiguriert ist, das Spektrometer so zu steuern, um es zu veranlassen, die Ionen aus jedem Segment L_j, L_j zusammen in der Fragmentierzelle zu speichern.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 20 oder 21, wobei der Massenanalysator eines oder mehrere aus einer kreisförmigen Falle, einer elektrostatischen Falle, einem FT-ICR oder TOF-Massenanalysator ist.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 20, 21 oder 22, wobei die Fragmentierzelle eine Nur-HF-Kollisionszelle ist.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 23, das dazu angeordnet ist, die Fragmentierung in Übereinstimmung mit dem einem oder anderen der folgenden Verfahren durchzuführen: (a) Elektronentransferdissoziation (ETD); (b) Elektroneneinfangdissoziation (ECD); (c) Elektronenionisierungsdissoziation (EID); (d) ozoninduzierte Dissoziation (OzID); (e) IRMPD; (f) UV-Dissoziation
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Fragmentierzelle „in line“ zwischen dem Massefilter oder der Massendispergiervorrichtung und dem Massenanalysator angeordnet ist.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Fragmentierzelle in einer „Sackgassen-“ Konfiguration außerhalb eines Ionenpfades von dem Massefilter oder der Massendispergiervorrichtung, über eine Ionenspeichervorrichtung zum Massenanalysator positioniert ist.
Tandem-Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 20 bis 25, wobei der Massefilter oder die Massendispergiervorrichtung ein Quadrupol-Massefilter, eine Quadrupol-Ionenfalle (3D-Falle) oder eine lineare Ionenfalle (LT) oder ein TOF-Massefilter ist.
Tandem-Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 20 bis 27, wobei das Spektrometer zudem eine Ionenschleuse umfasst und die Steuereinheit zudem dazu konfiguriert ist, die Schleuse so zu steuern, dass die Anzahl der Ionen, die in die Fragmentierzelle eintreten, in zumindest manchen der Segmente beschränkt ist.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 28, wobei die Steuereinheit dazu konfiguriert ist, die Ionenschleuse synchron mit einem Parameterwechsel der Ionenfragmentierung innerhalb der Fragmentierzelle zu betreiben, wobei ein Spannungsoffset der Zelle und/oder ein Elektronen-/Photonen-/Ionen-/ Reaktantenfluss in die Zelle umfasst ist.