DE112012002568B4

DE112012002568B4 - Gezielte Analyse für Tandem-Massenspektrometrie

Info

Publication number: DE112012002568B4
Application number: DE112012002568.7T
Authority: DE
Inventors: Alexander Makarov
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2019-11-07
Anticipated expiration: 2032-06-20
Also published as: GB201322938D0; WO2012175517A3; US9099289B2; US20140131567A1; US8957369B2; GB2505384A; WO2012175517A2; US20150340217A1; GB201110662D0; DE112012002568T5; US20150155147A1; GB2505384B; US9287101B2; CN103650099A; CN103650099B; JP5860958B2; JP2014520271A

Abstract

Verfahren zur Massenspektrometrie, umfassend die folgenden Schritte:
a) Erzeugen von Vorläuferionen in einer lonenquelle (10);
b) Lenken der Vorläuferionen in einen loneninjektor (21, 23);
c) Ausstoßen der Vorläuferionen aus dem loneninjektor (21, 23) zu einem lonenakkumulationsmittel über ein lonentor (40), sodass die Vorläuferionen an dem Ionentor (40) nur ein einziges Mal auf ihrem Weg zu dem Ionenakkumulationsmittel ankommen, wobei die Vorläuferionen als mehrere zeitlich getrennte Ionenpakete aufgrund ihrer unterschiedlichen Flugzeiten vom loneninjektor (21, 23) zum lonenakkumulationsmittel ankommen, wobei die Ionenpakete jeweils Ionen einer bestimmten von mehreren unterschiedlichen lonenspezies enthalten;
d) Steuern des Ionentors (40), um so aus den mehreren Ionenpaketen, die an dem lonentor (40) ankommen, eine Untermenge von mehreren Ionenpaketen, die aus einer Untermenge von Vorläuferionenspezies von Interesse stammen, sequentiell auszuwählen;
e) Wiederholen der Schritte a) bis d) über mehrere sequenzielle Zyklen, wobei das lonentor (40) so gesteuert wird, dass unterschiedliche Untermengen der mehreren Ionenpakete während unterschiedlicher Zyklen ausgewählt werden;
f) Akkumulieren und Mischen der Untermengen der mehreren Ionenpakete, die während des ersten und der mehreren sequenziellen Zyklen ausgewählt wurden, in dem lonenakkumulationsmittel; und
g) paralleles Analysieren der resultierenden akkumulierten lonenpopulation, die aus den gemischten Untermengen von Ionenpaketen stammt, in einem hochauflösenden Massenanalysator (70); wobei der Schritt d) das Steuern des lonentors (40) während des ersten und der mehreren sequenziellen Zyklen umfasst, um die Untermenge der mehreren Vorläuferionen in Abhängigkeit von den relativen Intensitäten der Ionenspezies im von der lonenquelle (10) generierten Spektrum von Ionen auszuwählen, sodass lonenspezies mit einer hohen relativen Intensität über weniger der mehreren Zyklen akkumuliert werden als lonenspezies mit einer niedrigen relativen Intensität.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur gezielten Analyse von Ionen mittels Tandem-Massenspektrometrie.
Allgemeiner Stand der Technik
Die Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie ist eine wohl etablierte Analysetechnik zur gezielten Analyse von komplexen Mischungen. In einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer werden Ionen aus einer Ionenquelle erzeugt und in einen ersten Quadrupol-Analysator injiziert. Hier wird ein begrenzter Massenbereich (m/z) ausgewählt, wobei dieser begrenzte Massenbereich in eine zweite Stufe eintritt, die eine mit Gas befüllte Kollisionszelle umfasst. Fragmentionen, die durch Kollisionen mit Gas erzeugt werden, treten in einen zweiten Quadrupol-Analysator ein, wo ein bestimmtes Fragment zum Nachweis ausgewählt wird.
Die Triple-Quadrupol-Technik ermöglicht die Isolierung von Vorläufer- und entsprechenden Fragmentionen von Interesse und stellt somit ein robustes quantitatives Verfahren zur Zielanalyse bereit, wenn die zu analysierenden Ziele bekannt sind, jedoch im Vergleich zu anderen Analyten in sehr geringen Mengen vorhanden sind.
Ein Nachteil dieses Analyseverfahrens ist, dass nur ein begrenztes m/z-Fenster in der ersten Stufe isoliert wird, wobei alle anderen m/z auf den Quadrupol-Stäben verloren gehen. Diese verschwenderische Vorgehensweise verhindert eine schnelle Quantifizierungsanalyse, wenn eine Vielzahl von Zielverbindungen innerhalb einer begrenzten Zeit analysiert werden muss. Die Quadrupole müssen in jedem Fall so eingestellt werden, dass sie einen anderen m/z-Bereich akzeptieren, und die effektiven Arbeitszyklen müssen recht gering sein (ungefähr 0,1 % bis 10 %, je nach der Anzahl der Ziele).
Eine Alternative zu dem herkömmlichen Triple-Quadrupol-Massenspektrometer beinhaltet die gleichzeitige Erfassung aller Fragmente aus allen Vorläufern in einem Spektrum mit hoher Auflösung und hoher Massengenauigkeit. Nachdem Erhalt dieses einzelnen Spektrums kann es durchsucht werden, um zu versuchen, Ionen eines gewünschten m/z zu identifizieren. Zu Analysatoren mit einer ausreichenden Auflösung und Massengenauigkeit, um eine Implementierung dieses Effekts zu ermöglichen, gehören der elektrostatischen Fallenanalysator Orbitrap™ und der Flugzeit-(TOF)-Analysator. Allerdings bedeuten selbst bei solchen Instrumenten (Auflösungsvermögen > 50.000 bis 100.00 und Massengenauigkeit unter 2 ppm oder sogar noch besser) die extrem großen Konzentrationsbereiche in modernen gezielten Analyseexperimenten, dass die vorhandenen so genannten „Universalmassen“-Analysatoren mit der Triple-Quadrupol-Vorrichtung im Hinblick auf Linearität, dynamischen Bereich und Nachweisgrenzen für eine spezifisches m/z von Interesse nicht konkurrieren können. TOF-Analysatoren sind durch eine geringe Übertragung und Beschränkungen der Nachweiselektronik eingeschränkt. Für die Orbitrap™ besteht die Schwierigkeit hauptsächlich in der begrenzten Ladekapazität einer externen Einfangvorrichtung.
Eine Art und Weise der Verbesserung des Massenanalysedurchsatzes ist die Ausführung einer MS/MS, bei welcher der lonenstrahl in Übereinstimmung mit dem m/z der Pakete in Pakete aufgeteilt wird. Danach wird ein erstes Paket ohne Verlust eines anderen Pakets oder parallel zu einem anderen Paket fragmentiert. Das Aufteilen des lonenstrahls in Pakete kann durch die Verwendung einer Abtastvorrichtung erfolgen, die Ionen eines breiten Massenbereichs speichert. Geeignete Vorrichtungen zur Durchführung dieser Abtastung sind eine 3D-lonenfalle, wie zum Breispiel in der WO 2003/103010 A1 offenbart, eine lineare Falle mit radialem Ausstoß, wie in der US 7,157,698 B2 beschrieben, ein gepulstes lonenmobilitätsspektrometer (siehe zum Beispiel WO 2000/70335 A2 oder US 2003/0213900 A1 ), eine verlangsamte lineare Falle (siehe WO 2004/085992 A2 ) oder ein Flugzeit-Massenspektrometer mit mehrfacher Reflexion, wie in der WO 2004/008,481 A1 beschrieben.
In jedem Fall folgt der ersten Stufe der Massenanalyse eine schnelle Fragmentierung in zum Beispiel einer Kollisionszelle (vorzugsweise einer Kollisionszelle mit einem axialen Gradienten) oder durch einen gepulsten Laser. Die resultierenden Fragmente werden zum Beispiel mittels eines anderen TOF-Massenspektrometers, jedoch auf einer viel schnelleren Zeitskala als der Abtastdauer (als „geschachtelte Zeiten“ bekannt) analysiert. Die Leistung ist jedoch noch immer beeinträchtigt, da nur eine sehr begrenzte Zeit für jede Abtastung (typischerweise 10 bis 20 µs) vorgesehen ist.
Diese Konzepte der so genannten „2-dimensionalen MS“ scheinen im Gegensatz zu der herkömmlicheren Mehrkanal-MS/MS-Anordnung, bei der eine Anzahl paralleler Massenanalysatoren (typischerweise lonenfallen) verwendet wird, um jeweils einen Vorläufer auszuwählen und danach die Fragmente aus diesem Vorläufer in einen individuellen Detektor wie die in der US 5,206,506 A offenbarte lonenfallenanordnung oder die in der US 2003/089,846 A1 offenbarten mehreren Fallen auszulesen, einen guten Durchsatz bereitzustellen, ohne die Sensitivität zu beeinträchtigen.
Alle bekannten 2-dimensionalen MS-Techniken haben jedoch den Nachteil einer relativ niedrigen Auflösung der Vorläuferauswahl (nicht besser als Einheitsauflösung) und eines relativ geringen Auflösungsvermögen bei der Fragmentanalyse (nicht mehr als wenige Tausende). Ferner basieren diese bekannten 2-dimensionalen MS-Techniken auf der Verwendung von Einfangvorrichtungen zur Bereitstellung eines hohen Arbeitszyklus, wobei die Zykluszeit durch die Zykluszeit des langsamsten Analysators definiert ist. Moderne Ionenquellen können Ionenströme in einer Größenordnung von Hunderten von Pikoampere, das heißt über 10⁹ Elementarladungen pro Sekunde erzeugen. Wenn also der vollständige Abtastzyklus durch den gesamten Massenbereich von Interesse 5 ms beträgt, dann sollten solche Einfangvorrichtungen prinzipiell bis zu 5 Millionen Elementarladungen akkumulieren und trotzdem eine effiziente Vorläuferauswahl ermöglichen können.
Die WO 2008/059246 A2 beschreibt eine Anordnung, welche die gleichzeitige leistungsstarke Isolierung einer Vielzahl von lonenspezies entweder zum anschließenden Nachweis oder zur Fragmentierung ermöglicht. In der offenbarten Anordnung werden Ionen in eine elektrostatische Falle mit mehrfacher Reflexion injiziert, die Ionen entlang einer Achse vor- und zurückreflektiert. Ionen von Spezies von Interesse werden durch eine geeignete Steuerung eines elektrostatischen Tors isoliert, das Ionen in Übereinstimmung mit ihren Oszillationszeitraum in der Falle entlang eines ersten bzw. zweiten lonenwegs ablenkt.
Vor diesem Hintergrund stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Tandem-Massenspektrometrie nach Anspruch 1 bereit. Die Erfindung betrifft auch ein Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 21.
Die Erfindung basiert auf der Tatsache, dass eine gezielte Analyse nicht erfordert, dass alle MS/MS-Spektren unabhängig erfasst werden. Das Instrument muss lediglich getrennte und nachweisbare Peaks für die lonenspezies von Interesse liefern. Die Populationen dieser getrennten Vorläufer können erneut miteinander gemischt und in einem einzigen hochauflösenden Spektrum erfasst werden. Diese sogenannte parallele Reaktionsüberwachung (PRM) ermöglicht eine parallele Quantifizierung einer Vielzahl von Analyten von niedriger Intensität, sodass die Nachweisgrenzen gegenüber Triple-Quadrupolen in massiven Zielexperimenten erheblich erhöht werden.
Die an dem lonentor zur Weiterleitung an die lonenführung ausgewählten Ionen können bei Ankunft an der lonenführung und stromabwärts von dieser in einem unfragmentierten Zustand verbleiben, während sie in dem hochauflösenden Massenanalysator analysiert werden. Dieser Betriebsmodus erweitert die Funktionen der oben beschriebenen „Universalmassen“-Analysetechnik erheblich, da die Möglichkeit des Speicherns von m/z unterschiedlicher Intensitäten durch die Verwendung unterschiedlicher Arbeitszyklen eröffnet wird. Auf diese Weise werden sowohl unfragmentierte als auch fragmentierte Spektren mit einem Intensitätsbereich erhalten, der um 1 bis 3 Größenordnungen verringert wurde. Zum Beispiel können Peaks von niedriger Intensität nach jeder Injektion an den hochauflösenden Massenanalysator übertragen werden, wohingegen Peaks von hoher Intensität möglicherweise nur während 0,5 bis 1 % aller Injektionen übertragen werden. Die verschiedenen erhaltenen relativ kleinen Massenbereichsspektren (die jeweils ihr eigenes bestimmtes Abschwächungsschema haben) können wahlweise miteinander verknüpft werden (zum Beispiel anhand der Technik, die in der WO 2005/093783 A2 beschrieben ist). Mit einem Endspektrum, das für diese Differenzen hinsichtlich der Übertragungen korrigiert ist, ermöglicht ein solches „Verknüpfen des Spektrums“ eine signifikante Erweiterung des dynamischen Analysebereichs.
Außerdem stellt die angewendete Technik ausreichend Zeit zum Fragmentieren von Ionen bereit und stellt insbesondere ausreichend Zeit zum Anwenden solcher kürzlich entwickelter „langsamer“ Techniken wie Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) oder Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation (IRMPD) bereit.
Somit können gemäß einigen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung einige oder alle Vorläuferionen, die durch das lonentor gelassen werden, stromabwärts davon fragmentiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die lonenführung eine Fragmentierungszelle und eine Ionenfalle (die wahlweise eine zweite Ionenfalle sein kann) stromabwärts dieser Fragmentierungszelle. Vorläuferionen von Interesse werden dann von dem lonentor ausgewählt und in die Fragmentierungszelle geleitet, wo einige oder alle Vorläuferionen fragmentiert werden. Die Fragmentionen (und etwaige restliche Vorläuferionen) werden dann von dem hochauflösenden Massenanalysator analysiert. Am meisten bevorzugt werden die Fragmentionen in der (zweiten) Ionenfalle gespeichert, sodass zum Beispiel bestimmte Spezies von geringer Häufigkeit in dieser (zweiten) Ionenfalle durch eine Vielzahl von Zyklen der Technik vor der hochauflösenden Massenanalyse vermehrt werden können. In zusätzlichen oder alternativen Ausführungsformen kann die Vermehrung von Vorläuferionen auch oder stattdessen in dem Ionenakkumulationsmittel stattfinden, und zwar entweder durch Verwenden einer Fragmentierungszelle, jedoch bei einem Betrieb in einem niedrigen Energiemodus, sodass Ionen nicht fragmentiert werden, und/oder durch Umgehen der Fragmentierungszelle (oder Nichtverwenden davon) und Einsetzen einer zweiten Ionenfalle.
Somit kann eine Vielzahl von m/z-Bereichen (und nicht nur 1, wie in Quadrupol-Massenfiltern) aus einem breiten Massenbereich von Vorläufern ausgewählt werden. Jede ausgewählte Vorläuferspezies kann wahlweise mit einer jeweiligen optimalen Energie fragmentiert werden und die Fragmente können dann in einer einzigen Fragmentpopulation mit breitem Spektrum kombiniert werden. Diese einzige Fragmentpopulation kann dann in einem hochauflösenden Massenanalysator wie einem TOF-Massenspektrometer, einer elektrostatischen Orbitfalle wie der Orbitrap^(™) oder FT-ICR-Massenspektrometer analysiert werden. Somit wird ein Verfahren und eine Vorrichtung vorgeschlagen, die einerseits den begrenzten Raum, also die Ladekapazität der Einfanganalysatoren und andererseits den begrenzten dynamischen Bereich von TOF in Angriff nimmt, indem eine begrenzte, jedoch dennoch mehrzahlige Anzahl von lonenspezies von analytischem Interesse zur Fragmentierung und anschließenden parallelen Analyse ausgewählt wird. Zum Beispiel könnten mit dieser Technik zwischen 10 und 100 Vorläuferspezies zusammen analysiert werden.
Die vorliegende Erfindung kann ein Verfahren zur Tandem-Massenspektrometrie bereitstellen, umfassend die Schritte a) Erzeugen von Vorläuferionen in einer lonenquelle; b) Einfangen der Vorläuferionen in einer Ionenfalle; c) Ausstoßen der Vorläuferionen aus der Ionenfalle zu einer lonenführung über ein lonentor, sodass die Vorläuferionen an dem lonentor nur einmal auf ihrem Durchlass zu der lonenführung ankommen, wobei die Vorläuferionen als zeitlich getrennte mehrere Ionenpakete ankommen, die jeweils Ionen einer bestimmten von mehreren unterschiedlichen lonenspezies enthalten; d) derartiges Steuern des lonentors, dass es aus den mehreren Ionenpaketen, die an dem lonentor ankommen, sequentiell eine Untermenge von mehreren Ionenpaketen auswählt, die aus einer Untermenge von Vorläuferionenspezies von Interesse stammen; e) Mischen der ausgewählten Untermenge von Ionenpaketen in der lonenführung; und f) Analysieren der resultierenden lonenpopulation, die aus der gemischten ausgewählten Untermenge von Ionenpaketen stammt, in einem hochauflösenden Massenanalysator.
Es kann auch ein Tandem-Massenspektrometer bereitgestellt werden, umfassend eine lonenquelle zum Erzeugen von Vorläuferionen; eine Ionenfalle, die stromabwärts der lonenquelle zum Einfangen von Vorläuferionen aus der lonenquelle angeordnet ist; ein lonentor mit einmaligem Durchlass, das in einem Weg von Vorläuferionen angeordnet ist, die von der Ionenfalle zu einer stromabwärts befindlichen lonenführung ausgestoßen werden, wobei die Vorläuferionen an dem lonentor als mehrere zeitlich getrennte Ionenpakete ankommen, die jeweils Ionen einer bestimmten von mehreren unterschiedlichen lonenspezies enthalten; eine lonentorsteuerung, die zum Steuern des lonentors mit einmaligem Durchlass konfiguriert ist, den Durchlass nur einer Untermenge von Ionenpaketen zu ermöglichen, die eine jeweilige Untermenge mehrerer Vorläuferionenspezies von Interesse enthalten, wobei die lonenführung zum Aufnehmen von Vorläuferionen konfiguriert ist, die durch das lonentor mit einmaligem Durchlass hindurch gelassen werden; wobei das Tandem-Massenspektrometer ferner Folgendes umfasst: einen hochauflösenden Massenanalysator, der zum Analysieren der Ionen oder ihrer Fragmente angeordnet ist.
Figurenliste
Die Erfindung kann auf mehrere Arten und Weisen in die Praxis umgesetzt werden, wobei nun rein beispielhaft und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen einige Ausführungsformen beschrieben werden. Es zeigen:

1 eine erste Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers für die gezielte Analyse von Ionen;
2 eine zweite Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers für die gezielte Analyse von Vorläuferionen;
3a und 3b jeweils Drauf- und Seitenansichten einer dritten Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers für die gezielte Analyse von Vorläuferionen, das einen nicht einfangenden lonenbeschleuniger aufweist; und
4a und 4b jeweils schematische Ansichten von DC- und RF-Ionenführungen zur Bereitstellung eines alternativen Mittels zur orthogonalen Beschleunigung von Ionen als dem nicht einfangenen lonenbeschleuniger aus 3a und 3b.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
In Bezug auf 1 ist ein Tandem-Massenspektrometer 1 dargestellt. Das Massenspektrometer 1 umfasst eine lonenquelle 10 wie eine Elektrospray-Ionenquelle oder eine MALDI-Ionenquelle, die einen kontinuierlichen oder gepulsten Strom geladener Teilchen (Vorläuferionen) erzeugt, die analysiert werden sollen. Die Ionen aus der Ionenquelle werden in eine erste Stufe eines Nur-RF-Speichers (Ionenfalle) 20 gegeben, unmittelbar gefolgt von einer zweiten Stufe eines Nur-RF-Speichers (Ionenfalle) 21. Sowohl die erste als auch die zweite Ionenfalle 20, 21 sind durch lineare Nur-RF-Multipole gebildet, die mit Gas gefüllt und durch eine Öffnung 22 getrennt sind. Die Öffnung steuert den ankommenden Ionenfluss. Am meisten bevorzugt ist die zweite Ionenfalle 21 eine sogenannte gekrümmte lineare Falle oder C-Falle, zum Beispiel des Typs, der in der WO 2008/081334 A2 beschrieben ist. Die RF-Frequenz, die auf die Multipole der ersten und der zweiten Stufe 20, 21 angewendet wird, liegt vorzugsweise zwischen etwa 2 und 5 MHz. Der Druck in der zweiten Ionenfalle 21 ist derart gewählt, dass eine lonenkühlung in einem kurzen Zeitraum, vorzugsweise von weniger als 1 ms bereitgestellt wird. Dieser Zeitraum entspricht einem Druck von etwa 3 bis 10 x 10^-3 mbar Stickstoff. Vorzugsweise wird ein schmaler Gasstrahl aus der lonenquelle 10 eingesetzt.
Die Spannung der Öffnung 22 wird verringert, um Ionen in die zweite Ionenfalle 21 einzulassen, und danach wieder erhöht, um restliche Vorläuferionen aus der lonenquelle in der ersten Ionenfalle 20 zurückzuhalten (speichern).
Nach nicht mehr als 1 Millisekunde Kühlzeit werden die Ionen in der zweiten Ionenfalle 21 orthogonal zu der Achse dieser zweiten Ionenfalle 21 ausgestoßen. Die Achse der zweiten Ionenfalle 21 ist für die Zwecke dieser Beschreibung die Achse, entlang der die Fallenstäbe verlängert sind. Der Ausstoß kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Erstens können die Ionen durch Anlegen einer DC-Spannung an die RF-Stäbe der zweiten Ionenfalle 21, jedoch ohne Abschalten der RF-Spannungen, die an diese Stäbe angelegt werden, orthogonal ausgestoßen werden. Als Alternative kann die gleiche Technik, jedoch auch unter schnellem Abschalten der RF-Spannungen angewendet werden. Diese Technik ist in der US 7,498,571 B2 beschrieben, deren Inhalte hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. In diesem Fall ist die zweite Ionenfalle 21 vorzugsweise eine C-Falle wie in der WO 2008/081,334 A2 . Eine andere Alternative zur Ermöglichung des orthogonalen Ausstoßes aus der zweiten Ionenfalle 21 ist die Anwendung einer dipolaren Anregung an gestreckte RF-Stäbe, wie in der US5,420,425 A beschrieben. Die Amplitude der dipolaren Anregung kann abgetastet werden, um eine Massenabtastgeschwindigkeit zwischen 2 und 10x10⁵ amu/Sekunde bereitzustellen. Die bevorzugte Anordnung des Tandem-Massenspektrometers für diese Variante des orthogonalen Ausstoßes ist in 2 dargestellt und wird in Verbindung mit dieser Figur nachstehend ausführlicher beschrieben. Eine wieder andere Anordnung für den orthogonalen gepulsten Ausstoß aus der Falle 21 ist in der US 8,030,613 B2 beschrieben.
Wenngleich bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung den orthogonalen Ausstoß aus der zweiten Ionenfalle 21 nutzen, können Ionen auch axial aus der zweiten Ionenfalle 21 ausgestoßen werden. Allerdings ermöglicht diese Anordnung typischerweise eine geringere Raumladung des ausgestoßenen Impulses. Die Raumladungsgrenze der zweiten Ionenfalle erreicht vorzugsweise zwischen 1 und 3x10⁶ Elementarladungen. Dies entspricht einem zulässigen Ionenfluss zwischen 1 und 3x10⁹ Elementarladungen pro Sekunde, was einem lonenstrom zwischen 200 und 600 pA entspricht. Dies stimmt mit der typischen Leuchtdichte moderner Ionenquellen wie den oben beschriebenen Elektrospray- und MALDI-Ionenquellen überein.
Nach dem orthogonalen Ausstoß aus der zweiten Ionenfalle 21 werden Ionen durch einen optionalen elektrischen Sektor 25 in einen Flugzeitanalysator 30 mit einfacher oder mehrfacher Reflexion (MR-TOF) geleitet, um die Flugzeittrennung von Ionen in Übereinstimmung mit ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung zu ermöglichen und gleichzeitig eine relativ kompakte Verpackung aufrechtzuerhalten. In alternativen Ausführungsformen kann ein Multisektor-Flugzeit-Massenanalysator (z. B. MULTUM) oder ein TOF mit mehrfacher Ablenkung oder ein Orbital-Flugzeit-Massenanalysator als der Analysator 30 verwendet werden. Geeignete Vorrichtungen sind in der WO 2009/081143 A2 oder WO 2010/136534 A1 beschrieben.
Stromabwärts des MR-TOF 30 ist ein Ionentor 40 angeordnet. In der Ausführungsform aus 1 ist das lonentor 40 an dem Brennpunkt des MR-TOF-Analysators 30 angeordnet. Vorläufer mit unterschiedlichem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) kommen zu unterschiedlichen Zeitpunkten an dem Tor 40 an. Das Tor 40 untersteht einer Steuerung 100. Die Steuerung steuert das Tor 40, um (in der in 1 dargestellten Anordnung) Vorläuferionen von analytischem Interesse auf einer gewünschten Bahn in eine Fragmentierungszelle 50 einzulassen. Alle unerwünschten Ionen werden auf eine Ionensperre (oder Elektrometer) 41 unter Verwendung von Spannungsimpulsen abgelenkt, die an das lonentor 40 unter der Kontrolle der Steuerung 100 angelegt werden. Das lonentor 40 selbst kann als ein einfacher Deflektor oder alternativ als Bradbury-Nielsen-Gate (siehe Phys.Rev. Bd. 49, Nr. 5, S. 388-393) 1936) implementiert sein. Am meisten bevorzugt ist das lonentor 40 gitterlos. Wahlweise kann ein zusätzlicher Impulsgeber 42 eingesetzt werden, um die Energieverteilung zu verringern. Diese Technik ist in der US7,858,929 B2 beschrieben, deren Inhalte hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Das lonentor 40 und der Impulsgeber 42 können wahlweise in einem Energieauftrieb integriert sein, der das Potential (in Bezug auf die Flugröhre) auf einen Pegel erhöht, der zum Transfer zu einer stromabwärts befindlichen Kollisionszelle 50 für Ionen, die sich in der Nähe des lonentors 40 befinden, ausreichend ist.
Die auszuwählenden Ionenspezies können zuerst durch Erhalten eines Panoramaspektrums von Vorläuferionen hergeleitet werden. Die relativen Intensitäten von Vorläuferionen in diesem Panoramaspektrum können auch vorteilhaft zur Bereitstellung einer automatischen Verstärkungsregelung verwendet werden. Insbesondere können zur Einstellung der Anzahl von Vorläuferionen und ihren Fragmenten zueinander, um ähnliche relative Häufigkeiten bereitzustellen, einige der Vorläuferionenspezies während nur eines einzigen Zyklus des Tandem-Massenspektrometers übertragen werden, wohingegen andere Spezies in mehreren Zyklen übertragen werden. Dies wird anhand eines einfachen Beispiels deutlich. Es wird ausgegangen von einem Panoramaspektrum von Vorläuferionen, in dem eine erste lonenspezies, nämlich Spezies 1, eine relative Häufigkeit von ungefähr dem 40-Fachen der relativen Häufigkeit einer zweiten Vorläuferspezies, nämlich Spezies 2 hat. Damit letztendlich ungefähr ähnliche Anzahlen von Paketen der lonenspezies 1 und lonenspezies 2 analysiert werden, werden die Ionen von lonenspezies 1 nur während eines von vierzig Zyklen der Anordnung aus 1 durch das lonentor 40 gelassen. Mit „Zyklus“ ist das Entleeren der zweiten Ionenfalle 21 mit anschließender Flugzeittrennung und Steuerung an dem Ionentor 40 in die Fragmentierungszelle 50 gemeint. Im Gegensatz dazu werden Ionen von Spezies 2 mit einer relativen Häufigkeit des 1/40-Fachen derjenigen von lonenspezies 1 in jedem von vierzig Zyklen des Spektrometers 1 durch das lonentor 40 gelassen. Man wird natürlich verstehen, dass die relative Zeitsteuerung der mehreren Zyklen nicht maßgeblich ist: das heißt, bei der Bereitstellung einer angemessenen Anzahl von Vorläuferionen über mehrere Zyklen des Spektrometers 1 ist es typischerweise unerheblich, in welchem dieser Zyklen jede einzelne lonenspezies akkumuliert wird.
Als Alternative zu dieser „digitalen“ lonendosierung ist auch eine „analoge“ Dosierung möglich, wobei das lonentor 40 kein „Ein-/Aus“-Schalten des lonenstrahls, sondern vielmehr eine gesteuerte Abschwächung der Strahlintensität durch variable Spannung bereitstellt. Diese Abhängigkeit der Abschwächung von der Spannung kann unter Verwendung einer Kalibrierungsmischung kalibriert und dann für reale Analyten verwendet werden.
In beiden Varianten werden in den endgültigen Ausgabespektren gemessene Intensitäten vorzugsweise durch diese Abschwächungsfaktoren zurückskaliert, um eine genaue quantitative Darstellung bereitzustellen. Benachbarte, relativ enge Massenbereichsspektren können miteinander verknüpft werden, um ein breiteres Massenbereichs-(„Panorama“)-Spektrum zu erzeugen. Eine geeignete Technik diesbezüglich ist in der WO 2005/093783 A2 beschrieben. Mit einem endgültigen Spektrum, das für diese Übertragungsdifferenzen korrigiert ist, ermöglicht ein solches verknüpftes Panoramaspektrum einen enorm erweiterten dynamischen Analysebereich.
Vorzugsweise werden in der Anordnung aus 1 zwischen 10 und 100 separate lonenspezies (unterschiedliche m/z) für eine bestimmte Analyse in Abhängigkeit des jeweils durchgeführten Experiments ausgewählt. Analyten werden wünschenswerterweise parallel zu ihren internen Kalibranten ausgewählt, wenngleich, wie oben erläutert, die Anzahl der Zyklen je nach der Differenz der Intensitäten der Vorläuferionen in einem Vorläuferionenspektrum unterschiedlich sein kann.
Die Kollisionszelle 50, in die Vorläuferionenspezies selektiv gesteuert werden, ist vorzugsweise ein gasgefüllter Multipol mit einem DC-Feld, um Ionen am Ende der Kollisionszelle 50, wo sie sich vermischen, zu sammeln. Die Kollisionszelle 50 ist mit einem hochauflösenden Massenanalysator 70 mit optionaler Verwendung einer externen loneneinfangvorrichtung 60 zwischen der Kollisionszelle 50 und dem hochauflösenden Massenanalysator 70 verbunden. Wenn die Energieverteilung der Ionen auf wenige Duzend eV verringert werden kann, dann kann Stickstoff oder Argongas als ein Kollisionsgas in der Kollisionszelle 50 verwendet werden. Allerdings wird für eine Energieverteilung von mehreren Duzend über eV oder darüber Helium als ein Kollisionsgas eingesetzt, da dieses eine viel höhere Kollisionsenergie ermöglicht.
Nachdem alle ausgewählten Vorläuferionen in der Kollisionszelle 50 fragmentiert und abgekühlt wurden, werden sie über die optionale externe Vorrichtung 60 in den hochauflösenden Massenanalysator 70 befördert. Mit „hochauflösendem Analysator“ ist eine beliebige Vorrichtung gemeint, die eine Massenanalyse mit einem Auflösungsvermögen von Zehn- oder Hunderttausenden bereitstellen kann, wie eine elektrostatische Orbitalfalle wie ein Orbitrap^(™)-Analysator, ein TOF-Analysator von beliebigem Typ wie ein TOF-Analysator mit orthogonaler Beschleunigung mit oder ohne lonenspiegel, ein Flugzeit-Massenanalysator mit mehrfacher Reflexion, ein Multisektor-Flugzeit-Massenanalysator, ein Flugzeit-Massenanalysator mit mehrfacher Ablenkung oder alternativ ein Fourier-Transformations-Massenanalysator oder sonstiger. Die optimale Einstellung des Auflösungsvermögens hängt von der Komplexität der resultierenden Mischung ab und sollte sogar für einfache Mischungen typischerweise mindestens 10.000 und vorzugsweise mindestens 20.000 betragen. Für mehrere Duzend sich überschneidende MS/MS-Spektren geht man davon aus, dass ein optimales Auflösungsvermögen 50.000 überschreitet.
Wenn der hochauflösende Massenanalysator 70 ein Orbitrap^(™)-Massenanalysator ist, ist die optionale externe Vorrichtung 60 vorhanden und ist vorzugsweise eine Nur-RF-Speicherfalle wie eine C-Falle, die in der WO 2008/081334 A2 beschrieben ist. In diesem Fall werden mehrere Ausstoßimpulse aus der zweiten Ionenfalle 21 in der Fragmentierungszelle fragmentiert, die Fragmente werden dann in der C-Falle 60 akkumuliert. Nach der Akkumulation aller Fragmente in der C-Falle 60 werden sie als ein einzelner Impuls in den Orbitrap-Analysator 70 injiziert, um ein einzelnes Spektrum zu erfassen.
Wenn der hochauflösende Massenanalysator 70 als Alternative ein TOF-Massenanalysator ist, dann können Fragmentionen in der Kollisionszelle 50 kontinuierlich aus dieser Kollisionszelle 50 austreten, wobei aus dem lonenstrom kontinuierlich bei einer Frequenz zwischen 1 und 100 kHz von einem orthogonalen Beschleuniger Stichproben zur kontinuierlichen Erfassung entnommen werden. Für lange Fluglängen und/oder TOF mit mehrfacher Reflexion kann wieder eine C-Falle oder andere RF-Speichervorrichtung als die externe Vorrichtung 60 verwendet werden. In diesem Fall ist es nicht notwendig, den Vorgang der Injektion der Fragmentionen in den TOF-Massenanalysator 70 mit dem Ausstoß aus der zweiten Ionenfalle 21 zu synchronisieren.
Als weitere Option können die Ionen ohne Fragmentierung in die externe Vorrichtung 60 befördert werden. Das heißt, die Ionen werden ohne Fragmentierung durch die Fragmentierungszelle 50 gelassen oder sie können als Alternative dazu veranlasst werden, die Fragmentierungszelle 50 zu umgehen. Dies kann durch Verringern der Amplitude der RF-Spannung an den Stäben der Fragmentierungszelle 50 oder durch die Verwendung eines zusätzlichen lonenwegs (nicht dargestellt) mit Nur-RF-Transportmultipolen erzielt werden. Dies ist die bevorzugte Vorgehensweise zum Erhalt einer Vorabtastung mit korrekten (unskalierten) Intensitäten von Vorläuferionen.
Dank der oben beschrieben Technik repräsentiert jedes Spektrum, das von dem hochauflösenden Massenanalysator 70 erhalten wird, die parallele (d. h. gleichzeitige) Erfassung von Fragmentspektren zwischen 10 und 100 Vorläuferionenspezies, wobei jeder Vorläufer ungefähr die gleichen lonenanzahlen hat, unter Anwendung der beschriebenen Technik der automatischen Verstärkungsregelung (AGC). Dies führt wiederum zu einer Erhöhung des Arbeitszyklus der Massenauswahl um einen Faktor G, wobei G der Anzahl der Vorläuferionenspezies ähnlich ist, die zur parallelen Erfassung und Analyse ausgewählt wurden. Eine solche Erhöhung des Arbeitszyklus stellt eine signifikante Verbesserung der Analysezeit und -empfindlichkeit dar.
2 zeigt eine alternative Anordnung eines Tandem-Massenspektrometers für die gezielte Analyse von Vorläuferionen mit hohem Durchsatz. Die Komponenten, die 1 und 2 gemeinsam haben, sind mit ähnlichen Bezugszeichen gekennzeichnet. In 2 werden Ionen wieder von einer lonenquelle 10 erzeugt und in eine erste Stufe eines Nur-RF-Speichers (Ionenfalle) 20 gegeben. Eine Öffnung 22 trennt die erste Ionenfalle 20 von einer zweiten Stufe eines Nur-RF-Multipols (zweite Ionenfalle) 21.
Wie in der Ausführungsform aus 1 werden Ionen von der ersten und der zweiten Ionenfalle durch Verringern der Spannung an der Öffnung 22 durchgelassen, wobei die Spannung danach erneut erhöht wird, nachdem die zweite Ionenfalle 21 gefüllt ist.
In der Ausführungsform aus 2 werden dann Ionen orthogonal aus der zweiten Ionenfalle 21 direkt ohne die Verwendung eines MR-TOF 30, der in der Ausführungsform aus 1 verwendet wird, in die Fragmentierungszelle 50 ausgestoßen. Dies kann durch Anlegen einer dipolaren Anregung an die gestreckten RF-Stäbe der Falle 21 erreicht werden, wie in der US 5,420,425 A beschrieben. Die Amplitude der dipolaren Anregung kann zur Bereitstellung zwischen 2 und 10 x 10⁵ amu/Sekunde Massenabtastgeschwindigkeit abgetastet werden. Natürlich ist ein lonentor 40 zwischen der zweiten Ionenfalle 21 und der Fragmentierungszelle 50 wahlweise zusammen mit einem Impulsgeber 41 und einer Ionensperre 42 bereitgestellt, um Ionen aufzunehmen, die von dem lonentor 40 abgelenkt werden, wenn sie nicht von analytischem Interesse sind und nicht in die Kollisionszelle 50 injiziert werden sollen.
Im Gegensatz zu der Anordnung aus 1 ist das lonentor 40 in der Anordnung aus 2 unmittelbar stromabwärts der zweiten Ionenfalle 21 angeordnet (wobei kein MR-TOF-Analysator vorhanden ist, um einen Brennpunkt in der Anordnung aus 2 bereitzustellen). Dennoch kommen Ionen mit unterschiedlichem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (unterschiedlichen Spezies) zu unterschiedlichen Zeitpunkten an dem Tor 40 in der Anordnung aus 2 an, sodass nur Ionen von analytischem Interesse in die Fragmentierungszelle 50 gelassen werden. Typischerweise könnten auf diese Weise Fenster von nur wenigen atomaren Masseneinheiten (z. B. 1 bis 4 amu) angesteuert werden.
Nach der Fragmentierung der Vorläuferionen, die in die Fragmentierungszelle eintreten, werden diese in eine externe Vorrichtung 60 injiziert. Von da aus werden sie wiederum in einen hochauflösenden Massenanalysator 70 zur Erzeugung eines zusammengesetzten Massenspektrums aller Fragmentspezies zusammen injiziert.
In der Ausführungsform aus 2 können Vorläuferionen von Interesse ferner (durch Umlenken von Ionen, die nicht von Interesse sind, durch die Steuerung des lonentors 40 von der Steuerung 100) ohne Fragmentierung in die externe Vorrichtung 60 befördert werden. Der Transfer ohne Fragmentierung in die externe Vorrichtung 60 kann bei reduzierten RF-Amplituden oder wahlweise entlang eines zusätzlichen lonenwegs durch Nur-RF-Transportmultipole (in 2 nicht dargestellt) ausgeführt werden.
Die Anforderung eines hohen Durchsatzes der zweiten Ionenfalle 21 kann gelockert werden, wenn intensive Ionenpeaks entweder in der zweiten Ionenfalle 21 oder in vorherigen lonenstufen zusätzlich entfernt werden. Zum Beispiel kann eine RF-Optik mit niedriger Massengrenze in der Ionenquelle 10, der ersten Ionenfalle 20 oder der zweiten Ionenfalle 21 verwendet werden, um eine grobe Massenfilterung durchzuführen. Als Alternative kann eine Resonanzanregung bestimmter Verhältnisse von Masse zu Ladung in der lonenquelle 10, der ersten Ionenfalle 20 und/oder der zweiten Ionenfalle 21 verwendet werden. Als weitere Alternative kann eine kleine DC-Spannung an einen Quadrupol angelegt werden, um sowohl niedrige als auch hohe Massengrenzen entweder in der lonenquelle 10, der ersten Ionenfalle 20 oder der zweiten Ionenfalle 21 bereitzustellen. Die Hauptanforderung in einem solchen Fall der Vorfilterung besteht darin, dass für jede lonenspezies von Interesse die durchschnittliche lonenzahl N in einem Impuls an dem Eingang der Fragmentierungszelle 50 geringen kumulativen Verlusten über die vorherigen Stufen des Massenspektrometers 1 ausgesetzt sein sollte. Mathematisch kann dies durch I_in > e.z.N.f>>I_in/G ausgedrückt werden. Hierbei ist e die Elementarladung ((1,602 x 10^-19 Coulomb), z ist der Ladungszustand einer lonenspezies mit einem bestimmten m/z, f ist die Ausstoßfrequenz aus der zweiten Ionenfalle 21 und I_in ist der lonenstrom am Ausgang aus der lonenquelle 10. Wenn Hochfrequenz-RF-Spannungen an die erste und die zweite Ionenfalle 20, 21 angelegt werden (zum Beispiel zwischen 2 und 5 MHz), und geeignete breite Schlitze und eine korrekte Synchronisierung verwendet werden, kann ein lonenstrom I_out = e.z.N.f=(0,2...0,5) I_in erzielt werden. Mit anderen Worten stellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung einen Vorteil gegenüber Triple-Quadrupolen bereit, selbst wenn nur eine begrenzte Anzahl von Vorläufern ausgewählt wird.
Der oben beschriebene Ansatz ist auch mit relativ langsamen Fragmentierungsverfahren wie der Elektronentransfer-Dissoziation (ETD); OzID (ozoninduzierte Dissoziation), IRMPD, UV-Dissoziation und so fort kompatibel und verbessert die Nützlichkeit dieser „langsamen“ Fragmentierungsverfahren für gezielte Analysen. Derzeit werden solche Techniken bei gezielten Analysen aufgrund der langen Aktivierungszeit, die notwendig ist, nur sehr begrenzt angewendet. Zur Bereitstellung einer ähnlichen Fragmentierungseffizienz für unterschiedliche Vorläufer kann jedes ETD-Experiment für den gleichen Ladezustand aller Ionen ausgeführt werden, z. B. werden in einem ersten Experiment nur Ionen mit einer Ladung +3 zur Einführung in die Fragmentierungszelle 50 ausgewählt, in einem zweiten Experiment +4 usw. Für die IRMPD und UV-Dissoziation sollten gezielte Vorläufer vorzugsweise ähnliche Dissoziationskonstanten (das heißt Querschnitte) usw. aufweisen. Es können auch mehrere unterschiedliche Experimente dieser Art in jedem Spektrum des hochauflösenden Analysators vorhanden sein.
Die Anwendung der oben beschriebenen Verfahren ist vielfältig. Zum Beispiel können sie bei der Peptidquantifizierung, Analyse komplexer Mischungen in klinischen, Lebensmittel-, Umwelt- und forensischen Anwendungen angewendet werden. Während des Gebrauchs wird die Liste der Verhältnisse von Masse zu Ladung der Vorläufer und Fragmente in einen Computer (nicht dargestellt) geladen, der die Steuerung 100 direkt oder indirekt steuert, vorzugsweise zusammen mit entsprechenden Retentionszeiten in einem Flüssigchromatograph (LC) und ihren Variationsbereichen. Danach wird ein volles MS-Spektrum ohne Fragmentierung verwendet, um ein Übersichtsspektrum und eine Schätzung der Peakintensitäten zu erhalten. Danach werden in Abhängigkeit der AGC-Überlegungen wie erläutert ein oder mehrere Zyklen mittels der oben beschriebenen Techniken ausgeführt. Für Mischungen von Biopolymeren wie Peptiden müsste die Liste für jede Injektion in den hochauflösenden Analysator derart erstellt werden, dass ausgewählte Vorläufer minimale Überlappungen in ihren Fragmenten haben, d. h., für jeden Vorläufer mindestens ein spezifisches Fragment vorhanden sein sollte, das seine Identität zusammen mit der genauen Masse des Vorläufers bestätigen könnte.
Das Verfahren könnte auch ohne Fragmentierung vielfältig angewendet werden, sodass dann durch die Ermittlung einer genauen Masse von Analyten und durch die Minimierung des Risikos falscher positiver Ergebnisse des hohen Auflösungsvermögens, bei dem die Analyse durchgeführt wird, eine zuverlässige Identifizierung bereitgestellt wird. Ein Beispiel schließt ein pseudopanoramaartiges Massenspektrum mit sehr hohem dynamischem Bereich ein, wobei der gesamte Massenbereich in Tausende Unterbereiche aufgeteilt ist, wobei jeder Unterbereich einer ähnlichen Anzahl von Ladungen zugewiesen ist. Nach dem Ansteuern der Ionen in Übereinstimmung mit den zugewiesenen Ladungen wird ein Panoramaspektrum von dem hochauflösenden Analysator erfasst, wobei die intensivsten Peaks in dem ursprünglichen Panoramaspektrum im Vergleich zu den am wenigsten intensiven Peaks eine (viel) geringere Anzahl von Injektionen empfangen. Das erfasste Spektrum wird dann in Übereinstimmung mit dieser Differenz hinsichtlich der Anzahl von Injektionen korrigiert, sodass relative Intensitäten von Ionen wiederhergestellt werden, jedoch auch die Messung der am wenigsten intensiven Peaks mit einem viel höheren Signal-RauschVerhältnis ermöglicht wird, wenn sich diese außerhalb der Nähe der intensiven Peaks befinden.
Die Ausführungsformen aus 1 und 2 zeigen beide Tandem-Massenspektrometer, in denen Ionen aus der lonenquelle 10 in einer ersten Ionenfalle 20 eingefangen sind und danach an eine zweite Ionenfalle 21 übertragen werden, von wo die Ionen orthogonal zu dem MR-TOF 30 (1) oder direkt einer Kollisionszelle 50 (2) ausgestoßen werden. Allerdings werden in alternativen Anordnungen gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Ionen aus der lonenquelle keiner anfänglichen Einfangstufe unterzogen, sondern stattdessen direkt in einen orthogonalen Beschleuniger injiziert. 3a und 3b zeigen eine Drauf- und Seitenansicht einer solchen Anordnung für gezielte Analysen mit hohem Durchsatz unter Verwendung eines TOF-Analysators zur Vorläufertrennung, jedoch unter Verwendung einer nicht einfangenden orthogonalen Ausstoßvorrichtung stromabwärts der lonenquelle. Alternative Anordnungen von orthogonalen DC- und RF-Ausstoßvorrichtungen die wieder das anfängliche Einfangen von Ionen von der Ionenquelle vermeiden, sind jeweils in 4a und 4b dargestellt.
In Bezug auf 3a und 3b ist ein Tandem-Massenspektrometer gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ausführlicher dargestellt. Die Komponenten, die 1, 2 und 3 gemeinsam haben, sind mit ähnlichen Bezugszeichen gekennzeichnet.
Ionen werden, wie oben beschrieben, in der lonenquelle 10 erzeugt. Von dort werden sie in einen orthogonalen Beschleuniger 23 ausgestoßen. In der Ausführungsform aus 3a ist der orthogonale Beschleuniger 23 als ein Paar parallele Platten 24, 25 implementiert. Die parallele Platte 24 fungiert als eine Extraktionsplatte mit einem Gitter oder am meisten bevorzugt einem Schlitz zur Extraktion des Strahls, wie zum Beispiel in der WO 01/11660 A1 beschrieben. Ionen treten in den Beschleuniger ein, wenn keine DC-Spannung an diesen angelegt wird. Nachdem der lonenstrahl in einer ausreichenden Länge in den Beschleuniger 23 eingetreten ist, wird eine gepulste Spannung an den Beschleuniger angelegt und die Ionen werden über Linsen 27 in einen TOF-Analysator 30 extrahiert. Je nach der erforderlichen Isolierqualität kann der TOF-Analysator 30 ein TOF mit mehrfacher Reflexion, ein TOF mit mehrfacher Ablenkung oder ein TOF mit einfacher Reflexion sein. Ein TOF mit einfacher Reflexion ist dargestellt.
Aufgrund der vorhandenen sehr hohen Ionenströme ist es überaus wünschenswert, dass in dem lonenweg in dem TOF 30 keine Gitter vorhanden sind, um die Präsentation von Metalloberflächen, auf denen die Ionen abgeschieden werden können, in dem lonenweg von der Quelle zu dem Detektor zu vermeiden. 3b ist eine Seitenansicht des Tandem-Massenspektrometers gemäß der dritten Ausführungsform unter Verwendung des Beispiels eines TOF 30 mit einfacher Reflexion. Wie in 3b zu sehen ist, folgen die Ionen einer γ-förmigen Bahn in dem TOF 30 mit einfacher Reflexion in einem gitterlosen Spiegel 32. Weitere Einzelheiten der beispielhaften Anordnung des TOF 30, wie insbesondere in 3b dargestellt, sind in der WO 2009/081143 A2 angegeben.
Auf dem Rückweg von dem Spiegel 32 werden die Ionen von einem lonentor 40 angesteuert, wobei die Ionen von Interesse in eine Fragmentierungszelle 50 eingelassen werden und unerwünschte Ionen zu einer Ionensperre 41 abgelenkt werden. Vorzugsweise ist das lonentor 40 gitterlos und enthält eine gepulste Elektrode 42, die von Öffnungen umgeben ist, die die Penetration des Feldes von der gepulsten Elektrode 42 begrenzen. Wahlweise können diese Öffnungen zeitabhängige Spannungen aufweisen, die an sie angelegt werden, um eine Feldpenetration aus der gepulsten Elektrode 42 auszugleichen.
Nach der Auswahl auf der Grundlage ihrer Ankunftszeit treten die Ionen in eine Verlangsamungslinse 43 ein, in der ihre Energie auf den gewünschten Wert reduziert wird. Wenngleich nicht dargestellt, können die Ionen in den Ausführungsformen in 1 und 2 auch vor dem Eintritt in die Fragmentierungszelle 50 verlangsamt werden. Typischerweise kann die gewünschte Endenergie zur Fragmentierung zwischen 2,894·10⁶ J/kg und 4,824·10⁶ J/kg (30 und 50 eV/kDa) geschätzt werden, wobei Stickstoff oder Luft als ein Kollisionsgas eingesetzt wird. Die geschätzte Endenergie passt sich jedoch umgekehrt proportional zu der Gasmasse an, sodass die Endenergie 9,647·10⁶ bis 1,929·10⁷ J/kg (100 bis 200 eV/kDa) überschreiten kann, wenn Helium als ein Kollisionsgas verwendet wird. In ähnlicher Weise beträgt für eine minimale oder gar keine Fragmentierung die gewünschte Endenergie < 9,647·10⁵ J/kg (10 eV/kDa), wenn das Kollisionsgas Stickstoff oder Luft ist, und < 2,894·10⁶ bis 4,824·10⁶ J/kg (30 bis 50 eV/kDa), wenn Helium als Kollisionsgas eingesetzt wird. Um eine Verlangsamung auf solch niedrige Energien zu ermöglichen, werden die Ionen vorzugsweise erst gar nicht übermäßig beschleunigt, vorzugsweise um nicht mehr als 300 bis 500 V.
Ein typisches Beispiel einer geeigneten Verlangsamungslinse wird in P. O'Connor et al. J. Amer. Soc. Mass Spectrom., 1991, 2, 322-335, vorgestellt. Für einen Flugweg von 1 Meter in dem TOF 30 wird eine Auswahlauflösung von 500 bis 1000 erwartet, was für die meisten Anwendungen als angemessen gilt. Aufgrund der γ-Form der lonenbahn kommen die Ionen in der Ebene über dem orthogonalen Beschleuniger 23 derart an, dass ihre Anfangsenergie unabhängig von der Beschleunigungsenergie gewählt werden kann. Dies unterscheidet sich von herkömmlichen TOF mit orthogonaler Beschleunigung und ermöglicht eine Verbesserung des Arbeitszyklus und der lonenübertragung. Typischerweise arbeitet der TOF 30 bei einer Wiederholungsrate von etwa 10 kHz, sodass jeder Impuls bis zu 10⁵ bis 10⁶ Elementarladungen ausstößt.
Da die Ionenpakete typischerweise an der Fragmentierungszelle 50 als längliche Fäden ankommen, sollte dies bei der Gestaltung der Fragmentierungszelle 50 berücksichtigt werden, sodass diese solche Pakete aufnehmen kann. In derzeit bevorzugten Ausführungsformen wird dies durch Implementieren der Fragmentierungszelle 50 als längliche Kollisionszelle mit differenziellem Pumpen in ähnlicher Weise wie bei der Kollisionszelle erreicht, die in der WO 04/083,805 A2 und US 7,342,224 B2 beschrieben ist.
Nach der Fragmentierung in der Fragmentierungszelle 50 werden die Ionen durch Ausstoß in eine optionale externe Einfangvorrichtung 60 mit orthogonalem Ausstoß daraus in einen hochauflösenden Massenanalysator 70 miteinander gemischt und in gleicher Weise wie oben in Bezug auf die Anordnungen aus 1 und 2 analysiert.
4a und 4b zeigen erste und zweite Anordnungen von nicht einfangenen orthogonalen lonenbeschleunigern 23, die beide als Alternativen zu dem nicht einfangenen orthogonalen Beschleuniger 23 aus 3a und 3b verwendet werden können. Der nicht einfangene lonenbeschleuniger aus 4a ist eine DClonenführung, wohingegen der aus 4b eine RF-Ionenführung ist.
In 4a kommen Ionen aus der lonenquelle in einer Richtung „y“ an. Die Elektroden 25 und 24 (wobei die letztgenannte einen zentralen Schlitz aufweist) werden bei der gleichen DC-Spannung gehalten, bis Extraktionsspannungsimpulse angelegt werden, die dazu führen, dass Ionen in Impulsen durch den Schlitz in der Elektrode 24 in einer Richtung „z“ orthogonal zu der Eingaberichtung „y“ ausgestoßen werden.
4b zeigt eine andere alternative Anordnung, in der wieder Ionen aus der lonenquelle in einer Richtung „y“ ankommen und RF-Potentiale an den Elektroden 25, 24 gleich gehalten werden, bis Extraktionsimpulse angewendet werden. Genauer umfasst der Beschleuniger 23 in 4b neben der Rückplatten- und vorderseitigen Extraktionselektrode 25, 24 ferner obere und untere Elektroden 24' und 24", die eine RF-Phase verwenden, die derjenigen auf die Elektroden 24 und 25 entgegengesetzt ist. Die US 8,030,613 B2 beschreibt eine Technik zum Anwenden einer umschaltbaren RF auf eine Ionenfalle. Die in dieser Veröffentlichung beschriebene Technik kann jedoch gleichermaßen auf die nicht einfangene Nur-RF-Ionenführung aus 4b angewendet werden, sodass die RF gemäß dem in diesem Dokument beschriebenen Prinzip abschaltbar ist und Impulse an die Elektrode 25 und/oder 24 angelegt werden, um die Ionen durch den Schlitz in der Elektrode 24 zu extrahieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Beschleuniger 23 aus 4b insbesondere mit einem dämpfenden Gas bereitgestellt sein, um die Energieverteilung der Ionen zu verringern.
Wenngleich einige spezifische Ausführungsformen beschrieben wurden, wird der Fachmann ohne Weiteres erkennen, dass verschiedene Modifikationen oder Ergänzungen in Betracht gezogen werden können. Zum Beispiel können nicht nur Spiegel mit einfacher und mehrfacher Reflexion in der Anordnung aus 1 verwendet werden, sondern auch Multisektor- und Orbitalsysteme sowie lonenmobilitätsseparatoren. Weitere Detektoren und Analysatoren könnten zwecks zusätzlicher Funktionen installiert werden. Weitere Stufen der Massenauswahl können in den Ausführungsformen aus 3a, 3b, 4a und 4b wahlweise zwischen der lonenquelle 10 und dem orthogonalen Beschleuniger 23 aufgenommen werden.

Claims

Verfahren zur Massenspektrometrie, umfassend die folgenden Schritte: a) Erzeugen von Vorläuferionen in einer lonenquelle (10); b) Lenken der Vorläuferionen in einen loneninjektor (21, 23); c) Ausstoßen der Vorläuferionen aus dem loneninjektor (21, 23) zu einem lonenakkumulationsmittel über ein lonentor (40), sodass die Vorläuferionen an dem Ionentor (40) nur ein einziges Mal auf ihrem Weg zu dem Ionenakkumulationsmittel ankommen, wobei die Vorläuferionen als mehrere zeitlich getrennte Ionenpakete aufgrund ihrer unterschiedlichen Flugzeiten vom loneninjektor (21, 23) zum lonenakkumulationsmittel ankommen, wobei die Ionenpakete jeweils Ionen einer bestimmten von mehreren unterschiedlichen lonenspezies enthalten; d) Steuern des Ionentors (40), um so aus den mehreren Ionenpaketen, die an dem lonentor (40) ankommen, eine Untermenge von mehreren Ionenpaketen, die aus einer Untermenge von Vorläuferionenspezies von Interesse stammen, sequentiell auszuwählen; e) Wiederholen der Schritte a) bis d) über mehrere sequenzielle Zyklen, wobei das lonentor (40) so gesteuert wird, dass unterschiedliche Untermengen der mehreren Ionenpakete während unterschiedlicher Zyklen ausgewählt werden; f) Akkumulieren und Mischen der Untermengen der mehreren Ionenpakete, die während des ersten und der mehreren sequenziellen Zyklen ausgewählt wurden, in dem lonenakkumulationsmittel; und g) paralleles Analysieren der resultierenden akkumulierten lonenpopulation, die aus den gemischten Untermengen von Ionenpaketen stammt, in einem hochauflösenden Massenanalysator (70); wobei der Schritt d) das Steuern des lonentors (40) während des ersten und der mehreren sequenziellen Zyklen umfasst, um die Untermenge der mehreren Vorläuferionen in Abhängigkeit von den relativen Intensitäten der Ionenspezies im von der lonenquelle (10) generierten Spektrum von Ionen auszuwählen, sodass lonenspezies mit einer hohen relativen Intensität über weniger der mehreren Zyklen akkumuliert werden als lonenspezies mit einer niedrigen relativen Intensität.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend nach dem Auswählen der Untermenge von Ionenpaketen durch Steuern des Ionentors (40), Fragmentieren mindestens einiger der ausgewählten Vorläuferionen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Fragmentierens mindestens einiger der ausgewählten Vorläuferionen das Fragmentieren mindestens einiger der unterschiedlichen lonenspezies zu unterschiedlichen Zeitpunkten unter Verwendung jeweiliger unterschiedlicher Fragmentierungsenergien umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Fragmentierens mindestens einiger der ausgewählten Vorläuferionen das Fragmentieren der Ionen jeder der unterschiedlichen lonenspezies zu unterschiedlichen Zeitpunkten unter Verwendung jeweiliger unterschiedlicher optimierter Fragmentierungsenergien umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, wobei der Schritt des Fragmentierens der Ionen eine oder mehrere der Techniken umfasst, die ausgewählt sind aus Elektronentransfer-Dissoziation (ETD); Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation (IRMPD); ozoninduzierte Dissoziation (OzID); und UV-Dissoziation.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Schritt c) ferner das Ausstoßen der Vorläuferionen in ein Flugzeit-Massenspektrometer zum zeitlichen Trennen der Vorläuferionen in Ionenpakete vor der Ankunft an dem lonentor umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Schritt des Ausstoßens der Vorläuferionen in ein Flugzeit-Massenspektrometer ein Ausstoßen der Ionen in einen Flugzeit-(TOF)-Massenanalysator mit einfacher Reflexion, einen Flugzeit-(TOF)-Massenanalysator mit mehrfacher Reflexion, einen Flugzeit-(TOF)-Massenanalysator mit Multisektorreflexion und/oder eine orbitale Flugzeitvorrichtung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, ferner umfassend das Akkumulieren der Fragmente einer gewünschten Anzahl von Ionen für mehrere Vorläuferionenspezies von Interesse in dem lonenakkumulationsmittel und über mehrere Zyklen der Verfahrensschritte (a) bis (d) hinweg, wobei Schritt (g) ferner das parallele Analysieren der akkumulierten Fragmentionen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt des Akkumulierens über mehrere Zyklen während Schritt e) das derartige Steuern des lonentors umfasst, dass Ionenpakete ausgewählt werden, die unterschiedliche Untermengen der mehreren Vorläuferionenspezies enthalten, sodass über N Zyklen (wobei N eine ganze Zahl >1 ist) Ionen einer ersten lonenspezies m₁/z₁ zur Fragmentierung in M dieser Zyklen (wobei M eine ganze Zahl ≤ N ist) ausgewählt werden, wohingegen Ionen einer zweiten lonenspezies m₂/z₂ zur Fragmentierung in einer anderen Anzahl P von Zyklen (wobei P eine ganze Zahl ist; P ≤ N, jedoch P≠M ist) ausgewählt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei Schritt d) das Auswählen einer Untermenge von lonenpaketen umfasst, die aus einer Untermenge von zwischen 10 und 100 Vorläuferionenspezies stammen, die von dem lonenakkumulationsmittel ausgeworfen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei Schritt d) des Steuerns des lonentors (40) das Durchlassen der ausgewählten Untermenge von Ionenpaketen durch das lonentor (40) und direkt in das lonenakkumulationsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, ferner umfassend das Steuern des Ionentors (40), um so diejenigen Ionenpakete aus der Ionenfalle, die nicht weiter analysiert werden sollen, abzulenken, sodass sie nicht in das lonenakkumulationsmittel eintreten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, ferner umfassend das Ausführen einer vorläufigen Massenanalyse aller Vorläuferionen, um Vorläuferionenspezies von Interesse und ihre relativen Häufigkeiten zu identifizieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei Schritt g) des Analysierens der resultierenden lonenpopulation das Ausstoßen der Ionen in dem lonenakkumulationsmittel in eine elektrostatische Flugzeit-(TOF)-Orbitalfalle oder einen FT-ICR-Massenanalysator (70) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, ferner umfassend den Schritt des Kombinierens der Ergebnisse der Analysen der mehreren unterschiedlichen Untermengen von Ionenpaketen durch den hochauflösenden Massenanalysator, um so ein zusammengesetztes Massenspektrum zu bilden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei Schritt (b) des Lenkens der Vorläuferionen in einen loneninjektor das Einfangen der Vorläuferionen in einer Ionenfalle umfasst, wobei Schritt (c) dann das Ausstoßen der Ionen aus der Ionenfalle in das lonenakkumulationsmittel umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei Schritt (c) des Ausstoßens der Vorläuferionen aus dem loneninjektor das orthogonale Ausstoßen der Ionen umfasst.
Massenspektrometer (1), umfassend: eine lonenquelle (10) zum Erzeugen von Vorläuferionen; einen loneninjektor (21, 23), der stromabwärts der lonenquelle (10) angeordnet ist, um Vorläuferionen, die von der lonenquelle (10) aufgenommen werden, zu einem stromabwärts befindlichen lonenakkumulationsmittel auszustoßen; ein lonentor (40), das für einen einmaligen Durchlass eingerichtet ist, das in einem Weg von Vorläuferionen angeordnet ist, die aus dem loneninjektor (21, 23) zu dem stromabwärts befindlichen lonenakkumulationsmittel ausgestoßen werden, wobei die Vorläuferionen an dem lonentor (40) als mehrere zeitlich getrennte Ionenpakete ankommen, die jeweils Ionen einer bestimmten von mehreren unterschiedlichen lonenspezies enthalten; eine Ionentorsteuerung (100), die zum Steuern des lonentors (40) mit einmaligem Durchlass konfiguriert ist, um den Durchlass nur einer Untermenge von Ionenpaketen zu ermöglichen, die eine jeweilige Untermenge mehrerer Vorläuferionenspezies von Interesse enthalten; wobei die lonentorsteuerung (100) weiter dafür konfiguriert ist, das lonentor (40) mit einmaligem Durchlass während mehrerer Zyklen des Massenspektrometers (1) zu steuern, um jeweils eine unterschiedliche Untermenge von Ionenpaketen durchzulassen, das eine entsprechende unterschiedliche Untermenge der mehreren Spezies von Vorläuferionen von Interesse enthält, in Abhängigkeit von relativen Intensitäten der lonenspezies in dem Spektrum der Ionen, wie es von der lonenquelle erzeugt wird, sodass lonenspezies mit einer hohen relativen Intensität über weniger der mehreren Zyklen akkumuliert werden als lonenspezies mit einer niedrigen relativen Intensität; wobei das lonenakkumulationsmittel zum Aufnehmen von Vorläuferionen konfiguriert ist, die durch das lonentor (40) während der mehreren Zyklen des Massenspektrometers (1) hindurch gelassen werden; wobei das Massenspektrometer ferner Folgendes umfasst: einen hochauflösenden Massenanalysator (70), der zum parallelen Analysieren der akkumulierten Ionenpopulation, die aus den gemischten Untermengen von Ionenpaketen stammt, angeordnet ist.
Massenspektrometer nach Anspruch 18, wobei das lonenakkumulationsmittel eine lonenspeichervorrichtung und/oder eine Fragmentierungszelle (50) aufweist.
Massenspektrometer nach Anspruch 19, wobei das lonenakkumulationsmittel eine Fragmentierungszelle aufweist, die zum Aufnehmen der Untermenge von Ionenpaketen, die zum Durchlass durch das Ionentor mit einmaligem Durchlass ausgewählt sind, und zum Ausführen einer Fragmentierung der Untermenge angeordnet ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 18 bis 20, ferner umfassend einen Flugzeit-(TOF)-Massenanalysator mit einfacher Reflexion, einen Flugzeit-(TOF)-Massenanalysator mit mehrfacher Reflexion, einen Flugzeit-(TOF)-Massenanalysator mit Multisektorreflexion und/oder eine orbitale Flugzeitvorrichtung, die zwischen dem loneninjektor (21, 23) und dem lonentor (40) zum Trennen von Ionen nach dem Ausstoß aus dem loneninjektor (21, 23) auf ihrem Weg zu dem lonentor (40) angeordnet sind.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei der loneninjektor (21, 23) eine Ionenfalle zum Einfangen von Ionen, die von der lonenquelle (10) aufgenommen werden, und zum Ausstoßen dieser zu der stromabwärts befindlichen lonenführung ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei der loneninjektor erste und zweite parallele Platten umfasst, von denen eine eine Extraktionsplatte bildet.
Massenspektrometer nach Anspruch 23, wobei die Extraktionsplatte aus einem Gitter oder Schlitz gebildet ist oder ein solches aufweist.
Massenspektrometer nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, wobei der loneninjektor (21, 23) zum Ausstoßen von Ionen in eine Richtung eingerichtet ist, die orthogonal zu der Eingaberichtung von Vorläuferionen aus der lonenquelle(10) angeordnet ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei der loneninjektor eine nicht einfangende DC- oder Nur-RF-Ionenführung ist.