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Die
Erfindung bezieht sich auf eine Fragmentierungszelle für
Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) in einem Tandem-Massenspektrometer,
in dem Massenselektor und Massenanalysator räumlich getrennt
sind.
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Die
Erfindung besteht darin, in dem Tandem-Massenspektrometer für
die gewünschten Fragmentierungen von Biopolymerionen statt
einer bisher für ETD ausschließlich genutzten
zweidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfalle (2D-Ionenfalle) eine besondere
Ausführungsform einer dreidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfalle
(3D-Ionenfalle) zu verwenden, aus der die Fragmentionen dann entnommen und
dem Massenanalysator zugeführt werden können. Überraschenderweise
liefert die 3D-Ionenfalle zumindest im Fall der Fragmentierung durch
Elektronentransfer qualitativ wesentlich bessere Fragmentionenspektren
als die 2D-Ionenfalle; außerdem ist das Tandem-Massenspektrometer
mit der 3D-Ionenfalle für ETD-Fragmentionenspektren ebenfalls überraschend
wesentlich empfindlicher als mit einer 2D-Ionenfalle.
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Stand der Technik
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Die
Erforschung der Strukturen, Eigenschaften und Aktivitäten
von Proteinen, aber auch von anderen Biopolymeren, beruht weitgehend
auf der so genannten Tandem-Massenspektrometrie, die nicht nur Spektren
der Mixturen aus Proteinionen liefert, sondern auch einzelne Proteinionen
als „Elternionen” für eine Fragmentierung
auszuwählen, zu isolieren und dann zu fragmentieren gestattet,
so dass die entstehenden Bruchstückionen in einem Massenspektrum
gemessen werden können. Diese Fragmentionen-Massenspektren
enthalten insbesondere je nach Art der Fragmentierung Aussagen über
Primär- und Sekundärstrukturen der Proteine, die
nicht nur die genetisch vorgegebene Grundstruktur ihrer Aminosäuren
(die „Sequenz”), sondern auch weitergehende wichtige,
weil funktionsändernde Veränderungen („posttranslationale
Modifikationen”, PTM) nach Art und Lokalisierung erkennen
lassen.
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Man
kann die einzelnen Schritte der Tandem-Massenspektrometrie (Auswahl
der Elternionen und ihre Isolation, Fragmentierung, sowie die Massenanalyse
der Fragmentionen) in speichernden Massenspektrometern wie Ionenfallen
zeitlich nacheinander in derselben Speichereinheit durchführen („tandem-in-time”),
man kann aber auch die Auswahl der zu fragmentierenden Analytionen
in einem ersten Massenanalysator, dem „Massenselektor”,
die Fragmentierung in einer besonderen Zelle, und die Massenanalyse
in einem zweiten Massenanalysator durchführen („tan dem-in-space”).
Die Erfindung bezieht sich auf ein solches Tandem-Massenspektrometer
mit räumlich getrenntem Massenselektor und Massenanalysator.
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Die
Durchführung der Tandem-Massenspektrometrie in zeitlicher
Reihenfolge in speichernden Massenspektrometern ist außerordentlich
weit verbreitet und hat sich bis zu einem gewissen Grade als sehr
gut brauchbar erwiesen. Das betrifft sowohl die Tandem-Massenspektrometrie
in Ionen-Cyclotron-Resonanz-Massenspektrometern (ICR-MS), in denen
sich ultrahohe Massenauflösungen erreichen lassen, wie
auch die Verwendung von Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometern
(IT-MS) mit begrenzter Massenauflösung und Massengenauigkeit.
In beiden Arten von Tandem-Massenspektrometern gibt es jedoch Begrenzungen,
die teils die Messgeschwindigkeit, teils den Massenbereich und teils
die Massengenauigkeit betreffen und weitgehend auch von der anzuwendenden
Art der Fragmentierung bestimmt werden. Die Tandem-Massenspektrometrie
wird heute häufig mit mittelschnellen Separationsmethoden
für die Substanzen, beispielsweise Nano-Flüssigkeitschromatographie
oder Kapillarelektrophorese, gekoppelt, so dass die Substanzen nur
für wenige Sekunden im Massenspektrometer analysiert werden
können. Somit spielt die Messgeschwindigkeit heute eine
entscheidende Rolle; daneben wird aber insbesondere eine hohe Massengenauigkeit
und die Aufnahme eines möglichst vollständigen
Fragmentionenspektrums einschließlich der leichten Fragmentionen
immer wichtiger.
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Wegen
der hohen Anforderungen an die Massengenauigkeit und die Geschwindigkeit
bei der Messung der Fragmentionen hat es sich als günstig erwiesen,
die Fragmentierung in einer eigenen Zelle durchzuführen
und die entstehenden Fragmentionen dann in einem besonders geeigneten
Massenanalysator zu messen, insbesondere in einem Flugzeitmassenspektrometer
mit orthogonalem Einschuss der Ionen (OTOF-MS). Als Massenanalysatoren kommen
wegen der hohen Massenauflösung auch moderne Ausführungen
von Kingdon-Ionenfallen oder Ionen-Cyclotron-Resonanz-Massenspektrometer
in Frage, aber nur, wenn die Messgeschwindigkeit eine untergeordnete
Rolle spielt.
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Der
Erfolg der Tandem-Massenspektrometrie hängt von den verwendeten
Fragmentierungsverfahren ab, wobei es im Wesentlichen nur zwei grundsätzlich
verschiedene Fragmentierungsarten für Proteine oder ähnliche
Biopolymere gibt, die „ergodische” und die „elektroneninduzierte” Fragmentierung,
für die es aber jeweils viele verschieden günstige
Ausführungsformen gibt. Die verschiedenen Einzelverfahren
haben oft Mängel in Bezug auf den Massenbereich der Fragmentionenspektren,
Fragmentierungsgeschwindigkeit und besonders bei der Qualität und
damit der Auswertbarkeit der Fragmentionenspektren.
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Bevor
die Erfindung dargelegt werden kann, soll daher hier eine Diskussion
dieser Fragmentierungsverfahren erfolgen. Die Reaktionszellen für
die Fragmentierung haben immer Form und Funktion von Ionenfallen;
in ihr werden die selektierten Elternionen fragmentiert.
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Wie
angemerkt, stehen heute in Reaktionszellen der verschiedenen Arten
zwei grundsätzlich verschiedene Arten der Fragmentierung
zur Verfügung: die „ergodische” Fragmentierung
und die „elektroneninduzierte” Fragmentierung.
Die beiden Arten von Fragmentierungen, ergodisch und elektroneninduziert,
führen zu zwei wesentlich verschiedenen Arten von Fragmentionenspektren,
deren Informationsgehalte zueinander komplementär sind
und bei Messung beider Arten von Fragmentionenspektren zu besonders
vertieften Aussagen über die Analytionenstrukturen führen.
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Unter
einer „ergodischen” Fragmentierung von Analytionen
wird hier eine Fragmentierung verstanden, bei der ein genügend
großer Überschuss an innerer Energie in den Analytionen über
einen „metastabilen Zustand” mit einer Halbwertszerfallzeit
von einigen bis zu einigen hundert Mikrosekunden (und mehr) zu einem
Fragmentierungszerfall führt. Der Überschuss an
Energie kann beispielsweise durch eine Vielzahl von unelastischen
Stößen der Analytionen mit einem Stoßgas,
aber auch durch Absorption vieler Photonen einer Infrarot-Strahlung
erzeugt werden.
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Die
klassische Art der Fragmentierung der Analytionen in Hochfrequenz-Ionenfallen
ist die ergodische Fragmentierung durch Stöße
der irgendwie beschleunigten Analytionen mit dem in der Ionenfalle enthaltenen
Stoßgas, wobei also der Überschuss an innerer
Energie der bewegten Analytionen durch Stöße mit
den ruhenden Stoßgasmolekülen eingesammelt wird.
Damit die Stöße überhaupt Energie in
das Analytion pumpen können, müssen sie allerdings
mit einer minimalen Stoßenergie erfolgen. Da sachte Stöße
der Analytionen mit dem Stoßgas auch immer eine innere
Kühlung durch Abfuhr von Energie bewirken können,
herrscht immer eine Konkurrenz zwischen „Heizen” und „Abkühlen”,
wobei insbesondere für physikalisch schwere Ionen für
das Heizen eine größere Stoßenergie benötigt
wird als für leichte Ionen. Bei vorgegebener Dichte des
Stoßgases und gegebener kinetischer Energie der Stöße überwiegt für
physikalisch schwere Analytionen oberhalb einer Grenzmasse immer
die Kühlung; diese Analytionen lassen sich nicht mehr in
dieser Weise fragmentieren.
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In
dreidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfallen („3D-Ionenfallen”),
die aus einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden bestehen,
wird die Stoßenergie in klassischer Weise durch eine begrenzte
resonante Anregung der sekularen Ionenoszillationen der Elternionen
mit einer dipolaren Wechselspannung an den Endkappenelektroden erzeugt. Diese
führt zu vielen Stößen mit dem Stoßgas,
ohne die Ionen aus der Ionenfalle zu entfernen. Die Elternionen
können in den Stö ßen Energie aufsammeln, die
schließlich zum ergodischen Zerfall der Elternionen und
zur Entstehung der Bruchstückionen führt. Die
Bruchstückionen werden häufig auch „Tochterionen” genannt.
Bis vor wenigen Jahren war diese Stoßfragmentierung (CID
= „collision induced dissociation”) die einzig
bekannte Art der Fragmentierung in Ionenfallen.
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Diese
Stoßfragmentierung in dreidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfallen
hat aber auch Nachteile. So ist es notwendig, bei physikalisch schweren Analytionen
für die Herstellung genügend harter Stoßbedingungen
die Hochfrequenzspannung zum Speichern der Ionen sehr hoch zu wählen.
Dadurch ergibt sich eine sehr hoch liegende untere Massenschwelle
für die Ionenfalle. Ionen mit Massen unterhalb der Massenschwelle
können nicht mehr gespeichert werden; sie gehen verloren.
Es beginnt daher das Fragmentionenspektrum erst bei einer Masse, die
nach einer üblichen Faustregel etwa bei einem Drittel der
ladungsbezogenen Masse m/z des Analytions liegt; über die
leichten Fragmentionen kann das Fragmentionenspektrum keine Auskunft
mehr geben, da diese Ionen verloren gehen. Vielfach geladene physikalisch
schwere Analytionen haben wegen der hohen Anzahl an Protonen regelmäßig
eine geringe ladungsbezogene Masse m/z bei nur ungefähr 500
bis 1000 Dalton; diese lassen sich überhaupt nicht fragmentieren,
da die Hochfrequenzspannung nicht hoch genug eingestellt werden
kann, um genügend energetische Stöße
zu erzeugen.
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Es
bleibt somit für die klassische Stoßfragmentierung
der große Nachteil, dass sich für physikalisch
schwerere Analytmoleküle über etwa m = 3000 Dalton
mit dem klassischen Stoßverfahren die zugehörigen
Analytionen kaum fragmentieren lassen.
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Eine
ergodische Fragmentierung, die diesen Nachteil nicht hat, ist durch
die Schrift
WO 02/101 787
A1 (S. A. Hofstadler, and J. J. Drader) bekannt geworden.
Man wendet hier die aus der ICR-Massenspektrometrie bekannte Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation
(IRMPD) auch in Hochfrequenz-Ionenfallen an. Die Infrarot-Strahlung
wird dabei einer dreidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfalle durch
eine evakuierte, innen verspiegelte Hohlfiber durch die dafür perforierte
Ringelektrode zugeführt. Diese Art der Fragmentierung ist
vorteilhaft, da sie bei kleinen Hochfrequenzspannungen durchgeführt
werden kann; es werden dann auch die kleinen Fragmentionen gespeichert.
Die Innenoberflächen der Ionenfalle müssen dabei
aber extrem sauber gehalten werden, da sich durch die Einstrahlung
der Infrarot-Photonen oberflächlich gebundene Moleküle
von der Wand lösen, die dann mit den gespeicherten Analytionen
in vielfältiger Weise reagieren. Es gibt, vor allem aus diesem
Grunde, noch keine kommerziell vertriebenen Ionenfallen-Massenspektrometer
mit dieser Fragmentierungs-Variante.
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Jüngst
ist nun ein weiteres ergodisches Fragmentierungsverfahren in Ionenfallen
bekannt geworden, das ebenfalls nicht den Nachteil hat, schwere
Analytionen nicht fragmentieren und leichte Fragmentionen nicht
speichern zu können. Es werden hier ruhend gespeicherte
Analytionen vorzugsweise mit antipolaren, möglichst monoatomaren
Stoßionen einstellbarer kinetischer Energie beschossen. Da
die Hochfrequenzspannung hier sehr niedrig eingestellt werden kann,
kann man einerseits schwere Analytionen wegen der höheren
Energieübertragung pro Stoß mit gutem Erfolg fragmentieren
und andererseits sehr leichte Fragmentionen einfangen und messen.
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So
steht heute für die ergodische Fragmentierung mindestens
ein Verfahren zur Verfügung, das keine wesentlichen Nachteile
mehr hat.
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Nun
zu den elektroneninduzierten Fragmentierungsverfahren: Vor etwa
zehn Jahren wurde eine völlig neue Art der Fragmentierung
von Proteinionen entdeckt: eine nicht-ergodische Fragmentierung,
die durch den Einfang nieder-energetischer Elektronen induziert
wird (ECD = „electron capture dissociation”).
Durch die direkte Neutralisierung eines an einer Stelle der Aminosäurenkette
assoziierten Protons, das dann als radikales Wasserstoffatom verloren geht,
wird das Potentialgleichgewicht des Proteinions in der Nähe
des neutralisierten Protons so gestört, dass durch entsprechende
Umlagerungen ein Bruch der Kette aus Aminosäuren induziert
wird. Der Bruch betrifft dabei nicht eine peptidische Bindung, sondern weit
bevorzugt eine dazu benachbarte Bindung, die zu so genannten c-
und z-Fragmentionen führen. Im Gegensatz zur ergodischen
Fragmentierung ist diese Fragmentierung spontan, sie läuft
in weniger als 10–8 Sekunden ab.
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Diese
Art der Fragmentierung ist besonders einfach in ICR-Massenspektrometern
durchzuführen, da die nieder-energetischen Elektronen von
einer Glühkathode aus leicht entlang der Magnetkraftlinien der
gespeicherten Wolke aus Analytionen zugeführt werden können.
Die ECD-Fragmentierung ist nur mit einigen Schwierigkeiten auf Hochfrequenz-Ionenfallen
zu übertragen, da die starken Hochfrequenzfelder die Elektronen
nicht einfach nieder-energetisch an die Wolke der Analytionen heranlassen.
Es gibt trotzdem verschiedenartige Ansätze für
eine ECD-Fragmentierung in Hochfrequenz-Ionenfallen, die jedoch jeweils
einen höheren apparativen Aufwand erfordern und bis heute
keine ausreichende Empfindlichkeit zeigen.
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Es
ist nun vor wenigen Jahren ein Verfahren zur Fragmentierung von
Ionen in Hochfrequenz-Ionenfallen bekannt geworden, das zur Elektroneneinfang-Dissoziation
(ECD) gleichartige Fragmentierungen durch andersartige Reaktionen
liefert: die „Elektronentransfer-Dissoziation” (ETD).
Diese kann leicht in Ionenfallen durchgeführt werden, indem
geeignete negative Ionen zu den gespeicherten Analytionen hinzu
eingeführt werden. Verfahren dieser Art sind in den Offen legungsschriften
DE 10 2005 004 324.0 (R. Hartmer
und A. Brekenfeld) und
US
2005/0199804 A1 (D. F. Hunt et al.) beschrieben. Wie bei
ECD, gehören die Bruchstückionen dabei den so
genannten c- und z-Reihen an, und sind somit sehr verschieden von
den Bruchstückionen der Bund y-Reihen, die durch ergodische
Fragmentierungen gewonnen werden. Insbesondere bleiben aber bei
der Elektronentransfer-Dissoziation alle Seitenketten erhalten,
die bei ergodischer Fragmentierung stets verloren gehen, darunter
die wichtigen posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierungen,
Sulfatisierungen und Glycosilierungen.
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Die
Fragmentierung von Proteinionen durch Elektronentransfer (ETD) in
einer Hochfrequenz-Ionenfalle wird in sehr einfacher Weise durch
Reaktionen zwischen mehrfach geladenen positiven Proteinionen und
geeigneten negativen Ionen erzeugt. Geeignete negative Ionen sind
regelmäßig radikale Anionen, beispielsweise solche
von Fluoranthen, Fluorenon, Anthracen oder anderen polyaromatischen Verbindungen.
Bei radikalen Anionen sind die chemischen Valenzen nicht abgesättigt,
was sie zur leichten Abgabe von Elektronen befähigt, womit
sie zu einer energetisch begünstigten nichtradikalen Form gelangen.
Sie werden in NCI-Ionenquellen (NCI = „negative chemical
ionization”) erzeugt, höchstwahrscheinlich durch
einfachen Elektroneneinfang oder durch Elektronenübertragung.
NCI-Ionenquellen sind im Prinzip wie Ionenquellen für chemische
Ionisierung (CI-Ionenquellen) aufgebaut, werden aber anders betrieben,
um zu großen Mengen niederenergetischer Elektronen zu kommen.
Die NCI-Ionenquellen werden auch als Elektronenanlagerungs-Ionenquellen
bezeichnet.
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Ergodische
Fragmentierungen spalten zunächst alle nur leicht gebundenen
posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierungen, Sulfatisierungen
und Glycosilierungen ab und zeigen im Wesentlichen die nackten Sequenzen
der unmodifizierten Aminosäuren der Analytionen an. Posttranslationale
Modifikationen können daher nicht erkannt werden, weder
ihre Existenz, noch ihre Art und Position. Im Gegensatz zur ergodischen
Fragmentierung werden diese Modifikationsgruppen durch die elektroneninduzierte
Fragmentierung nicht abgespalten. Im Vergleich zu den ergodisch
gewonnenen Fragmentionenspektren wird daher durch eine zusätzliche
Masse an einer Aminosäure sowohl die Art wie auch die Stellung
der Modifikation bekannt. Diese außerordentlich wichtigen
Untersuchungsergebnisse können in dieser günstigen
und einfachen Weise nur durch den Vergleich beider Arten von Fragmentionenspektren
gewonnen werden.
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Es
ist daher besonders für eine Untersuchung von posttranslationalen
Modifikationen (PTM) heute notwendig, sowohl ergodisch gewonnene Fragmentionenspektren
wie auch elektroneninduziert gewonnene Fragmentionenspektren nebeneinander
aufzunehmen. Beide Arten von Frag mentionenspektren sollten dabei
höchsten Qualitätsansprüchen genügen,
Ein heutiges Tandem-Massenspektrometer für Bioanalytik
muss also beide Fragmentierungsarten in möglichst mängelfreien
Verfahren anbieten. Aber auch für andere Untersuchungen,
beispielsweise für de-novo-Sequenzierungen, ist ein Vergleich
von ergodisch und elektroneninduziert gewonnenen Fragmentionenspektren
guter Qualität vorteilhaft oder sogar zwingend notwendig.
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Als
separate ETD-Fragmentierungszellen in Tandem-Massenspektrometern
mit hochauflösenden Massenanalysatoren wurden bisher ausschließlich 2D-Ionenfallen
genutzt. Es können ETD-Fragmentierungen zwar auch in 3D-Ionenfallen
ausgeführt werden, die kommerziellen Ausführungsformen
der so benutzten 3D-Ionenfallen beschränken sich allerdings
auf solche Massenspektrometer, die diese 3D-Ionenfalle gleichzeitig
und ausschließlich auch als Massenanalysator für
die Messung der Fragmentionenspektren verwenden. In ihnen ist eine Überführung
der Fragmentionen in einen anderen Massenanalysator nicht vorgesehen
und nicht möglich.
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Die
ETD-Fragmentionenspektren aus 2D-Ionenfallen zeigen allerdings keine
sehr hohe Qualität; sie sind mit hohen Anteilen an unverbrauchten
Analytionen und an Fragmentionen der zweiten und dritten Generation
(mit vielen so genannten „inneren Fragmentionen”,
die nicht endständig sind) angereichert und auch nicht
sehr empfindlich.
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Es
sind gelegentlich 3D-Ionenfallen mit Massenanalysatoren höherer
Massenauflösung gekoppelt worden, sie wurden dabei aber
nie für eine ETD-Fragmentierung genutzt. Eine solche Nutzung einer
3D-Ionenfalle für eine (allerdings nur ergodische) Fragmentierung
bezieht sich auf ein kommerziell vertriebenes Tandem-Massenspektrometer
der Firma Shimadzu, in der die 3D-Ionenfalle verwendet wird, um
die Ionen aus ihrem Inneren axial durch einen Hochspannungspuls
in ein Flugzeitmassenspektrometer zu schießen. Es kann
in dieser 3D-Ionenfalle ergodisch fragmentiert werden; eine Version
mit elektroneninduzierter Fragmentierung ist weder bekannt noch
erhältlich. Für jedes Flugzeitmassenspektrum braucht
dieses Massenspektrometer eine gesonderte Füllung der 3D-Ionenfalle.
Da in jedem einzelnen Flugzeitmassenspektrum der dynamische Messbereich
wegen der geringen Wandlungsbreite der heute erhältlichen
Transientenrekorder beschränkt ist, und die 3D-Ionenfalle
daher nur mit beschränkter Anzahl von Analytionen betrieben
werden kann, ist dieses Massenspektrometer relativ langsam und unempfindlich.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, für Tandem-Massenspektrometer
mit getrenntem Massenselektor und Massenanalysator eine Fragmentierungszelle
bereitzustellen, die insbesondere für ETD- Fragmentionen
qualitativ besser auswertbare und empfindlicher aufzunehmende Fragmentionenspektren
liefert als mit den bisher verwendeten Fragmentierungszellen.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung besteht darin, in einem Tandem-Massenspektrometer, in
dem Massenselektor und Massenanalysator räumlich getrennt
sind, für ETD-Fragmentierungen statt der bisher ausschließlich
als Fragmentierungszellen genutzten 2D-Hochfrequenz-Ionenfalle eine
besonders gestaltete und ausgestattete 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle
zu verwenden, und die erzeugten Fragmentionen aus der 3D-Ionenfalle
dem Massenanalysator zuzuführen. Überraschenderweise
lassen sich zumindest für diese Fragmentierung durch Elektronentransfer-Dissoziation
(ETD) wesentlich bessere Fragmentionenspektren in Bezug auf ihre
Auswertequalität gewinnen, wie eigene Untersuchungen an
3D-Ionenfallen-Massenspektrometern einerseits und 2D-Ionenfallen
als Fragmentierungszellen andererseits ergeben haben. Für
ergodische Fragmentierungsverfahren ergeben sich keine Nachteile.
Es hat sich des Weiteren ergeben, dass die ETD-Fragmentionenspektren
aus 3D-Ionenfallen denen aus bisher verwendeten 2D-Ionenfallen auch
in Bezug auf die erreichbare Empfindlichkeit des Tandem-Massenspektrometers
weit überlegen sind. Hypothesen für die Gründe
der höheren Qualität und wesentlich besseren Empfindlichkeit
werden unten dargelegt.
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Die
3D-Hochfrequenz-Ionenfalle wird dabei nicht selbst als Massenanalysator
genutzt. Dadurch kann die Füllmenge auf 20000 bis 100000
Analytionen erhöht werden, die sonst durch Anforderungen der
Massenmessung auf etwa 10000 bis 20000 Analytionen beschränkt
ist. Somit können nach der Überführung
der Fragmentionen zum Massenanalysator dort mit einer einzigen Füllung
der 3D-Ionenfalle Fragmentionenspektren mit gutem dynamischen Messbereich
erzielt werden.
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Die
3D-Ionenfalle muss an die Anforderung, die jetzt vergrößerte
Wolke der Fragmentionen aus ihr möglichst ohne Verluste
entnehmen zu können, sowohl in ihrer Form wie auch in ihrer
elektronischen Ausstattung in besonderer Weise angepasst werden. Es
ist jedoch zweckmäßig, die 3D-Ionenfalle nach wie
vor sehr präzise zu formen und weitgehend massenanalytisch
genutzten 3D-Ionenfallen nachzubauen, um in ihr beispielsweise als
Massenselektor die Isolation der Analytionen durchführen
und dabei die heute elektronisch und softwaremäßig
sehr hoch entwickelten Verfahren der Ansteuerung beibehalten zu können.
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Beschreibung der Abbildungen
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Die 1 und 2 zeigen
in zwei hypothetischen Zeitdiagrammen, wie nach gegenwärtigen Vorstellungen
die zeitlich fortschreitende Bildung von Fragmentionen verschiedener
Genera tionen aus den gespeicherten Analytionen durch Elektronenübertragungs-Dissoziation
in einer 3D-Ionenfalle (1) und einer 2D-Ionenfalle (2)
voranschreitet.
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In 1 nimmt
die Menge der Analytionen (30) in einer 3D-Ionenfalle als
Fragmentierungszelle während der Zufuhr von Radikalanionen
für die Elektronenübertragungs-Dissoziation sehr
schnell unter Bildung der erwünschten Fragmentionen der
ersten Generation (31) ab, weil die eingeführten
Radikalanionen mit etwa gleicher Wahrscheinlichkeit jedes gespeicherte
Analytion erreichen und mit ihm reagieren können. Die Bildung
von unerwünschten Fragmentionen der zweiten Generation
(32) oder dritten Generation (33) schreitet nur
sehr langsam voran. Es existiert ein Zeitpunkt (35), zu
dem eine optimale Menge an Fragmentionen der ersten Generation in
der 3D-Ionenfalle vorhanden ist, bei geringer Restmenge an unzerfallenen
Analytionen und nur kleiner Menge an unerwünschten Fragmentionen
der zweiten Generation. Zu diesem Zeitpunkt (35) sollte
die weitere Zufuhr von negativen Radikalanionen und damit weitere
Fragmentierung unterbunden werden; die Mischung an Ionen ergibt
hier ein sehr gut auswertbares Fragmentionenspektrum.
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2 zeigt
hingegen, wie in einer 2D-Ionenfalle der Abbau der Analytionen (40)
langsamer, dagegen die unerwünschte Bildung von Fragmentionen
der zweiten (42) und dritten Generation (43) schneller
voranschreitet, weil sich Wolkenteile der Analytionen und Radikalanionen
nur in allmählich voranschreitender Durchdringung von Teilgebieten mischen
und bei weiterer Mischung die Fragmentionen durch frische Radikalanionen
unter Bildung von Fragmentionen zweiter und höherer Generation
weiter deprotoniert werden. Es existiert kein wirklich günstiger
Zeitpunkt für die Gewinnung qualitativ guter Fragmentionenspektren
ohne größere Anteile an unverbrauchten Analytionen
und an Fragmentionen der zweiten oder dritten Generation.
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3 zeigt
eine Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers nach
dieser Erfindung, wobei in einer 3D-Ionenfalle mit Ringelektrode (12)
und zwei Endkappenelektroden (11, 13) sowohl die
Selektion der Elternionen für die Fragmentierung wie auch
die Fragmentierung selbst vonstatten gehen kann. Die Fragmentionen
werden der 3D-Ionenfalle entnommen, und über das Ionenleitsystem
(14) einem Flugzeitmassenspektrometer (24) mit
orthogonalem Einschuss (OTOF) zur massengenauen Messung zugeführt.
Die Analytionen werden hier in einer Elektrosprüh-Ionenquelle
(1, 2) außerhalb des Vakuumsystems des
Tandem-Massenspektrometers erzeugt, die Radikalanionen in einer
NCI-Ionenquelle (8) innerhalb des Vakuumsystems.
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4 zeigt
eine 3D-Ionenfalle mit Einschussblenden (10), erster Endkappenelektrode (11),
Ringelektrode (12) und Ausschuss-Endkappenelektrode (13).
Ein zwiebelschalenartig auf gebaute Ionenwolke (60, übertrieben
groß gezeichnet) befindet sich in einem gerade eingeschalteten
Gleichspannungsfeld mit Äquipotential-Flächen
(61), die die Ionen in Richtung auf das Feld (62)
von Austrittsöffnungen treiben wird. Das Feld der Austrittsöffnungen
ist ebenfalls übertrieben groß gezeichnet. Die austretenden
Ionen werden vom weiteren Ionenspeicher, hier ein Oktopol-Stabsystem,
aufgenommen und können von hier aus dem Massenanalysator
zugeführt werden.
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5 stellt
die Endkappenelektrode (13) mit einer großen Austrittsöffnung
dar, die mit Drähten (64) überspannt
ist. Die Drähte bilden ein grobes Drahtnetz, dass hier
mehr ausgebeult ist, als es der Kontur (65) der hyperbolischen
Endkappenelektrode entspricht.
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Abbildung
zeigt eine Endkappenelektrode (13) mit einem Lochkranz
aus Austrittsöffnungen verschiedener Größe,
die nur wenig Material zwischen sich stehen haben.
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Beste Ausführungsformen
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Bisher
kann mangels intensiver Untersuchungen nur hypothetisch vermutet
werden, warum die ETD-Fragmentierung von Elternionen in 3D-Ionenfallen
so viel besser auswertbare und weitaus empfindlichere Fragmentionenspektren
liefert. Die Hypothese beruht auf folgender Modellvorstellung:
2D-Hochfrequenz-Ionenfallen
(auch „lineare Ionenfallen” genannt) als Fragmentierungszellen
für Elternionen sind ganz überwiegend als Quadrupol-
oder Hexapol-Stabsysteme aufgebaut. In 2D-Ionenfallen werden die
frisch eingeführten oder in der Zelle isolierten Elternionen
nach der Dämpfung ihrer Schwingungen durch das Stoßgas
in Form einer fadenartigen Wolke kleinen Durchmessers in der Längsachse des
Stabsystems gespeichert. Es werden für Fragmentierungen
durch Elektronentransfer mindestens zweifach, möglichst
drei- vier- oder fünffach oder noch höher geladene
Elternionen ausgesucht; in Grenzfällen werden 10- oder
sogar 15fach geladene Elternionen fragmentiert. An den Enden der
Stabsysteme werden die Elternionen durch entgegenstehende Gleichspannungsfelder
im Stabsystem gehalten. In dieses Stabsystem werden dann nach Bildung
der länglichen Elternionenwolke die negativen Radikalanionen
mit niedriger kinetischer Energie axial eingeführt. Sie
treffen dabei zunächst auf die Elternionen im zugewandten
Wolkenkopf und reagieren hier unter Fragmentierung der Elternionen
zu Tochterionen („Fragmentionen der ersten Generation”)
und unter Verbrauch der Radikalanionen. Erst die Zufuhr von weiteren
Radikalanionen kann die Elternionen in der Wolke hinter dem Wolkenkopf
erreichen und mit ihnen unter Fragmentierung reagieren.
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Aber
diese neu eingeführten Radikalanionen können auch
mit den bereits entstandenen Fragmentionen des Wolkenkopfes unter
deren weiterer Fragmentierung zu einer zweiten und sogar dritten
Generation von Fragmentionen („Enkelionen” und „Urenkelionen”)
bis hin zu deren Vernichtung durch vollständige Deprotonierung
durch die leicht von den Radikalanionen abzugebenden Elektronen
reagieren. Diese weitergehende Fragmentierung führt häufig
zu „inneren Fragmentionen”, die nicht endständig
und damit schwerer zu interpretieren sind, und schlussendlich zur
vollständigen Vernichtung eines Teils der bereits gebildeten
Fragmentionen. Diese weitergehende Fragmentierung hat zwar kleinere
Wirkungsquerschnitte und führt daher nicht zur vollständigen
Vernichtung aller gerade gebildeten Fragmentionen der ersten Generation
(der „Tochterionen”), hat aber zur Folge, dass
(a) nur ein kleiner Teil der Analytionen der fadenartig langen Wolke
bleibend zu nutzbaren Fragmentionen der ersten Generation umgewandelt
wird und dass (b) das Fragmentionenspektrum eine Menge unerwünschter
Fragmentionen der zweiten oder dritten Generation enthält,
was es qualitativ sehr viel schwieriger auswertbar macht. 2 gibt
eine prinzipielle Vorstellung davon, wie vermutlich die Bildung
der verschiedenen erwünschten (41) und unerwünschten
Fragmentionen (42, 43) unter Verbrauch der Elternionen
(40) voranschreitet. Zu keinem Zeitpunkt existiert eine
Mischung aus Ionen, die ein gut auswertbares Fragmentionenspektrum
ergeben.
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Es
gibt auch die Form geteilter Stabsysteme, deren Achsenpotentiale
in Abschnitten stufenförmig verschieden hoch eingestellt
werden können, und in denen die Elternionen allein in einem
der Abschnitte gespeichert werden können. In einem solchen
geteilten Stabsystem können dann eingeführte negative Radikalanionen
in einem anderen Abschnitt gesammelt werden. Durch Beseitigung der
Stufen im Achsenpotential können jetzt die beiden länglichen
Wolken der Elternionen und der Radikalanionen einander zugeführt
werden. Hier tritt nun der gleiche Effekt auf: Zuerst mischen sich
die beiden Wolkenköpfe unter Reaktionen und Fragmentierung.
Dann werden die gebildeten Fragmentionen weiterer Zufuhr von Radikalanionen
ausgesetzt und können in zweiter Generation fragmentieren
und schließlich sogar vollständig vernichtet werden.
Nur ein kleiner bis sehr kleiner Teil der Elternionen bleibt zu
Fragmentionen der ersten Generation gewandelt. Das Verfahren nutzt
daher nur einen kleinen Teil der Elternionen und ist sehr unempfindlich;
durch den hohen Anteil an Fragmentionen der zweiten und höherer
Generationen ist das Fragmentionenspektrum nicht gut auswertbar.
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In
3D-Hochfrequenz-Ionenfallen dagegen sammeln sich die Elternionen
in einer kleinen kugelförmigen Wolke im Zentrum der Ionenfalle.
Nachfolgend eingeführte Radikalanionen führen während
ihres Einfangs in der Ionenfalle gedämpfte Schwingungen
in mehr oder weniger allen Richtungen durch den Innenraum der Ionenfalle
aus, die sie immer wieder durch die Wolke der Elternionen führt.
Dabei können sie mit etwa gleicher Wahrscheinlichkeit mit
jedem der Elterionen reagieren. In 1 wird dargestellt, wie
die Bildung von Fragmentionen der erwünschten ersten Generation
(41) auf Kosten der Elternionen (30) schnell voranschreitet,
bevor es zur Bildung von unerwünschten Fragmentionen der
zweiten (32) und dritten Generation (33) kommt.
Wird dieser Prozess zu einer günstigen Zeit (35)
abgebrochen, so findet man schlussendlich in der Ionenfalle neben
nicht allzu vielen unfragmentierten Elternionen (30) eine
große Anzahl von Fragmentionen der ersten Generation (31),
und eine nur verschwindende Anzahl von Fragmentionen der zweiten
Generation (32). Das Fragmentionenspektrum hat eine ausgezeichnete
Qualität.
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Vergleicht
man die Empfindlichkeiten, die auf der prozentualen Ausnutzung der
angebotenen Elternionen basiert, so bietet die 3D-Ionenfalle eine
etwa um einen Faktor zehn höhere Empfindlichkeit für
das Massenspektrometer, bei sonst etwa gleichem Betrieb.
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Eine
günstige Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers
nach dieser Erfindung ist in 3 schematisch
wiedergegeben. Die Ausführungsform wird hier anhand der
Durchführung eines Analysenverfahrens zur Erzeugung eines
Fragmentionenspektrums erläutert. Es werde angenommen, dass
eine Mischung von Verdaupeptiden eines größeren
Proteins untersucht und dass ein Fragmentionenspektrum eines der
Verdaupeptide gemessen werden soll.
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Das
Tandem-Massenspektrometer enthält eine Elektrosprüh-Ionenquelle
(1) mit einer Sprühkapillare (2) außerhalb
des Massenspektrometers zur Ionisierung von Biomolekülen.
Dabei entstehen praktisch keine Fragmentionen; die Analytionen bestehen fast
nur aus einfach und überwiegend mehrfach protonierten Molekülen
(häufig „Pseudomolekülionen” genannt,
weil sie durch die zusätzlichen Protonen schwerer sind
als die originären Moleküle). Das erzeugte Gemisch
von Analytionen wird in üblicher Weise durch eine Einlasskapillare
(3) und einen Abstreifer (4) mit den Ionenleitsystemen
(5) und (9) durch die Druckstufen (15),
(16), (17) zur 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden
(11 und 13) und Ringelektrode (12) geführt
und dort in üblicher Weise eingefangen. Die Ionenleitsysteme
(5) und (9) bestehen aus parallelen Stabpaaren,
an denen alternierend die Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen.
Sie können als Quadrupolstabsystem, als Hexapol- oder als
Oktopol-Stabsystem ausgeführt sein.
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Der
Einfang der Ionen gilt immer noch als Schwachpunkt für
3D-Ionenfallen, weil nach Ergebnissen von (unvollständigen)
Simulationen nur etwa fünf bis maximal etwa zehn Prozent
der an gelieferten Ionen eingefangen werden. Da jedoch die 3D-Ionenfallen-Massenspektrometer
zu den empfindlichsten Massenspektrometern auf dem Markt gehören,
sind hier Zweifel erlaubt. Es scheint so, dass die Ausnutzung der
angebotenen Ionen durch den Einfangprozess einer 3D-Ionenfalle wesentlich
besser als ihr theoretisch abgeleiteter Ruf.
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Die
3D-Ionenfalle dient im Tandem-Massenspektrometer der 3 sowohl
zur Selektion der Elternionen aus dem Gemisch der Analytionen durch den
Prozess der so genannten „Isolation”, wie auch zur
Fragmentierung mit den verschiedenen Fragmentierungsverfahren. Im
Vordergrund der Beaschreibung soll hier die Fragmentierung durch Transfer
der Elektronen von Radikalanionen stehen. Die 3D-Ionenfalle dient
hier aber nicht zur Massenanalyse der Analyt- oder Fragmentionen,
die stattdessen aus der 3D-Ionenfalle in besonderer Weise entnommen
und einem eigenen Massenanalysator zugeführt werden.
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Als
Massenanalysator dient in dieser Ausführungsform ein Flugzeitmassenspektrometer
(24) mit orthogonalem Ioneneinschuss. Die aus der 3D-Ionenfalle
entnommenen Ionen werden durch den Kanal (20) längs
der Bahn (21) in den Pulser (22) niederenergetisch
eingeschossenen. Der fadenförmige Ionenstrahl wird im Pulser
(22) senkrecht zur bisherigen Flugbahn sehr schnell beschleunigt
und die Ionen fliegen nun als fadenförmige Abschnitte des
ursprünglichen Ionenstrahls mit massenspezifischer Geschwindigkeit
längs der Flugbahn (23) in den Reflektor (25),
in dem sie reflektiert und hoch nach Massen aufgelöst auf
den Ionendetektor (26) geschossen werden. Ein solches Flugzeitmassenspektrometer
bietet heute in besonderen kommerziellen Ausführungsformen
sowohl eine gute Massenauflösung von R = m/Δm
zwischen 20000 und 60000, eine sehr gute Massengenauigkeit von etwa
einem Millionstel der Masse (1 ppm) und einen sehr großen Spektrenbereich
für die ladungsbezogenen Massen m/z zwischen etwa 50 Dalton
und 5000 Dalton. Die Pulser-Rate beträgt etwa 10 Kilohertz,
damit können pro Sekunde 10000 Massenspektren aufgenommen und
addiert werden; in kürzerer Zeit entsprechend weniger.
Damit lässt sich dieses Massenspektrometer auf viele Forderungen
wie schnelle Messungen einerseits oder Messungen mit hohem dynamischen Messbereich
andererseits einstellen.
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Ein
erstes Massenspektrum der unfragmentierten Analytionen gibt eine Übersicht über
die Verdaupeptide. Sollen jetzt ein oder mehrere Peptide auf ihre
Sequenz aus Aminosäuren hin untersucht werden, so isoliert
man nach erneuter Füllung der 3D-Ionenfalle mit üblichen
Mitteln die dreifach, vierfach oder fünffach geladenen
Ionen dieses Peptids; das heißt, man überfüllt
zunächst die Ionenfalle und wirft dann alle Ionen aus der
Ionenfalle aus, die nicht den ausgewählten Elternionen
dieses Peptids entsprechen. Diese Isolation der ausgewählten
Elternionen wird durchgeführt, indem alle unerwünschten
Ionen durch Resonanz- oder andere Prozesse massenselektiv aus der
3D-Ionenfalle ausgeworfen werden. Diese Prozesse sind von 3D-Ionenfallen-Massenspektrometern
gut bekannt. Die Anzahl der Ladungen erkennt man am Abstand der
Isotopenlinien voneinander, die beispielsweise für dreifach
geladene Ionen genau 1/3 atomare Masseneinheit beträgt.
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Die
mehrfach geladenen Elternionen für die Fragmentierung,
die durch die Isolationsprozesse zu leichten Schwingungen angeregt
wurden, werden durch eine kurze Wartezeit von einigen Millisekunden durch
das Stoßgas wieder in das Zentrum der Falle hinein abgebremst.
Als Stoßgas wird in 3D-Ionenfallen meist Helium mit einem
Druck von etwa 10–2 Pascal verwendet;
der Druck kann in Sonderfällen auch bis zu zwei Größenordnungen
höher gewählt werden. Die mehrfach geladenen Elternionen
bilden dort eine kleine kugelförmige Wolke, deren Durchmesser von
der Anzahl der gespeicherten Ionen, aber auch von der Höhe
der Hochfrequenzspannung abhängt. Sie kann bei niedriger
Hochfrequenzspannung und hoher Anzahl von 20000 bis 50000 selektierten
Elternionen durchaus etwa zwei bis drei Millimeter betragen.
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Sodann
werden die negativ geladenen Radikalanionen hinzugefügt.
Diese Ionen werden hier in einer gesonderten Ionenquelle (8)
für negative chemische Ionisierung erzeugt und über
ein kleines Ionenleitsystem (7) zu einer Ionenweiche geführt,
wo sie in das Ionenleitsystem (9) zur Ionenfalle (11, 12, 13)
eingefädelt werden. Die Ionenweiche besteht in der hier
gezeigten Ausführung einfach aus einer Lochblende (6),
und aus einer Verkürzung zweier Stäbe des stabförmigen
Ionenleitsystems (9). Besonders günstig für
diese sehr einfache Art einer Ionenweiche ist es, wenn das Ionenleitsystem
als Oktopolstabsystem ausgeführt ist. Diese Ionenweiche
kann die Analytionen der Elektrosprüh-Ionenquelle (1, 2) bei
geeigneten Spannungen an den Halbblenden ungehindert durchlassen,
mit anderen Spannungen werden die negativen Radikalanionen aus der
Ionenquelle (8) in das Ionenleitsystem (9) hinein
reflektiert. Über dieses Ionenleitsystem (9) gelangen
sie zur 3D-Ionenfalle und werden dort in üblicher Weise durch
eine Einschussoptik (10) eingespeichert. Sie reagieren
dabei sofort (innerhalb weniger Millisekunden) mit den positiven
Elternionen unter meist spontanem Zerfall. Wie oben beschrieben,
werden dabei alle Elternionen mit etwa gleicher Wahrscheinlichkeit beteiligt.
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Da
sich statt des Transfers eines Elektrons durch Verbleib des neutralisierten
Protons auch einige stabile Radikal-Kationen bilden können,
die nicht sofort zerfallen, kann zur Unterstützung des
Zerfalls eine schwache dipolare Anregungswechselspannung für
eine resonante Anregung dieser sich bildenden Radikal-Kationen an
die beiden Endkappen (11, 13) der Ionenfalle gelegt
werden. Die Frequenz für diese Anregungswechselspannung
kann aus der bekannten Masse dieser Radikal-Kationen und ihrer bekannten
Ladung berechnet werden. Diese Anregungsspannung bewirkt, dass die
Ausbeute der gewünschten Fragmentionensorte erhöht
wird.
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Für
die Bestimmung der Zeiten für eine optimale Befüllung
der Ionenfalle gibt es verschiedene bekannte Verfahren, auf die
hier nicht näher eingegangen werden soll. Die Füllzeiten
bewirken eine Füllung mit einer optimalen Anzahl von Elternionen
nach der Isolierung. Dabei wird im Wesentlichen die Zahl der Ladungen
innerhalb der Ionenfalle gesteuert; für ein optimales Verhalten
bei der Spektrennahme spielen auch noch andere Parameter eine Rolle,
doch soll hier auf Einzelheiten nicht eingegangen werden. Für die
Befüllung mit negativen Ionen ist dagegen nur ein einziges
Mal eine optimale Befüllungszeit zu ermitteln, da immer
etwa die gleiche Menge an negativen Ionen gebraucht wird, um mit
der feststehenden Anzahl von positiven Elternionen optimal zu reagieren.
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Die
Form der 3D-Ionenfalle und ihre elektronische Versorgung muss an
die Aufgabe angepasst werden, die Fragmentionen aus der 3D-Ionenfalle möglichst
ohne Verluste entnehmen zu können, um sie dann dem Massenanalysator
zuzuführen. Wenn die 3D-Ionenfalle auch die Aufgaben des
Selektion und Isolation der Elternionen übernehmen soll,
ist es günstig, die Funktionen solcher 3D-Ionenfallen,
die auch als Massenanalysatoren dienen, möglichst beizubehalten.
Diese 3D-Ionenfallen sind außerordentlich präzise
gefertigt, mit hyperbolisch geformten Innenflächen der
Ring- und der Endkappenelektroden. Leichte willkürliche
Abweichungen von der theoretisch richtigen Form führen
zudem zu so genannten nichtlinearen Resonanzen, die elektrisch vorgegebene
Resonanzanregungen der Ionen verschärfen und schneller
wirksam machen können. Moderne 3D-Ionenfallen arbeiten
mit diesen nichtlinearen Resonanzen, sowohl beim massenselektiven
Auswurf der Ionen zur Massenmessung wie auch für das Verfahren der
Isolation. Es ist daher weitergehend günstig, auch diese
leichten und gezielten Formabweichungen zu übernehmen.
Die 3D-Ionenfallen dieses Typs werden häufig einfach „nichtlineare
Ionenfallen” genannt, weil in ihnen das elektrische Hochfrequenzfeld (und
damit auch das Pseudopotential) vom Zentrum der Ionenfalle in nichtlinearer
Weise zu den Elektroden hin ansteigt.
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Interessanterweise
haben alle kommerziell hergestellten 3D-Ionenfallen innerhalb der
Ionenfallen-Massenspektrometer einen Abstand von 14 Millimetern
zwischen den beiden Scheiteln der Endkappenelektroden. Diese Größe
ist als vielfältiger Kompromiss zwischen mechanischen und
elektrischen Parameter, insbesondere für den Arbeitsbereich
der Hochfrequenzspannungen, ent standen und sollte daher möglichst
auch beibehalten werden. Dieser Abstand geht schon auf Wolfgang
Paul zurück, dem Erfinder der Ionenfallen (Nobelpreis dafür
1989).
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Wie
oben bereits angemerkt, vergrößert sich für
den Betrieb als Fragmentierungszelle der Durchmesser der kugelförmigen
Wolke aus Elternionen, einerseits, weil mehr Elternionen eingefüllt
werden können und dürfen, andererseits, weil für
die bleibende Speicherung der interessanten leichten Fragmentionen
die Hochfrequenzspannung an der Ringelektrode sehr niedrig gehalten
wird, um die Massenschwelle, unterhalb der keine Ionen mehr gespeichert
werden können, niedrig zu halten. Dadurch verflacht sich
der Pseudopotentialtopf massenabhängig für alle
Ionen und die Wolke wird größer. Die Wolke der
Fragmentionen hat dann etwa die gleiche Größe wie
die der Elternionen. Soll diese große Wolke der Fragmentionen
aus der 3D-Ionenfalle ausgeworfen werden, so muss die entsprechende Öffnung
in einer der Endkappen vergrößert werden. Diese Öffnung
ist bei kommerziellen 3D-Ionenfallen-Massenspektrometern etwa 0,7
bis maximal 1,5 Millimeter groß. Da die Wolke aber bis
zu drei Millimeter groß sein kann, muss auch diese Öffnung
auf etwa drei Millimeter (oder mehr), mindestens jedoch auf 2,5
Millimeter vergrößert werden.
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Eine
solche Vergrößerung der Austrittsöffnung
verändert das Hochfrequenzfeld im Inneren sehr stark und
muss, besonders für den Typ der nichtlinearen Ionenfallen,
durch besondere Maßnahmen ausgeglichen werden. Der Ausgleich
kann prinzipiell durch eine Formänderung der Elektroden,
besonders in der Umgebung der Austrittsöffnung, bewirkt
werden, ist aber schwierig und mit großem Entwicklungsaufwand
verbunden. Es ist einfacher, die elektrische Wirkung der Form der
Endkappenelektroden in etwa dadurch beizubehalten, dass die Öffnung beispielsweise
durch ein mittelgrobmaschiges Netz aus sehr dünnen Drähten
verschlossen wird, wobei das Netz kappenförmig die gewünschte
Oberfläche nachzeichnen soll. 5 zeigt
eine solche Überspannung einer großen Öffnung
mit einem groben Netz aus feinen Drähten.
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Für
das präzise Befestigen und Ziehen der dünnen Drähte
gibt es eine Reihe von bekannten Verfahren. Beispielsweise kann
das „Bonden” von dünnen Golddrähten
von 25 bis 50 Mikrometer Durchmesser, das in der Technik der integrierten Schaltungen
in mehreren Ausführungsformen verwendet wird, auch hier
angewendet werden. Dabei kann die zu überspannende Öffnung
zunächst mit einem Formstück verschlossen werden,
das genau die Kappenform des Netzes unterlegt. Es sind aber auch andere
Befestigungs- und Spannmethoden für dünne Drähtchen
bekannt, darunter solche, die von Kaltverschweißungen Gebrauch
machen.
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Es
ist günstig, das Netz wie in 5 recht grob
zu lassen, damit die Drähtchen einen nur sehr kleinen Teil
der Oberfläche abdecken. So können mit nur je
zwei über Kreuz gespannten Drähtchen neun Öffnungsfelder
mit je etwa einem Millimeter Maschenweite erzeugt werden. Mit je
vier gespannten Drähten in beiden Richtungen lässt
sich eine Maschenweite von einem halben Millimeter erreichen, was
eine bessere Nachformung der elektrischen Hochfrequenzfelder im
Inneren der 3D-Ionenfalle, aber auch leicht höhere Verluste
an Ionen ergibt.
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Es
kann aber die größere Öffnung auch durch
ein fein gebohrtes Lochkranzmuster erzeugt werden, wie das in 4 und 6 angedeutet
ist. So kann man beispielsweise ein zentrales Loch von einem halben
bis einem Millimeter Durchmesser mit ein bis zwei Kränzen
von Austrittsöffnungen umgeben, wie in 6 zu
sehen, wobei die Durchmesser der Austrittsöffnungen so
gewählt werden, dass möglichst wenig Material
zwischen den Löchern stehen bleibt.
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Sowohl
die überspannten Drähte über der großen Öffnung
wie auch das Material um ein Lochkranzfeld können eine
Kontur der Oberfläche nachzeichnen, die stärker
gekrümmt und ausgebeult ist, als es den rotationshyperbolischen
Formen der Endkappenelektroden entspricht. Dadurch lässt
sich der Einfluss der Löcher auf das Hochfrequenzfeld im
Inneren zum Teil ausgleichen.
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Besonders
wichtig ist die elektronische Ausstattung der 3D-Ionenfalle. Es
ist günstig, die Fragmentionen unter Beibehaltung eines
schwachen Pseudopotentialtopfes auszutreiben, um die Wolke der Ionen
bis zuletzt möglich gut beieinander zu halten. Ist die
Hochfrequenzspannung so eingestellt, dass die Massenschwelle für
die leichtesten Ionen bei etwa 60 Dalton liegt, so herrscht zwischen
dem Zentrum der Ionenfalle und der Austrittsöffnung in
der Endkappenelektrode ein Hochfrequenzfeld mit Spitzenspannungen
von etwa 300 Volt.
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Die
Tiefe und die Wandsteilheit des Pseudopotentialtopfs, die (fiktiv)
von einem Ion bemerkt wird, ist von der Masse der Ionen abhängig.
Das Pseudopotential ergibt sich als Zeitintegral über die
Beschleunigungen, die das Hochfrequenzfeld auf die Ionen ausübt.
Für leichte Ionen ist der Pseudopotentialtopf wegen hoher
Beschleunigungen sehr tief; sie sammeln sich daher im Zentrum der
Ionenwolke an. Die schwereren Ionen ordnen sich dann zwiebelschalenförmig
um dieses Zentrum an, wie in 4 angedeutet;
die schwersten Ionen befinden sich außen, im Gleichgewicht
zwischen der Abstoßung durch die Ladungen der Ionen in
der Ionenwolke und der für diese schweren Ionen nur noch
schwachen Zentralkraft des Pseudopotentials.
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Legt
man jetzt eine Sauggleichspannung an die Endkappenelektrode, die
die Austrittsöffnung enthält, so entsteht, wie
in 4 gezeigt, im Inneren der Ionenfalle ein Saugfeld
mit Äquipotentialflächen (61), das die
Ionen fokussierend zur Austrittsöffnung (62) treibt.
Durch ein Saugfeld begrenzter Stärke werden zunächst
die schweren, nur leicht festgehaltenen Ionen der äußersten
Zwiebelschale der Ionenwolke (60) abgesaugt; sie bleiben
noch durch den Potentialtopf des Pseudopotentials einigermaßen
gut zusammen und bewegen sich im Takt der Hochfrequenzspannung zur
Austrittsöffnung (62) hin und können
in einer jeweils günstigen Phase der Hochfrequenzspannung
austreten, selbst wenn die Sauggleichspannung wesentlich kleiner
ist als die oben genannte Hochfrequenzspitzenspannung.
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Da
es auf die zeitliche Reihenfolge und auf die Dauer des Austretens
der Ionen nicht ankommt, können jetzt die leichteren Ionen
durch ein Anheben der Sauggleichspannung oder auch durch ein Absenken
der Hochfrequenzspannung ausgetrieben werden. Die Geschwindigkeit
dieser Spannungsänderungen spielt dabei kaum eine Rolle;
das Austreiben kann durchaus 100 Mikrosekunden bis zu einer Millisekunde
(oder mehr) dauern. Die ausgetriebenen Ionen werden dabei in einen
weiteren Ionenspeicher (63) eingebracht, der als zweidimensionale
Ionenfalle ausgebildet ist. Hier ist ein Oktopol-Stabsystem günstig,
weil es auch Ionen aufnimmt, die relativ weit außerhalb
der Achse eintreten. Dabei wird das Achsengleichpotential in dieser
Ionenfalle so eingestellt, dass die jeweils ausgetriebenen Ionen
nur mit jeweils niedriger kinetischer Energie eintreten, um keine
weiteren Fragmentierungen durch Stöße mit dem
auch hier vorhandenen Dämpfungsgas zuzulassen. Aus diesem
Ionenspeicher (63) werden die Ionen dann dem Massenanalysator
zugeführt.
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Die
Fragmentierungszelle im erfindungsgemäßen Tandem-Massenspektrometer
lässt sich aber nicht nur für die Fragmentierung
durch Elektrontransfer-Dissoziation verwenden, sondern auch für
ergodische Fragmentierungen. So kann beispielsweise durch den Einbau
einer weiteren entsprechenden Ionenquelle für die Erzeugung
von negativen Jodionen in die Apparatur nach 3 eine ergodische
Fragmentierung von positiv geladenen Protein-Elternionen herbeigeführt
werden. Durch die Einführung dieser Jodionen in die 3D-Ionenfalle
mit geeignet eingestellter Hochfrequenzspannung werden die stationär gespeicherten
Elternionen so gestoßen, dass sie in jedem Stoß größere
Energiemengen aufnehmen und so relativ rasch zum ergodischen Zerfall
gelangen. Es kann hiermit ein Fragmentionenspektrum hoher Qualität
mit großem Massenbereich aufgenommen werden. Auch die Fragmentierung
von Proteinionen mit physikalischer Masse über etwa 3000
Dalton ist möglich. Es stehen somit in diesem Tandem-Massenspektrometer
bei de Arten der Fragmentierung in jeweils hoher Qualität
zur Verfügung; ideal für die Untersuchung von
posttranslationalen Modifikationen und vielen anderen Struktureinzelheiten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 02/101787
A1 [0015]
- - DE 102005004324 [0020]
- - US 2005/0199804 A1 [0020]