DE102006056931B4

DE102006056931B4 - Stoßfragmentierung von Ionen in Hochfrequenz-Ionenfallen

Info

Publication number: DE102006056931B4
Application number: DE102006056931A
Authority: DE
Inventors: Andreas 28355 Brekenfeld
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2006-12-04
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2011-07-21
Anticipated expiration: 2026-12-05
Also published as: GB2446249B; US20110127424A1; US7847246B2; GB0723591D0; US20080135747A1; DE102006056931A1; GB2446249A

Abstract

Verfahren zur Stoßfragmentierung von Analytionen in einer mit Stoßgas befüllten Hochfrequenz-Ionenfalle mit den Schritten (a) Setzen der Speicherhochfrequenzspannung auf einen mäßig hohen bis hohen Wert, (b) Anregen von Schwingungsbewegungen der Analytionen durch ein elektrisches Feld (4; 14; 24; 30), wodurch harte Stöße mit dem Stoßgas erzeugt werden, und (c) Ausbremsen der Schwingungsbewegungen durch ein entgegen gerichtetes elektrisches Feld (5; 15; 25; 32), um die stoßangeregten Analytionen wieder im Zentrum der Ionenfalle zu versammeln.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Fragmentionen in Stoßprozessen und zur Speicherung auch leichter Fragmentionen in Hochfrequenz-Ionenfallen, in denen normalerweise hohe Speicherhochfrequenzspannungen eingestellt werden und Fragmentionen unterhalb einer relativ hoch liegenden Grenzmasse nicht gespeichert werden können.
Die Erfindung macht davon Gebrauch, dass bei Stoßfragmentierungen (wie bei allen ergodischen Fragmentierungen) die zu fragmentierenden Analytionen in einen metastabilen Zustand mit relativ langsamem Zerfall gebracht werden können, und bietet ein besonders wirksames Verfahren an, die Analytionen schon bei mäßig hoher Speicherhochfrequenzspannung durch dipolare Anregung auf Schwingungen mit harten Stoßbedingungen zu bringen und nach kurzer Zeit von typisch weniger als einer Millisekunde wieder durch dipolare Anregung in die Ruhestellung zu zwingen, so dass durch einen so ermöglichten schnellen Übergang zu einer niedrigen Speicherhochfrequenzspannung auch kleine Bruchstückionen aus nachfolgenden ergodischen Zerfällen gespeichert werden können.
Stand der Technik
3D-Ionenfallen nach Wolfgang Paul bestehen aus einer hyperbelförmigen Ringelektrode und zwei rotationssymmetrisch hyperbelförmigen Endkappenelektroden. Legt man an die Endkappen einerseits und an die Ringelektrode andererseits eine elektrische Spannung, so wird im Inneren ein im Wesentlichen quadrupolares Feld aufgespannt. Ist die Spannung eine Hochfrequenzspannung, so ist das entstehende elektrische Hochfrequenzfeld in der Lage, Ionen zu speichern. Meist ist es aus praktischen Gründen so, dass man diese Speicherhochfrequenzspannung nur einphasig an die Ringelektrode anlegt, während man die Endkappenelektroden auf Massepotential halt. Die Speicherhochfrequenzspannung hat eine Frequenz, die üblicherweise etwa bei einem Megahertz liegt.
Nach Hans Dehmelt kann man sich das Speicherhochfrequenzfeld einer 3D-Ionenfalle als einen dreidimensionalen Pseudopotentialtopf vorstellen, mit einem Minimum des Potentials im Zentrum, parabelförmig in alle Raumrichtungen ansteigend, wobei die Ionen im Potentialtopf auf Ellipsen kreisen oder durch das Zentrum schwingen können. Das Pseudopotential ist eine zeitliche Integration über das Quadrat der Feldstarke; der Gradient des Pseudopotentials treibt die Ionen unabhängig von der Polarität ihrer Ladung stets zum Zentrum der Ionenfalle zurück.
Die Ionen werden aber nur gespeichert, wenn sie eine Masse oberhalb einer Grenzmasse besitzen. Unter „Masse” soll hier immer, wie in der Massenspektrometrie notwendig, die ladungsbezogene Masse m/z verstanden werden, also die physikalische Masse m geteilt durch die Anzahl z der (positiven oder negativen) Elementarladungen. Ionen unterhalb der Grenzmasse sind so leicht, dass sie während einer Halbphase der Speicherhochfrequenzspannung bereits bis an die gegenüber liegenden Elektroden beschleunigt werden können; für diese ist keine Speicherung mehr möglich, da für diesen Fall das Pseudopotential nicht existiert.
Die übrigen Ionen oszillieren im Pseudopotentialtopf in der Ionenfalle, wobei bei einer gegebenen Hochfrequenzspannung die Oszillationsfrequenzen in etwa umgekehrt proportional zu ihrer Masse sind. Die Oszillationsfrequenzen sind ein Charakteristikum für die Masse, man kann die Oszillationen der Ionen beispielsweise sehr präzise und massenselektiv resonant anregen. Fair den Zusammenhang zwischen Oszillationsfrequenz und Masse gibt es sehr gute Nährungsformeln.
Wird die Ionenfalle mit einem Stoßgas eines Druckes zwischen 1 und 10^–2 Pascal befüllt, so werden die Oszillationen der Ionen im Potentialtopf innerhalb kurzer Zeit so gedämpft, dass die Ionen sich im Minimum des Potentialtopfes in einer kleinen Wolke sammeln. Die Größe der Wolke bestimmt sich einerseits aus der Coulombschen Abstoßung der Ionen untereinander, und andererseits aus der zum Zentrum gerichteten Kraft des Pseudopotentials. Die Zeit, die die Dämpfung benötigt, ist umgekehrt proportional zum Druck des Stoßgases. Bei einem Druck von etwa 10^–2 Pascal beträgt die Zeit bis zur Dämpfung einige wenige Millisekunden; dabei erlebt das Ion einige Hundert Stöße.
3D-Ionenfallen können auch als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten Ionen massenselektiv ausgeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher geniessen werden. Es sind mehrere verschiedene Methoden für den Ionenauswurf bekannt geworden, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll. Gute kommerzielle Ionenfallen-Massenspektrometer haben einen Massenbereich bis zu einer ladungsbezogenen Masse von m/z = 3000 atomaren Masseneinheiten (Dalton), wobei besondere Scanverfahren bei jeder Masse auch noch die Isotopenmuster von vierfach geladenen Ionen auflösen können. Ionenfallen-Massenspektrometer gehören zu den preiswertesten Massenspektrometern; sie sind weit verbreitet.
2D-Ionenfallen bestehen aus stabförmigen, zueinander parallelen Elektrodenpaaren; sie gehen ebenfalls auf Wolfgang Paul zurück. An den Elektrodenpaaren werden jeweils die Phasen einer Hoch frequenzspannung angelegt. Diese Ionenfallen werden zweidimensional genannt, weil das Pseudopotential von der Längsachse aus nur in zwei Raumrichtungen ansteigt und die Ionen zur Achse zurücktreibt. In Längsrichtung muss man besondere Maßnahmen ergreifen, um die Ionen innerhalb der 2D-Ionenfalle zu halten; diese Maßnahmen können in elektrischen Gleichspannungsfeldern, aber auch in Pseudopotentialen durch Hochfrequenzspannungen an besonders geformten Elektroden bestehen. Durch Beschickung mit Dämpfungsgas lässt sich auch hier eine Sammlung der Ionen erreichen, in diesem Fall sammeln sich die Ionen in einer langgestreckten Ionenwolke in der Achse der Ionenfalle.
Eine besondere Form der 2D-Ionenfallen sind die quadrupolaren Ionenfallen, die aus vier Polstäben bestehen. Diese besonderen 2D-Ionenfallen werden auch häufig „lineare Ionenfallen” genannt. Lineare Ionenfallen mit vier Polstäben formen im Inneren ein Quadrupolfeld und können wie 3D-Ionenfallen als Massenanalysatoren verwendet werden, wobei es auch hier verschiedene Scanverfahren gibt, beispielsweise solche des massenselektiven Auswurfs der Ionen durch Schlitze in den Polstäben oder durch Blenden am Ende der Stabsysteme. Kommerzielle Geräte mit Auswurf durch Schlitze in den Polstäben haben gegenwärtig einen ladungsbezogenen Massenbereich bis zu m/z = 2000 Dalton.
Alle Ionenfallen können aber auch mit anderen Arten von Massenanalysatoren gekoppelt werden, beispielsweise, um besonders hohe Massenauflösungsvermögen zu erreichen oder Ionen besonders hoher ladungsbezogener Massen m/z messen zu können. Es sind Kopplungen mit Ionenzyklotron-Resonanz-Analysatoren, mit Flugzeitmassenanalysatoren, mit magnetischen Sektorfeld-Geräten oder mit Kingdon-Zellen bekannt geworden. In diesen Fällen dienen die Hochfrequenz-Ionenfallen meist nur dazu, für die Fragmentierung der Ionen zur Verfügung zu stehen, also auch für die hier besonders betrachteten Stoßfragmentierungen.
Wir wenden uns hier einem Anwendungsgebiet zu, in dem die Massenspektrometrie eine große Rolle spielt: der Proteomik. Hier werden die Proteine häufig enzymatisch zu Verdaupeptiden abgebaut, und diese werden massenspektrometrisch untersucht. Dabei spielen Fragmentierungsvorgänge eine große Rolle, weil sie Sequenzen von Aminosäuren und Modifikationsstrukturen erkennen lassen.
In Ionenfallen der verschiedenen Arten stehen heute zwei grundsätzlich verschiedene Arten der Fragmentierung zur Verfügung: die „ergodische” Fragmentierung und die ”elektroneninduzierte” Fragmentierung.
Alle „elektroneninduzierte” Fragmentierungsverfahren bestehen darin, durch Einfang oder Übertragung eines Elektrons ein assoziiertes Proton eines Peptid- oder Proteinions zu neutralisieren, woraufhin durch eine spontane Umlagerung ein Bruch der Kette aus Aminosäuren erfolgt. Der Bruch betrifft dabei nicht die peptidischen Bindungen, sondern dazu benachbarte Bindungen, die zu so genannten c- und z-Fragmentionen führen. Es sind inzwischen verschiedene Arten dieser Art von Fragmentierung bekannt geworden: Die Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD = „electron capture dissociation”); die Elektronentransfer-Dissoziation (ETD = „electron transfer dissociation”) und die Elektronenübertragung durch hoch angeregte Neutralteilchen (MAID = „metastable atom induced dissociation”). Besonders die Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) wird auch in Ionenfallen durchgeführt.
Unter einer „ergodischen” Fragmentierung von Analytionen wird hier eine Fragmentierung verstanden, bei der ein genügend großer Überschuss an innerer Energie in den Analytionen zu einer Fragmentierung führt. Der Überschuss an Energie kann beispielsweise durch eine Vielzahl von Stößen der Analytionen mit einem Stoßgas, aber auch durch Absorption vieler Photonen einer Infrarot-Strahlung (IRMPD = „infrared multi photon dissociation”) erzeugt werden.
Nach dem ursprünglich von Boltzmann als Hypothese formulierten Ergodensatz wird in einem abgeschlossenem System, beispielsweise in einem komplexen molekularen Analytion, bei Vorhandensein einer bestimmten Energie jeder Zustand, der mit dieser Energie verwirklicht werden kann, im Laufe der Zeit tatsächlich verwirklicht werden. Dieser Ergodensatz ist inzwischen mathematisch bewiesen, also keine Hypothese mehr. Da die Fragmentierung einen möglichen Zustand erzeugt, nämlich die Entstehung zweier Teilchen aus dem Analytion, wird die Fragmentierung auch irgendwann eintreten. Durch die Energieaufnahme entstehen zwischenzeitlich „metastabil” genannte Analytionen, die dann irgendwann zerfallen. Der Zerfall wird an sich durch eine „Halbwertszeit” charakterisiert, die aber vom Betrag der Überschussenergie abhängt und heute noch nicht eindeutig bestimmbar ist.
Die Wahrscheinlichkeit der ergodischen Spaltung einer bestimmten Bindung hängt von ihrer Bindungsenergie ab. Mit hoher Wahrscheinlichkeit werden nur die schwächsten Bindungen des Analytions gespalten. In Proteinen sind die schwächsten Bindungen die so genannten peptidischen Bindungen zwischen den Aminosäuren, die zu Fragmenten der b- und der y-Reihe führen, die teils geladen als Fragmentionen, teils als Neutralteilchen entstehen. Da die peptidischen Bindungen zwischen verschiedenen Aminosäuren etwas unterschiedliche Bindungsenergien aufweisen, werden einige peptidische Bindungen des Analytions mit höherer Wahrscheinlichkeit, andere mit geringerer Wahrscheinlichkeit gespalten. Das führt dazu, dass im Fragmentionenspektrum nicht alle Fragmentionen aus Peptidbindungen gleiche Intensität haben. Die Schwankungen der Intensitäten spiegeln also die Energien der verschiedenartigen peptidischen Bindungen wieder. Nicht-peptidische Bindungen werden dagegen so selten gespalten, dass ihre Bruchstücke nicht in messbaren Mengen vorkommen.
Um in Hochfrequenz-Ionenfallen aus den Analytionen durch Stoßfragmentierung Bruchstückionen zu erzeugen, muss man zunächst eine Ionensorte auswählen, die man zu Bruchstückionen fragmentieren und dann messen möchte. Die Analytionen liegen meist als Gemisch vor: sie können von mehreren Substanzen stammen, die alle zu analysieren sind, aber auch aus Ionen mehrerer Ladungsstufen bestehen, von denen eine für die Fragmentierung auszuwählen ist. Die Bruchstückionen (der ersten Fragmentierungsgeneration) werden häufig als „Tochterionen” bezeichnet, und die Ionen der für die Fragmentierung auszuwählenden Ionensorte der Analytionen werden häufig „Elternionen” genannt. Nach Wahl der Elternionen werden alle anderen Ionen, die sich in der Ionenfalle befinden, mit bekannten Mitteln aus ihr ausgeworfen, so dass nur die Elternionen übrig bleiben.
Die Elternionen brauchen übrigens nicht exakt alle die gleiche Masse zu besitzen, es können auch die verschieden schweren Ionen sein, die zwar dieselbe Bruttoformel der Zusammensetzung aus den Elementen besitzen, aber verschiedene Isotopenzusammensetzungen umfassen. Die gemeinsame Fragmentierung aller Ionen einer solchen Isotopengruppe stellt sogar das vorwiegend benutzte Verfahren dar, da dann auch die Tochterionen in Isotopengruppen auftreten, und an den Isotopengruppen leicht der Ladungszustand abzulesen ist.
Der Vorgang des Auswerfens aller nicht gewählten Ionen wird häufig als „Isolation” der Elternionen bezeichnet. Das Auswerfen ist in seinen Grundprinzipien weitgehend bekannt und kann in allen kommerziell erhältlichen Ionenfallen-Massenspektrometern leicht ausgeführt werden. Es beruht einerseits auf Anwendung der unteren Massengrenze zum Auswerfen der Ionen, die leichter sind als die Elternionen, und andererseits auf der Anwendung einer massenselektiv resonanten Anregung der Oszillationen der nicht gewünschten schwereren Ionen, wobei die Anregung so stark gewählt wird, dass die Ionen die Elektroden berühren und damit entladen werden oder sonst aus der Ionenfalle verschwinden. Die resonante Anregung wird in 3D-Ionenfallen durch eine elektrische Wechselspannung bewirkt, die quer über die beiden Endkappenelektroden angelegt wird und somit ein dipolares Wechselfeld erzeugt. In 2D-Ionenfallen können die dipolaren Anregungsspannungen an zwei gegenüberliegende Polstäbe angelegt werden.
Die verbleibenden Elternionen sammeln sich wieder durch die Dämpfung im Stoßgas in einer kleinen Wolke im Zentrum der Ionenfalle. Sie können jetzt zu Bruchstücken fragmentiert werden. Die übliche Art der Fragmentierung ist die Stoßfragmentierung (CID = „collision induced decomposition”). Durch eine relativ zarte resonante Anregung werden sie zu Oszillationen gezwungen, die zu vielen niederenergetischen Stößen mit dem Stoßgas führen. In vielen dieser Stöße werden jeweils kleine Energieportionen in die Elternionen hinein übertragen. Die innere Energie der molekülinternen Schwingungssysteme steigt, bis eine der schwächeren Bindungen innerhalb der molekularen Struktur des Elternions aufbricht. Aus einem einfach geladenen Elternion entsteht ein Tochterion und ein Neutralteilchen; aus einem doppelt geladenen Elternion entstehen häufig (jedoch nicht immer) zwei einfach geladene Tochterionen. Da die Tochterionen nicht mehr resonant angeregt werden, weil sie eine andere Masse und damit eine andere Oszillationsfrequenz besitzen, werden ihre Oszillationen ab Bruch durch das Stoßgas gedämpft und die Tochterionen sammeln sich im Zentrum. Sie können dann beispielsweise in herkömmlicher Weise durch ein sequentiell massenselektives, resonantes Auswerfen in einem Detektor, der sich außerhalb der Ionenfalle befindet, in Form eines Tochterionenspektrums gemessen werden.
Diese Art der Stoßfragmentierung hat ihre Nachteile, die besonders darin liegen, dass es sowohl aufheizende wie auch kühlende Stöße gibt. Dabei beziehen sich hier die Begriffe „Aufheizen” und „Kühlen” auf die innere Energie der Elternionen, nicht auf die Energie der sekularen Oszillationen, für die hier stets die Begriffe „Anregen” und „Dämpfen” verwendet werden. Sind die Stöße alle sehr niederenergetisch, treffen also Elternion und Stoßgasmolekül sehr langsam aufeinander, so überwiegen die kühlenden Stöße: es wird innere Energie der Elternionen dadurch abgebaut, dass Energie an das Stoßgasmolekül abgegeben wird. Nur bei harten Stößen schnell aufeinander stoßender Partner kann vom Elternion Energie aufgenommen werden. Da als Stoßgas meist Helium verwendet wird, können die Stoßgasmoleküle gar keine innere Energie aufsammeln. Für diese Energieübertragung in das Innere der Elternionen hinein sind Anregungen von Energiezuständen der inneren Schwingungssysteme notwendig, die, wie aus der Quantentheorie bekannt, eine Mindestenergie erfordern. Nur harte Stöße, also Stöße mit hoher Relativgeschwindigkeit der stoßenden Partner, führen zum Aufheizen der Elternionen.
Es muss also die Anregung zur Fragmentierung mit genügend harten Stößen verbunden werden, also mit Mindestgeschwindigkeiten der Elternionen durch eine Anregung ihrer Sekularschwingungen. Diese harten Stöße lassen sich nur mit einer relativ hohen Speicherhochfrequenzspannung erreichen, da nur dann die Wände des Potentialtopfes genügend steil und hoch sind, um schnelle, weite Oszillationen zu erreichen. Aber selbst hier kann man nur mit besonderer Vorsicht arbeiten: Es muss die Dämpfung der sekularen Oszillationen der Elternionen im Stoßgas immer mit der ständigen Amplitudenvergrößerung durch die dipolare Anregung im Gleichgewicht bleiben, da sonst die Amplituden der Sekularschwingungen anwachsen, bis das Elternion aus der Ionenfalle fliegt. Da die Dämpfung durch Stöße mit dem Stoßgas ein statistischer Vorgang ist, muss die Wechselspannung, zur resonanten Anregung der sekularen Oszillationen vorsichtig klein gehalten werden, um nicht Ionenverluste größeren Ausmaßes erleben zu müssen. Trotz reduzierter mittlerer Auslenkung hohe Stoßgeschwindigkeiten zu erreichen erzwingt die Anwendung hoher Speicherhochfrequenzspannung.
Es wird in der Literatur eine Faustregel wiedergegeben, die besagt, dass nur dann fragmentiert werden kann, wenn sich die Speicherhochfrequenzspannung mindestens auf einem Wert befindet, der eine untere Massenschwelle ergibt, die bei einem Drittel der ladungsbezogenen Masse der Elternionen liegt. Damit ist es aber nicht möglich, kleine Bruchstückionen in der Falle zu sammeln, deren ladungsbezogene Masse unter einem Drittel der ladungsbezogenen Masse der Elternionen liegt.
Wir wenden uns hier einem Anwendungsgebiet zu, in dem die Massenspektrometrie eine große Rolle spielt: der Proteomik. Hier werden die Proteine häufig enzymatisch zu Verdaupeptiden abgebaut, und diese werden massenspektrometrisch untersucht. Geht man von Peptidionen aus, so bilden sich in den genannten Stoßzellen auch so genannte innere Bruchstücke, die aus zwei Brüchen der Kette von Aminosäuren stammen. Insbesondere treten dabei häufig so genannte Immoniumionen auf. das sind geladene einzelne Aminosäuren, die von irgendwo aus der Kette stammen. Die Messung solcher Immoniumionen hat einen hohen Informationswert, da sie sofort die Anwesenheit dieser Aminosäure im Peptid signalisieren. Man kann häufig an den Immoniumionen bereits die Zusammensetzung des Peptids aus Aminosäuren ablesen, auch wenn dadurch die Anordnung der Aminosäuren längs der Kette nicht bestimmt werden kann.
Für die Speicherung auch sehr kleiner Fragmentionen (besonders der Immoniumionen) durch Stoßfragmentierung sind jüngst besondere Verfahren bekannt geworden, die vom langsamen, metastabilen Zerfall der Ionen durch den ergodischen Fragmentierungsprozess Gebrauch machen.
Im Patent US 6 949 743 B1 (J. C. Schwartz) wird ein Verfahren der Stoßfragmentierung durch eine kurze Anregung der Analytionen mit einem kurzen Puls resonanter Anregungswechselspannung bei erhöhter Speicherhochfrequenzspannung vorgeschlagen. Die Speicherhochfrequenzspannung wird sodann erniedrigt, um die untere Massenschwelle zu erniedrigen und leichte Fragmentionen sammeln zu können.
Auch in E 10 2005 025 497 A1 (A. Brekenfeld) wird die Fragmentierung für kurze Zeit von einigen Zehnteln einer Millisekunde bis zu einigen Millisekunden bei höheren Speicherhochfrequenzspannung als üblich durchgeführt. Während der anschließenden Dämpfung der sekularen Oszillationen durch das Stoßgas wird dann gesteuert auf eine niedrige Speicherhochfrequenzspannung übergegangen. Dieser Übergang zu niedrigen Spannungen der Speicherhochfrequenz darf nicht schnell erfolgen, da sonst die oszillierenden Ionen bei der Verflachung des Speichertopfes aus dem Topf entkommen können. Bei der hohen Speicherhochfrequenzspannung zur Fragmentierung kann entweder mit einer resonanten Anregung gearbeitet werden, oder aber mit einer Auslenkung der Elternionen weit aus dem Zentrum heraus durch Gleichspannungspotentiale an mindestens einer der Elektroden, nach deren Ausschalten nur noch die stark rücktreibende Kraft der Speicherhochfrequenzspannung auf die Ionen wirkt, so dass die Ionen kraftvolle Stöße mit dem Stoßgas erleben. Bei der anschließend niedrigen Speicherhochfrequenzspannung sammeln sich dann die Bruchstückionen, dabei auch sehr leichte Tochterionen und Enkelionen, im Zentrum der Ionenfalle und können in üblicher Weise gemessen werden.
Analytionen schwerer Massen im Massenbereich von m = 2000 bis 5000 Dalton und darüber bieten größere Schwierigkeit für eine Stoßfragmentierung. Das liegt insbesondere daran, dass sie seht viel mehr interne Energie brauchen, um ergodisch in einigermaßen kurzer Zeit zu fragmentieren. Bei längerer Wartezeit für die Fragmentierung tritt aber wieder eine Kühlung durch das Stoßgas ein, also ein Verlust an innerer Energie, so dass jede weitere ergodische Fragmentierung unterbleibt. Außerdem entstehen sehr viele hoch geladene Fragmentionen, die es schwierig bis unmöglich machen, das Fragmentionenspektrum auszuwerten. Eine Lösung dieses Problems bietet die Deprotonierung der hoch geladenen Analytionen vor ihrer Fragmentierung.
Im Bereich der Deprotonierungen von hoch geladenen Pseudomolekülionen, die im Prinzip seit langem bekannt sind, ist jüngst ein interessantes Verfahren bekannt geworden. Die hoch geladenen Pseudomolekülionen einer Substanz, die in verschiedenen Ladungsstufen vorliegen, können in einer Hochfrequenz-Ionenfalle gleichzeitig deprotoniert werden und dieser Prozess der Deprotonierung kann bei einer bestimmten Ladungsstufe angehalten werden, so dass sich bei dieser Ladungsstufe alle Pseudomolekülionen höherer Ladungsstufen teildeprotoniert sammeln. Dazu ist es erforderlich, bei dem ladungsbezogenen Massenwert m/z dieser Ladungsstufe der Analytionen eine leichte resonante Anregung der sekularen Schwingungen durch eine Dipolwechselspannung zu setzen. Die dann angeregt schwingenden Ionen dieser Ladungsstufe sind zu weiteren Reaktionen mit deprotonierenden Reaktant-Anionen nicht mehr fähig, da zur Deprotonierung eine niedrige Relativgeschwindigkeit der beteiligten Partner notwendig ist. Dieses Verfahren ist im Patent US 7 064317 B2 (S. M. McLucky et al.) beschrieben.
Eine solche Umwandlung von hoch geladenen Pseudomolekülionen verschiedener Ladungsstufen in eine vorbestimmte Ladungsstufe sorgt gleichzeitig auch für eine hohe Empfindlichkeit, da sich die Analytionen aller höheren Ladungsstufen während der Deprotonierung mit relativ hoher Ausbeute bei der ausgewählten Ladungsstufe sammeln. Man kann Ausbeuten von über 50 Prozent erzielen. Außerdem ist es so möglich, bei Vorhandensein der hoch geladenen Ionen mehrerer Substanzen die Analytionen auszuwählen, da die Ionen der fremden Substanzen nicht gesammelt, sondern bei genügend langer Reaktionszeit bis zum bitteren Ende, bis zu ihrer Neutralisierung, deprotoniert werden.
Eine solche teilweise Deprotonierung ist also sehr nützlich, um hoch geladene schwere Analytionen überhaupt erst einer Stoßfragmentierung zugänglich zu machen.
Die Patentschrift US 5,528,031 A betrifft ein Verfahren zur Fragmentierung von Ionen in nichtlinearen Ionenfallen durch Stöße der Ionen mit Molekülen eines Fragmentierungsgases unter dipolarer Anregung der säkularen Ionenschwingungen, bei dem ein Gemisch von Frequenzen zur resonanten Anregung verwendet wird. Das Gemisch hat eine Frequenzgrenze, die verhindert, dass die Ionen über die maximale Schwingungsweite zwischen den Endkappen hinaus angeregt werden können.
Der Patentanmeldung WO 2006/042187 A2 ist zu entnehmen, dass eine Fragmentierung von Proteinionen und danach der Fragmentionen derart durchgeführt wird, dass die Fragmentionen einfach bis vierfach geladen sind.
Die Patentschrift US 6 710 336 B2 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Dissoziierung ausgewählter Ionen, bei dem zum Zwecke der Isolierung von Ionen einer bestimmten ladungsbezogenen Masse vorberechnete Wellenformen an die Endkappenelektroden einer Quadrupol-Ionenfalle angelegt werden. Die verschiedenen vorberechneten Wellenformen können in einer Bibliothek nachgehalten und von dort abgerufen werden.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, hoch wirksame Verfahren zur Stoßfragmentierung von Elternionen in Hochfrequenz-Ionenfallen bereitzustellen, bei der die Fragmentionen, insbesondere auch leichte Fragmentionen, zu größeren Anteilen in der Ionenfalle verbleiben als mit bisherigen Verfahren.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es ist die Grundidee der Erfindung, die Elternionen für die Stoßfragmentierung bei einer mäßig hohen bis hohen Speicherhochfrequenzspannung durch elektrische Felder so anzuregen, dass sie schnell eine in der Ionenfalle maximal mögliche Amplitude ihrer Schwingungsbewegungen annehmen und dass diese Schwingungsbewegungen nach einer Expositionszeit für Stöße wieder zwangsweise schnell durch entgegen gerichtete elektrische Felder ausgebremst werden, so dass sich die Elternionen danach wieder in Ruhestellung befinden. Es kann dann die Speicherhochfrequenzspannung schlagartig auf einen niedrigen Wert gesetzt werden, um auch leichte Fragmentionen aus nachfolgenden ergodischen Zerfällen in der Ionenfalle zu sammeln.
Die „schnelle” Anregung soll so definiert sein, dass die maximale Schwingungsamplitude nach nur wenigen Schwingungsperioden erreicht wird, im Grenzfall in nur einem Viertel einer Schwingungsperiode. Der Vorgang, die schwingenden Ionen wieder in ihre Ruhestellung zu bringen, soll hier „Ausbremsung” genannt werden. Unter „schneller Ausbremsung” soll verstanden werden, dass wieder in wenigen Schwingungsperioden die Ruhestellung erreicht ist; im Grenzfall wieder in einem Viertel einer Schwingungsperiode. Als „mäßig hoch” wird eine Speicherhochfrequenzspannung verstanden, wenn die untere Massenschwelle zwischen einem Achtel und einem zwei Fünfteln der ladungsbezogenen Masse der Elternionen liegt. In diesem Bereich wird die klassische Stoßfragmentierung mit einem Anregungs-Dämpfungs-Gleichgewicht durchgeführt, für die gewöhnlich die Massenschwelle bei einem Drittel liegt. Die Speicherhochfrequenzspannung ist „hoch”, wenn die Massenschwelle über zwei Fünfteln der ladungsbezogenen Masse der Elternionen liegt.
Im einfachsten Fall kann die Erfindungsidee durch eine nicht-resonante Anregung bestimmter Zeitdauer durchgeführt werden. Regen wir Elternionen, deren sekulare Schwingungsfrequenz bei einer Einstellung der Speicherhochfrequenzspannung beispielsweise genau 100 Kilohertz beträgt, mit einer dipolaren Wechselspannung von 95 Kilohertz an, so schwingen die Ionen an, bilden nach zehn Schwingungen einen Schwebungsbauch definierter Amplitude, und verkleinern dann ihre Schwingungsamplituden wieder, um nach 20 Schwingungen, also nach etwa 200 Mikrosekunden, wieder im Schwebungsknoten in Ruhestellung zu sein. Wird jetzt die Anregungswechselspannung abgeschaltet, so bleiben die Elternionen in Ruhe. Die Maximalamplitude im Schwebungsbauch kann durch die Höhe der Anregungsspannung genau vorgegeben werden.
Wählen wir für eine Anregungswechselspannung eine Frequenz, die weiter weg ist von der sekularen Frequenz der Ionen, so wird das Maximum schneller erreicht, braucht aber für eine gleiche Amplitude im Maximum des Schwebungsbauches eine höhere Anregungsspannung. Mit 90 Kilohertz erreichen wir das Maximum des Schwebungsbauches nach nur fünf Schwingungen, und den Schwebungsknoten nach nur zehn Schwingungen. Dieses schnellere Durchfahren des Anschwingvorgangs ist an sich günstig, weil weniger kühlende Stöße erlebt werden. Die kurze Zeitdauer der Exposition für harte Stöße ist aber nachteilig.
Die Zeitdauer der Exposition kann aber dadurch verlängert werden, dass die Anregungswechselspannung bei Erreichen des Schwebungsbauches für eine Zeit n·T abgeschaltet wird, wobei T die Periodendauer der sekularen Frequenz des Elternions darstellt und n für eine beliebige positive ganze Zahl steht. Die Elternionen schwingen dann mit fast unverminderter Amplitude weiter, nur durch das Stoßgas gedämpft. Diese Dämpfung ist aber nicht sehr groß, da im Wesentlichen nur harte Stöße erlebt werden, keine elastischen Stöße, deren Dämpfungswirkung größer ist. Nach einer genügend langen Expositionszeit kann jetzt die Ausbremsung durch phasenrichtiges Einschalten der Anregungswechselspannung erfolgen, bis der Schwebungsknoten und damit die Ruhestellung erreicht ist. Die Zeitdauer der Exposition wird durch das leicht nicht-synchrone Schwingen der verschiedenen Ionen einer Isotopengruppe beschränkt; generell darf diese Exposition nicht länger als etwa eine Millisekunde dauern.
Mehrere andere Ausführungsformen führen zu sehr ähnlichen Ergebnissen: beispielsweise eine resonante Anregung definierter Form, eine Anregung mit einer Überlagerung mehrerer nicht-resonanter Anregungsfrequenzen, oder Anregung und Ausbremsung durch jeweils einen einzigen Gleichspannungspuls richtigen Zeiteinsatzes.
Es können die Elternionen auch durch eine dipolare Gleichspannung aus dem Zentrum der Ionenfalle in ein Gebiet gebracht werden, in dem sie durch erzwungene Schwingungen durch das Speicherhochfrequenzfeld sehr harte Stöße erleben. Auch hier ist eine schnelle Rückführung in die Ruhestellung möglich.
Sehr schwere Analytionen, die hoch geladen in die Ionenfalle eingebracht werden, können für eine wirksame Stoßfragmentierung zuerst einer Ladungsverminderung durch Deprotonierung mit Hilfe von negativen Ionen unterworfen werden. Besonders geeignet ist ein Anhalten dieser Deprotonierung bei einer vorgegebenen Ladungsstufe, deren Ionen besonders Für eine Stoßfragmentierung geeignet sind.
Die verschiedenen Arten der Stoßfragmentierung liefern nicht nur verschiedenartige Information, sondern sind haben auch unterschiedliche Nachweisempfindlichkeiten. In automatisch ablaufenden Analysenverfahren, die beispielsweise bei Kopplungen der Massenspektrometrie mit Flüssig-Chromatographie angewandt werden, ist es daher zweckmäßig, die Art der Stoßfragmentierung automatisch von Masse, Ladungszustand und Häufigkeit der zu untersuchenden Analytionen steuern zu lassen. Es wird also automatisch je nach Masse, Ladungszustand und Häufigkeit entweder die klassische Stoßfragmentierung durch Anregungs-Dämpfungs-Gleichgewicht, die Stoßfragmentierung durch kurzzeitige Anregung mit Dämpfung und Rücknahme der Speicherhochfrequenzspannung, die nicht-resonante Anregung/Ausbremsung, die resonante Anregung/Ausbremsung oder die pulsförmige Anregung/Ausbremsung, die letzteren jeweils mit schlagartiger Verminderung der Speicherhochfrequenzspannung, ausgeführt. Außerdem kann je nach Masse, Ladungszustand und Häufigkeit automatisch gesteuert werden, ob der Stoßfragmentierung eine Deprotonierung vorhergeht und bei welcher Ladungsstufe diese Deprotonierung angehalten wird.
Beschreibung der Abbildungen
zeigt eine einfache Schwebungsperiode der sekularen Schwingungen von Elternionen, deren sekulare Schwingungsfrequenz 100 Kilohertz beträgt und die mit 95 Kilohertz nicht-resonant angeregt werden, (1) Beginn der Anregung, (2) Schwebungsbauch, (3) Schwebungsknoten mit Ende der Anregung, in dem die Ionen wieder in Ruhestellung sind, (4) und (5) Anregungsspannung (gestrichelt). Jede Anregung oder Ausbremsung wirkt dann maximal, wenn sich die Phasen zwischen Anregungswechselspannung und Ionenschwingungen um 90° unterscheiden, bei gleicher Phase tritt keine Beschleunigung oder Ausbremsung ein.
stellt eine ähnliche nicht-resonante Anregung dar wie in , aber mit höherer Anregungsspannung (14) und geänderten Frequenz von etwa 90 Kilohertz, die deshalb ein schnelleres Anschwingen zwischen Beginn (10) der Anregung und dem Schwebungsbauch (11) ergibt. Zwischen den Zeitpunkten (11) und (12) wird die Anregungsspannung komplett abgeschaltet, daher ergibt sich eine Periode konstanter Amplitude. Die leichte Dämpfung durch das Stoßgas und die Überlagerung der Ionenschwingungen mit erzwungener Schwingung durch die Speicherhochfrequenzspannung sind hier vernachlässigt. Zum Zeitpunkt (12) beginnt die Ausbremsung der Schwingung durch eine phasenjustierte Anregungsspannung (15), die zum Zeitpunkt (13) wieder abgeschaltet wird.
zeigt, dass sich eine ähnliche Schwebungsform der Ionenschwingungen auch mit einer resonanten Anregung und Ausbremsung bilden lassen kann. Die Anregung und Ausbremsung erfolgt durch zwei Wechselspannungspakete (24) und (25), wobei hier zum Ausbremsen eine um 180° gedrehte Phase angewendet wird. Untersucht man das Anregungspaket mit einer Fourier-Analyse, so stellt man fest, dass es sich hier um die Überlagerung zweier nicht-resonanter Schwingungen handelt, die in ihrer Überlagerung die Elternionen resonant anregen. Alternativ kann für die Abbremsung auch ein Wechselspannungspaket ohne Phasendrehung verwendet werden. Der Versatz muss dann aber ein halbzahliges (nicht ganzzahliges) Vielfaches der Periodendauer der sekularen Frequenz betragen.
gibt die Anregung und Ausbremsung der sekularen Ionenschwingungen (31) durch zwei Gleichspannungspulse (30) und (32) wieder. Der Gleichspannungspuls zum Ausbremsen muss nicht gegenpolig zum Anregungspuls ausgeführt sein, es ist auch ein Ausbremsen mit einem gleich gepolten Ausbremsungspuls möglich, wobei lediglich eine andere Phase gewählt werden muss.
gibt eine ganz andere Ausführungsform der Erfindung. Anders ist hier die Exposition für harte Stöße, die hier nur durch erzwungene, eingeprägte Schwingungen (43) der Hochfrequenzspeicherspannung erfolgen, wobei eine Gleichspannung (44) zwischen gegenüberliegenden Elektroden die Ionen aus dem Zentrum in ein Gebiet bringt, in dem ein hohes Feld der Speicherhochfrequenzspannung herrscht. Dabei wird zu Beginn (40) eine erste Gleichspannung (41) eingeschaltet, die die Ionen aus dem Zentrum heraus beschleunigt und weit aus dem Zentrum katapultiert. Sind die Elternionen auf ihrer Sollposition angekommen, so wird die Gleichspannung erhöht, bis sie ihre Haltespannung (44) angenommen hat. Die Elternionen führen jetzt die erzwungenen Schwingungen (43) aus. Nach genügend langer Exposition wird der Vorgang rückwärts durchlaufen (45, 47). Die Exposition kann hier prinzipiell beliebig lange verlaufen, da die erzwungene Schwingung für die Ionen allen Isotopenzusammensetzungen gleich verläuft. Durch die phasengenaue zeitliche Positionierung der beiden Gleichspannungsschritte (41) und (42) wird erreicht, dass die Ionen durch die Auslenkung nicht zu starken Oszillationen um die Sollposition der Auslenkung angeregt werden. So wird selbst bei großen Auslenkungen der Verlust der Ionen an den Elektroden vermieden.
stellt ein Schema eines 3D-Ionenfallenmassenspektrometers für die Durchführung eines Verfahrens nach dieser Erfindung dar, hier einer Elektrosprüh-Ionenquelle (61, 62), einer Elektronenanlagerungs-Ionenquelle (68) für die Erzeugung negativer Ionen für die Deprotonierung und einer 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden (71, 73) und Ringelektrode (72). Das Ionenleitsystem (69), hier als Oktopol-Stabsystem ausgeführt, kann sowohl positive wie auch negative Ionen zur Ionenfalle leiten. Die Anregungsspannungen werden den beiden Endkappenelektroden (71, 73) zugeführt.
gibt das Schema eines 2D-Ionenfallenmassenspektrometers wieder, dessen Ionenfalle aus vier hyperbolisch geformten Polstäben (81–84) besteht, von denen hier der Polstab (81) zum Auswurf der Ionen mit einem Schlitz (87) versehen ist. Die Anregungsspannungen werden hier zwei gegenüberliegenden Polstäben, beispielsweise den Polstäben (81) und (83) zugeführt. Durch Anlegen einer zusätzlichen Wechselspannung an die anderen beiden Polstäbe mit einer um 90° verschobenen Phase kann statt der linearen Schwingung auch eine zirkulare Schwingung angeregt werden.
zeigt ein Massenspektrum der Fragmentionen von doppelt geladenen Ionen eines Peptids namens Glu-Fib, das die Molekülmasse m = 1569,7 Dalton besitzt und dessen Ionen durch das Verfahren nach dieser Erfindung fragmentiert wurden. Die Sequenz, der b-, (b-17)-, (b-18)-, y-, (y-17)- und (y-18)-Ionen wurde durch ein Erkennungsprogramm automatisch annotiert. Das Massenspektrum reicht bis zur ladungsbezogenen Masse m/z = 80 hinunter.
Besonders vorteilhafte Ausführungsformen
Eine besonders einfache Ausführungsform verwendet eine ein fache Schwebungsform für die Erzeugung harter Stöße, wie sie in gezeigt ist. Eine einfache Schwebungsperiode der sekularen Schwingungen von Elternionen, deren sekulare Schwingungsfrequenz 100 Kilohertz beträgt, wird hier durch eine nicht-resonante Anregung mit einer Frequenz von 95 Kilohertz erzeugt. Genau zehn Schwingungsperioden nach Beginn (1) der Anregung wird der Schwebungsbauch (2) erreicht, und nach weiteren zehn Schwingungsperioden sind die Elternionen im Schwebungsknoten (3) wieder in Ruhestellung. Hier wird die Anregungsspannung abgestellt. Es ist deutlich zu sehen, dass, wie bekannt, jede Anregung oder Ausbremsung dann maximal wirkt, wenn sich die Phasen zwischen Anregungswechselspannung und Ionenschwingungen um 90° unterscheiden, bei gleicher Phase tritt keine weitere Beschleunigung oder Ausbremsung mehr ein. Es kann die Maximalamplitude genau auf die Dimensionen der Ionenfalle abgestimmt werden, so dass durch eine hohe Geschwindigkeit der Elternionen die Stöße sehr hart werden, aber trotzdem keine Elternionen durch Anstoßen an die Elektroden verloren gehen.
Im Schwebungsbauch schwingen die Ionen übrigens mit einer Frequenz, die nicht der sekularen Frequenz der frei schwingenden Ionen entspricht. Eine Fourier-Analyse der Schwingung zeigt an, dass hier eine Überlagerung zweier Frequenzen vorliegt: die der Anregung, und die der sekularen Schwingung frei schwingender Ionen.
Die ist nur eine Näherung, da zur Erzielung einer einfachen zeichnerischen Darstellung die eingeprägten, erzwungenen Schwingungen durch die Speicherhochfrequenzspannung weggelassen wurden. Diese erzwungenen Schwingungen sind vernachlässigbar klein, wenn die Speicherhochfrequenzspannung und damit die untere Massenschwelle genügend klein ist. Ist die sekulare Schwingungsfrequenz etwa 100 Kilohertz, und beträgt die Frequenz der Speicherhochfrequenzspannung etwa ein Megahertz, so haben die eingeprägten Schwingungen eine Amplitude, die nur wenigen Prozenten der Amplitude der sekularen Schwingung entspricht. Das ist anders, wenn die Speicherhochfrequenzspannung höher gewählt wird, um härtere Stöße zu erhalten. Liegt die untere Massenschwelle bei der Hälfte der ladungsbezogenen Masse der Elternionen, so haben die eingeprägten Schwingungen bereits Amplituden, die etwa einem Viertel der Amplitude der sekularen Schwingungen entsprechen. Diese Amplituden sind zu berücksichtigen, um die schwingenden Elternionen nicht an die Elektroden der Ionenfalle anstoßen zu lassen.
Die Stoßfragmentierung wird üblicherweise mit einem gerade noch verträglich hohen Druck des Stoßgases vorgenommen, um eine hohe Anzahl von Stößen zu erhalten. Es kann damit selbst in solchen Ionenfallen, die auch als Massenanalysatoren verwendet werden, erreicht werden, dass die Elternionen in jeder Schwingungsperiode bis zu vier Stöße mit dem Stoßgas erleben. Als Stoßgas wird für gewöhnlich Helium verwendet; da damit die Ionenfalle auch ohne Einbußen an Massenauflösungsvermögen als Massenanalysator verwendet werden kann. Der Druck des Heliums liegt dann bei etwa bei einigen Zehnteln eines Pascal. Nimmt man an, dass die mittleren zehn Ionenschwingungen die Bedingungen für harte Stöße erfüllen, so erleben die Elternionen etwa 40 harte Stöße, was für mittelschwere Elternionen im Bereich physikalischer Massen zwischen m = 500 und 1500 Dalton für eine ergodische Fragmentierung ausreicht. Für schwerere Analytionen muss die Anzahl der Stöße oder deren Energie erhöht werden.
Die Energie der Stöße hängt nicht nur von der Schwingungsamplitude, sondern insbesondere auch von der Schwingungsfrequenz ab, da die Geschwindigkeit der Elternionen mit der Frequenz zunimmt. Die sekulare Schwingungsfrequenz der Elternionen kann dadurch erhöht werden, dass die Speicherhochfrequenzspannung erhöht wird. In diesem Fall sind die erzwungenen Schwingungen zu berücksichtigen.
Wird ein andersartiger Massenanalysator verwendet, und dient die Hochfrequenz-Ionenfalle nur als Manipulationszelle für die Ionen, so kann auch das Stoßgas mit höherer Dichte oder ein etwas schwereres Stoßgas verwendet werden, beispielsweise Stickstoff oder Argon. Ein schwereres Stoßgas erhöht den Energieeintrag pro Stoß. Es kann auch in solchen Ionenfallen, die auch als Massenanalysatoren eingesetzt werden, der Druck des Stoßgases während der Fragmentierungsperiode pulsartig erhöht werden. Es ist dann sogar möglich, pulsartig ein Stoßgas mit höherer Molekularmasse einzulassen.
Nachteilig ist bei der Verwendung eines einzigen Schwebungsbauches, dass die maximale Amplitude der Ionenschwingung nur kurz anhält. Es kann aber, wie darstellt, relativ leicht eine längere Periode der Schwingungen mit konstanter Amplitude durch zeitweises Ausschalten der Anregung erreicht werden. Diese Schwingungen erfolgen dann genau in der sekularen Schwingungsfrequenz der Ionen. Die Dauer der Unterbrechung muss ein Vielfaches der Periodendauer der sekularen Frequenz des Ions betragen, wenn die Phasenlage der Abbremsungsspannung zum Zeitpunkt des Wiedereinschaltens mit der Phasenlage der Anregungsspannung zu Zeitpunkt des Ausschaltens übereinstimmt. stellt eine ähnliche nicht-resonante Anregung dar wie in , verwendet aber eine etwa doppelt so hohe Anregungsspannung (14) und auch eine geänderte Frequenz von etwa 90 Kilohertz. Es ergibt sich daraus ein schnelleres Anschwingen zwischen Beginn (10) der Anregung und dem Erreichen der maximalen Amplitude im Schwebungsbauch (11). Ist die Maximalamplitude erreicht, so wird die Anregungsspannung komplett abgeschaltet, also hier zwischen den Zeitpunkten (11) und (12). Es ergibt sich eine Periode konstanter Amplitude, wenn man von der eingeprägten Schwingung einerseits und der leichten Dämpfung durch das Stoßgas andererseits absieht. Auch in dieser ist die Überlagerung der sekularen Ionenschwingungen mit den erzwungenen Schwingungen durch die Speicherhochfrequenzspannung weggelassen. Zum Zeitpunkt (12) beginnt die Ausbremsung der Schwingung durch ein phasenjustiertes Einschalten der Anregungsspannung (15), die zum Zeitpunkt (13) wieder abgeschaltet wird.
Die maximale Zeitdauer der Exposition für harte Stöße wird durch die Isotopie eingeschränkt. Da es in der Regel interessiert, die Fragmentionen aller Isotopenzusammensetzungen zu sehen, ist es notwendig, die Elternionen mit allen Isotopenzusammensetzungen in möglichst gleicher Weise zu behandeln und zu fragmentieren. Aus der Isotopie der Fragmentionen lässt sich beispielsweise der Ladungszustand der Ionen ermitteln. Da die Massen der aus verschiedenen Isotopen zusammengesetzten Ionen jedoch verschieden ist, schwingen diese Ionen auch verschieden schnell und können daher nicht synchron die gleiche sekulare Schwingung beibehalten.
Als Faustregel kann man sagen, dass die Ionen der leichtesten und schwersten Isotopengemische etwa um 0,2 Prozent in ihrer Masse auseinander liegen, so dass zwischen einer mittleren Masse, die als Zielmasse angeregt wird, und den leichtesten beziehungsweise schwersten Ionen der Isotopengruppe jeweils ein Unterschied von etwa 0,1 Prozent besteht. Da die Schwingungsfrequenzen in etwa den Massen umgekehrt proportional sind, liegen auch die Schwingungsfrequenzen der leichtesten bzw. schwersten Ionen um etwa 0,1 Prozent von den mittleren Schwingungsfrequenzen entfernt, das heißt, nach 1000 Schwingungen haben sich die Phasen der leichtesten oder schwersten Ionen um eine volle Periode gegenüber den mittelschweren Ionen verschoben. Experimentell konnte ermittelt werden, dass sich die Schwingungen aber nur um höchstens ein Zehntel einer Periode verschieben dürfen. Das heißt, die Anzahl der Schwingungen während der Expositionsdauer darf nur maximal etwa 100 betragen, gleich, ob resonant oder nicht-resonant angeregt wird. Für Elternionen einer sekularen Frequenz von 100 Kilohertz kann also die Expositionszeit maximal eine Millisekunde betragen, für Elternionen einer Sekularfrequenz von 200 Kilohertz nur eine halbe Millisekunde.
Es lässt sich, wie zeigt, eine ähnliche Schwebungsform der Ionenschwingungen wie in auch mit einer resonanten Anregung und Ausbremsung bilden. Die Anregung und Ausbremsung erfolgt durch zwei genau bemessene Wechselspannungspakete (24) und (25), wobei hier zum Ausbremsen eine um 180° gedrehte Phase angewendet wird. Die Form der Wechselspannungspakete wurde hier als Überlagerung zweier nicht-resonanter Anregungsfrequenzen gebildet, stellt also selbst einen Schwebungsbauch dar. Es ist hier also so, dass die Überlagerung zweier nicht-resonanter Schwingungen die Elternionen resonant anregen. Die Anregung ist resonant, weil die angeregten Ionenschwingungen genau die Frequenz der frei schwingenden Ionen haben, also der sekularen Frequenz, was bei nicht-resonanter Anregung nicht der Fall ist.
Alternativ kann für die Abbremsung auch ein Wechselspannungspaket ohne Phasendrehung verwendet werden. Der Versatz muss dann aber ein halbzahliges (nicht ganzzahliges) Vielfaches der Periodendauer der sekularen Frequenz betragen. Es ist übrigens interessant zu sehen, dass eine gemeinsame Fourier-Analyse der beiden Anregungspakete für Anregung und Ausbremsung nie die sekulare Frequenz der Ionen enthält, wenn die Ionen durch diese Pakete auch wieder vollständig in Ruhestellung gebracht werden. Besonders interessant ist, dass eine resonante Anregung mit einem Anregungspaket geschieht, das die sekulare Frequenz gar nicht enthält, sondern aus zwei (oder mehr) sich überlagernden Frequenzen zusammengesetzt ist, die beide (oder alle) von der sekularen Frequenz verschieden sind.
In den meisten Massenspektrometern ist es so, dass die Pakete der Anregungswechselspannungen einmal als digitale Folge von Zahlenwerten berechnet und dann während der Ausführungszeit Zahlenwert für Zahlenwert an einen Digital-zu-Analog-Wandler (DAC) abgegeben werden.
Mit einer Überlagerung von Anregungsspannungen mit vier verschiedenen nicht-resonanten Frequenzen lässt sich übrigens ein Verlauf der sekularen Schwingungen der Elternionen erzeugen, der etwa den Schwingungsverläufen der oder entspricht, ohne dass bei Erreichendes Schwingungsbauches ein Abschalten erfolgen muss. Diese Schwingungsform hat dann eine festgelegte, unveränderbare Länge.
Es bedarf zur Anregung der Ionenschwingungen aber im Prinzip gar keiner Anregungswechselspannung. Es kann die Schwingung auch mit einfachen Gleichspannungspulsen angeregt werden. gibt diese Anregung und Ausbremsung der sekularen Ionenschwingungen (31) durch zwei Gleichspannungspulse (30) und (32) wieder. Es sind hier allerdings recht hohe Spannungen erforderlich. Der Gleichspannungspuls zum Ausbremsen ist hier gegenpolig ausgeführt; es ist jedoch auch ein Ausbremsen mit einem Ausbremsungspuls möglich, der in Polarität und Form dem Anregungspuls gleich ist, wobei lediglich eine andere Phase gewählt werden muss. Die zeitliche Breite der Anregungspulse beträgt in etwa nur ein Viertel der sekularen Schwingungsperiode. Dieses Verfahren hat den leichten Nachtteil, dass der Ausbremsungspuls alle bis dahin gebildeten Fragmentionen stark anregt und im ungünstigsten Fall bei Verminderung der Speicherhochfrequenzspannung aus der Ionenfalle wirft. Das spielt jedoch keine Rolle, wenn vorzugsweise nur die nach der Ausbremsung durch den ergodischen Zerfall zeitversetzt entstehenden Fragmentionen gesammelt werden sollen.
Der Vorteil aller bisher geschilderten Ausführungsformen liegt insbesondere darin, dass die Schwingungsamplitude genau auf die Form der Ionenfalle ausgerichtet werden kann, so dass die Elternionen bis kurz vor die Elektroden der Ionenfalle schwingen. Das ist bei der klassischen Stoßfragmentierung, bei der ein Gleichgewicht zwischen einer stetig beschleunigenden Anregung und einer stetigen Dämpfung durch das Stoßgas hergestellt wird, nicht möglich. Die Dämpfung ist ein statistischer Vorgang und unterliegt starken Schwankungen, so dass eine hohe Sicherheitsmarge eingehalten werden muss. Mit dieser Erfindung sind extrem weite Schwingungen möglich und durch die damit verbundene kinetische Energie der Elternionen, die mit dem Quadrat der Amplituden anwächst, nimmt die Übertragung von Stoßenergie in das Innere der Elternionen so stark zu, dass die etwa 400 Stöße, die hier maximal möglich sind, weitaus genügen, um den größten Teil der Elternionen ergodisch zerfallen zu lassen.
Die Speicherhochfrequenzspannung sollte so weit herabgesetzt werden, dass eine untere Massenschwelle für die Ionenspeicherung erreicht wird, die die nachzuweisenden leichten Tochterionen zu halten imstande ist. Für den Nachweis aller Immoniumionen sollte die Grenzmasse dann bei etwa 55 Dalton liegen, da die leichteste Aminosäure eine Molekülmasse von 57 Dalton hat.
Die Speicherhochfrequenzspannung lässt sich nicht beliebig schnell umschalten, da für ihre Erzeugung in der Regel ein Lufttransformator verwendet wird, der einen bestimmten Energieinhalt hat. Die Umschaltzeiten liegen in der Größenordnung von etwa 100 Mikrosekunden. Das ist hier nicht nachteilig, da damit eine kleine Zeitspanne für die Dämpfung der restlichen Schwingungen zur Verfügung steht. Es wurde oben bereits ausgeführt, dass sich nicht alle Ionen verschiedener Isotopenzusammensetzungen gleichmäßig ausbremsen lassen, so dass einige Isotopenionen noch restliche Schwingungen ausführen.
Gerade für schwere Elternionen mit einer Molekülmasse von 2000 bis 5000 Dalton kann es notwendig sein, für die Stoßfragmentierung eine unüblich hohe Speicherhochfrequenzspannung zu wählen, um energiereichere Stöße zu erzeugen, als es mit dem üblichen Verfahren möglich ist. Die Speicherhochfrequenzspannung kann dabei durchaus so hoch gewählt werden, dass die untere Massenschwelle für die Ionenspeicherung bei der halben bis zu etwa zwei Dritteln der ladungsbezogenen Masse der Elternionen liegt. Experimentell ergeben sich gute Resultate, wenn die Grenzmasse bei etwa der Hälfte der Masse der Elternionen liegt. Es ist dabei zu berücksichtigen, dass bei hohen Speicherhochfrequenzspannungen die den schwingenden Ionen im Pseudopotentialtopf eingeprägten Zwangsschwingungen durch das Hochfrequenzfeld relativ große Amplituden haben. In einem Speicherhochfrequenzfeld, in dem Elternionen nur wenig oberhalb der Grenzmasse schwingen, sind die Amplituden der eingeprägten Zwangsschwingungen etwa ebenso groß wie die Amplituden der Oszillationen im Pseudopotentialtopf. Die eingeprägten Zwangsschwingungen sind sehr energiereich und helfen bei der Fragmentierung.
Eine weitere Ausführungsform setzt die Elternionen nur diesen Zwangsschwingungen an einem Ort mit hohem Speicherhochfrequenzfeld aus. Der Vorgang ist in dargestellt. Es wird keine Anregungswechselspannung verwendet, sondern es wird einfach an den Ionenfallen-Elektroden eine Gleichspannung (41) angelegt, die bewirkt, dass die Wolke der Elternionen bis nahe an eine der Elektroden heran katapultiert wird. Hier unterliegen sie den erzwungenen Schwingungen (43). Die eingeprägten Zwangsschwingungen (43) führen zu vielen energiereichen Stößen mit dem Stoßgas. Die Gleichspannung wird jetzt auf den Wert (44) erhöht, um die Elternionen dort zu halten. Durch das zeitlich genaue Schalten der beiden Gleichspannungen (41) und (44) wird erreicht, dass die Ionen durch die Auslenkung nicht zu starken Oszillationen um die Sollposition der Auslenkung angeregt werden. So wird selbst bei großen Auslenkungen der Verlust der Ionen an den Elektroden vermieden. Nach einer Expositionszeit wird die Haltespannung auf den Wert (45) erniedrigt, was die Elternionen in das Zentrum der Ionenfalle katapultiert. Sind sie dort angekommen, wird die Gleichspannung vollends abgeschaltet (47). Dieses Verfahren kann auch modifiziert werden. So ist es möglich, an zwei einander gegenüberliegenden Elektroden Potentiale entgegen gesetzter Polarität anzulegen, oder auch nur ein Potential unsymmetrisch zu verwenden.
Da alle Elternionen auch verschiedener Isotopenzusammensetzungen der erzwungenen Schwingung in sehr ähnlicher Weise unterliegen, können die Elternionen diesen Stößen im Prinzip beliebig lange ausgesetzt werden, ohne dass eine Isotopendiskriminierung eintritt. Eine lange Exposition ist aber hier deshalb ungünstig, weil alle Fragmentionen, deren ladungsbezogene Masse schwerer als die der Elternionen ist, durch die Gleichspannung an die Elektroden gedrückt und damit vernichtet werden. Leichtere Fragmentionen werden ebenfalls erzwungenen Schwingungen ausgesetzt, wenn auch nicht so stark; sie können aber weiter fragmentiert werden. Bei der Fragmentierung von mehrfach geladenen Ionen treten immer viele Fragmentionen auf, deren ladungsbezogene Masse schwerer ist als die der Elternionen. Das Herunterschalten der Gleichspannung soll die Phase der eingeprägten Zwangsschwingungen der Elternionen berücksichtigen, da deren Amplituden und kinetischen Energien nicht mehr zu vernachlässigen sind.
Die Stoßfragmentierungen nach dieser Erfindung haben auch den überraschenden Vorteil, dass die Fragmentation bei mäßig hohen Speicherhochfrequenzspannungen vorgenommen werden kann, wenn die Masse der Elternionen nicht sehr hoch ist. Es sind durchaus sehr gute Fragmentierungen mit einer Einstellung möglich, bei der die untere Massenschwelle bei einem Sechstel der ladungsbezogenen Masse der Elternionen liegt. zeigt ein Fragmentionenspektrum von Glu-Fib, das unter diesen Bedingungen aufgenommen wurde. Glu-Fib hat eine Molekülmasse von m = 1569,7 Dalton; es wird hier doppelt geladen fragmentiert. Es werden damit bereits zur Expositionszeit sehr viele Fragmentionen gesammelt, und nur die sehr leichten Fragmentionen, beispielsweise die Immoniumionen, kommen nach dem Herabsetzen der Speicherhochfrequenzspannung hinzu.
Es ist die Frage, wann eigentlich die Immoniumionen entstehen. Da sie in der Regel interne Fragmentionen sind, also aus ergodischen Zweitzerfällen stammen, ist vermutlich ihre Zerfallszeit recht lang, und sie sind gut auch noch nach Ablauf einer Millisekunde aufzufangen.
Sehr schwere Analytionen, beispielsweise mit Molekülmassen zwischen 2000 und 5000 Dalton, sind meist hoch geladen. Wenn sie in Elektrosprüh-Ionenquellen ionisiert wurden, haben sie 4 bis 10 Protonen. Die ladungsbezogenen Massen liegen zwischen 500 und 1200 Dalton. Die Fragmentionenspektren dieser hoch geladenen Analytionen sind außerordentlich kompliziert und lassen sich kaum auswerten. Es ist daher zweckmäßig, sie vor einer Fragmentierung zunächst teilweise zu deprotonieren.
Die Deprotonierung wird durch Reaktionen der hoch geladenen Analytionen mit geeigneten Reaktant-Anionen vorgenommen. Die Reaktant-Anionen sind in der Regel nicht-radikale Anionen, wobei sehr viele verschiedene Substanzklassen für eine Bildung dieser Reaktant-Anionen infrage kommen. Eine Deprotonierungs-Reaktion besteht in einem Protonentransfer von einem hoch geladenen Analytion zu einem Reaktant-Anion, wobei letzteres neutralisiert wird, ohne dabei ein Radikal zu bilden. Die Deprotonierungs-Reaktionen haben Wirkungsquerschnitte, die dem Quadrat der Ladungsstufe der hoch geladenen Analytionen proportional sind; die Reaktionen laufen für hoch geladene Analytionen außerordentlich schnell ab.
Die Deprotonierung kann bei einer vorgewählten Ladungsstufe angehalten werden. Das Anhalten der Deprotonierung in der Hochfrequenz-Ionenfalle besteht darin, die Analytionen, die durch fortgesetzte Deprotonierung bei dieser Ladungsstufe angekommen sind, durch eine Dipolwechselspannung resonant schwach anzuregen. Die Anregung darf nicht so stark sein, dass die Analytionen aus der Ionenfalle ausgeworfen werden. Es ist ein Gleichgewicht zwischen der Anregung durch die Dipolwechselspannung und der Dämpfung durch das Stoßgas herzustellen. Diese Art der schwachen Anregung ist für Ionenfallen bekannt (beispielsweise für Stoßfragmentierungen) und kann durch die Software-Steuerung jeder kommerziell vertriebenen Ionenfalle durchgeführt werden. Durch die Bewegung der Analytionen bei ihrer sekularen Schwingung entziehen sie sich weiteren Deprotonierungs-Reaktionen, da diese nur bei niedrigen Relativgeschwindigkeiten stattfinden.
Durch dieses Verfahren können also alle Analytionen höherer Ladungsstufen bis zur gewünschten Ladungsstufe deprotoniert werden. Dadurch wir erreicht, dass die Massenspektren der Fragmentionen sehr viel einfacher zu interpretieren sind.
Häufig sind die Fragmentierungen an Analytionen durchzuführen, die der massenspektrometrischen Untersuchung nur kurzzeitig zur Verfügung stehen, beispielsweise, wenn sie aus einem vorgeschalteten Separationsverfahren stammen, also aus einem Flüssig-Chromatographen oder einer Kapillarelektrophorese-Einrichtung. Dann werden in der Regel automatisch ablaufende Analyseverfahren eingesetzt, die auch eine automatische Fragmentierung der Analytionen einschließen. Die automatisch ablaufenden Analyseverfahren nehmen zunächst ganz gewöhnliche Massenspektren auf, aus denen dann automatisch bestimmt wird, welche Analytionen für die Aufnahme von Fragmentionenspektren einer Fragmentierung unterworfen werden sollen.
In diesen automatisch ablaufenden Analysenverfahren kann nun die Art der Stoßfragmentierung automatisch durch Masse, Ladungszustand und Häufigkeit der jeweils zu untersuchenden Analytionen bestimmt werden. Es kann also automatisch je nach Masse, Ladungszustand und Häufigkeit entweder die klassische Stoßfragmentierung durch Anregungs-Dämpfungs Gleichgewicht, die Stoßfragmentierung durch kurzzeitige Anregung mit Dämpfung und Rücksteuerung der Speicherhochfrequenzspannung, die nicht-resonante Anregung/Ausbremsung, die resonante Anregung/Ausbremsung oder die pulsförmige Anregung/Ausbremsung, die letzteren drei jeweils mit oder ohne schlagartige Herabsetzung der Speicherhochfrequenzspannung, ausgeführt werden. Außerdem kann je nach Masse und Ladungszustand bestimmt werden, ob der Stoßfragmentierung eine Deprotonierung vorhergehen soll.
Eine günstige Ausführungsform eines Ionenfallenmassenspektrometers für die Ausführung von Verfahren zur Erfindung ist in schematisch wiedergegeben. Es wird hier eine Elektrosprüh-Ionenquelle (61) mit einer Sprühkapillare (62) außerhalb des Massenspektrometers zur Ionisierung der Analytmoleküle verwendet. Die Analytmoleküle befinden sich dazu in einer wässerigen Lösung, der zur Erleichterung des Sprühens organische Lösungsmittel wie Methanol oder Acetonitril beigemischt sind. Die durch das Elektrosprühen erzeugten teilweise hoch geladenen Analytionen werden in üblicher Weise durch eine Einlasskapillare (63) und einen Gas-Abstreifer (64) in das Ionenleitsystem (65) geführt, wobei das mitgeführte Umgebungsgas weitgehend abgesaugt wird. Mit Hilfe der Ionenleitsysteme (65) und (69) werden die geladenen Analytionen durch die Druckstufen (75), (76), (77) zur 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden (71) und (73) und Ringelektrode (72) geführt und dort in üblicher Weise eingefangen. Die Ionenleitsysteme (65) und (69) bestehen aus parallelen Stabpaaren, an denen alternierend die Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen. Sie sind üblicherweise als Hexapol- oder als Oktopol-Stabsystem ausgeführt.
Ein erstes Massenspektrum, das durch resonante Anregung der Ionen mit massenselektivem Auswurf mit Messung im Ionendetektor (74) gewonnen wird, gibt eine Übersicht über die verschiedenen Ladungsstufen, in denen die Analytionen vorliegen. Nach einer Wiederholung der Füllung der Ionenfalle kann jetzt die Ionensorte einer ausgewählten Ladungsstufe mit üblichen Mitteln isoliert werden; diese Ionen bilden dann die Elternionen für die Fragmentierung. Dazu überfüllt man zunächst die Ionenfalle, damit später genügend Ionen für eine gute Spektrenaufnahme übrig bleiben, und wirft dann alle Ionen aus der Ionenfalle aus, die nicht den ausgewählten Elternionen entsprechen.
Die Analytionen werden durch eine kurze Wartezeit von einigen Millisekunden durch das vorhandene Stoßgas in das Zentrum der Falle hinein gedämpft. Sie bilden dort eine kleine Wolke von etwa einem Millimeter Durchmesser. Sodann werden die Elternionen fragmentiert, wobei eines der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann. Zusätzlich kann beispielsweise auch eine Fragmentierung durch Elektronentransfer-Dissoziation vorgenommen werden, wobei die dazu benötigten radikalen Anionen in der Ionenquelle (68) erzeugt werden können. Es können aber auch noch andere Arten von Fragmentierungen angewendet werden.
Sind die Analytionen hoch geladen, so können sie vor ihrer Fragmentierung durch Zugabe von nicht-radikalen negativen Ionen teilweise deprotoniert werden. Die nicht-radikalen Anionen für die Deprotonierung können in der Ionenquelle (68) erzeugt werden. Sie können aber auch in der Elektrosprüh-Ionenquelle (61) erzeugt werden, meist unter Verwendung einer zweiten Sprühkapillare (62). Dabei können die nicht-radikalischen Anionen durch eine Corona-Entladung in Eingangsbereich der Einlasskapillare (63) erzeugt werden.
Die negativen Ionen aus der Ionenquelle (68) für negative chemische Ionisierung können über ein kleines Ionenleitsystem (67) zu einer Ionenweiche geführt werden, wo sie in das Ionenleitsystem (69) zur Ionenfalle (71, 72, 73) eingefädelt werden. Die Ionenweiche besteht in der hier gezeigten Ausführung einfach aus einer Lochblende (66) und aus einer Verkürzung zweier Stäbe des stabförmigen Ionenleitsystems (69). Besonders günstig für diese sehr einfache Art einer Ionenweiche ist es, wenn das Ionenleitsystem als Oktopolsystem ausgeführt ist.
In ist schließlich eine lineare Ionenfalle gezeigt, die statt einer 3D-Ionenfalle verwendet werden kann. Die Wechselspannung zur Anregung der Elternionen zur Fragmentierung kann dabei an zwei einander gegenüberliegende Polstäbe angeschlossen werden, beispielsweise an die Polstäbe (81) und (83). Sie kann dabei die dortige Speicherhochfrequenzspannung überlagern; es ist aber auch möglich, die Speicherhochfrequenzspannung nur an zwei Polstäbe zu legen. Die lineare Ionenfalle ist durch Lochblenden (85) abgeschlossen, durch die Ionen (88) eingebracht werden können. Die lineare Ionenfalle kann auch als Massenanalysator verwendet werden, indem die Ionen durch resonante Anregung durch einen Schlitz (87) im Polstab (81) zu einem nicht gezeigten Ionendetektor bin ausgeworfen werden.
Durch zwei Wechselspannungen, die um 90° in ihrer Phase verschoben und kreuzweise an die vier Polstäbe der linearen Ionenfalle angelegt sind, kann statt der linearen Schwingung eine zirkulare Schwingung angeregt werden. Diese Anregungsform hat den besonderen Vorteil, dass die Wechselwirkung der angeregten Ionen mit nicht-angeregten Ionen, die im Zentrum der Ionenfalle verbleiben, minimiert wird. Dies verbessert die Selektivität der Anregung. Besonders effizient ist dieses Anregungsverfahren anzuwenden um die oben beschriebene Deprotonierung bei einem bestimmten Ladungszustand anzuhalten.
Die zur Anregung verwendeten Wechselspannungen können in linearen Ionenfallen auch an Hilfselektroden angelegt werden, die in den Zwischenräumen zwischen den Polstäben angeordnet sind.
Die Implementierung mindestens einiger der Fragmentierungsverfahren nach dieser Erfindung kann der Fachmann leicht vornehmen. Für kommerzielle Ionenfallen-Massenspektrometer ist in der Regel nur eine andere Steuerung vorzunehmen, es sind in der Regel alle notwendigen Spannungsgeneratoren vorhanden, wobei allerdings für manche der vorgeschlagenen Verfahren die Höhe der zur Verfügung stehenden Spannungen nicht ausreichen mag. Die andersartige Steuerung kann durch Eingriffe in die Software vorgenommen werden. In einigen kommerziellen Ionenfallen-Massenspektrometern ist es nach Stand der Software sogar den Benutzern möglich, diese Änderungen der Steuerungsverfahren vorzunehmen.

Claims

Verfahren zur Stoßfragmentierung von Analytionen in einer mit Stoßgas befüllten Hochfrequenz-Ionenfalle mit den Schritten (a) Setzen der Speicherhochfrequenzspannung auf einen mäßig hohen bis hohen Wert, (b) Anregen von Schwingungsbewegungen der Analytionen durch ein elektrisches Feld (4; 14; 24; 30), wodurch harte Stöße mit dem Stoßgas erzeugt werden, und (c) Ausbremsen der Schwingungsbewegungen durch ein entgegen gerichtetes elektrisches Feld (5; 15; 25; 32), um die stoßangeregten Analytionen wieder im Zentrum der Ionenfalle zu versammeln.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (c) die Speicherhochfrequenzspannung herabgesetzt wird, so dass eine Speicherung auch leichter Fragmentionen aus den nachfolgenden ergodischen Zerfällen der stoßangeregten Analytionen möglich wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregen und Ausbremsen der Schwingungsbewegungen in den Schritten (b) und (c) durch nicht-resonante Anregungswechselfelder (4, 5; 14, 15) vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregen und Ausbremsen der Schwingungsbewegungen in den Schritten (b) und (c) durch resonante Anregungswechselfelder (24, 25) vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Schritten (b) des Anregens und (c) des Ausbremsens das Anregungswechselfeld für eine vorgewählte Expositionszeit (11–12; 21–22) ausgeschaltet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregen und Ausbremsen der Schwingungsbewegungen in den Schritten (b) und (c) durch das Feld je eines Gleichspannungspulses (30, 32) vorgenommen wird, wobei zwischen den beiden Pulsen eine vorgewählte Expositionszeit liegt.
Verfahren zur Stoßfragmentierung von Analytionen in einer mit Stoßgas befüllten Hochfrequenz-Ionenfalle mit den Schritten (a) Setzen der Speicherhochfrequenzspannung auf einen mäßig hohen bis hohen Wert, (b) Anregen von Schwingungsbewegungen der Analytionen zur Erzeugung energiereicher Stöße mit dem Stoßgas durch Anlegen einer elektrischen Gleichspannung mit einem ersten Wert (41), so dass die Analytionen bis nahe an eine der Elektroden (71, 72, 73) der Hochfrequenz-Ionenfalle herankatapultiert werden, (c) Erhöhen der elektrischen Gleichspannung auf einen zweiten Wert (44), um die Analytionen dort zu halten, (d) Ausbremsen der Schwingungsbewegungen durch Erniedrigen der elektrischen Gleichspannung von dem zweiten Wert (44) auf einen dritten Wert (45), was die Analytionen in das Zentrum der Ionenfalle katapultiert, und (e) Abschalten (47) der elektrischen Gleichspannung, wenn die Analytionen am Zentrum der Ionenfalle angekommen sind.
Verfahren zur Stoßfragmentierung von Analytionen in einer mit Stoßgas befüllten Hochfrequenz-Ionenfalle, bei dem hoch geladene und teilweise deprotonierte Analytionen bereitgestellt und einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 unterzogen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass für die Stoßfragmentierung der Druck des Stoßgases während der Fragmentierungsperiode pulsartig erhöht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Stoßfragmentierung die restlichen unzerfallenen Analytionen durch resonante Anregung aus der Ionenfalle mindestens teilweise entfernt werden.