DE102015117635B4

DE102015117635B4 - Strukturaufklärung von intakten schweren Molekülen und Molekülkomplexen in Massenspektrometern

Info

Publication number: DE102015117635B4
Application number: DE102015117635.1A
Authority: DE
Inventors: Ralf Hartmer
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2018-01-11
Anticipated expiration: 2035-10-17
Also published as: US10504708B2; CN107037118B; DE102015117635A1; GB2543414A; CN107037118A; US20170110302A1; GB2543414B; GB201616028D0

Abstract

Verfahren zur Strukturaufklärung schwerer Molekül-Ionen und Molekülkomplex-Ionen mit ladungsbezogenen Massen m/z von über 2000 Dalton in einer linearen Hochfrequenz-Multipol-Stoßzelle (7), bei dem die Ionen auf eine vorbestimmte kinetische Energie zwischen 100 und 300 Elektronenvolt pro überzähliger Ladung beschleunigt und axial in die lineare Stoßzelle (7) eingeschossen werden, und bei dem etwaig verbleibende Molekül(komplex)-Ionen sowie die entstandenen Fragment-Ionen aus der linearen Stoßzelle (7) heraus zu einem Massenanalysator (12–16) geführt werden, wobei eine Stoßfragmentierung in der linearen Stoßzelle (7) in einem Gemisch aus einem leichten und einem schweren Stoßgas durchgeführt wird und ein schweres Stoßgas eine Molekülmasse von mindestens 80 Dalton, ein leichtes Stoßgas eine Molekülmasse von höchstens 40 Dalton besitzt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die massenspektrometrische Untersuchung schwerer Moleküle, insbesondere schwerer Molekülkomplexe, zum Teil in ihrer natürlichen Struktur, durch Stoßfragmentierung in linearen Hochfrequenz(HF)-Multipol-Stoßzellen, insbesondere Quadrupol-Stoßzellen.
Anmerkung: In dieser Schrift wird statt der gesetzlichen „vereinheitlichten atomaren Masseneinheit“ (u) die Einheit „Dalton“ (Da) verwendet, die in der letzten (achten) Ausgabe 2006 der Schrift „The International System of Units (SI)“ des „Bureau International des Poids et Mesures“ der atomaren Masseneinheit gleichwertig beigestellt wurde; vor allem, wie dort angemerkt, um die Einheiten Kilodalton, Millidalton und ähnliche verwenden zu können.
In Massenspektrometern kann in der Regel nur das Verhältnis aus der Ionenmasse zur Ladung des Ions bestimmt werden. Wenn im Folgenden von der „Masse eines Ions“ oder der „Ionenmasse“ gesprochen wird, kann auch das Verhältnis von Masse m zur Anzahl z der überzähligen positiven oder negativen Elementarladungen des Ions gemeint sein, also die elementarladungsbezogene (kurz: ladungsbezogene) Masse m/z.
Unter einem „Fragmentionen-Massenspektrum“ oder „Tochterionen-Massenspektrum“ wird in der Regel ein Massenspektrum der Fragmentionen einer ausgewählten Ionenart verstanden, wobei die für die Fragmentierung ausgewählte Ionenart meist als „Eltern-Ion“ bezeichnet wird.
Stand der Technik
Massenspektrometrie von intakten Molekülkomplexen hat sich als ein mächtiges Werkzeug für die Untersuchung der Stöchiometrie, des Zusammenhangs von Struktur und Funktion und anderer Eigenschaften dieser Molekülkomplexe erwiesen. Die präzise Masse der Elternmolekül-Ionen und der Fragment-Ionen kann für die Qualitätskontrolle produzierter Molekülkomplexe eingesetzt werden. Die Molekülkomplexe können beispielsweise monoklonale Antikörper (insbesondere mit Wirkstoff-Antikörperkonjugat, Englisch: antibody drug conjugate ADC), natürlich vorkommende lösliche Membranproteine oder andere nicht kovalent gebundene Proteinkomplexe sein.
Die intakten Molekülkomplexe werden oft als „native“ Molekülkomplexe bezeichnet; sie besitzen die Form, die sie in ihrer natürlichen Umgebung haben. Die Ionisierung der intakten Molekülkomplexe findet in der Regel in Elektrosprüh-Ionenquellen statt, meist in sogenannten Nanosprüh-Ionenquellen. Die Molekülkomplexe werden in wässriger Lösung zugeführt, ohne die Zugabe von organischen Lösungsmitteln, die eine unerwünschte Denaturierung bewirken würden, zum Beispiel die Entfaltung eines gefalteten Molekülkomplexes. Da die intakten Molekülkomplexe dicht gepackt sind, sind nur die äußeren Oberflächen einer Protonierung im Plasma des Elektrosprühens zugänglich; die Anzahl der überzähligen Protonen dieser Ionen ist daher ungewöhnlich gering, und die ladungsbezogene Masse m/z ist außergewöhnlich hoch, sie liegt bei vielen Kilodalton.
Einen guten Einblick in die Schwierigkeiten derartiger Untersuchungen gibt die Arbeit von A. Laganowsky et al. „Mass spectrometry of intact membrane protein complexes“, Nature Protocols, Vol. 8, No. 4, 2013, 641. Hier wird ein Flugzeit-Massenspektrometer mit orthogonalem Einschuss der Ionen verwendet, das in üblicher Weise mit einem Quadrupol-Massenfilter und einer linearen Stoßzelle versehen ist. Die Ionisierung findet durch sogenanntes Nanosprühen statt, wobei eine wässrige Lösung verwendet wird, die Detergentien enthält, jedoch keine organischen Lösungsmittel. Zum Abstreifen der Detergentien-Mizellen (Assoziationskolloide) wird in der Stoßzelle ein einzelnes schweres Gas, Argon oder Schwefelhexafluorid (SF₆), verwendet, dessen Druckeinstellung jedoch außerordentlich kritisch ist. Mit niedrigen Drucken wird keine zufriedenstellende Entfernung der Mizellen erreicht, bei höheren Drucken wird die Transmission der oligomeren Komplexe stark herabgesetzt, vermutlich, weil das schwere Stoßgas keine thermische Kühlung der Komplex-Ionen bewirkt. Die thermische Kühlung ist aber notwendig, um die Ionen nahe der Achse der linearen Stoßzelle zu versammeln und aus der Stoßzelle durch in der Regel enge Blenden herauszuführen.
Noch schwieriger ist die Fragmentierung dieser schweren intakten Molekülkomplex-Ionen. Mit normal-leichtem Stoßgas wie beispielsweise molekularem Stickstoff N₂ wird keine oder nur unzureichende Fragmentierung erreicht; mit schwerem Stoßgas wie SF₆ wird hingegen keine oder kaum thermische Kühlung und folglich keine oder nur unzureichende Versammlung der Molekülund Fragment-Ionen in der Achse der Stoßzelle erreicht. In der Publikation von X. Ma et al. (“Surface Induced Dissociation Yields Quaternary Substructure of Refractory Noncovalent Phosphorylase B and Glutamate Dehydrogenase Complexes“, J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2014) 25: 368–379) wird daher auf eine Dissoziation an Oberflächen ausgewichen, was aber mit normalen kommerziellen Massenspektrometern nicht ohne komplizierten Umbau möglich ist.
Die internationale Anmeldung WO 2015/025008 A1 beschreibt ein Massenspektrometer zur Durchführung einer Analyse von Probenionen, aufweisend ein erstes Ionenoptikelement, das mit einem ersten Gas versorgt wird, einen Massenanalysator, dessen Leistung von dem Druck des ersten Gases in dem ersten Ionenoptikelement abhängig ist, und eine Steuerung zum Einstellen einer Eigenschaft des ersten Gases, die zumindest den Druck umfasst, in Abhängigkeit einer Charakteristik der durch das Massenspektrometer durchzuführenden Analyse.
Die japanische Patentanmeldung JP 2006-092980 A offenbart ein Massenspektrometer für die Proteinanalyse sowie Strukturanalyse synthetischer Makromoleküle, das eine Einheit zur Steuerung eines Massenflussmeters zwecks zeitabhängiger Anpassung des Mischungsverhältnisses von Helium- und Xenon-Gas in einer Stoßzelle umfasst.
Die internationale Anmeldung WO 2009/094762 A1 erläutert ein Verfahren zur Fragmentierung von in einer Ionenfalle gespeicherten Ionen. Es sollen ein nicht-stationärer Druck eines neutralen Kollisionsgases von weniger als etwa 7 × 10^–2 Pascal und eine Anregungsamplitude von weniger als etwa 500 Millivolt (Spitze-zu-Masse) verwendet werden, um Ionen mit mehr als etwa 80% Fragmentierungseffizienz zu fragmentieren. Die Dauer der Ionenanregung soll länger als etwa 25 Millisekunden sein.
Die Patentanmeldung US 2006/0024720 A1 präsentiert Verfahren und eine Vorrichtung zur multiplexierten Datenerfassung bei Gasphasen-Ionenmobilitäts-Analysen verbunden mit Massenspektrometrie. Ionenpakete werden in eine Ionenmobilitätsdriftkammer mit einer Geschwindigkeit eingeführt, die schneller als die Ankunftszeitverteilung der Ionenmobilitätstrennung ist. Die so erzeugten gefalteten Ankunftszeitverteilungen werden durch Messung in einem Massenspektrometer und entsprechende Nachverarbeitungsalgorithmen entfaltet.
Es besteht angesichts der vorhergehenden Ausführungen ein Bedarf, Verfahren zur Strukturaufklärung von schweren Molekül-Ionen und Molekülkomplex-Ionen so zu modifizieren, dass eine effiziente Fragmentierung sowie gleichzeitig eine effiziente Durchleitung der Ionen und Fragmente durch das Massenspektrometer möglich werden.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf die massenspektrometrische Untersuchung der Ionen schwerer Moleküle, insbesondere schwerer Molekülkomplexe, mit ladungsbezogenen Massen m/z von über 2000 Dalton, bevorzugt über 3000 Dalton, wobei das Molekulargewicht zum Teil weit über 100000 Dalton liegen kann, durch Stoßbehandlung in linearen Hochfrequenz-Multipol-Stoßzellen. Die schweren Moleküle und Molekülkomplexe sollen auch in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden können.
Molekülkomplexe im Rahmen dieser Offenbarung können beispielsweise monoklonale Antikörper (insbesondere Wirkstoff-Antikörperkonjugate, ADC), natürlich vorkommende lösliche Membranproteine oder andere nicht kovalent gebundene Proteinkomplexe sein.
In der Erfindung wird vorgeschlagen, in linearen Stoßzellen, die die Ionen in HF-Multipol-Feldern führen, mit einem Gemisch aus mindestens einem leichten und mindestens einem schweren inerten Stoßgas zu arbeiten. Von den Multipol-Feldern sind Quadrupol-Felder bevorzugt, weil sie die beste axiale Fokussierung der Ionen in die Achse gewährleisten. Das schwere inerte Stoßgas besitzt eine Molekülmasse von mindestens 80 Dalton, das leichte inerte Stoßgas eine Molekülmasse von höchstens 40 Dalton. Molekülkomplexe sind in der Regel aus mehreren Teilmolekülen zusammengesetzt, die durch Wasserstoff- oder Disulfidbrücken zusammengehalten werden. Das schwere Stoßgas führt zu impuls- und energiereichen Stößen, die in erwünschter Weise zur Abspaltung dieser nicht kovalent gebundenen Teile der Molekülkomplex-Ionen führen. Die Molekülkomplex-Ionen werden dazu mit kinetischen Energien von einigen Hundert Elektronenvolt pro überzähliger Ladung axial in die Stoßzelle eingeschossen; durch die Stöße mit den schweren Stoßgasmolekülen werden sie aus der Achse abgelenkt und im fokussierenden HF-Feld zu starken Oszillationen in radialer Richtung angeregt. Um diese Oszillationen zu dämpfen, ist ein leichtes Stoßgas vorgesehen, das zusätzlich in die Stoßzelle eingeführt wird.
Mit höheren Einschussenergien können auch die bereits abgespaltenen Molekülteile weiter fragmentiert werden.
Als schwere Stoßgase können beispielsweise die chemisch inerten Gase Xenon (Xe, ≈ 131 Da, mono-atomar), Krypton (Kr, ≈ 83 Da, mono-atomar), Schwefelhexafluorid (SF₆, ≈ 146 Da, molekular), Uranhexafluorid (UF₆, ≈ 352 Da, molekular) oder perfluorierte Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Perfluorbutan (C₄F₁₀, ≈ 238 Da, molekular), verwendet werden; als leichtes Stoßgas bietet sich insbesondere inerter Stickstoff (N₂, ≈ 28 Da, bi-atomar) an, der besonders gute Dämpfungseigenschaften bietet; es können jedoch auch andere leichte Gase verwendet werden wie beispielsweise die Edelgase Helium (He, ≈ 4 Da, mono-atomar), Neon (Ne, ≈ 20 Da, mono-atomar) oder Argon (Ar, ≈ 40 Da, mono-atomar).
Es kann für bestimmte Anwendungen vorgesehen werden, dem Gemisch aus leichtem und schwerem Stoßgas noch weitere Gaskomponenten zuzufügen, beispielsweise weitere Gase, die unter die Definition eines leichten oder schweren Stoßgases fallen, oder ggfs. auch noch andere davon abweichende Gase.
Die Arbeit von D. J. Douglas, „Applications of Collision Dynamics in Quadrupole Mass Spectrometry“ J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998, 9, 101–113 bietet einen guten Überblick über die Grundlagen von Stoßprozessen in Quadrupol-Ionenspeicherzellen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
zeigt schematisch vereinfacht ein Flugzeit-Massenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF), wie es grundsätzlich im Stand der Technik bekannt ist.
zeigt oben das Massenspektrum des intakten Antikörpers Adalimumab (m = 148080 Da), der wegen seiner kompakten Faltung im Elektrosprühen nur wenige (etwa 21–27) Protonen an seiner Oberfläche binden kann und dessen Ionen daher eine außergewöhnlich hohe ladungsbezogene Masse m/z von etwa sechs Kilodalton haben. Im unteren Teil der Abbildung sind die 24-fach geladenen Ionen isoliert.
gibt die Massenspektren der Fragment-Ionen des 24-fach geladenen Ions von Adalimumab wieder, die mit verschiedenen Beschleunigungsspannungen und einem Stoßgasgemisch aus Stickstoff und Schwefelhexafluorid gewonnen werden. Die kinetischen Energien beim axialen Einschuss in die lineare Stoßzelle ergeben sich zu 2592 Elektronenvolt bei 108 Volt Beschleunigungsspannung bzw. 4512 Elektronenvolt bei 188 V Beschleunigungsspannung.
stellt einen Ausschnitt aus den Massenspektren der Fragment-Ionen des Adalimumab vergrößert dar.
bis geben das Massenspektrum der Fragment-Ionen, das mit einer Beschleunigungsspannung von 208 Volt erzeugt wurde, wieder. ist ein Übersichtsspektrum, wohingegen die und Ausschnitte daraus mit zugeordneten Massenund Ladungszahlen darstellen (teil-annotierte Spektren). Die kinetische Energie beim axialen Einschuss in die lineare Stoßzelle ergibt sich zu 4992 Elektronenvolt bei 208 Volt Beschleunigungsspannung.
zeigt ein durch reinen Stickstoff stoßfragmentiertes Tochterionenspektrum der einfach geladenen Ionen eines Phosphazenheterodimers der monoistopischen Elternmasse m/z = 5159,8215 Da mit der Summenformel [(C₄₈H₁₈F₈₄N₃O₆P₃)(C₅₄H₁₈F₉₆N₃O₆P₃)(NH₄)]^–. Das Dimer ist über ein Ammonium nicht kovalent verbrückt. Der Einschuss der Ionen in die Stoßzelle erfolgte mit einer Beschleunigung von etwa 200 V. Es werden hier ausschließlich die beiden Phosphazen-Monomere gebildet; sie sind durch einen Kreis bzw. eine Raute gekennzeichnet.
gibt das stoßinduzierte Tochterionenspektrum des Phosphazenheterodimers wieder, das schon in gezeigt wurde, jedoch wurde hier die Stoßzelle mit einem Stoßgasgemisch bestehend aus Stickstoff und Schwefelhexafluorid befüllt. Die Ionen wurden mit einer Beschleunigung von etwa 200 Volt in die Quadrupol-Stoßzelle eingeschossen. Die primär gebildeten Phospazen-Monomere sind durch eine Raute (C₄₈H₁₈F₈₄N₃O₆P₃)⁺ bzw. einen Kreis (C₅₄H₁₈F₉₆N₃O₆P₃)^– gekennzeichnet. Fragmentierungsprodukte der jeweiligen Phosphazen-Monomere sind durch ein Dreieck für das Monomer (C₄₈H₁₈F₈₄N₃O₆P₃) bzw. durch einen Stern für das Monomer (C₅₄H₁₈F₉₆N₃O₆P₃) gekennzeichnet.
zeigt Strukturvorschläge für die Fragmente, die aus den stoßinduzierten Anregungen des Phosphazenheterodimers entstehen.
Bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfindung bezieht sich auf die massenspektrometrische Untersuchung der Ionen schwerer Moleküle, insbesondere schwerer Molekülkomplexe, mit ladungsbezogenen Massen m/z von über 2000 Dalton, ausgehend von Molekulargewichten von zum Teil weit über 100000 Dalton, vorzugsweise in ihrer natürlichen Struktur durch Stoßbehandlung in linearen Hochfrequenz-Multipol-Stoßzellen, die bevorzugt aus einer Anzahl parallel angeordneter Polstäbe bestehen, zum Beispiel vier Polstäbe für einen Quadrupol. Die zu untersuchenden Ionen werden mit kinetischen Energien bis zu einigen Hundert Elektronenvolt pro überzähliger Ladung, nämlich 100 bis 300 Elektronenvolt multipliziert mit der Zahl der überzähligen Ladungen, axial in diese Stoßzellen eingeschossen. Die Stoßbehandlung kann sich auf das Abstreifen von leichten Teilchen (Mizellen, Wasserkomplexe) beziehen, die in der Regel durch Wasserstoff-Brückenbindung anheften, oder auf die Aufspaltung der Molekülkomplexe in die Teilmoleküle, oder auch auf die Fragmentierung von Teilmolekülen.
Eine lineare Stoßzelle ist für gewöhnlich durch eine Anordnung aus einer Vielzahl länglicher, parallel zueinander, um eine gemeinsame Achse angeordneter Elektroden (häufig Stäbe genannt) gekennzeichnet. Die Elektroden können einen kreisrunden Querschnitt haben. Häufig werden jedoch auch Stäbe mit einem nach innen weisenden hyperbolischen Profil verwendet, um möglichst reine Multipol-Felder zu erzeugen. Es gibt jedoch vielfältige weitere Varianten, wie zum Beispiel flache Elektroden, die in paarweiser Gegenüberstellung eine polygonale lichte Weite durch die Stoßzelle bilden (beispielsweise mit quadratischem Querschnitt bei einer Vier-Elektrodenanordnung). Ferner sind, während kreisrunde oder hyperbolische Elektroden als konvexe Ausformungen bezeichnet werden können, auch schon konkave Ausgestaltungen bekannt geworden, bei denen sich die achsennahe Seite der Elektroden konkav nach radial auswärts wölbt. Die Linearität oder Zweidimensionalität (2D) der Stoßzelle bezeichnet insbesondere den Umstand, dass die Elektroden eine axiale Erstreckung oder Länge haben, die ein Vielfaches des Dimensionsparameters oder Durchmessers der lichten Weite im Inneren ist.
In der Erfindung wird vorgeschlagen, in üblichen linearen Stoßzellen, die die Ionen mit Hochfrequenz-Multipol-Feldern festhalten, mit einem Gemisch aus mindestens einem leichten und mindestens einem schweren Stoßgas zu arbeiten. Das schwere Stoßgas besitzt eine Molekülmasse von mindestens 80 Dalton, das leichte Stoßgas eine Molekülmasse von höchstens 40 Dalton. Die Stoßgase sollten Partialdrucke zwischen 0,01 und 10 Pascal haben, ein bevorzugter Bereich liegt bei etwa 1 bis 2 Pascal pro Gas. Die Gase können gleiche Partialdrucke besitzen; es scheint jedoch vielfach günstig zu sein, wenn der Partialdruck des leichten Stoßgases etwas geringer ist als der des schweren Stoßgases. Das schwere Stoßgas kann beispielsweise 75% der Gasmischung ausmachen, wohingegen das leichte Stoßgas die restlichen 25% aufbringt.
Es gibt allerdings auch Fälle, bei denen es günstig ist, wenn der Partialdruck des schweren Stoßgases etwas geringer ist als der des leichten Stoßgases. Diese Anwendung verspricht Nutzen vor allem dann, wenn relativ schwach gebundene Molekülkomplexe, wie beispielsweise die Molekülkomplexe von Wirkstoff-Antikörper-Konjugaten untersucht werden. In bevorzugten Ausführungsformen hat das schwere Stoßgas einen Anteil von mehr als 20%, insbesondere mehr als 35%, speziell mehr als 60% des gesamten Stoßgases in der linearen Stoßzelle. Das leichte Stoßgas würde dann mit komplementären Anteilen von jeweils 80%, 65% bzw. 40% zugegeben.
Molekülkomplexe sind in der Regel aus mehreren Molekülteilen zusammengesetzt, die durch Wasserstoff- oder Disulfidbrücken zusammengehalten werden. Das schwere Stoßgas führt zu impuls- und energiereichen Stößen, die in erwünschter Weise zur Abspaltung dieser nicht kovalent gebundenen Teile der Molekülkomplex-Ionen führen. Die Molekülkomplex-Ionen werden dazu mit erheblichen kinetischen Energien von einigen Hundert Elektronenvolt pro überzähliger Ladung axial in die Stoßzelle eingeschossen; durch die Stöße mit den schweren Stoßgasmolekülen werden sie aus der Achse abgelenkt und zu starken Oszillationen in radialer Richtung angeregt. Um diese Oszillationen zu dämpfen, ist ein leichtes Stoßgas vorgesehen, das zusätzlich in die Stoßzelle eingelassen wird.
Als schwere Stoßgase können beispielsweise Xenon (Xe, ≈ 131 Da), Krypton (Kr, ≈ 83 Da), perfluorierte Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Perfluorbutan (C₄F₁₀ ≈ 238 Da), Schwefelhexafluorid (SF₆, ≈ 146 Da) oder Uranhexafluorid (UF₆, ≈ 352 Da) verwendet werden; als leichtes Stoßgas bietet sich insbesondere Stickstoff (N₂, ≈ 28 Da) an, der besonders gute Dämpfungseigenschaften bietet; es können jedoch auch andere leichte Gase verwendet werden.
Die Verwendung einer Mischung aus Stoßgasen ist für spezifische Fragestellungen bereits bekannt; sie ist in 3D-Ionenfallen verwendet worden. Ein frühes Beispiel ist die Arbeit von K.L. Morand et al., „Efficient Trapping and Collision-induced Dissociation of High-mass Cluster Ions Using Mixed Target Gases in the Quadrupole Ion Trap“ Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 6, 520–523 (1992). Im Allgemeinen werden die Ionen in 3D-Ionenfallen durch Helium thermisch gedämpft, um sie räumlich zu fokussieren. Sollen die Ionen fragmentiert werden, so werden sie durch Aufschalten spezifischer Wechselspannungen bestimmter Frequenz resonant zu Schwingungen im Speicherfeld angeregt; die Geschwindigkeiten der Ionen, besonders der schweren Ionen, ist aber nicht groß genug, um in Stößen mit Helium-Atomen genügend Energie für den Zerfall aufnehmen zu können. Es wird dann zusätzlich ein geringer Anteil eines schwereren Gases zugesetzt, um die Energieaufnahme und schließlich den Zerfall zu Fragment-Ionen zu verbessern, wobei die Autoren der oben zitierten Arbeit beispielsweise bereits die Edelgase Neon und Argon als schwer ansehen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bestehen diese zuvor beschriebenen Mischungen von Stoßgasen aus zwei leichten Gasen, denn die erwähnten Gase Neon und Argon haben beide Molekülmassen von höchstens 40 Dalton.
Ebenfalls bekannt ist der Einsatz schwerer, ungemischter Stoßgase in linearen Stoßzellen, siehe die eingangs zitierte Arbeit von A. Laganowsky et al.; jedoch immer mit dem Nachteil, kaum eine thermische Kühlung angeregter Ausgangs- und Fragment-Ionen zu bewirken. Die vorliegende Offenbarung hebt sich von den früheren Veröffentlichungen insbesondere durch die Anwendung einer Mischung aus schweren und leichten Stoßgasmolekülen in linearen Stoßzellen ab, wodurch eine Lösung für das Problem der Fokussierung schwerer stoßzufragmentierender Ionen und deren Fragment-Ionen bereitgestellt wird.
Die linearen Stoßzellen sind in der Regel als Quadrupol-Stabsysteme ausgelegt und werden mit Hochfrequenzspannungen zum Speichern und Führen der Ionen betrieben. Das quadrupolare Hochfrequenzfeld erzeugt Kräfte auf die Ionen, die sie stets in die Achse des Stabsystems zurücktreiben; es entsteht eine Pseudopotentialmulde um die Achse herum, in der Ionen radial schwingen können. Der Einschuss der Ionen in diese linearen Stoßzellen erfolgt mit Beschleunigung der Ionen mit einigen Hundert Volt. Ein einzelner Stoß bewirkt bereits eine erhebliche Energieübertragung und führt meist schon zum Abspalten eines nicht kovalent gebundenen Teilmoleküls. Dabei treten aber durch die Stöße statistisch auch starke seitliche Ablenkungen der Restmole- kül-Ionen auf. Diese führen zu starken radialen Schwingungen im rücktreibenden Kraftfeld, die durch die Beigabe eines leichten Stoßgases gedämpft werden. Durch die Dämpfung versammeln sich die Ionen in Zeiträumen von etwa einer Millisekunde wieder in der Achse des Systems, so dass sie wohlfokussiert aus der Stoßzelle heraus zu einem angeschlossenen Massenanalysator wie einem Flugzeit-Massenspektrometer geführt werden können.
Bei stärkerer Einschussbeschleunigung, etwa über 200 Volt, können auch die bereits abgespaltenen Molekülteile für eine weitere Strukturaufklärung weiter fragmentiert werden.
zeigt schematisch vereinfacht ein Flugzeit-Massenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF), wie es grundsätzlich im Stand der Technik bekannt ist. In einer Ionenquelle (1) mit einer Sprühkapillare (2) werden an Atmosphärendruck Ionen erzeugt, die durch eine Kapillare (3) ins Vakuumsystem gebracht werden. Ein üblicher HF-Ionentrichter (4) leitet die Ionen in ein erstes HF-Quadrupol-Stabsystem (5), das sowohl als einfaches Ionenführungssystem aber auch als Massenfilter zur Auswahl einer zu fragmentierenden Sorte von Eltern-Ionen betrieben werden kann. Die unselektierten oder selektierten Ionen werden kontinuierlich durch die Ringblende (6) in die Stoßzelle (7) eingespeist, die auch als Vorratsspeicher dienen kann. Selektierte Eltern-Ionen können dabei in üblicher Weise mit höherer Einschussenergie eingeschossen werden, wodurch sie durch energetische Stöße mit den Molekülen des Stoßgases fragmentiert werden. Die Stoßzelle (7) ist annähernd gasdicht umschlossen und wird nach Stand der Technik durch die Gaszuführung (8) mit einem einzelnen Stoßgas beschickt. Die radialen Bewegungen der eingeführten Ionen und auch der neu erzeugten Fragment-Ionen werden im Stoßgas gedämpft, so dass sie sich in der Achse versammeln. Aus der Stoßzelle (7) werden durch die Extraktionsschaltlinse (9) Ionen entnommen, in Verbindung mit der Einzellinse (10) zu einem feinen Primärstrahl (11) geformt und zum Ionenpulser (12) geschickt. Der Ionenpulser (12) pulst periodisch einen Abschnitt des Primärionenstrahls (11) orthogonal in die auf hohem Potential befindliche Driftstrecke (13) als massendispersivem Bereich des Flugzeit-Massenspektrometers aus, wodurch der neue Ionenstrahl (14) entsteht, der einzelne linienförmige Ionenbündel enthält. Der Ionenstrahl (14) wird im Reflektor (15) in zweiter Ordnung energiefokussierend reflektiert und im Detektor (16) gemessen.
Das Massenspektrometer wird durch die Pumpen (17) evakuiert. Der Reflektor (15) stellt in dem gezeigten Beispiel einen zweistufigen Reflektor nach Mamyrin dar, mit zwei Gittern (18) und (19), die ein erstes starkes Bremsfeld einschließen, dem ein schwächeres Reflektionsfeld folgt. Aufgrund der Geschwindigkeitsstreuung werden die linienförmigen Ionenbündel bis in den Reflektor hinein breiter, aber durch die Geschwindigkeitsfokussierung bis zum Detektor wieder sehr fein fokussiert; dadurch ergibt sich eine hohe Massenauflösung, wie sie für die Massenbestimmung schwerer Ionen gebraucht wird.
Es versteht sich, dass der Aufbau aus nach entsprechender Umrüstung der Stoßzelle (7) für den Betrieb mit einer Mischung aus leichtem und schwerem Stoßgas für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung verwendet werden kann.
In wird gezeigt, wie das durch Nanosprühen ohne Zusatz von organischen Lösungsmitteln erzeugte Massenspektrum eines intakten (nativen) Antikörpers („Adalimumab“; Handelsname Humira^®; Zulassungsinhaber: AbbVie Ltd.) aussieht. Während für gewöhnlich durch Elektrosprühen (einschließlich Nanosprühen) Ionen gebildet werden, die durch vielfache Protonierung im Bereich 700 Da < m/z < 1500 Da der ladungsbezogenen Massen m/z liegen, werden hier Ionen mit Massen von etwa m/z ≈ 6000 Da gebildet. Aus dieser Verteilung von Ionen kann mit üblichen Mitteln (zum Beispiel einem der Stoßzelle vorgelagerten Hochfrequenz-Bandpass-Massenfilter) eine Ionensorte ausgefiltert werden. Im unteren Teil der ist das Massenspektrum der isolierten Ionensorte des Antikörpers mit 24 Protonen dargestellt. Diese isolierte Ionensorte kann nun in einer linearen Stoßzelle in einem Gemisch von Stickstoff und Schwefelhexafluorid fragmentiert werden.
Das nativ versprühte Adalimumab liefert eine Verteilung von wenig unterschiedlichen Ladungszahlen mit z = 21 bis z = 27 und die isolierte Ionensorte mit 24 Protonen repräsentiert etwa 30% des Gesamtsignals aller Adalimumab-Ionen. Im gewöhnlichen ESI Prozess (unter Verwendung organischer Lösungsmittel) liefert Adalimumab Ionen mit sehr verschiedenen Ladungszahlen mit z = 41 bis z = 70. Wird im gewöhnlichen ESI Prozess ein Tochterionenspektrum von nur einem Ladungszustand aufgenommen, dann wird nur ein geringer Anteil von weniger als 10% des Gesamtsignals für das Tochterionenspektrum verwendet. Insofern sorgt das native Elektrosprühen für eine Art inhärenter Ladungszustandskonzentration mit einhergehender verbesserter Massensignalgrundlage.
Für die Aufnahme des Tochterionenspektrums kann es von Vorteil sein, wenn das Eltern-Ion vergleichsweise wenige Ladungen pro Masseneinheit aufweist. Fragmentierungen wie die stoßinduzierte Dissoziation (collision-induced dissociation, CID) ebenso wie elektronen-induzierte Dissoziation, zum Beispiel Elektronentransfer-Dissoziation (ETD), werden durch den Grad der Protonierung eines Peptides oder Proteins gesteuert. Sowohl für CID als auch ETD sind Zusammenhänge zwischen Ladungszustand und -lokalisation am Molekül mit der zu erwartenden Fragmentierungsposition bekannt. Peptide, die einfach geladen sind, zeigen beispielsweise bevorzugt Dissoziationen an bestimmten Aminosäuren, insbesondere in der Nähe von „sauren“ Aminosäuren (Aspartat bzw. Glutamat) oder an Prolin-Aminosäuren. Wenn die Ladungszahl durch das native Elektrosprühen jedoch begrenzt ist, wird auch nicht zu erwarten sein, dass an jeder Stelle des Proteins eine Amidbindung gespalten wird. Eine derart beschränkte Anzahl an Fragment-Ionen verringert die Komplexität und ermöglicht somit eine leichtere, insbesondere automatische Auswertung eines Tocherionenspektrums nach den üblichen Regeln, die dem Fachmann bekannt sind. Das Fragment-Ionenspektrum wird salopp gesprochen „übersichtlicher“.
zeigt die Fragmentierungsspektren, die bei Einschussbeschleunigungen mit 108 bis 188 Volt entstehen, bei Druckeinstellungen von je etwa 2,4 Pascal SF₆ und 0,8 Pascal N₂. Die und zeigen die Spektren in feineren Details; für das Massenspektrum der Fragment-Ionen in wurden die Ionen mit 208 Volt eingeschossen. Es sei hier angemerkt, dass diese Einschussbeschleunigungen viel höher sind als gewöhnlich; im Normalfall wird mit Beschleunigungen von 50 bis 80 Volt eingeschossen. Die hohe Einschussbeschleunigung ist notwendig, weil die intakten Molekül(komplex)-Ionen viel weniger Protonen enthalten und daher die Einschussenergie pro Masseneinheit, die lediglich von der Anzahl der überzähligen Ladungen abhängt, viel niedriger ist.
In den Fragmentierungsspektren in , , sind Signale, die sich den Eltern-Ionen zuordnen lassen, und Signale von Fragment-Ionen deutlich voneinander getrennt. Das Verhältnis aus Masse zu Ladung ist bei den abgespalteten Fragment-Ionen deutlich niedriger, d.h. die Fragmente sind stärker protoniert. Im gewöhnlichen ESI Prozess kann es sein, dass Signale von Fragment-Ion und Eltern-Ion überlagert sind und Fragment-Ionen nicht detektiert werden können. Auch darin äußert sich ein Vorteil des nativen Elektrosprühens.
Als weiteres Beispiel möge eine Verbindung dienen, in denen zwei verschiedene Phosphazene über ein Ammoniakmolekül nichtkovalent verbunden sind. Die monoisotopische Molekülmasse der Ionen dieses Molekülkomplexes beträgt m/z = 5159,8215 Da; die Summenformel ist [(C₄₈H₁₈F₈₄N₃O₆P₃)(C₅₄H₁₈F₉₆N₃O₆P₃)(NH⁴)]⁺. zeigt das in reinem Stickstoff stoßfragmentierte Tochterionenspektrum dieses Phosphazenheterodimers. Der Einschuss in die Stoßzelle erfolgte mit einer Beschleunigung von etwa 200 V, was auf Grund der Ladungszahl z = 1 einer kinetischen Energie von 200 eV entspricht. Es werden hier ausschließlich die Phospazen-Monomere gebildet; sie sind durch einen Kreis bzw. eine Raute gekennzeichnet.
Erfindungsgemäß kann man Fragment-Ionen der Monomere durch Stöße mit einem Gemisch aus einem leichten und einem schweren Stoßgas, in diesem Fall Stickstoff und Schwefelhexafluorid, erhalten. gibt das stoßinduzierte Tochterionenspektrum des Phosphazenheterodimers mit diesem Gemisch wieder. Die Ionen wurden mit einer Beschleunigung von etwa 200 Volt in die hier verwendete Quadrupol-Stoßzelle eingeschossen. Die primär gebildeten Phos phazen-Monomere sind durch eine Raute (C₄₈H₁₈F₈₄N₃O₆P₃)⁺ bzw. einen Kreis (C₅₄H₁₈F₉₆N₃O₆P₃)⁺ gekennzeichnet. Fragmentierungsprodukte der jeweiligen Phosphazen-Monomere sind durch ein Dreieck für das Monomer (C₄₈H₁₈F₈₄N₃O₆P₃) bzw. durch einen Stern für das Monomer (C₅₄H₁₈F₉₆N₃O₆P₃) gekennzeichnet. Aus diesem Massenspektrum der Fragment-Ionen kann man die Struktur des Molekülkomplexes ableiten; zeigt Strukturvorschläge für die Fragmente, die aus den stoßinduzierten Anregungen des Phosphazenheterodimers entstehen.
Hier zeigt sich die Stärke des vorgeschlagenen Verfahrens. Enthielte das verwendete Stoßgas lediglich eine leichte Komponente wie molekularen Stickstoff, würden bei der verwendeten Stoßenergie von beispielsweis 200 V kaum Fragment-Ionen entstehen, so dass eine Strukturaufklärung mangels Datengrundlage kaum oder nur schwer möglich wäre. Würde man nur ein einzelnes, schweres Stoßgas wie Schwefelhexafluorid verwenden, das die Fragmentierungseffizienz erhöht, wäre jedoch die Ausbeute an verfügbaren Ionen, die es bis zum Massenanalysator schaffen, in den meisten Fällen zu gering, um überhaupt nachweisbare Massensignale zu erhalten, die für Strukturaufklärung erforderlich sind. Die Verwendung des Stoßgasgemisches hingegen schafft für beide Probleme Abhilfe. Das schwere Stoßgas sorgt bei entsprechend angepasster Einschussenergie für eine effiziente Fragmentierung der Molekül(komplex)-Ionen, wohingegen der Anteil des leichten Stoßgases eine wirksame Fokussierung aller Ionen in Achsennähe gewährleistet, so dass sich etwaige Eltern-Ionenreste gemeinsam mit den Fragment-Ionen in hinreichender Zahl zum Massenanalysator weiterleiten lassen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt in Massenspektrometern ausgeführt, die mit einer Elektrosprüh-Ionenquelle, einem Quadrupol-Massenfilter zur Auswahl von Eltern-Ionen, einer linearen Hochfrequenz-Quadrupol-Stoßzelle und einem Flugzeit-Massenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF) ausgerüstet ist. zeigt das Schema eines solchen Massenspektrometers. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Stoßzelle mit einer Einrichtung versehen ist, mit der sich die Ionen in axialer Richtung auf den Pulser des OTOFs hin austreiben lassen. Solche Einrichtungen sind dem Fachmann bekannt und brauchen deswegen nicht weiter erläutert zu werden. Die Elektrosprüh-Ionenquelle kann verschiedene Ausführungsformen besitzen; besonders geeignet für die Erzeugung von Molekülkomplex-Ionen mit intakter Struktur sind Nanosprüh-Ionenquellen, von denen es wiederum verschiedene Ausführungsformen gibt.
Statt des Flugzeitanalysators können auch andere hochauflösende Massenanalysatoren verwendet werden, wie beispielsweise Ionenzyklotronresonanz-Analysatoren (ICR) oder Massenanalysatoren auf der Basis von Kingdon-Ionenfallen, etwa die bekannte Orbitrap^® (Thermo-Fischer Scientific).
Zusammengefasst schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Strukturaufklärung von schweren Molekül-Ionen, insbesondere schwerer Molekülkomplex-Ionen, mit ladungsbezogenen Massen m/z von über 2000 Dalton in üblichen linearen Hochfrequenz-Multipol-Stoßzellen vor, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Stoßfragmentierung in einer linearen Stoßzelle in einem Gemisch aus mindestens einem leichten und mindestens einem schweren Stoßgas durchgeführt wird, wobei schwere Stoßgase eine Molekülmasse von mindestens 80 Dalton, leichte Stoßgase eine Molekülmasse von höchstens 40 Dalton besitzen. Die Stoßgase sollten mit Partialdrucken zwischen 0,01 bis 10 Pascal in der Stoßzelle vorhanden sein. Die Stoßgase können dabei etwa gleiche Partialdrucke besitzen, für manche Molekül(komplex)-Ionen kann jedoch der Partialdruck des leichten Stoßgases geringer sein als der Partialdruck des schweren Stoßgases. Für schwach gebundene Molekülkomplexe kann es vorteilhaft sein, wenn der Partialdruck des schweren Stoßgases etwas geringer ist als der des leichten Stoßgases.
Die Molekül(komplex)-Ionen werden mit Beschleunigungsspannungen zwischen 100 und 300 Volt in die Stoßzelle eingeschossen, oder, anders ausgedrückt, mit einer kinetischen Energie zwischen etwa 100 und 300 Elektronenvolt pro überzähliger Ladung.
Wenn die Moleküle und Molekülkomplexe aus biologischer Umgebung stammen, so kann es für Strukturuntersuchungen zielführend sein, die Molekül(komplex)-Ionen so herzustellen, dass sie die intakte (native) Struktur behalten, die die Moleküle und Molekülkomplexe in ihrer natürlichen Umgebung besitzen. Dazu können die Molekül(komplex)-Ionen in Elektrosprüh-Ionenquellen hergestellt werden, wobei sie in rein wässriger Lösung ohne Zusatz von organischen Lösungsmitteln versprüht werden. Gegebenenfalls lässt sich der wässrigen Lösung ein Detergenz beimengen, also eine oberflächen-aktive, oberflächenspannungsverringernde Substanz.
Für den Betrieb des Massenspektrometers mit Flugzeit-Massenanalysator ist es zweckmäßig, wenn die lineare Stoßzelle eine Einrichtung besitzt, mit der die Ionen axial aus der Zelle ausgetrieben werden können. Zum Beispiel kann ein Gleichspannungsgradient erzeugt werden, der die verbleibenden und/oder dissoziierten Ionen aus der Stoßzelle herauszieht. Statt des Massenanalysators nach dem Flugzeit-Prinzip können auch Massenanalysatoren nach dem Prinzip der Ionenzyklotronresonanz oder dem Prinzip der Kingdon-Ionenfallen eingesetzt werden.
Die Molekülkomplex-Ionen können beispielsweise aus Antikörpern, ggfs. mit Wirkstoff-Antikörperkonjugat (ADC), natürlich vorkommenden löslichen Membranproteinen oder anderen nicht kovalent gebundenen Proteinkomplexen gebildet werden.

Claims

Verfahren zur Strukturaufklärung schwerer Molekül-Ionen und Molekülkomplex-Ionen mit ladungsbezogenen Massen m/z von über 2000 Dalton in einer linearen Hochfrequenz-Multipol-Stoßzelle (7), bei dem die Ionen auf eine vorbestimmte kinetische Energie zwischen 100 und 300 Elektronenvolt pro überzähliger Ladung beschleunigt und axial in die lineare Stoßzelle (7) eingeschossen werden, und bei dem etwaig verbleibende Molekül(komplex)-Ionen sowie die entstandenen Fragment-Ionen aus der linearen Stoßzelle (7) heraus zu einem Massenanalysator (12–16) geführt werden, wobei eine Stoßfragmentierung in der linearen Stoßzelle (7) in einem Gemisch aus einem leichten und einem schweren Stoßgas durchgeführt wird und ein schweres Stoßgas eine Molekülmasse von mindestens 80 Dalton, ein leichtes Stoßgas eine Molekülmasse von höchstens 40 Dalton besitzt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stoßgase in der linearen Stoßzelle (7) Partialdrucke zwischen 0,01 bis 10 Pascal haben.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stoßgase in der linearen Stoßzelle (7) gleiche Partialdrucke haben.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Partialdruck des schweren Stoßgases in der linearen Stoßzelle (7) geringer als der Partialdruck des leichten Stoßgases ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Partialdruck des leichten Stoßgases in der linearen Stoßzelle (7) geringer als der Partialdruck des schweren Stoßgases ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül(komplex)-Ionen mit Beschleunigungsspannungen zwischen 100 und 300 Volt in die Stoßzelle (7) eingeschossen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül(komplex)-Ionen in Elektrosprüh-Ionenquellen (1–2) hergestellt werden, wobei sie in wässriger Lösung unter Verwendung eines pH-neutralen Puffers ohne Zusatz von organischen Lösungsmitteln versprüht werden, so dass sie die intakte (native) Struktur behalten, die die zu Grunde liegenden Moleküle und Molekülkomplexe in ihrer natürlichen Umgebung besitzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die lineare Stoßzelle (7) eine Einrichtung (9) besitzt, mit der die Ionen axial aus der Zelle ausgetrieben werden können, um zum Massenanalysator (12–16) geführt zu werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Massenanalysator (12–16) nach dem Flugzeit-Prinzip, dem Prinzip der Ionenzyklotronresonanz oder dem Prinzip der Kingdon-Ionenfallen arbeitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül(komplex)-Ionen aus Antikörpern oder Wirkstoff-Antikörperkonjugaten gebildet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekül(komplex)-Ionen aus löslichen Membranproteinen oder anderen nicht kovalent gebundenen Proteinkomplexen gebildet werden.