CN107037118A - 在质谱仪中对完整重分子和分子复合物进行结构测定 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过在线性射频多极碰撞池中的碰撞处理对分子量有时远高于100000道尔顿的重分子和分子复合物进行质谱分析,尤其涉及其自然结构的质谱分析。本发明提出在使用射频多极场引导离子的线性碰撞池中使用至少一种轻碰撞气体(<40道尔顿)和至少一种重碰撞气体(>80道尔顿)的混合物。分子复合物通常由多个部分分子组成,这些部分分子通过氢键或二硫键结合在一起。重碰撞气体产生高动量和高能量碰撞,从而分裂和进一步破碎分子复合物离子的这些非共价键合的部分。为此,以每个电荷几百电子伏的动能将分子复合物离子轴向注入到碰撞池中;由于与重碰撞气体分子发生碰撞,这些离子将从轴偏转,并且被激发从而在聚焦RF场的径向上经历强烈振荡。将轻碰撞气体额外引入到碰撞池中从而使这些振荡减速。
Description
技术领域
本发明涉及通过在线性射频(RF:radio frequency)多极碰撞池、尤其是四极碰撞池中碰撞诱导的碎片对重分子、尤其重分子复合物(有时是它们的自然结构)进行质谱分析。
注意:本文使用“道尔顿”(Da)单位,而非法定“标准的原子质量单位”(u),Da单位在于最新版(第八版)2006国际计量局“国际单位制(SI)”文件中,与原子质量单位处于同等地位,尤其如文件所述,这样做是为了能够使用单位千道尔顿、毫道尔顿等类似单位。
在质谱仪中,通常只能确定离子质量和离子电荷的比率。在下文中,“离子的质量”或“离子质量”也指离子的质量m与离子的多余正或负元电荷数量z的比率,即元电荷相关(简称“电荷相关”)质量m/z。
“碎片离子质谱”或“子离子质谱”通常理解为所选离子种类的碎片离子的质谱,而被选择用来破碎的离子种类通常称为“母离子”。
背景技术
完整分子复合物的质谱分析经证明是研究这些分子复合物的化学计量、结构与功能的关系以及其他特性的有力工具。母分子离子和碎片离子的精确质量可用于所产生的分子复合物的质量控制。例如,分子复合物可以是单克隆抗体(尤其是抗体药物偶联物,ADC)、自然产生的可溶性膜蛋白或其他非共价键合的蛋白复合物。
完整分子复合物通常是指“天然”分子复合物;它们与其在自然环境中的形式相同。完整分子复合物的电离通常在电喷雾离子源中发生,这种离子源通常是所谓的纳喷雾离子源。分子复合物存在于未添加有机溶剂的水溶液中,有机溶剂可能造成不良变性,例如,使折叠的分子复合物展开。由于完整分子复合物紧密聚集,因此在电喷雾等离子体中只有外表面能够质子化;因此,这些离子的多余质子数量极其低,并且电荷相关质量m/z异常高,在几千道尔顿的范围内。
A.Laganowsky等人的著作《Mass spectrometry of intact membrane proteincomplexes》,《Nature Protocols》,Vol.8,No.4,2013,641对此类分析的困难提供了深入见解。此处使用正交离子注入飞行时间质谱仪,该质谱仪通常具有一个四极质量过滤器和一个线性碰撞池。通过所谓的纳喷雾进行电离,其中,使用含有清洁剂但不含有机溶剂的水溶液。为了剥离清洁剂胶束(缔合胶体),在碰撞池中使用重气、氩或六氟化硫(SF6),但是,其压力设置非常关键。在低压力下,去除胶束的效果无法让人满意,在较高压力下,低聚复合物的传输被大大降低,可能是因为重碰撞气体不能对复合物离子进行热冷却。但是,必须进行热冷却才能在线性碰撞池的轴附近收集离子,并通过通常较窄的膜片将其引导出碰撞池。
更困难的是这些完整重分子复合物离子的破碎。使用标准轻碰撞气体、例如分子态氮N2,则不能破碎或破碎不足;而使用重碰撞气体、例如SF6,则热冷却很少或没有,因此在碰撞池的轴上无法收集到分子离子和碎片离子,或收集不足。因此,在X.Ma等人的出版物《Surface Induced Dissociation Yields Quaternary Substructure of RefractoryNoncovalent Phosphorylase B and Glutamate Dehydrogenase Complexes》,《J.Am.Soc.Mass Spectrom.》(2014)25:368-379)中,避免了在表面解离,但在未经复杂修改的情况下,这不能使用标准市售的质谱仪。
鉴于之前的讨论,需要通过高效破碎来修改重分子离子和分子复合物离子的结构测定方法,同时可以让离子和碎片在质谱仪中有效地传输。
发明内容
本发明涉及通过在线性射频多极碰撞池中的碰撞处理对重分子离子进行质谱分析,尤其是对电荷相关质量m/z大于2000道尔顿、优选大于3000道尔顿的重分子复合物进行质谱分析,其中分子量有时可能远高于100 000道尔顿。目的还包括能够分析在其自然环境中的重分子和分子复合物。
在本发明范围内,例如,分子复合物可以是单克隆抗体(尤其是抗体药物结合物ADC)、自然产生的可溶性膜蛋白或其他非共价键合的蛋白复合物。
本发明提出在引导RF多极场中的离子的线性碰撞池中使用至少一种轻惰性碰撞气体和至少一种重惰性碰撞气体的混合物。多极场优选是四极场,因为它们可确保离子最好地轴向聚焦到轴上。重惰性碰撞气体应具有至少约为80道尔顿的分子量,而轻惰性碰撞气体应具有至多约为40道尔顿的分子量。分子复合物通常由多个部分分子组成,这些分子通过氢键或二硫键结合在一起。重碰撞气体产生高动量和高能量碰撞,从而有利地造成分子复合物离子的这些非共价键合的部分的分裂。为此,以每个多余电荷几百电子伏的动能将分子复合物离子轴向注入到碰撞池;由于重碰撞气体分子的碰撞,这些离子将从轴偏转,并且被激发从而在聚焦射频场的径向上经历强烈振荡。将轻碰撞气体额外引入至碰撞池中以使这些振荡减速。
在较高注入能量下,还可进一步破碎已经分裂的分子部分。
例如,化学惰性气体氙(Xe,≈131Da,单原子)、氪(Kr,≈83Da,单原子)、六氟化硫(SF6,≈146Da,分子)、六氟化铀(UF6,≈352Da,分子)或诸如十氟丁烷(C4F10,≈238Da,分子)等的全氟化烃类可用作重碰撞气体;特别地,惰性氮气(N2,≈28Da,双原子),具有非常优良的减速特性,适合作为轻碰撞气体;但是,也可使用其他轻气体,例如稀有气体氦(He,≈4Da,单原子)、氖(Ne,≈20Da,单原子)或氩(Ar,≈40Da,单原子)。
对于某些应用,可添加更多气体成分到轻碰撞气体和重碰撞气体的混合物中,例如属于轻碰撞气体或重碰撞气体定义范围内的其他气体,或者可选择甚至不符合这些定义的其他可选气体。
D.J.Douglas的著作《Applications of Collision Dynamics in QuadrupoleMass Spectrometry》,《J.Am.Soc.Mass Spectrom.》1998,9,101-113)很好地概述了四极离子贮存池中碰撞过程的基础知识,因此通过引述完全包括在本发明中。
附图说明
图1显示了正交离子注入飞行时间质谱仪(OTOF)的简化示意图,这是人们基本熟知的现有技术。
图2的上部显示了完整抗体阿达木单抗(m=148 080道尔顿)的质谱;由于其在电喷雾中紧凑折叠,只有少量质子(大约21–27个)能够结合至其表面,因此其离子具有大约6千道尔顿的极高电荷相关质量m/z。该图的下部显示了携带24倍电荷的隔离离子。
图3显示了携带24倍电荷的阿达木单抗碎片离子的质谱,该质谱通过使用不同加速电压和氮气与六氟化硫碰撞气体混合物获得。在108伏的加速电压下,轴向注入到线性碰撞池期间的动能为2592电子伏,在188伏的加速电压下,动能为4512电子伏。
图4说明了阿达木单抗碎片离子质谱的放大细节图。
图5A至5C显示了使用208伏加速电子产生的碎片离子的质谱。图5A为总质谱,而图5B和5C显示了相关质量和电荷数量的详细情况(部分注释质谱)。在208伏的加速电压下,轴向注入到线性碰撞池期间的动能为4992电子伏。
图6显示了磷腈异二聚体的单电荷母离子通过纯氮碰撞破碎的子离子的质谱,该母离子的单一同位素质量为m/z=5159.8215Da,实验式为[(C48H18F84N3O6P3)(C54H18F96N3O6P3)(NH4)]+。该二聚体通过铵非共价键合。离子在大约200V的加速电压下注入到碰撞池中。在此处仅形成两种磷腈单体,分别用圆圈和菱形表示。
图7显示了图6中所示磷腈异二聚体碰撞诱导的子离子质谱,不同的是,此处的碰撞池已经填充由氮气和六氟化硫组成的碰撞气体混合物。离子已在大约200伏的加速电压下被注入四极碰撞池。初步形成的磷腈单体分别用菱形(C48H18F84N3O6P3)+和圆圈(C54H18F96N3O6P3)+表示。具体磷腈单体的破碎产物分别用三角形(C48H18F84N3O6P3)和星号(C54H18F96N3O6P3)表示。
图8显示了磷腈异二聚体碰撞诱导振荡产生的碎片的建议结构。
具体实施方式
本发明涉及通过在线性射频多极碰撞池中的碰撞处理对重分子离子进行质谱分析(优选在其自然结构下),尤其是对电荷相关质量m/z大于2000道尔顿的重分子复合物进行质谱分析,其中分子量有时可能远高于100 000道尔顿,碰撞池优选由平行排列的多个极杆构成,例如四个极杆,即四极碰撞池。待分析的离子以每个多余电荷最多几百电子伏的动能被轴向注入到这些碰撞池中,例如100到300电子伏乘以多余电荷数。碰撞处理可能涉及剥离通常因氢键形成而粘附的轻粒子(胶束、水复合物),或可能涉及将分子复合物分裂为部分分子,或者部分分子的破碎。
线性碰撞池通常的特征是,多数细长电极(通常称为杆)的排列彼此平行于公共轴。电极可能具有圆形截面。通常也可使用具有向内双曲形状的杆,以便产生较好的纯多极场。还有多个其他变体,例如扁平电极,它们成对相对排列,在碰撞池中形成多边形的内部宽度(例如,对于四电极配置而言,具有正方形截面)。圆形或双曲电极可称为凸面实施方式,但凹面设计也广为人知,其中,朝向轴的电极一侧径向向外呈现凹面拱形。碰撞池的线性或二维性(2D)尤其意味着,电极具有轴向延长或长度,它是内部宽度尺寸参数或直径的倍数。
本发明提出在使用射频多极场保留离子的通常线性碰撞池中使用至少一种轻碰撞气体和至少一种重碰撞气体的混合物。重碰撞气体应具有至少约为80道尔顿的分子量,而轻碰撞气体应具有至多约为40道尔顿的分子量。碰撞气体应具有0.01至10帕斯卡的分压,每种气体的优选范围为大约1至2帕斯卡。气体可有相同的分压,虽然通常轻碰撞气体的分压稍微低于重碰撞气体的分压更有利。例如,重碰撞气体的分压可构成气体混合物压力的75%,而轻碰撞气体的分压构成余下的25%。
但是,也有重碰撞气体的分压稍微低于轻碰撞气体的分压更为有利的情况。在分析结合相对弱的分子复合物时,尤其可以采用这种应用,例如抗体药物偶联物的分子复合物。在最佳实施例中,线性碰撞池中重碰撞气体占总碰撞气体的比例大于20%,具体大于35%,最好大于60%。然后分别以80%、65%或40%的补充比例添加轻碰撞气体。
分子复合物通常由多个分子部分组成,这些分子通过氢键或二硫键结合在一起。重碰撞气体产生高动量和高能量碰撞,从而有利地分裂分子复合物离子的这些非共价键合的部分。为此,以每个多余电荷几百电子伏的大量动能将分子复合物离子轴向注入到碰撞池;由于重碰撞气体分子的碰撞,这些离子从轴偏转,并且被激发从而在径向上经历强烈振荡。将轻碰撞气体额外引入至碰撞池中从而使这些振荡减速。
例如,氙(Xe,≈131Da)、氪(Kr,≈83Da)、诸如十氟丁烷(C4F10,≈238Da)等全氟化烃类、六氟化硫(SF6,≈146Da)或六氟化铀(UF6,≈352Da)可用作重碰撞气体。特别地,氮气(N2,≈28Da)具有非常优良的阻尼特性,适合作为轻碰撞气体;但是,也可使用其他轻气。
碰撞气体混合物用于特定目的已为人们所知,并且已经用于3D离子阱。早期示例为K.L.Morand等人的著作《Efficient Trapping and Collision-induced Dissociationof High-mass Cluster Ions Using Mixed Target Gases in the Quadrupole IonTrap》,《Rapid Communications in Mass Spectrometry》,Vol.6,520-523(1992)。3D离子阱中的离子通常通过氦进行热减速以使其在空间上聚焦。为了破碎离子,通过以特定频率连接特定交流电压来共振激发这些离子,使其在贮存场中振荡;然而,离子的速度,尤其重离子的速度,不足以吸收足够能量以通过与氦原子碰撞分解。然后额外添加一小部分重气以提高能量吸收,因而最终分解为碎片离子;上述著作的作者已经将稀有气体氖和氩视为重气。
在本发明的范围内,上述碰撞气体的混合物由两种轻气组成,因为所述气体氖和氩的分子质量均小于等于40道尔顿。
在线性碰撞池中使用未混合的重碰撞气体同样为人们所熟知(请参见A.Laganowsky等人的上述著作);然而,常常有难以对激发的开始离子和碎片离子进行热冷却的缺点。本发明不同于之前的出版物,具体通过在线性碰撞池中使用重碰撞气体分子和轻碰撞气体分子的混合物,解决了聚焦重离子以进行碰撞破碎并产生碎片离子的问题。
线性碰撞池通常设计为四极杆系统,并且采用射频电压储存和引导离子。四极射频场对离子产生力,这些力使离子始终回到杆系统的轴上;这样做在轴周围产生一个赝势阱,阱中的离子能够径向振荡。通过几百伏的离子加速将离子注入到这些线性碰撞池中。即使单次碰撞也能产生显著的能量传输,并且通常能够因此分裂非共价键合的部分分子。但是,在统计学上,由于碰撞,余下的分子离子也会发生强烈的横向偏转。这导致恢复力场中发生强烈径向振荡,该振荡通过添加轻碰撞气体进行减速。减速使离子在大约一毫秒的时间内再次聚集到系统的轴上,从而通过良好聚焦将其引导出碰撞池,到达诸如飞行时间质谱仪等连接的质量分析器。
在较强的注入加速电压下,例如高于200伏,已经分裂的分子部分会进一步破碎,从而进行额外结构测定。
图1显示了正交离子注入飞行时间质谱仪(OTOF)的简化示意图,这是人们基本熟知的现有技术。大气压力下,在离子源(1)内使用喷雾毛细管(2)产生离子,这些离子通过毛细管(3)引入真空系统。传统射频离子漏斗(4)将离子引导进第一个射频四极杆系统(5),它既可用作简单的离子导向系统,也可用作质量过滤器来筛选母离子的种类以供破碎。滤除掉或筛选出的离子通过环形膜片(6)连续送入碰撞池(7),该碰撞池还可用作贮存池。筛选出的母离子可通过传统方式以相对较高注入能量注入,由于与碰撞气体分子的能量碰撞,这些离子被破碎。碰撞池(7)几乎气密密封,根据现有技术,通过供气管线(8)供应各种碰撞气体。引入的离子以及新产生的碎片离子的径向移动在碰撞气体中被减速,从而使这些离子可聚集在轴上。离子通过与单透镜(10)结合的可切换提取透镜(9)从碰撞池(7)提取,使离子变成一细条主射束(11)形状,然后将其送至离子脉冲发生器(12)。离子脉冲发生器(12)定期将一部分主离子束(11)在正交方向上以脉冲形式发至高电位漂移区(13),它是飞行时间质谱仪的质量分散区,因此每次都产生新的离子束(14),该离子束包含各个线性离子包。离子束(14)在反射器(15)内通过二阶聚能完成反射,然后在检测器(16)内进行检测。
质谱仪用泵(17)抽真空。在实施例中,反射器(15)表示一种两段式Mamyrin反射器,有两个栅条(18)和(19),它们形成第一段强减速场,弱反射场紧跟其后。由于速度离散,线性离子包向上偏转进入反射器,在达到检测器之前,离子包通过速度聚焦再次非常精确地聚集,这可产生重离子质量测定所需的高质量分辨率。
需要了解的是,出于本发明目的,图1的设计可在适当修改碰撞池(7)后用于以轻碰撞气体和重碰撞气体的混合物来操作。
图2显示了在未添加有机溶剂的情况下通过电喷雾产生的完整(天然)抗体(阿达木单抗;商品名称;授权持有者:AbbVieLtd.)的质谱。鉴于通过电喷雾(包括纳喷雾)形成的离子,由于多次质子化,其电荷相关质量m/z通常在700Da<m/z<1500Da的范围内,因此在此处,形成质量大约为m/z≈6000Da的离子。可以使用传统方法(例如,碰撞池上游的射频带通质量过滤器)筛选出此分布的离子种类。图2的下部分显示了含有24个质子的抗体的已分离离子种类的质谱。此已分离离子种类现在可以在线性碰撞池内在氮和六氟化硫的混合物中破碎。
天然喷雾阿达木单抗提供质子数z=21到z=27变化较小的分布,含有24个质子的已分离离子种类占所有阿达木单抗离子总信号的约30%。在传统电喷雾电离(ESI)过程中(使用有机溶剂),阿达木单抗提供电荷数在z=41到z=70范围内的离子。在传统电喷雾电离(ESI)过程中记录仅一个电荷态的子离子质谱时,仅有少于总信号10%的一小部分被用于子离子质谱。就这一点而言,天然电喷雾可提供一种需要改进质量信号基础的固有电荷态浓度。
为了记录子离子质谱,当母离子每质量单位具有相对较少的电荷时,可能比较有利。诸如碰撞诱导解离(CID)和电子诱导解离(例如电子转移解离(ETD))的破碎由多肽或蛋白的质子化程度控制。对于碰撞诱导解离(CID)和电子转移解离(ETD),分子中电荷态和电荷定位之间的关系以及预计破碎位置为已知。例如,单电荷多肽更易于在特定氨基酸中解离,尤其在“酸性”氨基酸(天冬氨酸盐或谷氨酸盐)附近或在脯氨酸氨基酸处。但是,如果电荷数受自然电喷雾限制,则无法预计酰胺键会在蛋白质的每个部位分裂。因而在本领域技术人员熟知的标准要求下,受限碎片离子的数量降低了评估子离子质谱的复杂度,从而能够更轻松,尤其是能够自动地评估。用通俗的说法,碎片离子质谱变得“更加清晰”。
图3显示了通过108至188伏的注入加速和每种情况下大约2.4帕斯卡(SF6)和0.8帕斯卡(N2)的压力设置获得的破碎质谱。图4和5显示了更详细的质谱,图5中的是碎片离子的质谱,离子在208伏下注入。在此应该注意,此处注入加速电压远远高于平时;在正常情况下,在50至80伏的加速电压下进行注入。由于完整分子(复合物)离子包含少很多的质子,所以需要高注入加速电压,因此每质量单位的注入能量(只是多余电荷数量的函数)低很多。
在图3、4、5中的破碎质谱中,可能与母离子关联的信号与碎片离子信号清晰分离。在分裂的碎片离子中,质荷比更低,即碎片的质子化程度更高。在传统电喷雾电离(ESI)过程中,碎片离子和母离子的信号可能重叠,并且碎片离子可能无法检测。这说明了天然电喷雾的又一个优势。
另一个示例可以为化合物,其中,两个不同的磷腈通过氨分子非共价键合。该分子复合物离子的单一同位素质量为m/z=5159.8215道尔顿;实验式为(C48H18F84N3O6P3)(C54H18F96N3O6P3)(NH4)]+。图6显示了该磷腈异二聚体在纯氮中碰撞破碎的子离子质谱。在大约200V的加速电压下将离子注入碰撞池,这基于电荷数z=1对应于200eV的动能。在此处仅形成磷腈单体,分别用圆圈和菱形表示。
根据本发明,单体的碎片离子可通过与轻碰撞气体和重碰撞气体的混合物碰撞获得,在此情况下,为氮和六氟化硫。图7显示了使用此混合物碰撞诱导的磷腈异二聚体的离子质谱。此处使用大约200伏的加速电压将离子注入四极碰撞池。初步形成的磷腈单体分别用菱形(C48H18F84N3O6P3)+和圆圈(C54H18F96N3O6P3)+表示。各磷腈单体的破碎产物分别用三角形(C48H18F84N3O6P3)和星号(C54H18F96N3O6P3)表示。分子复合物的结构可通过此碎片离子的质谱导出;图8显示了磷腈异二聚体碰撞诱导激发所产生碎片的建议结构。
所提出方法的效果在此显而易见。如果碰撞气体仅包含轻成分(例如分子氮),则在所用碰撞能量下(例如200V),离子很难破碎,从而因缺乏足够数据很难或不能进行结构测定。如果仅使用单一重碰撞气体(例如六氟化硫),则破碎效率将增加,但是在多数情况下,到达质量分析器的可用离子的产量将过低,而无法获得结构测定所需可检测的质量信号。相比之下,使用碰撞气体混合物解决了这两个问题。通过适当调整注入能量,重碰撞气体确保分子(复合物)离子高效破碎,而轻碰撞气体部分确保有效地将所有离子聚焦在轴附近,从而让足够数量的任何余下的母离子和碎片离子一同被引导至质量分析器。
符合本发明的方法优选在配备电喷雾离子源、筛选母离子的质量过滤器、线性射频四极碰撞池和正交离子注入时间飞行质谱仪(OTOF)的质谱仪中进行。图1显示了此类质谱仪的示意图。当碰撞池配备可将离子轴向抛射至正交离子注入时间质飞行谱仪(OTOF)脉冲发生器的装置时,其优势更为突出。此类装置为本领域技术人员所熟知,因此不需要进一步说明。电喷雾离子源可能有不同实施方式;其中有很多实施方式的纳喷雾离子源特别适用于产生具有完整结构的分子复合物离子。
可使用其他高分辨率质量分析器代替飞行时间分析器,例如离子回旋共振(ICR)分析器,或基于Kingdon离子阱的质量分析器,例如人们熟知的(ThermoFischer Scientific)。
总的来说,本发明提出了在传统线性射频多极碰撞池中对重分子离子进行结构测定的方法,尤其是对电荷相关质量m/z大于2000道尔顿的重分子复合物离子进行结构测定,其特征是,在线性碰撞池的至少一种轻碰撞气体和至少一种重碰撞气体的混合物中进行碰撞诱导破碎,重碰撞气体的分子量至少大约为80道尔顿,轻碰撞气体的分子量至多大约为40道尔顿。碰撞气体应以0.01至10帕斯卡的分压存在于碰撞池中。碰撞气体可有大约相同的分压,但对于很多分子(复合物)离子,轻碰撞气体的分压可能低于重碰撞气体的分压。对于弱键合的分子复合物,重碰撞气体的分压稍微低于轻碰撞气体的分压时,优势会更为突出。
优选在100到300伏的加速电压下,或者换句话说,以每个多余电荷大约100到300电子伏的动能,将分子(复合物)离子注入碰撞池。
当分子和分子复合物源自生物环境时,产生分子(复合物)离子时最好保持分子和分子复合物在自然环境中所具有的完整(天然)结构,以进行结构分析。为此,可在电喷雾离子源中产生分子(复合物)离子,其中在不添加有机溶剂的纯水溶液中喷射离子。可将活性剂,即可降低表面张力的表面活性物质,选择性地添加到水溶液中。
为了将质谱仪与飞行时间质量分析器结合使用,线性碰撞池最好具有可用来从池中轴向抛射离子的装置。例如,可产生直流电压梯度,从而从碰撞池中提取剩余的和/或解离的离子。可使用符合离子回旋共振原理或Kingdon离子阱原理的质量分析器代替符合飞行时间原理的质量分析器。
分子复合物离子可以由例如抗体(选择性地带有抗体药物偶联物(ADC))、自然产生的可溶性膜蛋白或其他非共价键合的蛋白复合物形成。
Claims (12)
1.一种在线性射频多极碰撞池中对电荷相关质量m/z大于2000道尔顿的重分子离子和分子复合物离子进行结构测定的方法,其中离子被加速到预定的动能,并轴向注入线性碰撞池,并且其中任何剩余的分子(复合物)离子和产生的碎片离子被引导出线性碰撞池,并进入质量分析器,
其特征在于,
在线性碰撞池的轻碰撞气体和重碰撞气体混合物中进行碰撞诱导破碎,其中重碰撞气体的分子量至少约为80道尔顿,轻碰撞气体的分子量至多约为40道尔顿。
2.根据权利要求1的方法,其特征在于,线性碰撞池中的碰撞气体具有0.01至10帕斯卡的分压。
3.根据权利要求1或2的方法,其特征在于,线性碰撞池中的碰撞气体具有大约相同的分压。
4.根据权利要求1或2的方法,其特征在于,线性碰撞池中的重碰撞气体的分压低于轻碰撞气体的分压。
5.根据权利要求1或2的方法,其特征在于,线性碰撞池中的轻碰撞气体的分压低于重碰撞气体的分压。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法,其特征在于,在100至300伏的加速电压下将分子(复合物)离子注入碰撞池。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法,其特征在于,分子和分子复合物源自生物环境,分子(复合物)离子在产生时保持分子和分子复合物在自然环境中所具有的完整(天然)结构。
8.根据权利要求7的方法,其特征在于,分子(复合物)离子在电喷雾离子源中产生,其中,使用不添加有机溶剂的pH中性缓冲液在纯水溶液中喷射所述离子。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法,其特征在于,线性碰撞池具有一个可用来从池中轴向抛射离子的装置,以便将离子导入到质量分析器。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法,其特征在于,质量分析器根据飞行时间原理、离子回旋共振原理和Kingdon离子阱原理之一运行。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法,其特征在于,分子(复合物)离子由抗体或抗体药物偶联物构成。
12.根据权利要求1至10中任一项的方法,其特征在于,分子(复合物)离子由可溶性膜蛋白或其他非共价键合蛋白复合物形成。
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