DE102005039560B4

DE102005039560B4 - Neuartiges Tandem-Massenspektrometer

Info

Publication number: DE102005039560B4
Application number: DE102005039560A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen; Carsten Stoermer; Bruce Sudbury Reinhold
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2005-08-22
Filing date: 2005-08-22
Publication date: 2010-08-26
Anticipated expiration: 2025-08-23
Also published as: DE102005039560A1; GB0615832D0; US20070084998A1; GB2429579A

Abstract

Tandem-Massenspektrometer, mindestens bestehend aus
(a) einer Einrichtung zur Ionisierung einer Probe außerhalb des Vakuums des Tandem-Massenspektrometers,
(b) einem Speicherreservoir innerhalb des Vakuums des Tandem-Massenspektrometers für die Speicherung der Ionen der Probe,
(c) einer Einrichtung zur Beendigung der Zuführung von Ionen in das Speicherreservoir, die auch die Zufuhr von Umgebungsgas in das Vakuum des Tandem-Massenspektrometers unterbindet,
(d) einem Ionentor, das Ionen eines ausgewählten kleinen Massenbereichs aus dem Speicherreservoir exportiert und die anderen Ionen unbeschädigt im Speicherreservoir zurücklässt,
(e) einer Einrichtung zur Fragmentierung der exportierten Ionen, und
(f) einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Einschuss zur Aufnahme von Massenspektren der Fragmentionen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Tandem-Massenspektrometer (abgekürzt MS/MS), also auf Massenspektrometer, die Massenspektren von Fragmentionen einer selektierten Ionensorte aufnehmen und so die Menge und die Masse der Fragmentionen bestimmen können.
Es ist das Neuartige der Erfindung, dass alle MS/MS-Untersuchungen einer Probe an einem einmalig geschaffenen Vorrat von Ionen dieser Probe vorgenommen werden, wobei die jeweils zu untersuchende Ionensorte aus dem Vorrat massenselektiv exportiert wird, ohne die anderen Ionensorten zu beschädigen. Im Verfahren der Erfindung wird zunächst eine Probe (oder ein Teil davon) vollständig ionisiert und die Ionen werden, anders als bei bisherigen Tandem-Massenspektrometern, in einem Speicherreservoir im Vakuum gespeichert. Alle darauf folgenden Analysen werden an diesen gespeicherten Ionen ausgeführt, ohne weitere Ionen zuzuführen, um keine Änderungen der Konzentrationen der gespeicherten Ionensorten zu bewirken. Als selektierende Einrichtung des Tandem-Massenspektrometers wird nicht, wie im Stand der Technik üblich, ein Massenfilter eingesetzt, das die nicht-selektierten Ionen vernichtet, sondern ein massenselektives Ionentor. Das massenselektive Ionentor exportiert die zu analysierenden Ionensorten aus dem Speicherreservoir und lässt die nicht-selektierten Ionen unbeschädigt im Speicherreservoir zurück. Diese Ionen bleiben gespeichert und können später weiteren analytischen Untersuchungen zugeführt werden. Die exportierten Ionen werden fragmentiert, und die Fragmentionen werden in einem schnellen Massenanalysator hoher Massenauflösung, bevorzugt in einem Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem Ioneneinschuss, als Massenspektrum aufgenommen. Die Vorgänge des Exports einer selektierten Ionensorte mit anschließender Fragmentierung und der Aufnahme des Fragmentionenspektrums können für beliebig viele Ionensorten wiederholt werden. Verschiedene Arten massenselektiver Ionentore werden vorgestellt.
Stand der Technik
Die Tandem-Massenspektrometrie hat sich in den letzten vier Jahrzehnten zu einem außerordentlich erfolgreichen Zweig der Massenspektrometrie entwickelt. Ein Tandem-Massenspektrometer (MS/MS) filtert zunächst aus einem stetigen Angebot eines Ionengemisches in Form eines kontinuierlichen Ionenstrahls eine vorgewählte Ionensorte aus, fragmentiert diese Ionensorte, und misst in einem Massenanalysator das Spektrum der Fragmentionen. Die Ionen der ausgewählten Ionensorte werden häufig „Elternionen” genannt, die Fragmentionen heißen häufig „Tochterionen”.
Es haben sich im Laufe der Zeit zwei grundsätzlich verschiedene Arten der Tandem-Massenspektrometrie entwickelt, die als „Tandem im Raum” und „Tandem in der Zeit” bezeichnet werden.
„Tandem im Raum” bezeichnet ein Verfahren, das ein Massenfilter (also ein erstes massenspektrometrisches Trennsystem) als massenselektive Einrichtung benutzt, eine davon räumlich getrennte Kammer für die Fragmentierung der selektierten Ionen verwendet und einen wiederum räumlich davon getrennten Massenanalysator (ein zweites massenspektrometrisches Trennsystem) zur Aufnahme des Spektrums der Tochterionen. Die Verwendung zweier massenspektrometrischen Trennsysteme hat zur Abkürzung MS/MS geführt. Als Massenfilter wurden in der Anfangszeit der Tandem-Massenspektrometrie regelmäßig magnetische Sektorfelder verwendet, heute werden (außer bei so genannten TOF/TOF-Geräten) praktisch ausschließlich Hochfrequenz-Quadrupol-Massenfilter eingesetzt. Als Massenanalysatoren können mehrere Arten von Massenspektrometern verwendet werden, darunter Massenspektrometer mit magnetischen Sektorfeldern, Hochfrequenz-Quadrupol-Massenspektrometer, Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer, oder Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss. Im Verfahren „Tandem im Raum” wird aber stets im selektierenden Massenfilter zu einer gegebenen Zeit nur eine einzige analytisch interessierende Ionensorte durchgelassen, alle anderen Ionensorten des Ionengemisches werden vernichtet und sind für weitere Untersuchungen verloren.
Das Verfahren „Tandem in der Zeit” besteht darin, alle Schritte der Selektion, der Fragmentierung und der Analyse der Tochterionen in einer einzigen Zelle, einer Ionenfalle, zeitlich nacheinander auszuführen. Auch hier wird, wie auch bei „Tandem im Raum”, im Schritt der Selektion nur die analytisch interessierende Elternionensorte behalten; alle anderen Ionensorten werden vernichtet und sind für alle Zeiten verloren. Als Ionenfallen können hier lineare Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen mit vier Polstäben, dreidimensionale Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen mit einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, oder auch die Zellen von Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern verwendet werden. Dieses Verfahren „Tandem in der Zeit” erlaubt es relativ einfach, die Selektions- und Fragmentierungsschritte zu wiederholen und damit nicht nur Tochterionenspektren, sondern auch Enkelionenspektren oder sogar Urenkelionenspektren zu messen.
Die Vernichtung aller Ionensorten, die nicht gerade zur Analyse anstehen, ist nicht nachteilig, so lange in einer Probe nur eine einzige Ionensorte allein analysiert werden soll. Sollen dagegen mehrere oder sogar viele Substanzen mit möglicherweise jeweils vielen Ionensorten analysiert werden, so ist diese Vernichtung eine Verschwendung von Probenmaterial und damit sehr nachteilig.
Die Bedeutung der Tandem-Massenspektrometrie liegt darin, dass sie durch die Aufnahme der Fragmentionenspektren einerseits Einblicke in die Struktur der selektierten Elternionen und andererseits eine sichere Identifizierung der Art der Elternionen ermöglicht. In den Biowissenschaften ermöglicht sie insbesondere die Bestimmung von Sequenzen in Biopolymeren (oder zumindest von Teilen dieser Sequenzen und auch von Modifizierungen dieser Sequenzen), insbesondere von Aminosäuresequenzen in Proteinen und Peptiden. Die Bedeutung der Tandem-Massenspektrometrie ist weiterhin dadurch gestiegen, dass die besonderen Ionisierungsverfahren für Biomoleküle, insbesondere Elektrosprühen (ESI) und matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI) außerordentlich zart sind (so genannte „weiche” Ionisierungsverfahren) und selbst praktisch keine Fragmentionen liefern, wie das für die frühen Ionisierungsverfahren wie Elektronenstoß-Ionisierung der Fall war. Die zarten Ionisierungsverfahren liefern nur so genannte Pseudo-Molekülionen, meist protonierte oder deprotonierte Moleküle, die als einzige Information die Masse des Moleküls liefern, aber darüber hinaus keine weiteren Kenntnisse über Identität und Struktur der Moleküle. Für die sichere Identifizierung einer Substanz sind daher weitergehende Informationen notwendig, wie sie praktisch nur die Tandem-Massenspektrometrie liefert. Selbst wenn es „nur” um eine quantitative Bestimmung einer gesuchten, an sich bekannten Substanz handelt, ist in der Bioanalytik eine sichere Identifizierung und damit die Anwendung der Tandem-Massenspektrometrie unabdingbar.
Besonders wichtig für die Tandem-Massenspektrometrie ist die Fragmentierung der selektierten Ionen. Für Proteine und Peptide hat sich inzwischen herausgestellt, dass es wohl im Wesentlichen zwei grundsätzlich verschiedene Arten der Fragmentierung dieser Biopolymere gibt. Diese beiden Arten der Fragmentierung liefern voneinander unabhängige Informationen (man spricht hier oft von „orthogonalen” Verfahren), wobei ein Vergleich der Fragmentionenspektren der beiden Fragmentierungsarten besonders wertvolle zusätzliche Information ergibt.
Die erste Art der Fragmentierung ist ein Zerfall der Elternionen, nachdem sie durch einen oder mehrere Energieaufnahmeprozesse genügend innere Energie aufgesammelt haben. Die innere Energie verteilt sich dabei auf alle inneren Schwingungssysteme des Elternions, wobei sich aber die Lokalisierung der Energie stets ändert, weil die Schwingungssysteme gekoppelt sind und daher fortdauernd untereinander Energie austauschen. Tritt schließlich an einer Bindung des Elternions eine Kraft auf, die die Bindungskraft übersteigt, so bricht hier das Elternion in zwei Fragmente. Die Brüche betreffen dabei in statistischer Weise nur solche Bindungen, die niedrige Bindungsenergien aufweisen. Diese Art des Zerfalls führt bei Proteinen überwiegend zu so genannten b- und y-Fragmentionen. Die Energie kann durch eine Vielzahl von moderaten Stößen angesammelt werden (CID = collision induced decomposition), aber auch durch die Aufnahme einer Vielzahl von Infrarot-Quanten (IRMPD = infrared multi photon decomposition).
Eine Abart davon ist die so genannte hochenergetische Stoßfragmentierung (HE-CID). Bei Stößen im Bereich kinetischer Energien von einigen Kiloeletronenvolt reicht ein Stoß, um zu Fragmentierungen zu führen. Die so erzeugten Fragmentspektren sehen etwas anders aus, weil sie mehr Spontanfragmentierungen, beispielsweise an Seitenketten, und ebenfalls mehr Folgefragmentierungen und daher insgesamt mehr Fragmentionensignale enthalten. Sie sind schwerer zu interpretieren und werden daher eher vermieden. Prinzipiell enthalten diese Hochenergie-Fragmentionenspektren von Proteinen aber ebenfalls vorwiegend b- und y-Fragmentionen.
Die zweite Art des Zerfalls wird durch einen Elektronenübertrag auf mehrfach positiv geladene Elternionen hervorgerufen; der Zerfall ist spontan und führt vorwiegend zu so genannten c- und z-Fragmentionen. Der Elektronenübertrag kann durch direkten Einfang eines Elektrons (ECD = electron capture dissociation), durch Übertragung eines Elektrons eines negativ geladenen Ions (ETD = electron transfer dissociation), oder durch den Übertrag eines Elektrons aus einem hoch angeregten Atom auf das Elternion hervorgerufen werden.
Die bisher kommerziell vertriebenen Tandem-Massenspektrometer haben für die Messung einer Mehrzahl von Substanzen aus einer Probe immer eine relativ geringe Empfindlichkeit, da stets für die Auswahl einer Ionensorte für die weitere Präparation bis zur Analyse ihrer Fragmentionen alle anderen Ionensorten vernichtet werden und für weitere Analysen nicht mehr zur Verfügung stehen. Für weitere Analysen anderer Ionensorten oder anderer Substanzen der gleichen Probe müssen unter weiterem Probenverbrauch jeweils neue Ionen generiert werden. Da für viele biochemische Fragestellungen nur sehr wenig Probenmaterial zur Verfügung steht, sind die bisherigen Tandem-Massenspektrometer nachteilig. So ist es ein Wunschziel vieler Molekularbiologen, das Proteom einer einzigen Zelle, das aus nur etwa 10⁸ Protein-Molekülen besteht, bestimmen zu können. Aber selbst in größeren Mengen an ursprünglichem Probenmaterial können sich interessierende Analytsubstanzen in so extrem geringen Mengen befinden, dass, etwa nach einer Extraktion mit einer entsprechenden Mischung von Antikörpern, nur sehr wenig Analytmoleküle für eine Bestimmung der relativen Konzentrationen zur Verfügung stehen. Beispielsweise beträgt die Konzentrationen der medizinisch außerordentlich interessanten 20 bis 30 verschiedenen Interleukine nur jeweils etwa 10 bis 100 Attomol pro Milliliter. In einem Extrakt aus 100 Millilitern finden sich somit nur gerade noch so eben nachweisbare Mengen an Interleukinen, nicht ausreichend für eine heutige MS/MS-Analyse.
Dabei muss jedoch die massenselektive Auswahl und Isolierung einer Ionensorte nicht zwangsweise mit einer Zerstörung aller anderen Ionen verbunden sein. Es kann beispielsweise eine Überführung der Ionen einer ausgewählter Ionensorte von einem Ionenspeicher in einen anderen Ionenspeicher vorgenommen werden, ohne die nicht ausgewählten Ionen zu zerstören. Es ist seit langem bekannt, dass man Ionen massenselektiv von einer ersten Ionenzyklotronresonanzzelle in eine zweite überführen kann, wobei die nicht überführten Ionen in der ersten Zelle verbleiben. Auch die massenselektive Übertragung von Ionen aus einer Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle in eine benachbarte ist bekannt. Ganz allgemein kann man Ionen aus Ionenfallen durch Resonanzprozesse massenselektiv auswerfen ohne die verbleibenden Ionen zu zerstören, dabei kann es sich um zweidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen mit vier Polstäben, um dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen mit Ringelektrode und Endkappenelektroden oder auch um Ionenzyklotronresonanzzellen handeln. Es handelt sich hier um das Grundprinzip aller Ionenfallen-Massenspektrometrie mit externem Ionennachweis, bei dem stets massenselektiv eine Ionensorte zur Messung ausgeworfen wird, während die übrigen Ionen unzerstört in der Ionenfalle verbleiben.
Ein relativ einfaches Verfahren für die massenselektive Überführung von Ionen ohne Vernichtung aller anderen Ionen ist im Patent US 6 177 668 B1 (J. W. Hager) zu finden. Hier wird ein Verfahren mit einem massenselektiven axialen Auswurf am Ende eines Hochfrequenz-Polstabsystems beschrieben. Der Auswurf der Ionen wird durch eine Anregung der Ionen im Streufeld am Ende des Polstabsystems bewirkt: „Trapped ions are axially mass selectively ejected by taking advantage of the mixing of the degrees of freedom induced by the fringing fields and other anti-harmonicities in the vicinity of the end lens. Thus, ions can be mass selectively ejected at the exit end at the same time as ions are being admitted into the entrance end of the rod set, thereby taking better advantage of the ion flux from a continuous ion source” (zitiert aus der Zusammenfassung des Patents). Dieser massenselektive Auswurf der Ionen wirft die Ionen in diesem Patent auf einen Ionendetektor, wirkt also selbst als ein Massenanalysator. Durch ein Scannen des Auswurfs nach Massen lässt sich so ein Massenspektrum aufnehmen. Der Schwerpunkt der Erfindung dieses Patentes liegt auf einer neuen Art eines Ionenfallen-Massenspektrometers durch diesen Massenscan mit einem hohem Nutzgrad der eingesetzten Ionen. Es lässt sich damit eine sehr zufrieden stellende Massenauflösung erzielen, wobei aber eine sehr langsame Scangeschwindigkeit in Kauf genommen werden muss. Die Aufnahme der Massenspektren dauert sehr lange, beispielsweise sind (nach den Daten aus dem Patent) für einen Massenscan über 3000 Masseneinheiten für eine Massenauflösung von R = 6000 insgesamt 24 Sekunden notwendig. Außerdem wird hier immer nur in einem Scan ein relativ kleiner Teil der Ionen (größenordnungsmäßig etwa fünf bis zwanzig Prozent) aus der Ionenfalle ausgeworfen.
J. W. Hager beschreibt aber in seinem Patent nicht nur die Anwendung dieses Ionenauswurfs im Streufeld als massenspektrometrisches Grundprinzip, er verwendet das Prinzip auch bereits als einen Massenselektor für die Auswahl von Elternionen für eine nachfolgende Fragmentierung, immer aber in Verbindung mit derselben Art der Ionenfallen-Massenspektrometrie mit axialem Ionenauswurf als Massenanalysator für die Fragmentionen und immer in Verbindung mit einem konstanten Einstrom von Ionen aus einer Ionenquelle. In diesem Patent wird nicht die allgemeine Bedeutung dieses Prinzips des Massenselektors für die Tandem-Massenspektrometrie im Allgemeinen und insbesondere für die Analyse eines abgeschlossenen Vorrats von Ionen erkannt und dargestellt.
Ein solcher Massenselektor, der Ionen eines ausgewählten kleinen Massenbereichs von einem Ionenspeicher in einen anderen Ionenspeicher transportieren kann, ohne die nicht ausgewählten Ionen zu zerstören, wird nachfolgend ein „Ionentor” (ion gate) genannt.
Aus der Offenlegungsschrift WO 2001/015201 A2 (Reinhold et al.) ist ein Mehrstufen-Massenspektrometer (”Multiple Stage Mass Spectrometer”) bekannt, in dem mehrere massenselektiv arbeitende Ionenspeicher angeordnet sind (”Linear Trap Array”). Das Mehrstufen-Massenspektrometer wird als Tandem-Massenspektrometer verwendet, wobei zu fragmentierende Elternionen massenselektiv von einem Ionenspeicher in einen nachfolgenden Ionenspeicher überführt und dort fragmentiert werden, ohne die restlichen nicht-selektierten Ionen im Ausgangsionenspeicher zu zerstören. Die aus den selektierten Elternionen hervorgehenden Tochterionen werden in einem den Ionenspeichern nachfolgenden externen Ionendetektor (”External Ion Detector”) analysiert.
Wenn hier von „Masse der Ionen” oder auch nur einfach von „Masse” in Verbindung mit Ionen die Rede ist, so ist stets die „ladungsbezogene Masse” m/z gemeint, also die physikalische Masse m der Ionen geteilt durch die dimensionslose und absolut genommene Anzahl z der positiven oder negativen Elementarladungen, die dieses Ion trägt.
Unter „Analyse” einer Ionensorte oder einer Substanz soll hier sowohl die Feststellung der Menge relativ zu anderen Ionensorten oder anderen Substanzen (die „quantitative Analyse”) verstanden werden, wie auch die Feststellung der Identität der Ionensorte oder Substanz (die „qualitative Analyse”) über weitergehende Messungen, beispielsweise aus Messungen der inneren Struktur der Ionen, oder auch nur die Feststellung der Struktur, bei Biopolymeren die Sequenz der unmodifizierten oder modifizierten Polymerbausteine der Ionen einer Ionensorte überhaupt (die „Strukturanalyse”, „Sequenzanalyse”, „Modifikationsanalyse” und dergleichen).
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren und Geräte bereitzustellen, mit denen aus sehr kleinen Probenmengen eine größere Anzahl von Substanzen mit höchster Empfindlichkeit sicher analysiert werden können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Im Verfahren der Erfindung werden zunächst Ionen einer Probe (oder einer Teilprobe) außerhalb des Vakuumsystems des Massenspektrometers erzeugt und in einem Speicherreservoir innerhalb des Massenspektrometers gespeichert. Ist das Speicherreservoir mit genügend vielen Ionen gefüllt, oder ist die gesamte Probe ionisiert, wird die weitere Zufuhr von Ionen unterbunden, um die Konzentrationsverhältnisse im Speicherreservoir während der kommenden Analysen der verschiedenen Substanzen der Probe nicht zu verändern. Es kann jedoch auch genügen, einfach eine weitere Ionisierung durch Abschaltung von Spannungen zu been den. Des Weiteren wird die Einfuhröffnung für die Ionen, die auch Umgebungsgas in das Massenspektrometer einlässt, durch eine besondere Einrichtung verschlossen werden.
Nach Abschluss der Füllung des Speicherreservoirs wird jetzt eine Elternionensorte ausgewählt, die zuerst analysiert werden soll. Diese Elternionen werden nun durch ein massenselektives Ionentor aus dem ersten Speicherreservoir exportiert, ohne dabei andere Ionen des Speicherreservoirs zu vernichten. Es sollen dabei möglichst wenige andere Ionensorten mit exportiert werden, das heißt, der exportierte Massenbereich soll möglicht klein sein. Die exportierten Ionen werden dann in einer der üblichen Weisen fragmentiert und die Fragment ionen in einem Massenanalysator hoher Massenauflösung und hohen Nutzgrades für die Ionen durch die Aufnahme des Fragmentionenspektrums analysiert.
Das Verfahren kann sodann für andere Ionensorten der ersten Analytsubstanz und für beliebig viele Ionensorten der anderen Analytsubstanzen wiederholt werden, ohne dass dafür stets neue Ionen aus neuem Probenmaterial erzeugt werden müssen, wie das bei heute üblichen Tandem-Massenspektrometern der Fall ist. Andere Ionensorten der gleichen Analytsubstanz können Ionen mit anderem Ladungszustand, beispielsweise dreifach statt zweifach geladene Ionen, andere Ionen der Isotopengruppe oder aber auch Ionen anderer Verdaupeptide des Analytproteins sein. Aus den Fragmentionenspektren können letztendlich die Identitäten, die Konzentrationen oder die Strukturen aller zu untersuchenden Analytsubstanzen bestimmt werden. Für quantitative Bestimmungen sollen sich nach den Regeln guter Laborarbeit unter den Analytsubstanzen auch Referenzsubstanzen bekannter Art und Konzentration befinden, die zur Konzentrationsbestimmung dienen, aber auch für die ständige Überprüfung des Verfahrens verwendet werden können. Das Verfahren soll zuvor für die Analytsubstanzen kalibriert worden sein.
Die Ionen im Speicherreservoir bleiben bei entsprechender Konstruktion des Vakuumsystems durchaus über Zeiten von vielen Minuten hinweg fast unverändert, aber abhängig von der Reinheit des Vakuumsystems und der Reinheit des zugeführten Dämpfungs- und Stoßgases lassen sich störende Veränderungen der Ionen, hauptsächlich über teilweise Entladungen von höher geladenen Ionen, über längere Zeiten in der Größenordnung von halben oder ganzen Stunden hinweg nicht vollständig vermeiden. Da jedoch das erfindungsgemäße Tandem-Massenspektrometer für die Analyse einer Vielzahl von Ionensorten eingesetzt werden soll, beispielsweise für die Analyse von 20 bis 200 Ionensorten, die zu etwa 5 bis 20 verdauten Proteinen gehören können, ist hier ein schneller Massenanalysator zur Aufnahme der Fragmentionenspektren durchaus günstig, möglicherweise sogar erforderlich. Ein Massenanalysator soll hier als „schnell” betrachtet werden, wenn er etwa ein volles Fragmentionenspektrum pro Sekunde aufnehmen kann. Es können dann viele Analytsubstanzen in relativ wenigen Minuten analysiert werden. Es ist auch günstig, wenn der Massenanalysator ein hohes Massenauflösungsvermögen, beispielsweise R = m/Δm > 10 000, besitzt. Weiter ist günstig, dass er zur Aufnahme der Fragmentspektren einen hohen Massenbereich besitzt, dass er beispielsweise Fragmentionenspektren über den Bereich von etwa 50 bis 4000 atomaren Masseneinheiten aufzunehmen gestattet.
Das erfindungsgemäße, neuartige Tandem-Massenspektrometer besteht also mindestens aus (a) einer Ionenquelle für die Ionisierung der Probe außerhalb des Vakuums des Tandem-Massenspektrometers, (b) einem Speicherreservoir für die Ionen der Probe innerhalb des Vakuums des Tandem-Massenspektrometers, (c) einer Einrichtung zur Beendigung der Zuführung von Ionen in das Speicherreservoir, die auch die Zufuhr von Umgebungsgas in das Vakuum des Tandem-Massenspektrometers unterbindet, (d) einem Ionentor, das Ionen eines ausgewählten kleinen Massenbereichs aus dem Speicherreservoir exportiert und alle anderen Ionen unbeschädigt im Speicherreservoir zurücklässt, (e) einer Fragmentierungseinrichtung für die exportierten Ionen und (f) einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Einschuss für die Aufnahme des Massenspektrums der Fragmentionen. Der Massenanalysator soll bei guter Massenauflösung schnell sein und die angebotenen Ionen gut ausnutzen. Ein bevorzugter Massenanalysator ist ein Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss.
Das Speicherreservoir kann auch mit Einrichtungen versehen sein, negative Ionen einzuschießen oder Reaktantgase verschiedener Arten zuzugeben, um durch Ionen-Ionen-Reaktionen oder durch Ionen-Molekül-Reaktionen bestimmte gewünschte Veränderungen der Ionenpopulation vor der Analyse der Analytsubstanzen vorzunehmen. Beispiele für solche Reaktionen sind Verminderungen der Ladungen an hoch geladenen Ionen („charge stripping”), oder Austausch von Wasserstoff durch Deuterium.
Als Massenanalysatoren kommen zwar prinzipiell fast alle Arten von Massenspektrometern in Frage, die eingangs als Massenanalysatoren für Tandem-Massenspektrometer aufgeführt wurden. Besonders günstig sind aber hier Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss, da sie eine schnelle Spektrennahme, eine hohe Massengenauigkeit, einen hohen Massenbereich, eine gute Ausnutzung der Ionen („duty cycle”) und einen hohen dynamischen Messbereich bei vergleichsweise geringen Herstellungskosten bieten. Relativ ungünstig sind hingegen Quadrupol-Massenanalysatoren und magnetische Sektorfeld-Massenanalysatoren, weil diese wiederum als Massenfilter arbeiten, jeweils nur eine Ionensorte nach der anderen für eine Messung ausfiltern und währenddessen alle anderen Ionensorten vernichten.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt ein einfaches Schema eines Tandem-Massenspektrometers nach dieser Erfindung, mit einer Nanoelektrosprüh-Ionenquelle (1, 2), einer Einlasskapillare (3), einem Verschlussmechanismus (19) für die Einlasskapillare (3), einem Ionentrichter (4), einem ersten Speicherreservoir (6), dessen Ende das Ionentor bildet, mit einem koaxialen Lochblendenbündel (7, 8, 9), deren erste Lochblende (7) für die Anregung der ausgewählten Ionensorte für den Export geschlitzt ist (in der schematischen Darstellung nicht sichtbar), einem zweiten Speicherreservoir (10), das hier auch als Stoßzelle für die Fragmentierung der exportierten Ionen dient, und einem Flugzeitmassenanalysator, bestehend aus Linsensystem (11) zur Formung eines feinen Ionenstrahls, Pulser (12), Reflektor (13) und Ionendetektor (14).
2 zeigt einen Querschnitt durch das Ende des Speicherreservoirs (6) mit vier Polstäben (21–24) und vier Hilfselektroden (25–28).
Die 3, 4 und 5 zeigen Formen der ersten Lochblende am Ende des quadrupolaren Stabsystems, wobei die Lochblende zur Anregung der ausgewählten Ionensorte geschlitzt ist: in 3 ist die Blende kreuzförmig geschlitzt für eine zirkumpolare Anre gung, in 4 und 5 ist sie einfach geschlitzt, einmal für eine klassische und einmal für eine diagonale Anregung.
Die 6 und 7 geben Querschnitte durch Stabsysteme wieder, die durch Form (41) oder Dislozierung (42) jeweils eines Polstabs das quadrupolare Hochfrequenzfeld im Inneren jeweils mit einem hexapolaren Multipolfeld überlagern.
8 gibt einen Querschnitt durch ein Stabsystem wieder, das durch die Form zweier Polstäbe (43, 44) das quadrupolare Hochfrequenzfeld im Inneren mit einem oktopolaren Multipolfeld überlagert.
9 zeigt, wie durch jeweils zwei zusammen geschaltete Hilfselektroden in einem Stabsystem, das eine hexapolare Überlagerung liefert (siehe 6), eine günstige dipolare Anregung mit einer Anregungswechselspannung erzeugt wird.
Bevorzugte Ausführungsformen
Bevorzugte Ausführungsformen und Verfahren werden in den Ansprüchen 1 bis 20 dargelegt.
Im Unterschied zu J. W. Hager wird in dieser Erfindung eine Probe (oder Teilprobe) vollständig ionisiert und die Ionen werden in einem genügend großen Speicherreservoir gespeichert, ohne dass während der Analysenvorgänge für die verschiedenartigen Bestandteile der Probe weitere Ionen in das Speichereservoir eingelassen werden. Bei J. W. Hager wird es geradezu als Vorteil angesehen, während der Analyse weitere Ionen in das Volumen einströmen lassen zu können.: „Thus, ions can be mass selectively ejected at the exit end at the same time as ions are being admitted into the entrance end of the rod set, thereby taking better advantage of the ion flux from a continuous ion source”. (Zitiert aus der Zusammenfassung des Patentes).
Das Ionentor wird in der hier vorliegenden Erfindung für für die selektierende Überführung der Ionen in ein nächstes Speicherreservoir verwendet. Für die massenspektrometrische Aufnahme der Fragmentionen wird in dieser Erfindung ein Massenanalysator bevorzugt, der für diese Aufgabe wesentliche Eigenschaften besitzt, wie Schnelligkeit der Spektrenaufnahme, Massenauflösung, hoher Massenbereich und insbesondere eine hohe Massengenauigkeit in der Größenordnung von wenigen Millionsteln der Masse (ppm). Vorzugsweise wird ein Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem Ioneneinschuss verwendet.
Das Speicherreservoir kann in verschiedenen Formen gebaut werden, wobei stets der größte Teil der Wände eine Struktur aus Elektroden besitzt, an denen die beiden Phasen einer Hochfrequenzspannung ein Pseudopotential aufbauen, das Ionen beider Polaritäten abstößt und damit in dem Speicherreservoir einsperren kann. Die Grundlagen für ein solches Speicherreservoir sind in Patent US 5 572 035 A angegeben (J. Franzen). Ein Teil der Wände kann auch Elektroden mit einem Ionen abstoßendem Gleichspannungspotential tragen, dann sind aber nur Ionen einer einzigen Polarität speicherbar. Diese Einschränkung ist aber nicht nachteilig, da gleichzeitig gespeicherte Ionen verschiedener Polarität nur miteinander reagieren und sich so weitgehend gegenseitig vernichten würden. Besonders günstig sind hier relativ einfache Speicherreservoire, die seit langem bekannt sind und als Hexapol- oder vorzugsweise als Quadrupol-Stabsysteme mit endständigen koaxialen Lochblendensystemen aufgebaut sind. Die günstigste Form des Speicherreservoirs hängt weitgehend von der Art des verwendeten Ionentors ab.
Es gibt verschiedene Arten massenselektiver Ionentore. Sie basieren in der Regel auf einer zumindest anfänglichen resonanten dipolaren Anregung der Ionen zu schwingenden Bewegungen, bedingen also eine Kammer, in der die Ionen durch rücktreibende Zentralkräfte Oszillationen ausführen können. So können beispielsweise die ausgewählten Elternionen aus einem Quadrupo1-Stabsystem, das als erstes Speicherreservoir fungiert, durch resonante dipolare Anregung ihrer sekularen Schwingungen in radialer Richtung aus Schlitzen in den Polstäben massenselektiv ausgeworfen, in einem Ionentrichter eingefangen und zu einer Fragmentierungskammer weitergeleitet werden. Dieser Auswurf führt allerdings zu hohen kinetischen Energien der ausgeworfenen Ionen. In ähnlicher Weise können Ionen aus einer dreidimensionalen Ionenfalle mit Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden massenselektiv ausgeworfen werden, ohne die restlichen Ionen zu beschädigen. Dieser massenselektive Export von Ionen ist die Grundlage aller Massenanalysen mit Ionenfallen.
Eine prinzipiell andere Art eines solchen massenselektiven Ionentors basiert wiederum auf einem Quadrupolfeld zwischen vier Polstäben, exportiert die ausgewählten Elternionen aber axial in ein zweites Speicherreservoir, siehe J. W. Hager, oben zitiert. Diese Art von Ionentor beruht grundsätzlich auf dem Vorhandensein dreier Charakteristika: erstens muss lokal eine Schwächung im axialen Verlauf dieses hochfrequenten Quadrupolfeldes vorliegen, die zwangsweise mit axialen Kraftkomponenten des damit generierten Pseudopotentials verbunden ist, zweitens muss eine Einrichtung zur resonanten Anregung der ausgewählten Ionensorte in radialer Richtung vorhanden sein und drittens muss eine schwache Gleichspannungsbarriere quer zur Achsenrichtung das Durchtreten der Ionen aus dem ersten Speicherreservoir in das zweite verhindern, so lange die Ionen nicht zusätzlich Energie erhalten.
Die lokale Schwächung des Quadrupolfeldes kann beispielsweise durch eine eng lokalisierte Änderung im Querschnitt des Stabsystems, beispielsweise durch Einfräsungen, Kerben oder Löcher in den Polstäben, besonders einfach aber durch das Streufeld am Ende des Stabsystems gebildet werden. Hier kann eine Ionenlinse aus Lochblenden die Gleichspannungsbarriere formen. Ist beispielsweise die erste Lochblende dieser Lochblendenlinse quergeteilt, so kann durch sie auch die radiale Anregung der Elternionen erfolgen. In anderen Ausbildungen kann sowohl die Gleichspannungsbarriere wie auch die dipolare Anregung durch Hilfselektroden zwischen den Polstäben des Quadrupolsystems bewirkt werden.
Am Ort einer zunehmenden Schwächung des Quadrupolfeldes in seinem axialen Verlauf, beispielsweise am Ende des Polstabsystems, gibt es außerhalb der Achse axiale Komponenten des Pseudopotentialgradientens (des elektrischen Pseudofeldes). Werden die ausgewählten Elternionen an diesem Ort radial resonant angeregt, so erleben sie bei einer Vergrößerung ihrer radialen Oszillationen zunehmend die axial nach außen gerichtete Kraft der axialen Komponente des Pseudofeldes, durch die sie eine axial gerichtete Beschleunigung erhalten, dadurch die Gleichspannungsbarriere überwinden und in das zweite, anschließende Speicherreservoir eintreten können. Bei kontinuierlichem Betrieb der radialen Anregung werden somit die ausgewählten Elternionen kontinuierlich in das zweite Speicherreservoir transportiert, wobei ihre Konzentration im ersten Speicherreservoir vor dem Ionentor kontinuierlich abnimmt. Die Diffusion der Ionen in axialer Richtung sorgt für ständigen Nachschub.
Es werden weiter unten verschiedene Ausführungsformen dieses axial wirkenden Ionentors diskutiert, die sich durch die Art der radialen Anregung der ausgewählten Ionensorte und durch verschiedenartige Ausbildungen des Polstabsystems unterscheiden.
Da die Kapazität eines jeden Ionenspeichers begrenzt ist und durch hohe Raumladungen weiträumige Entmischungen von Ionen verschiedener ladungsbezogener Massen stattfinden, wodurch eine konzentrationstreue Entnahme von Ionen erschwert wird, kann das erste Speicherreservoir auch eine Einrichtung besitzen, vorbekannte (oder vorher gemessene) Ionensorten besonders hoher Häufigkeit, aber ohne Interesse für die analytische Aufgabe, zu entfernen. Damit wird der dynamische Messbereich dieses neuartigen Tandem-Massenspektrometers erhöht.
Eine bevorzugte Ausführungsform des ersten Speicherreservoirs (6) verwendet ein etwa 20 Zentimeter langes quadrupolares Stabsystem aus vier einfachen Rundstäben (21, 22, 23, 24) mit einem Scheitelabstand von etwa zwei Zentimetern. Hyperbolisch geformte Stäbe sind ebenfalls möglich, aber nicht unbedingt erforderlich. An den Enden des Polstabsystems (6) befinden sich Bündel koaxialer Lochblenden (5, 7, 8, 9), die mit Gleichspannungen belegt werden können und so die Ionen einer gewünschten Polarität durch Gegenspannungen im Inneren des Stabsystems (6) halten können. Die Kammer um das Stabsystem herum ist durch einen Vorratsbehälter (18) mit einem nichtreaktiven Dämpfungsgas befüllt, beispielsweise mit Helium, doch sind auch andere leichte Dämpfungsgase möglich, wie etwa Reinststickstoff. Bei einem Druck im quadrupolaren Speicherreservoir (6) von etwa 10^–2 Pascal werden sämtliche Bewegungen eingefüllter Ionen einschließlich ihrer Oszillationen quer zur Achse innerhalb von wenigen Millisekunden so gedämpft, dass sich die Ionen in der Längsachse des Stabsystems (6) sammeln. Sie frieren jedoch nicht völlig ein, sondern bewegen sich immer noch mindestens mit thermischen Energien und vermischen sich ständig zumindest in axialer Richtung durch diese Diffusionsbewegungen.
Der optimale Querschnitt des quadrupolaren Stabsystems (6) für das Speicherreservoir hängt sehr stark von der genauen Art des verwendeten Ionentors ab und kann nur zusammen mit der Funktion dieses Ionentors diskutiert werden. In den 2, 6, 7 und 8 sind verschiedenartige Querschnitte gezeigt.
Es ist seit langem bekannt, dass sich Ionen in dreidimensionalen Ionenfallen aus Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, aber auch in anderen Formen von Ionenspeichern über längere Zeiten (viele Minuten) ohne wesentliche Verluste speichern lassen, wenn auch nach noch längeren Zeiten leichte Veränderungen der Ionen, insbesondere Verringerungen der Ionenladungen, zu beobachten sind. Für einen Hexapolspeicher im Ultrahochvakuum-Bereich eines FTICR-Massenspektrometers siehe dazu beispielsweise: „A Gated-beam Electrospray Ionization Source with an External Ion Reservoir. A New Tool for the Characterization of Biomolecules Using Electrospray Ionization Mass Spectrometry”, Steven A. Hofstadler et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 13, S. 1971–1979 (1999).
Ein voluminöses quadrupolares Stabsystem (6) kann bis zum Überlauf etwa 10⁸ bis 10¹⁰ Ionen aufnehmen. Es ist jedoch nicht zweckmäßig, so viele Ionen einzufüllen, da sich die Ionen dann im Inneren großräumig radial entmischen und so eine konzentrationsproportionale Entnahme erschweren. Leichte Ionen sammeln sich in der Achse, schwere Ionen werden durch die Raumladung weit nach außen gedrängt, weil die rücktreibenden Pseudokräfte des quadrupolaren Hochfrequenzfeldes für diese schwereren Ionen kleiner sind als für leichtere Ionen. Die Anzahl der Ionen sollte daher auf etwa 10⁶ bis maximal 10⁸ Ionen beschränkt werden. Eine Anzahl von etwa 10⁷ Ionen kann sich bei genügender Länge des Polstabsystems in einer fadenförmigen Wolke von nur wenig mehr als etwa einem Millimeter Durchmesser in der Achse des Polstabsystems sammeln, womit die Ionen aller ladungsbezogenen Massen mit etwa gleicher Wahrscheinlichkeit entnommen werden können. Die leichten Ionen befinden sich zwar auch hier innen, sehr achsennah, und die schwereren Ionen außen; alle Ionen aber können relativ gut durch ein dipolares Anregungsfeld erfasst und resonant zu Oszillationen quer zur Achse angeregt werden.
Das Speicherreservoir soll mit einen Dämpfungsgas im Druckbereich von etwa 10^–4 bis 1 Pascal, vorzugsweise etwa 10^–2 Pascal, betrieben werden, um die gespeicherten Ionen in ihrer Bewegung zu dämpfen. Als Dämpfungsgas kommen beispielsweise Edelgase wie Helium oder Argon, aber auch Reinststickstoff zur Anwendung. Diese niedermolekularen oder sogar edlen Gase können nicht mit den Ionen reagieren, da ihre Reaktionsaffinitäten, besonders auch ihre Protonenaffinitäten, zu gering sind. Das Dämpfungsgas und das zugrunde liegende Ultrahochvakuum müssen jedoch frei von Substanzdämpfen höheren Molekulargewichts sein, da diese mit den gespeicherten Ionen in vielfältiger Weise reagieren können. Die häufigste Reaktionsweise ist dabei die Protonenübertragung von mehrfach positiv geladenen Analytionen auf die Verunreinigungsmoleküle. Dabei wird der Ladungszustand der Analytio nen verringert; es findet so genanntes „Charge Stripping” statt. Dabei ist die Entstehung neuer Ionen der Verunreinigungssubstanzen nicht so schädlich wie die Verringerung der Konzentration der höher geladener Analytionen, die gerade als Elternionen für die Fragmentierung sehr günstig sind. Das Vakuumsystem muss daher nach den Regeln von Ultrahochvakuum-Systemen (UHV) aus entsprechenden Materialien wie Metall und Keramik und mit entsprechenden Reinigungsmethoden gefertigt sein. Wird Helium als Dämpfungsgas verwendet, so ist es in der Regel äußerst rein; es müssen aber die Zuleitungen und Druckminderer entsprechend sauber verlegt und gereinigt sein.
Ionen der gleichen Polarität können untereinander nicht reagieren, weil sie sich gegenseitig durch ihre Ladung abstoßen; sie können sich daher wegen ihrer relativ geringen kinetischen Energie nicht auf solch kurze Abstände nähern, wie sie für chemische Reaktionen unabdingbar notwendig sind. Es sind also nur Reaktionen mit Ionen anderer Polarität oder mit Neutralteilchen möglich.
Zwischen den vier Rundstäben (21–24) können in einer günstigen Ausführungsform jeweils draht- oder schneidenförmige Elektroden (25–28) angebracht sein. Diese Elektroden werden im Weiteren als „Hilfselektroden” bezeichnet; sie können insbesondere in Längsrichtung in verschiedene getrennte, voneinander isolierte Abschnitte eingeteilt sein oder auch nur bestimmte Abschnitte überdecken. Durch Anlegen verschiedener Gleich- und Wechselspannungen an diese Hilfselektroden oder durch Spannungsabfälle an verschiedenen Hilfselektrodenabschnitten längs der Achse können verschiedenartige Effekte erzielt werden: Es kann beispielsweise eine Gleichspannungsbarriere errichtet werden, oder es kann die Ionenwolke im Inneren umgerührt oder in Längsrichtung bewegt werden. Es können vorgewählte Ionensorten durch dipolar angelegte Wechselspannungen an zwei gegenüberliegenden Hilfselektroden (zum Beispiel 25 und 27) angeregt werden, beispielsweise, um sie durch ein Ionentor zu exportieren, aber auch, um unerwünschte Ionen aus dem Reservoir quer zur Achse auszuwerfen. Ein solches Auswerfen von Ionen ist günstig, wenn das Ionengemisch vorwiegend aus einigen wenigen Ionensorten besteht, die jedoch analytisch nicht interessieren, aber den wesentlichen Teil der Raumladung bilden. Der Auswurf aller Ionen dieser wenigen hochkonzentrierten Ionensorten ermöglicht es, das Ionenreservoir (6) mit den analytisch interessierenden Ionen zu füllen, so dass auch Ionen sehr geringer Konzentration gemessen werden können.
Das Speicherreservoir wird vorzugsweise durch ein koaxiales Lochblendensystem (5) an einer Stirnseite mit Ionen aus einer Ionenquelle (1, 2) befüllt. Die Ionenquelle kann sich innerhalb oder auch außerhalb des Vakuumsystems befinden.
Besonders günstig ist hier eine besondere Abart einer Elektrosprüh-Ionenquelle, die sich Nanoelektrosprüh-Ionenquelle nennt und außerhalb des Vakuumsystems arbeitet ( US 5 504 329 A , M. Mann und M. Wilm). Diese Ionenquelle wird mit wenigen Mikrolitern einer gelösten Probe beschickt, die sich in einer winzigen, zu einer feinen Spitze ausgezogenen Kapillare (2) befinden. Die Spitze hat eine Öffnung von nur etwa vier Mikrometer Durchmesser. Eine elektrische Sprühspannung von etwa einem Kilovolt zieht die Flüssigkeit zu einem Taylor-Konus aus, von dessen Spitze aus ein kontinuierlicher Strom kleinster, geladener Tröpfchen fortfliegt. Diese Tröpfchen werden in einem warmen bis heißen Gegenstrom aus reinem Umgebungsgas, beispielsweise Reinststickstoff, getrocknet. Es bleiben nach dem Trocknen der Mikrotröpfchen in der Regel mehrfach geladene Ionen der gelösten Substanzen zurück. Diese Ionen werden in üblicher Weise in das Vakuumsystem eingeführt, beispielsweise können sie durch eine Einlasskapillare (3) mit umgebendem Reinststickstoff ins Vakuum gesaugt werden. Sie werden im Vakuumsystem in mehreren differentiellen Pumpstufen vom eingesaugten Umgebungsgas befreit und im Ionenreservoir gespeichert. Für die Abtrennung vorn Umgebungsgas können insbesondere Ionentrichter (4) ( US 6 107 628 A , R. D. Smith und S. A. Shaffer) verwendet werden. Es können mit einer solchen Einrichtung etwa 10⁶ Ionen pro Sekunde in das Speicherreservoir eingespeichert werden. Eine optimale Füllung kamt also in etwa 10 bis 100 Sekunden vollendet werden, vorausgesetzt, dass aus dem Speicherreservoir nicht ständig uninteressante Ionen zur Erhöhung der Messdynamik wieder ausgeworfen werden.
Nach der Befüllung des Speicherreservoirs wird der Zustrom weiterer Ionen unterbunden, um für die nachfolgenden Analysen keine Änderungen der Konzentrationen zu erleben. Dieser Schritt ist ein wesentlicher Teil der Erfindung. Die Unterbindung des Zustroms findet automatisch statt, wenn die Probe vollständig verbraucht ist, kann aber beispielsweise auch einfach durch ein Absenken der Sprühspannung der Nanoelektrosprüh-Ionenquelle erreicht werden. Günstiger ist es allerdings, durch ein Verschließen der Einlasskapillare (3) durch eine besondere Verschlusseinrichtung (19) auch den Zustrom von Umgebungsgas (etwa Reinststickstoff) und damit den Zustrom von Spurenverunreinigungen zu unterbinden. Der Reinststickstoff ist dann im Inneren des Massenspektrometers in wenigen Sekunden abgepumpt. Es kann dann beispielsweise im Inneren des Massenspektrometers mit sehr sauberen Helium als Stoß- und Dämpfungsgas gearbeitet werden, unabhängig von der Wahl des Umgebungsgases der Nanoelektrosprüh-Ionenquelle.
Selbstverständlich können hier auch andere Arten von Ionenquellen außerhalb des Vakuumsystems, unter anderem auch MALDI, verwendet werden. Jedoch ist die Verwendung des Nanoelektrosprühens (1, 2) besonders vorteilhaft, weil sie eine hohe Ausbeute an Ionen pro eingesetztem Molekül und einen hohen Anteil an mehrfach geladenen Ionen der Substanzen liefert. Diese mehrfach geladenen Ionen eignen sich besonders gut für eine gleichmäßige und informationsreiche Bildung von Fragmentionen.
Die Ionen können in diesem ersten Speicherreservoir (6) in vielfältiger Weise für die weitere Analyse präpariert werden. So können besonders häufige Ionensorten die für die analytische Aufgabe uninteressant sind, wie oben bereits angedeutet, aus dem Speicher ausgeworfen werden. Das kann beispielsweise durch eine starke resonante Anregung durch die oben geschilderten Hilfselektroden (25–28) geschehen. Es kann aber auch durch eine resonante Anregungsspannung geschehen, die an zwei einander gegenüberliegende Polstäbe (zum Beispiel 21, 23) selbst gelegt wird. Diese Ionen können aber schließlich auch durch das Ionentor selbst entfernt werden. Das Entfernen kann bereits während der Befüllung vorgenommen werden, um es gar nicht erst zu einer Überfüllung des Reservoirs kommen zu lassen.
Manchmal sind reaktive Veränderungen der Ionen im Speicherreservoir wünschenswert. Sie können im Speicherreservoir vorgenommen werden, indem entsprechende Reaktantgase willkürlich eingeführt werden. Ein Beispiel dazu ist ein Austausch von Wasserstoffatomen der Ionen durch Deuteriumatome; aber auch vielfältige Arten von Derivatisierungen der Ionen mit chemischen Gruppen sind möglich. Durch das Einführen von Ionen entgegen gesetzter Polarität ist es möglich, den Ladungszustand hoch geladener Ionen zu verringern („Charge stripping”), also beispielsweise fünf- bis zwanzigfach geladene positive Ionen durch den Einschuss von negativen Ionen, die Protonen aufnehmen können, auf zwei bis drei Ladungen pro Ion zu reduzieren. Werden negative Ionen eingelassen, die leicht Elektronen abgeben, so können große, mehrfach positiv geladene Proteine bereits in diesem Speicherreservoir durch „Electron Transfer Dissociation” gespalten werden. Die Ionen der anderen Polarität können beispielsweise aus einer entsprechend gewählten Materiallösung durch die gleiche Elektrosprüh-Ionenquelle (1, 2) mit entgegengesetzt gepolter Sprühspannung erzeugt und in analoger Weise durch den Ionentrichter (4) und das Lochblendenbündel (5) in das Speicherreservoir (6) eingebracht werden und dort reagieren, auch wenn das Speicherreservoir für die dauerhafte Speicherung von Ionen dieser Polarität nicht eingerichtet ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines Ionentors verwendet das Streufeld am Ende des quadrupolaren Speicherreservoirs (6) für die Bereitstellung der axialen Komponenten des Pseudofeldes, das zum Export ausgewählter Elternionen in ein anschließendes zweites Speicherreservoir dient. Am Ausgang des Stabsystems des ersten Speicherreservoirs befindet sich für gewöhnlich eine Ionenlinse aus koaxial angeordneten Lochblenden (7, 8, 9), an denen Gleichspannungen liegen, die die ausgangsseitige Potentialbarriere formen. Diese Potentialbarriere hält die gedämpften Ionen innerhalb des ersten Speicherreservoirs (6). Solange das Speicherreservoir (6) befüllt wird, und die Ionen noch höhere kinetische Energien besitzen, wird diese Potentialbarriere durch höhere Spannungen unüberwindbar gemacht. Nach vollständiger Befüllung des Speicherreservoirs und nach Dämpfung der Ionen werden die Linsenspannungen erniedrigt, so dass diese Potentialbarriere dann in der Mitte einen relativ niedrigen Überlauf hat, der aber immer noch die in ihrer Bewegung gedämpften Ionen des Speicherreservoirs zurückhält. Durch diesen Überlauf im Lochblendensystem (7, 8, 9) können die Ionen exportiert werden, aber nur, wenn sie durch eine axial wirkende Kraft eine entsprechende kinetische Energie zur Überwindung der Potentialbarriere erhalten.
Im Inneren des Polstabsystems (6) ist das quadrupolare Hochfrequenzfeld überall längs der Achse im Querschnitt völlig identisch geformt. Die lokale Verringerung der Stärke im Streufeld am Ende des Polstabsystems (6) führt zu einer axialen Komponente des elektrischen Hochfrequenzfeldes und damit zu einer axialen Feld- oder Kraftkomponente des Pseudopotentials, die im Inneren des Stabsystems nicht existiert. Diese axiale Kraftkomponente ist abhängig vom Radius; sie ist in der Achse nicht vorhanden, steigt aber mit dem Radius zunehmend nach außen an. Das führt dazu, dass radial angeregte Ionen mit der Vergrößerung ihrer Schwingungsweite zunehmend die axial nach außen wirkende Kraftkomponente des Pseudopotentials im hochfrequenten Streufeld spüren, axial nach außen getrieben werden und in Achserrichtung die Gleichspannungspotentialbarriere des Linsensystems (7, 8, 9) überwinden können. Die Ionen werden axial in die nächste Kammer (das zweite Speicherreservoir 10) exportiert. Dazu muss nur die Potentialbarriere genügend tief eingestellt werden, so dass sie von den Ionen unter der Kraft der axialen Komponente des Pseudopotentials überwunden werden kann. Alle restlichen Ionen bleiben im ersten Speicherreservoir (6). Sie können später ebenfalls massenselektiv zu einer eigenständigen Analyse ihrer Konzentration ausgeworfen werden.
Es lassen sich mit dieser Art von Ionentor durchaus sehr gute Massenauflösungsvermögen für den massenselektiven Ionenexport erzielen. Das dazu notwendige langsame Ausfließen der Ionen der eingestellten Exportmasse stört nicht sonderlich, da das Ausfließen im Wesentlichen durch die recht langsame Ionendiffusion für den Nachschub bestimmt wird. Um den weit überwiegenden Teil der eingestellten Ionensorte ausfließen zu lassen, sind einige Hundert Millisekunden erforderlich. Es lassen sich dann Massenauflösungsvermögen der Selektion von R = 5000 bis R = 10 000 erreichen. Das reicht für die Abtrennung von Ionen einer nominalen Masse von Ionen der nächsten nominalen Masse.
Normalerweise kommt in der Tandem-Massenspektrometrie eine solch hohe Massenauflösung für die Selektion nicht zur Anwendung, da es erwünscht ist, dass alle Ionen einer Isotopengruppe fragmentiert werden. Nur dann ist eine Isotopenverteilungstreue auch im Fragmentionenspektrum zu erhalten. Eine solch hohe Massenauflösung kann aber sehr zweckmäßig sein, beispielsweise, wenn durch die Auswahl der monoisotopischen Ionen einer Ionensorte auch nur monoisotopische Fragmentionen erzeugt und gemessen werden sollen (Näheres dazu siehe unten). Gerade bei komplexen Gemischen kann das für die eindeutige Erkennung einer Substanz sehr hilfreich sein. Soll dagegen eine Isotopenverteilungstreue auch im Fragmentionenspektrum erhalten bleiben, so können die verschiedenen Ionen der Isotopengruppe auch nacheinander exportiert und im zweiten Speicherreservoir wieder gemischt werden.
Der Nachschub an Ionen für den Export durch das Ionentor kann aber auch gegenüber der reinen Diffusionsbewegung beschleunigt werden. Werden beispielsweise für die radiale Anregung der selektierten Ionen die oben beschriebenen Hilfselektroden verwendet, so können die selektierten Ionen im ganzen Speicherreservoir gleichmäßig zu Oszillationen angeregt werden. Weiter unten wird beschrieben, wie es möglich ist, die Amplitude dieser Oszillationen zu begrenzen. Jetzt kann man an verschiedene Hilfselektrodenabschnitte eine Gleichspannung so anlegen, dass im Inneren des Speicherreservoirs ein leichter Spannungsabfall erzeugt wird, der Ionen in Richtung auf das Ionentor vorwärts treibt. Es braucht sich hier nur Spannungsabfälle in Höhe von wenigen Zehnteln Volt bis zu maximal einigen Volt zu handeln. In der Achse des Speicherreservoirs wird dabei kein Spannungsabfall entstehen, da sich die gesamte Ionenwolke so verschiebt, dass sich jeder Spannungsabfall durch Raumladung ausgleicht. Außerhalb der Achse können aber die Ionen den Spannungsabfall fühlen; sie werden zum Ionentor getrieben. Schwingen nun die ausgewählten Ionen durch die Achse bis in Regionen außerhalb der stationären Ionenwolke, so erleben sie hier den Spannungsabfall und werden zum Ionentor getrieben.
Für die endständige Ausführungsform des Ionentors gibt es eine ganze Reihe von verschiedenartigen Unterarten, die sich durch die Einrichtung zur dipolaren Anregung der ausgewählten Elternionen und durch die Ausformung des Polstabssystems unterscheiden und die hier im Einzelnen kurz diskutiert werden sollen.
Ausführungsform 1: Anregung durch geteilte Linsenblende.
Die Lochblende des Linsensystems, die den Polstäben zugewandt ist, kann einfach oder kreuzweise quer geteilt sein und zusätzlich zum Gleichspannungspotential mit einer Bipolar oder zirkumpolar wirkenden Wechselspannung versorgt werden. Sie kann somit für die radiale Anregung der zu exportierenden Elternionen verwendet werden. Hier gibt es drei verschiedene Formen der Anregung:
Ausführungsform 1a: Anregung in der Ebene durch zwei Polstäbe des Speicherreservoirs („klassische Anregung”).
Hier hat der Schlitz der Lochblende eine Ausrichtung, die parallel zur Richtung zwischen zwei gegenüber liegenden Polstäben (22) und (24) ist, wie in 4 gezeigt. Diese Form der geteilten Lochblende mit den Hälften (29) und (30) führt zu einer Anregung der Ionen in einer Ebene, die durch die zwei gegenüber stehenden Polstäbe (21) und (23) aufgespannt ist. Diese Anregung ist ausreichend für einen massenselektiven Ionenexport, aber es ist nicht die optimale Anregung.
Ausführungsform 1b: Anregung in der Ebene durch die Lücke mitten zwischen den Polstäben des Speicherreservoirs („diagonale Anregung”).
Diese Form der Anregung hat einen entscheidenden Vorteil gegenüber der oben beschriebenen klassischen Anregungsweise. Es wird hier wiederum eine zweigeteilte Lochblende (31, 32) benutzt, doch liegt der Schlitz der Querteilung jetzt in der Richtung der gegenüber liegenden Lücken zwischen je zwei nebeneinander liegenden Polstäben, wie in 5 sichtbar. Bei dieser Art der Anregung werden die Ionen auf eine Schwingungsbahn gebracht, bei der die durch die Hochfrequenzspannung an den Polstäben (die „Treiber-Hochfrequenz”) eingeprägten Zwangsschwingungen der Ionen nicht in der Ebene der Sekularschwingungen, sondern senkrecht dazu stattfinden. Hierdurch wird bewirkt, dass im Streufeld die nach außen wirkenden Pseudokräfte bereits bei kleineren Schwingungsamplituden als bei der klassischen Anregung erreicht werden. Damit wird der Export der Elternionen erleichtert, der Export findet bei kleineren Amplituden statt.
Ausführungsform 1c: Zirkumpolare Anregung.
Für diese Art der Anregung ist es notwendig, die erste Lochblende wie in 3 kreuzweise zu schlitzen und eine vierphasige Anregungswechselspannung zu verwenden. Die vier Phasen der Anregungswechselspannung sind jeweils um 90° gegeneinander verschoben und werden reihum an die vier Blendenviertel (33, 34, 35, 36) angelegt. Die ausgewählten Elternionen werden dann resonant zu Kreisbahnen kleiner Amplitude, also kleinem Radius, angeregt. Hier werden die Pseudokräfte, die zum Export der Elternionen über die Potentialbarriere hinweg genügen, bereits bei sehr kleinen Auslenkungen aus der Achse erreicht.
Ausführungsform 2: Anregung durch Hilfselektroden, die sich zwischen den Polstäben des Speichereservoirs befinden.
Die ausgewählten Elternionen brauchen nicht durch geteilte Lochblenden angeregt zu werden; sie können auch durch die Hilfselektroden (25, 26, 27, 28) angeregt werden, die sich wie in 2 gezeigt in den Lücken zwischen den Polstäben (21, 22, 23, 24) befinden. Die radiale, lang anhaltende Anregung der ausgewählten Elternionen birgt aber immer die Gefahr einer Fragmentierung, wenn sie zu stark vorgenommen wird, das heißt, wenn sie zu großen und schnellen Schwingungsamplituden führt. Eine Fragmentierung im Speicherreservoir (6) ist aber unbedingt zu vermeiden, da sie mit einer Verfälschung der Konzentrationsverhältnisse einhergeht. Nur bei kleinen Schwingungsweiten sind die Geschwindigkeiten für eine gegebene Ionensorte langsam, und nur bei langsamen Stößen mit dem Dämpfungsgas bleiben die Stöße elastisch, nehmen also keine innere Energie auf.
Ausführungsform 2a: Begrenzte Länge der Hilfselektroden.
Die Hilfselektroden können die Anregung zwar prinzipiell in der gesamten Länge des Speicherreservoirs vornehmen, für manche Anwendungen ist es aber günstiger, die Anregung nur an längs geteilten Hilfselektroden im endständigen Teil des Speicherreservoirs vorzunehmen. Die Hilfselektroden dieses Abschnitts brauchen dabei nur eine Län ge von etwa 10 bis 20 Millimetern zu haben. Die Einschränkung der Anregung auf ein kleines Volumen des Speicherreservoirs ist hier bereits hilfreich gegen ein Fragmentierung. Diese dipolare Anregung darf trotzdem nur sehr vorsichtig vorgenommen werden, da im Prinzip die Amplituden der angeregten Ionen in Resonanz immer weiter steigen und nur durch Stöße mit dem Dämpfungsgas gebremst werden. Es muss also ein kritisches Gleichgewicht zwischen Anregung und Dämpfung eingestellt werden.
Die schwingenden Elternionen bleiben nicht ortsfest an einer Stelle, sondern wandern statistisch umher: kommen sie dabei in die Nähe des Endes des Polstabsystems, so erleben sie die nach außen gerichteten Kräfte des Pseudopotentials und werden exportiert. Sie fließen also allmählich aus dem Speicherreservoir aus. Das statistische Umherwandern (die Diffusion) wird durch die elastischen Stöße mit dem Dämpfungsgas unterstützt.
Diese Art der Anregung ist eigentlich nur dann günstig, wenn die Ionen sehr langsam im Quadrupolfeld schwingen, wenn es sich also um sehr schwere Ionen handelt und wenn das Quadrupolfeld sehr kleine Spannungen hat. Es ist daher für diesen Betrieb günstig, mit den schwersten Elternionen, die zu analysieren sind, zu beginnen. Dann werden die nächst schweren Ionen analysiert. Im Verlaufe der folgenden Analysen kann dabei auch stufenweise die Hochfrequenzspannung erniedrigt werden, um immer sehr langsam schwingende Elternionen zu exportieren. Man kann sogar so vorgehen, dass immer die gleiche, relative langsame Anregungsfrequenz eingestellt bleibt, und dass die Auswahl der anzuregenden und zu exportierenden Ionen durch die Stärke des Hochfrequenzfeldes getroffen wird.
Ausführungsform 2b: Begrenzung der Schwingungsamplituden durch ein überlagertes Hexapolfeld.
Wird für das Polstabsystem des Speicherreservoirs eine Querschnittsform gewählt, die dem Quadrupolfeld ein relativ starkes Hexapolfeld überlagert (siehe 6 und 7), so werden die Sekularschwingungen der Ionen auf Grenzamplituden beschränkt. Das Hexapolfeld bewirkt, dass die Sekularfrequenz der schwingenden Ionen von ihrer Amplitude abhängig, und zwar mit steigender Amplitude kleiner wird. Da mit zunehmender resonanter Anregung die Amplitude zunimmt, verschiebt sich die Sekularfrequenz der schwingenden Ionen und die Ionen fallen schnell aus der Resonanz. Ihre Amplitude wird nicht mehr größer. Hat sich die Phase der Anregungsfrequenz dann um mehr als 90° gedreht, findet sogar eine Verkleinerung der Schwingungsamplitude statt, bis wieder der Zustand einer resonanten Vergrößerung erreicht wird. Die Schwingungen der resonant angeregten Elternionen haben also begrenzte Amplituden, deren Größe von der Stärke des überlagerten Hexapolfeldes, also von der Form und Positionierung der Polstäbe abhängt, wie in 5 und 7 dargestellt. Wandern die angeregten Ionen nun in das Streufeld am Ende des Polstabsystems, so sehen sie kurzzeitig ein schwächeres radiales Pseudopotential, welches sie wieder in Resonanz bringt und ihre Amplituden kurzzeitig vergrößert. Sie werden aber ummittelbar darauf durch die wachsende axiale Komponente des Pseudopotentials in das zweite, anschließende Speicherreservoir exportiert. Es ist hier zweckmäßig, ein relativ starkes Hexapolfeld zu überlagern, damit die Oszillationen der Elternionen klein bleiben. Ein Hexapolfeld kann übrigens auch elektrisch überlagert werden, indem die beiden Hochfrequenzspannungen der gleichen Phase, die an zwei gegenüber liegende Polstäbe angelegt werden, nicht gleich groß sind. Es lässt sich damit die Stärke des Hexapolfeldes einstellen.
Es kann auch hier günstig sein, die Anregung der Ionen durch die Hilfselektroden nur am Ende des Speicherreservoirs vorzunehmen. Andererseits ist es hier interessant, die Anregung im gesamten Speicherreservoir vorzunehmen, und die begrenzt schwingenden Ionen, wie oben beschrieben, durch einen Spannungsfall an den Hilfselektroden zum Ionentor zu treiben, um für diese selektierten Ionen eine schnellere Leerung der Speicherreservoirs zu erreichen. Der Spannungsabfall an den Hilfselektroden kann durch geteilte Abschnitte der Hilfselektroden, aber auch durch einen Spannungsabfall an drahtförmigen Hilfselektroden erzeugt werden. Für die Reihenfolge bei der Auswahl der Elternionen gelten die Überlegungen, die schon zu Ausführungsform 2a gemacht wurden.
Ausführungsform 2c: Begrenzung der Amplituden durch ein überlagertes Oktopolfeld.
In ähnlicher Weise kann man dem Quadrupolfeld durch Form oder Positionierung der Polstäbe ein Oktopolfeld überlagern, wie in 8 in einem Beispiel gezeigt wird. Ist dieses Oktopolfeld stark genug, so werden wiederum die Amplituden resonant angeregter Ionenschwingungen begrenzt. Dabei findet die Begrenzung der Anregung von Schwingungen in einer der beiden Ebenen zwischen je zwei gegenüber liegenden Polstäbe durch Verringerung der Sekularfrequenz (Ebene durch Polstäbe 24–22), in der anderen Ebene (durch Polstäbe 43–44) durch Vergößerung der Sekularfrequenz statt. Die Wirkung zeigt sich erst beim Einwandern der Ionen in das Streufeld: dabei wird in einem Falle die Amplitude im Streufeld vorübergehend vergrößert, im anderen Falle verringert. Beide Richtungen sind für die Begrenzung der Amplitude brauchbar. Das Oktopolfeld lässt sich nicht elektrisch einstellbar machen, es kann nur durch Formänderungen der Polstäbe erzeugt werden.
Ausführungsform 2d: Verwendung der nichtlinearen Resonanz.
Die Überlagerungen mit Hexapol- oder Oktopolfeldern erzeugen auch nichtlineare Resonanzen, die eintreten, wenn die Sekularfrequenz der Ionen gerade bei einem ganzzahligen Bruchteil der Frequenz der Treiber-Hochfrequenzspannung liegt. Die erste nichtlineare Hexapol-Resonanz liegt bei einem Drittel, die erste Oktopol-Resonanz bei einem Viertel der Frequenz der Treiber-Hochfrequenzspannung. Zu kleineren Bruchtei len hin nimmt die nichtlineare Resonanz sehr kräftig ab. In einer solchen nichtlinearen Resonanz braucht man nur eine sehr kleine Anregungsspannung der dipolaren Anregung, um die Ionen diese nichtlineare Resonanz, die nur außerhalb der Achse wirkt und nach außen zunimmt, spüren zu lassen. Die Ionen werden dann durch diese Resonanz erfasst und schwingen automatisch bis zur Begrenzung ihrer Amplitude durch die oben geschilderte Verschiebung ihrer sekularen Frequenz. Die Resonanzen bei einem Drittel oder einem Viertel der Hochfrequenz haben leider recht hohe Oszillationsfrequenzen; somit besteht hier immer die Gefahr der Fragmentierung der Ionen, wenn nicht extrem kleine Amplituden verwendet werden. Die Resonanzen bei wesentlich kleineren Bruchteilen der Treiber-Hochfrequenz sind dagegen viel schwächer und weniger ausgeprägt. Alle diese Resonanzen sind selbsthaltend: Ionen, die in der Resonanz mit Maximalamplitude schwingen, halten sich selbst bei Abschalten der äußeren Anregung durch das Dipolfeld in der Resonanzschwingung, da diese Schwingung durch nichtlineare Phänomene aus der Treiber-Hochfrequenzspannung gespeist wird.
Auch für alle die vorgenannten Ausführungsformen 2b bis 2d kann es günstig sein, wenn die Abschnitte der Hilfselektroden, die zur Anregung verwendet werden, nur relativ kurz sind und fast, aber nicht ganz, bis an das Ende der Polstäbe reichen. Die Elternionen aus dem übrigen Teil des Speicherreservoirs wandern ständig durch Diffusion in diesen Teil ein und werden hier auch angeregt. Für die Ausführungsformen 2b bis 2d, in denen Überlagerungen mit Feldern höherer Ordnung verwendet werden, können sich diese Überlagerungen mit höheren Multipolfeldern und die anregenden Hilfselektroden aber auch über die ganze Länge des Speicherreservoirs erstrecken, wobei die angeregten Ionen durch einen Spannungsabfall an den Hilfselektroden zum Ionentor getrieben werden können.
Die Überlagerungen mit höheren Multipolfeldern und die anregenden Hilfselektroden können jedoch durch entsprechende Ausformung des Polstabsystems auch nur am Ende des Polstabsystems ausgebildet sein. Für die Anregung in der Ausführungsform 2a ist wieder eine diagonale oder zirkumpolare Anregung sehr günstig; in den Ausführungsformen 2b bis 2d sind diese Anregungsformen ohne Belang, da die günstigsten Anregungsrichtungen von der Richtung der überlagerten höheren Multipolfelder abhängt.
Die Anregung der Ionenschwingungen quer zur Achse des Stabsystems sollte, wie bereits mehrfach betont, für einen axialen Export nicht groß sein, um Fragmentierungen der Ionen zu vermeiden. Für einen gut massenaufgelösten Export genügt es, wenn die Schwingungen nur etwa zwei bis drei Millimeter zu jeder Seite aus der Achse heraus reichen. Wie oben angemerkt, ist es günstig, die Ionen langsam schwingen zu lassen; entweder durch Auswahl möglichst schwerer Ionen oder durch die Wahl einer kleinen Hochfrequenzspannung.
In einer Anordnung mit verzerrt angeordneten oder ungleich dicken Polstäben, die im Inneren einen nichtlinearen radialen Anstieg des Pseudopotentials bewirken, lässt sich eine Ionensorte zu Schwingungen mit einer nur noch schwach einstellbaren, nur leicht modulierten Grenzamplitude anregen. Werden lange Hilfselektroden benutzt, die sich über das ganze Speicherreservoir erstrecken, so schwingen alle so angeregten Ionen im Speicherreservoir. In diesem Fall lassen sich die selektierten Ionen in einigen Zehn Millisekunden durch einen Spannungsabfall an den Hilfselektroden zum Ionentor treiben.
Es kann jedoch auch besser (und einfacher) sein, wie oben bereits beschrieben, nicht alle Elternionen gleichzeitig schwingen zu lassen, sondern nur die Elternionen im letzten Endstück des Speicherreservoirs. Da die Ionen nicht ortsfest gebunden sind, sondern sich ständig durch Diffusion auch in Längsrichtung bewegen, geraten sie auch in das Streufeld am Ende des Speicherreservoirs und werden dabei durch das Ionentor in das zweite Speicherreservoir exportiert. Es ist, als ob diese Ionen kontinuierlich aus dem Speicherreservoir auslaufen. Dieses Exportieren der Elternionen erfolgt ebenfalls kontinuierlich, indem die radiale Anregung über längere Zeit eingeschaltet bleibt. Die Zeitdauer des Auslaufens der Ionen hängt von der Länge dieses Speicherreservoirs ab; für obig genannte Abmessungen herrscht eine Halbwertszeit in der Größenordnung von etwa hundert Millisekunden. Werden die Ionen in ihrer Gesamtheit durch leichte Wechselspannungen an verschiedenen Abschnitten der Hilfselektroden im Speicherreservoir hin- und hergeschickt, so lässt sich das Auslaufen der angeregten Elternionen noch etwas beschleunigen.
Ist das Speichereservoir mit sehr vielen Ionen gefällt, so wird dabei durch die herrschende Raumladung nur eine mäßige Massenauflösung des massenselektiven Ionenexports durch das Ionentor erreicht, in der Regel beschränkt auf einige atomare Masseneinheiten. Die Massenauflösung kann aber durch die Einrichtung eines zweiten Ionentors verbessert werden. Dazu wird das zweite Speicherreservoir wieder als ein quadrupolares Stabsystem ausgelegt, das aber nie so stark befüllt werden wird wie das erste Speicherreservoir, da ja stets nur ein kleiner Teil der Ionen die eingestellte Exportmasse besitzt. Am Ende dieses zweiten Reservoirs, das viel kürzer sein kann als das erste Speicherreservoir, befindet sich das zweite Ionentor, das jetzt weniger durch Raumladungen gestört ist und daher besser massenselektiv arbeiten kann. Beide Ionentore können auch gleichzeitig arbeiten. Sind die analytisch gewünschten Ionen in ein drittes Speicherreservoir übertragen, so können die restlichen Ionen des zweiten Speicherreservoirs in das erste Speicherreservoir zurück geführt werden, indem die Spannungsbarriere erniedrigt und die Achsenpotentiale entsprechend eingestellt werden. Es gehen daher praktisch niemals Ionen verloren. Dieser Vorgang lässt sich beliebig oft für die gleiche ladungsbezogene Masse oder auch später für eine andere Masse wiederholen.
Ein solches Tandem-Massenspektrometer mit mindestens drei Speicherreservoiren und zwei Ionentoren kann aber nicht nur zur Erhöhung der Massenauflösung des massenselektiven Ionenexports verwendet werden, sondern auch zur Erzeugung von Enkelionen, also Fragmentionen der zweiten Fragmentierungsgeneration. So können beispielsweise die gut massenselektierten Ionen aus dem dritten Speicherreservoir nach Entleerung des zweiten Speicherreservoirs in dieses zweite Speicherreservoir zurückgeführt werden. Sie können dann in diesem zweiten Speicherreservoir fragmentiert werden, beispielsweise durch radiale resonante Anregung, wie unten im Einzelnen beschrieben. Die Stoßfragmentierung kann auch erreicht werden, indem bei der Rückführung der Ionen aus dem dritten Speicherreservoir in das zweite durch die Achsenpotential in der Reservoiren entsprechende kinetische Energie mitgeteilt wird. Auch andere Fragmentierungsmechanismen sind möglich, wie unten näher beschrieben. Aus dem Gemisch von Fragmentionen kann jetzt durch das zweite Ionentor eine Ionensorte massenselektiv in das dritte Speicherreservoir überführt, dabei (oder dort) fragmentiert und anschließend durch den Massenanalysator als Enkelionenspektrum aufgenommen werden.
Ein besonders günstiges Tandem-Massenspektrometer nach dieser Erfindung hat also nicht nur ein Ionentor, sondern deren zwei, die zwischen entsprechenden Speicherreservoiren angeordnet sind.
Eine ganz anders geartete Ausführungsform eines massenselektiven Ionentores verwendet ebenfalls ein Speicherreservoir in Form eines Quadrupol-Stabsystems. Hier ist aber einer der Polstäbe mit einem langem Schlitz versehen, aus dem die ausgewählten Elternionen durch eine dipolare resonante Anregung in einen Ionentrichter hinein ausgeworfen werden können. Ein mit Gas befüllter Ionentrichter fängt die Elternionen ein führt sie in ein zweites Speicherreservoir.
Dieser massenselektive Auswurf der Elternionen arbeitet besonders gut, wenn der Auswurf unter Bedingungen einer nichtlinearen Resonanz erfolgt. Dazu ist die Anordnung der Polstäbe, die rund oder vorzugsweise hypberbolisch geformt sein können, leicht asymmetrisch zu verzerren, beispielsweise durch eine etwas größere Entfernung nur eines einzigen Polstabes von der Achse, so dass dem entstehenden Quadrupolfeld im Inneren des Stabsystems ein leichtes Hexapolfeld überlagert wird. Es entsteht dadurch eine nichtlineare Resonanz für solche Ionen, deren sekulare Schwingung gerade einem Drittel der an die Polstäbe angelegten Hochfrequenzspannung entspricht. Die unsymmetrische Verzerrung mit dem überlagerten Hexapolfeld bremst aber auch das Amplitudenwachstum aus, da jetzt die Schwingungsfrequenz von der Amplitude der Schwingung abhängig wird. Um diesen Effekt zu kompensieren, muss daher auch ein weiteres Multipolfeld höherer Ordnung, beispielsweise ein Oktopolfeld überlagert werden, da dieses die Frequenzverschiebung durch das Hexapolfeld in gewissem Umfang zu kompensieren gestattet. Dadurch kann man einen sehr gut nach Massen aufgelösten Auswurf der ausgewählten Elternionen erreichen.
Zum Auswurf der Elternionen wird jetzt von demjenigen gegenüberliegenden Stabpaar, das auch den Stab mit dem Schlitz enthält, die Hochfrequenzspannung weggenommen. (Vorzugsweise werden jetzt die Lochblenden an beiden Enden mit der halben einphasigen Hochfrequenzspannung belegt). Die nur noch einphasige Hochfrequenzspannung an den beiden übrigen Polstäben wird nun in seiner Spannung so eingestellt, dass die ausgewählten Elternionen gerade bei einem Drittel der Hochfrequenz schwingen. Nunmehr wird eine sehr leichte Wechselspannung mit der Frequenz von einem Drittel der Hochfrequenz gegenphasig an die beiden spannungslosen Polstäbe gelegt. Hierdurch werden die praktisch in der Achse ruhenden Elternionen ganz leicht in ihrer Sekularfrequenz dipolar angeregt. Sie beginnen zu schwingen, gelangen dadurch in den Wirkungsbereich der nichtlinearen Resonanz und verlassen das Speichereservoir durch den Schlitz im Polstab. Durch die Kombination aus Hexapolfeld und Oktopolfeld ist der Auswurf streng einseitig. Dieser Auswurf ergibt trotz seiner hohen Auswurfgeschwindigkeit eine sehr gute Massenauflösung der Selektion. Es ist hier zweckmäßig, mit den leichtesten Ionen unter den zu analysierenden Elternionen zu beginnen, da diese den feinsten Ionenfaden nahe der Achse bilden. Es kann sogar zweckmäßig sein, im Übergang von einer Elternionensorte zur nächst schwereren alle Ionensorten der dazwischen liegenden Massen auszuwerfen, um immer die leichteste Ionensorte des Reservoirs auszuwerfen.
Nachteilig bei diesem Auswurf ist die relativ hohe kinetische Energie der ausgeworfenen Ionen, bestehend aus einer Mindestenergie von einigen Hundert Elektronenvolt und einer leider recht hohen Streunung der kinetischen Energie. Die Mindestenergie kann dabei relativ leicht durch ein elektrisches Gegenfeld beseitigt werden, die überschüssige Energie kann aber nur durch Stöße mit einem Dämpfungsgas vernichtet werden. Dabei werden unvermeidlich bereits einige der ausgeworfenen Ionen fragmentiert. Es ist daher günstig, den Innenraum des auffangenden Ionentrichters bereits als Stoßkammer zur Fragmentierung zu verwenden.
Wir kehren jetzt zum axialen Export zurück. Die massenselektierten Ionen, die sich im zweitem Speicherreservoir befinden, sind jetzt zu fragmentieren. Dazu sind sie beispielsweise in üblicher Weise mit einer Stoßenergie von 30 bis 100 Elektronenvolt in eine Fragmentierungskammer einzuschießen, die wiederum als Quadrupol-Stabsystem ausgelegt sein kann. Die Fragmentierungskammer ist ebenfalls mit einem Dämpfungsgas befüllt, das hier als Stoßgas für die Fragmentierung wirkt. Es kann durchaus wieder Helium des gleichen Drucks wie im Speicherreservoir verwendet werden, so dass vom ersten Speicherreservoir bis zur Stoßfragmentierungskammer der gleiche Druck herrscht. Der Druck kann durch einen Gasbehälter (18) und eine Druck mindernde Zuführung aufrecht erhalten werden.
Die Fragmentierungskammer kann durchaus mit dem zweiten Speicherreservoir (10) identisch sein. Es findet dann die Beschleunigung der Ionen auf einstellbare 30 bis 50 Elektronenvolt bereits beim Verlassen des ersten Speicherreservoirs (6) durch das Ionentor statt, wobei zwischen Potentialbarriere des Ionentors und dem Achsenpotential des zweiten Speicherreservoirs (10) diese 30 bis 100 Volt einzustellen sind. Sind zur Verbesserung der Selektion der Elternionen zwei Ionentore hintereinander angeordnet, so kann das dritte Speicherreservoir als Stoßkammer dienen.
Die Fragmentierung kann aber auch im zweiten Speicherreservoir (oder in einem weiteren) durch eine radiale dipolare Anregung der Elternionen vorgenommen werden. Diese Anregung benötigt Zeiten von einigen zehn bis zu etwa hundert Millisekunden für eine Fragmentierung, da viele Stöße notwendig sind um genügend Energie für einen Zerfall aufzunehmen. Diese Art der Stoßfragmentierung ist aber besonders günstig, weil im Wesentlichen nur direkte Tochterionen generiert werden, keine Enkelionen, weil sich nach dem Zerfall der Elternionen die Tochterionen nicht mehr in Resonanz mit dem anregenden Dipolfeld befinden und sofort durch das Stoßgas gedämpft und gekühlt werden.
Es sind aber auch ganz andere Fragmentierungsarten bekannt, die ebenfalls hier eingesetzt werden können. So können die selektierten Elternionen in der Fragmentierungskammer in an sich bekannter Weise durch die Strahlung eines Infrarot-Lasers (IRMPD), durch Elektroneneinfang (ECD), durch Beschuss mit hoch angeregten Neutralteilchen aus einer FAB-Teilchenquelle (FAB = fast atom bombardment) oder durch Elektronenübertragung durch negative Ionen (ETD) fragmentiert werden.
Für alle diese Verfahren ist es günstig, als Fragmentierungskammer (10) wieder ein Quadrupol- oder ein Hexapol-Stabsystem zu verwenden, das mit einem Dämpfungsgas beschickt wird. Es sammeln sich dann die Fragmentionen in der Längsachse dieser Kammer (10) und können durch enge endständige Lochblenden (11), die auch als Druckminderungsstufe dienen, als feiner Ionenstrahl in den Massenanalysator eingebracht werden.
Ein für diese Zwecke hervorragender Massenanalysator ist ein Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss. Die Ionen werden in Form eines sehr feinen Strahls und möglichst monoenergetisch in den Pulser (12) des Flugzeitmassenspektrometers eingeschossen. Der Pulser pulst dann periodisch mit einer Frequenz von etwa 10 bis 20 Kilohertz einen Abschnitt des Ionenstrahls senkrecht zur bisherigen Flugrichtung in die Driftstrecke des Flugzeitmassenspektrometers aus. Die Ionen trennen sich dabei nach ladungsbezogenen Massen, weil die Geschwindigkeiten der verschiedenen Ionensorten unterschiedlich sind. Die Ionen treten dann in einen Ionenreflektor (13) ein, der sie auf einen Ionendetektor (14) reflektiert. Dabei tritt eine Orts- und Energiefokussierung ein, die ein hohes Massenauflösungsvermögen ergibt. Im Ionendetektor werden die Ionenströme der einzelnen Ionensorten verstärkt und dann über einen elektrischen Nachverstärker einem Transientenrekorder zugeführt, der die Ionenströme in einem Takt von jeweils etwa einer halben Nanosekunde digitalisiert und die Werte zu den phasengleich aufgenommenen Werten der früher aufgenommenen Spektren zeitsynchron hinzuaddiert. Es werden somit Einzelspektren von 50 bis 100 Mikrosekunden Länge gemessen. Es entstehen Summenspektren, die beispielsweise in kommerziellen Geräten etwa 128 000 oder sogar 256 000 Ionenstromwerte umfassen.
In handelsüblichen Tischgeräten zeigen diese Flugzeitmassenspektren Massenauflösungen von m/Δm = 15 000 und Massengenauigkeiten von etwa 3 ppm (parts per million). Der Pulser arbeitet mit etwa 15 Kilohertz, wenn Beschleunigungen im Pulser von etwa 8 bis 10 Kilovolt verwendet werden. Es werden also 15 000 Massenspektren pro Sekunde generiert und addiert. Dabei werden im Pulser sehr viele Ionen des feinen Ionenstrahls erfasst und periodisch ausgepulst, gute Flugzeitmassenspektrometer haben Nutzgrade für die Ionen des Ionenstrahls in der Größenordnung von etwa 50 Prozent der eingeschossenen Ionen. Werden die Additionen nach 1500 Spektren abgebrochen, so können zehn Summenspektren pro Sekunde geliefert werden. Diese Geräte können also auch zur Verfolgung schnell veränderlicher Vorgänge eingesetzt werden, sie verwenden einen großen Teil der Ionen des angebotenen Ionenstrahls, und sie haben durch die einstellbare Anzahl der addierten Massenspektren einen einstellbaren dynamischen Messbereich.
Sind höhere Massengenauigkeiten erforderlich, so kann statt des Flugzeitmassenspektrometers ein Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer nachgeschaltet werden. Dieses arbeitet in der Regel mit einem Magnetfeld, das durch supraleitende Magnetspulen erzeugt wird. Es sind Geräte mit sieben, neun und elf Tesla erhältlich; die Massengenauigkeiten können beträchtlich unter einem Millionstel der Masse liegen. Diese FTMS-Massenspektrometer arbeiten allerdings relativ langsam; sie liegen an der Grenze der Definition eines „schnellen” Massenspektrometers.
Aber auch andere Arten von Massenspektrometern können verwendet werden. Wird beispielsweise ein Quadrupol-Massenspektrometer nachgeschaltet, so erhält man eine Abart eines so genannten Triple-Quad-Gerätes, das wegen der drei aufeinander folgenden Quadrupol-Stabsysteme so benannt wurde: das erste Stabsystem dient als Massenfilter zur Selektion der Ionen, das zweite als Fragmentierungs-Quadrupol und das dritte als Massenanalysator für die Fragmentionen. Das selektierende Massenfilter, dass alle Ionen vernichtet, die sich nicht im Prozess der Analyse befinden, wird dann hier erfindungsgemäß durch ein sparsameres System mit einem massenselektiven Ionentor ersetzt. Dieses Gerät ist aber nicht ideal im Sinne der Erfindung, weil das Massenfilter als Massenanalysator an der Grenze der Definition eines „schnellen” Massenspektrometers liegt, und weil der Massenanalysator wieder sehr unökonomisch arbeitet.
Das erste Speicherreservoir kann aber auch völlig anders gestaltet sein. So ist es möglich, eine dicke zylindrische Kammer mit zwei halbkugeligen Abschlüssen aus zwei doppelhelikal gewickelten Drahtwendeln zu erzeugen, wobei die zwei Hochfrequenzphasen an die beiden Drahtwendeln angeschlossen werden. Frei gelassene Löcher an beiden Enden dienen dem Einschuss der Ionen und der Extraktion. Es ist dabei am besten, wenn das Extraktionsloch durch ein Quadrupol-Stabsystem abgeschlossen wird, das dann mit einem Ionentor der beschriebenen Art endet.
Das Tandem-Massenspektrometer kann auch mit einer weiteren Einrichtung zur Erzeugung von Enkelionen ausgestattet sein, wie oben bereits beschrieben. Dazu ist prinzipiell hinter der ersten Fragmentierungseinrichtung ein weiteres Ionentor anzuordnen, mit denen eine bestimmte Tochterionensorte selektiert wird. Die selektierten Tochterionen werden dann in einer zweiten Fragmentierungseinrichtung zu Enkelionen fragmentiert. Der Massenanalysator nimmt dann das Enkelionenspektrum auf. Die zweite Fragmentierungsstufe erhöht die Selektivität des Verfahrens beträchtlich und damit die Identifizierungssicherheit. Die nicht selektierten anderen Tochterionen verbleiben in der ersten Fragmentierungseinrichtung und können in nachfolgenden Schritten ebenfalls nach selektiver Auswahl durch weitere Fragmentierung analysiert werden. Wenn sich zwei Ionentore zwischen drei Speicherreservoiren befinden, können damit sowohl eine Erhöhung der Massenauflösung für den Ionenexport wie auch ein Export einer Fragmentionensorte für die Aufnahme von Enkelionenspektren durchgeführt werden, indem die Ionen zwischen den Speicherreservoiren nach Bedarf bin und her geschoben werden. Mit drei Ionentoren zwischen vier Speicherreservoiren lassen sich auch Urenkelionenspektren ohne Verluste anderer Tochter- oder Enkelionen aufnehmen.
Als ein Verfahren für die Anwendung des neuartigen Tandem-Massenspektrometers werde hier die analytische Aufgabe betrachtet, in einem Gewebe, das nur aus wenigen Zellen besteht, die relativen Konzentration von etwa 20 verschiedenartigen Proteinen zu messen. Es werden dazu mit durchaus bekannten Methoden die Proteine dieser Zellen lysiert. Zu dem Lysat wird nun eine bekannte Menge eines Referenzproteins zugegeben. Dieses dient später als Konzentrationsreferenz, dient aber auch zur Überprüfung des gesamten Verfahrens. Die Analytproteine (einschließlich des Referenzproteins) mögen alle zu einer hydrophob affinen Gruppe gehören. Diese können daher in einem ersten Schritt durch eine Breitband-Extraktion aus dem Lysat extrahiert werden, um die Komplexität des Gemischs zu reduzieren. Das kann beispielsweise durch magnetische Nanopartikel geschehen, deren Oberfläche durch eine hydrophobe Belegung affin aktiviert ist. Auf Einzelheiten werde hier nicht eingegangen, sie sind dem Fachmann bekannt. Dem Extrakt kann dann nochmals ein zweites Referenzprotein zugegeben werden. Es gibt Breitband-Extraktionsverfahren für verschiedenartige Substanzgruppen von Gemischen, beispielsweise für anionische Peptide, kationische Peptide, phosphorylisierte Peptide und viele andere.
Die Lösung mit den extrahierten Analytproteinen kann jetzt mit einem Enzym, beispielsweise Trypsin, verdaut werden, um Verdaupeptide zu erhalten, die sich im eingeschränkten Massenbereich von etwa 100 bis 4000 atomaren Masseneinheiten analysieren lassen. Die Verdaupeptide der Analytproteine müssen in diesem Fall genau bekannt sein. Das gelöste Gemisch der Verdaupeptide, das nur wenige Mikroliter Lösung umfasst, wird nun in eine Nanosprühkapillare eingefüllt und durch ein elektrisches Feld mit negativer Ziehspannung versprüht, wobei nach Verdampfen der Tröpfchen die Verdaupeptide zu praktisch 100 Prozent positiv ionisiert werden. Aus einer sehr geringen Anzahl von Zellen, im Grenzfall aus einer einzigen Zelle, lassen sich so etwa 10⁸ Ionen der Verdaupeptide aus den extrahierten Proteinen herstellen. Die meisten dieser Ionen sind dabei übrigens doppelt positiv geladen.
Von diesen Ionen lassen sich mit modernen Mitteln etwa zehn Prozent, also etwa 10⁷ Ionen, in das Speicherreservoir einspeichern. Da einige Verdaupeptide, die aber nicht zu den Analytproteinen gehören, überragend häufig auftreten, können diese durch Anregung ihrer sekularen Schwingungen mit Hilfe der Hilfselektroden aus dem Speicherreservoir auswerfen. Es mögen dann etwa 10⁶ Ionen im Speicherreservoir übrig bleiben, eine Anzahl, die für die weiteren Analysen vorteilhaft ist.
Beginnend mit den der schwersten Sorte der Verdaupeptidionen, werden nun ausgewählte Ionensorten der Analytsubstanzen und Referenzsubstanzen einzeln nacheinander analysiert. Dazu werden vorzugsweise die doppelt geladenen Ionen ausgewählter Verdaupetide dieser Substanzen verwendet. Diese doppelt geladenen Ionen werden in beschriebener Weise durch das Ionentor in die Fragmentierungskammer exportiert und dort mit einer der zur Verfügung stehenden Fragmentierungsarten fragmentiert. Die Fragmentionen werden im Flugzeitmassenspektrometer als Fragmentionenspektrum aufgenommen.
Die Ionen der Verdaupeptide eines komplexen Gemisches besetzen im Allgemeinen alle Massen des Massenbereichs vielfach. Es ist bekannt, dass einfach geladene Verdaupeptidionen bei jeder Massenzahl einen Cluster bilden, der etwa 0,3 atomare Masseneinheiten breit ist. Doppelt geladene Ionen bilden einen Cluster von 0,15 Masseneinheiten Breite um halbzahlige Massenwerte. Selektiert man also die monoisotopischen Ionen eines Verdaupeptids mit Einheitsauflösung (eine ganzzahlige Massenzahl wird von der nächsten getrennt), so ist mit einer Überlagerung von mehreren Ionen gleicher Massenzahl, aber verschiedener Identität, zu rechnen. Zur Erhöhung der Selektivität findet daher die Aufnahme der Fragmentionenspektren statt, da diese für jedes Verdaupeptid weitgehend einmalig sind, ähnlich einem Fingerabdruck. Da sich bei der gleichzeitigen Fragmentierung mehrerer Verdaupeptide die Fragmentionenspektren überlagern, muss das bekannte Fragmentionenspektrum des analytisch interessierenden Verdaupeptids mit bekannten mathematischen Verfahren ausgefiltert werden.
Unter den „monoisotopischen” Ionen des Verdaupeptids versteht man diejenigen Ionen der Isotopengruppe, die nur aus ¹²C, ¹H, ¹⁴N, ¹⁶O, ³²S und ³¹P bestehen. Werden diese gut von den anderen Ionen der Isotopengruppe getrennt selektiert und dann fragmentiert, so besteht das Fragmentionenspektrum dieser monoisotopischen Ionen nur noch aus Einzellinien, nicht mehr aus Isotopengruppen. Dieser Effekt kann bei dem Filterprozess gut verwendet werden, da die meisten der überlagerten Ionensorten nicht monoisotopische Ionen sind und nach der Fragmentierung als (meist seltsam verzerrte) Isotopengruppen erscheinen.
Für organische Substanzen ist das monoisotopische Ionensignal bis zu einem Molekulargewicht von m < 2200 atomaren Masseneinheiten das stärkste Signal, hier ist also die Wahl der monoisotopischen Ionen besonders günstig. Im anschließenden Bereich der Molekülge wichte von m = 2200 bis zu m = 3300 atomaren Masseneinheiten ist das Ionensignal der Ionen, die ein ¹³C enthalten, das stärkste Signal. Werden diese Ionen exportiert und fragmentiert, so erhält man ein Fragmentionenspektrum aus jeweils zwei Ionensignalen pro Isotopengruppe mit leicht vorhersagbaren Intensitätsverhältnissen. Auch dieses Fragmentionenspektrum lässt sich daher leicht erkennen und für eine Analyse verwenden. Im übertragenen Sinne gilt das auch für Ionen, die zwei und mehr ¹³C-Atome enthalten, die Interpretation der Fragmentionenspektren wird aber immer komplizierter. Es ist aber durchaus nicht immer notwendig, eine Isotopentreue im Fragmentionenspektrum dadurch anzustreben, dass man alle Isotopensignale einer Isotopengruppe exportiert und fragmentiert.
Dieser Analysenprozess wird dann für alle bekannten Verdaupeptide aller Analytproteine und Referenzproteine durchgeführt. Es mögen dabei für die 20 Analytproteine durchaus etwa 100 bis 200 Verdaupeptide analysiert werden müssen. Die Zusammenfassung dieser Resultate gibt aber eine große Sicherheit für die quantitative Analyse der Analytproteine. Das Analysenverfahren muss dabei, wie in der analytischen Chemie stets erforderlich, vorher mit bekannten Mischungen der gleichen Proteine kalibriert werden.
Der analytische Prozess ist übrigens sehr schnell. Setzt man für jedes Verdaupeptid eine Extraktionszeit und eine Analysenzeit von je einer vollen Sekunde an, so dauert der gesamte Analysenprozess nur etwa 200 bis 400 Sekunden, zuzüglich der Zeit der Ionisierung von etwa drei Minuten. Die Analyse umfasst also die Zeit von rund acht Minuten. Verglichen mit einer Analyse, die eine Substanztrennung durch Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese voraussetzt, ist diese Analysenzeit sehr kurz. Durch doppelt ausgelegte erste Speicherreservoire, wie sie in Patentanmeldung DE 10 2004 028 638 A1 beschrieben sind, kann die Zeit verkürzt werden.
Sind nur wenige Substanzen in günstig aufbereiteten Proben quantitativ über Enkelionenspektren zu messen, so können dafür mit der vorliegenden Erfindung Verfahren entwickelt werden, die insgesamt nur zwei bis drei Minuten dauern und ohne jegliche Chromatographie auskommen.
Selbstverständlich können Proteingemische auch ohne enzymatischen Verdau gemessen werden. Dann muss der Flugzeitmassenanalysator auf einen hohen Massenbereich von einigen 100 000 atomaren Masseneinheiten eingestellt werden. Hier kann es günstig sein, ein Charge Stripping vorzunehmen.
Ein weiteres Verfahren kann beispielsweise die Proteine identifizieren„ die sich in einem 2D-Gel weitgehend aufgetrennt als so genannte „Spots” befinden. Die angefärbten Spots werden ausgestanzt, einem enzymatischen Verdau des Proteins unterworfen und die Verdaupeptide werden anschließend aus dem Gel eluiert. Wenige Mikroliter des Eluats werden in die Kapillare einer Nanoelektrosprüh-Ionenquelle eingebracht; die Ionen werden im Speicherreservoir gespeichert. Ein kleiner repräsentativer Teil der Ionen aus dem Speicherre servoir wird nun ohne Selektion und Fragmentierung dem Flugzeitmassenspektrometer zugeführt, um einen Überblick über die Massen der vorhandenen Verdaupeptidionen zu erhalten. Die Ionen der Verdaupeptide werden dann einzeln in erfinderischer Weise exportiert und fragmentiert. Die Fragmentionenspektren dienen in üblicher Weise zur Identifizierung des Proteins im Spot verwendet, indem die Spektren den bekannten Suchmaschinen für Vergleiche mit Proteinsequenzdatenbanken zugeführt werden. Für eine solche Identifizierung sind bei einem automatisierten Verfahren einschließlich der Ionisierung und der Spektrennahme nur wenige Sekunden erforderlich, beispielsweise nur etwa zehn bis dreißig Sekunden.
Die Anwendung von Gerät und Verfahren ist vielfältig. Das Verfahren mit seinen vielen Abwandlungen kann beispielsweise in der zellbiologischen Forschung, in der medizinischen Diagnostik mit Biomarker-Proteinen, in klinischen Studien zur Pharmakokinetik und vielen anderen forschungsmäßig wie routinemäßig durchgeführten Untersuchungen zur Konzentrationsbestimmung von Substanzen in komplexen Gemischen eingesetzt werden.

Claims

Tandem-Massenspektrometer, mindestens bestehend aus (a) einer Einrichtung zur Ionisierung einer Probe außerhalb des Vakuums des Tandem-Massenspektrometers, (b) einem Speicherreservoir innerhalb des Vakuums des Tandem-Massenspektrometers für die Speicherung der Ionen der Probe, (c) einer Einrichtung zur Beendigung der Zuführung von Ionen in das Speicherreservoir, die auch die Zufuhr von Umgebungsgas in das Vakuum des Tandem-Massenspektrometers unterbindet, (d) einem Ionentor, das Ionen eines ausgewählten kleinen Massenbereichs aus dem Speicherreservoir exportiert und die anderen Ionen unbeschädigt im Speicherreservoir zurücklässt, (e) einer Einrichtung zur Fragmentierung der exportierten Ionen, und (f) einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Einschuss zur Aufnahme von Massenspektren der Fragmentionen.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Ionentor in oder an einer Kammer befindet, in der Ionen quer zur Längsachse der Kammer oszillieren können, und dass die Kammer eine Einrichtung zur dipolaren oder zirkumpolaren resonanten Anregung der Oszillationen dieser Ionen besitzt.
Tandem-Massenspektrometer nach einem der bisherigen Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Hochfrequenzspannungen betriebenes Quadrupol-Stabsystem als Speicherreservoir verwendet wird.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Ionentor innerhalb oder am Ende des Quadrupol-Stabsystems angeordnet ist und aus einer Störung des sonst längs der Achse konstanten Querschnitts des hochfrequenten Quadrupolfeldes, aus einer Gleichspannungspotentialbarriere und aus einer Einrichtung zur dipolaren oder zirkumpolaren Anregung einer Ionensorte quer zur Achse des Stabsystems besteht.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Ionentor am Ende des Quadrupol-Stabsystems befindet.
Tandem-Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Quadrupol-Stabsystem derart gestaltet ist, dass dem hochfrequenten Quadrupolfeld im Quadrupol-Stabsystem Multipolfelder höherer Ordnung überlagert sind.
Tandem-Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Quadrupol-Stabsystem mit Hilfselektroden zwischen den Polstäben des Stabsystems ausgestattet ist, wobei die Hilfselektroden aus drahtförmigem Widerstandsmaterial bestehen oder in Längsrichtung in voneinander isolierte Abschnitte eingeteilt sind.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Spannungsversorgung vorhanden ist, die sowohl eine Anregungshochfrequenzspannung an den Hilfselektroden wie auch einen Spannungsabfall längs der Hilfselektroden erzeugen kann.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfselektroden in Abschnitte eingeteilt sind und nur die Hilfselektroden im Abschnitt am Ende des Polstabsystems mit Hochfrequenzspannungen zur Anregung der Ionen beschickt werden.
Tandem-Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen dem ersten Speicherreservoir zur Speicherung der Ionen einer Probe und dem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Einschuss weitere Speicherreservoire und weitere Ionentore befinden.
Tandem-Massenspektrometer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Speicherreservoire als Quadrupol-Stabsysteme aufgebaut sind.
Verfahren zur quantitativen, qualitativen oder strukturellen massenspektrometrischen Analyse mindestens einer Analytsubstanz in komplexen Gemischen mit folgenden Schritten: (a) Ionisierung einer Probe des komplexen Gemisches in einer Ionenquelle außerhalb des Vakuumsystems eines Massenspektrometers, (b) Speicherung der Ionen in einem Speicherreservoir innerhalb des Vakuumsystems des Massenspektrometers, (c) Beendigung der Füllung des Speicherreservoirs mit Ionen, (d) Abschluss des Vakuumsystems zur Ionenquelle, (e) Export einer ausgewählten Ionensorte einer der Analytsubstanzen aus dem Speicherreservoir durch ein Ionentor, wobei das Ionentor im Wesentlichen nur die Ionen eines eingestellten Massenbereichs exportiert und die nicht exportierten Ionen unbeschädigt zurücklässt, (f) Fragmentierung der exportierten Ionen, (g) Aufnahme des Massenspektrums der Fragmentionen in einem Massenanalysator, und (h) Wiederholung der Schritte e) bis g) für andere Ionensorten der gleichen Analytsubstanz oder für Ionensorten anderer Analytsubstanzen.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass während oder nach der Füllung des Speicherreservoirs unerwünschte Ionensorten aus dem Speicherreservoir entfernt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Speicherreservoir als quadrupolares Polstabsystem aufgebaut ist, dass der massenselektive Export der Ionen in Schritt e) durch ein Ionentor am Ende des Polstabsystems erfolgt und dass die zu exportierenden Ionen durch Hilfselektroden zwischen den Polstäben angeregt und zum Ionentor getrieben werden.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass dem Quadrupolfeld des Polstabsystems mindestens ein Feld höherer Ordnung so überlagert ist, dass die Amplituden der angeregten Ionen begrenzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der massenselektive Export der Ionen in Schritt e) in ein zweites Speicherreservoir erfolgt, und dass eine ausgewählte Ionensorte aus diesem zweiten Speicherreservoir durch ein weiteres Ionentor exportiert wird, bevor die Fragmentierung der Ionen in Schritt f) erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Fragmentierung der exportierten Ionen in Schritt f) ein massenselektiver Export einer ausgewählten Tochterionensorte mit anschließender Fragmentierung zu Enkelionen stattfindet, und dass in Schritt g) das Massenspektrum dieser Enkelionen im Massenanalysator gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass sich unter den Analytsubstanzen eine Referenzsubstanz bekannter Art und Konzentration befindet, auf deren gemessene Häufigkeit sich die gemessenen Häufigkeiten der anderen Analytsubstanzen beziehen lassen.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die monoisotopischen Ionen der ausgewählten Ionensorte exportiert werden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene Ionen der Isotopengruppe der ausgewählten Ionensorte nacheinander durch das Ionentor aus dem Speicherreservoir exportiert und in einem zweiten Speicherreservoir wieder gemischt werden.