CN110208361B - 螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪。它由俘获激光光源1‑1，谐振问询探测光源1‑2，单模光纤2‑1、2‑2，函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，1×6光纤耦合器6，多芯光纤耦合器7，照明光源8，载物台9，显微物镜10，CCD11，计算机12，螺旋四芯光纤13，单细胞14，环形器15，滤光片16，平衡光电探测器17，带有FFT档的示波器18和微操手19组成。采用扫频式激振螺旋多芯光纤光镊，实现对单细胞的准静态稳定俘获和扭转激励细胞及其内部结构成分谐振的功能，从而获得细胞相应的质谱信息。本发明可用于单细胞质谱的测量，尤其是能够实现对单细胞的实时、原位、动态质谱检测功能。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪，可用于单细胞质谱的测量，属于质谱仪器和分析技术领域。
(二)背景技术
细胞是组成生命体的基本单元，了解一个细胞中发生的生命活动对于我们认识生命过程有具有十分重要的价值。单细胞技术是当前生物学技术的前沿，可以给科学家提供许多新的生物学信息，不仅可以检验过去经典方法的结论，还可以发现许多新的规律。传统的细胞生物学依据细胞的来源组织、自身外在形态，以及分泌物等特征对细胞群体进行分类和研究。这些技术和分析手段在疾病诊断和细胞与细胞间的相互作用等领域取得了显著的研究成果。然而，随着细胞分析技术的不断提高，人们越来越发现细胞之间具有个体差异性。即使是在相同条件下培养的同源细胞，其形态及其特性仍旧存在一定的差异。这些差异的来源是细胞内随时发生的化学反应的随机性。在细胞内所发生的随机过程可能会导致细胞的某些参数的结果存在多个稳定态，而传统的群体细胞检测技术只能给出这些稳态的平均结果。因此，为了了解不同细胞个体之间随机性导致的各种差异，单细胞分析技术的发展就显得尤为重要。
正是由于不同的细胞个体之间具有差异性，为了如实地反映细胞在结构和功能上对生物系统的正常运转所起到的作用，就必须从单细胞水平上对细胞中物质的组成和含量进行分析研究。但是单细胞分析研究却由于细胞的极小体积、极多的物质种类、极少的物质含量以及不同物质间显著的浓度差异而一度受阻。由于细胞内不同物质的质量有差异，因此质谱是一种很适合于单细胞分析的检测方法，它具有无需标记、极高的灵敏度以及多物质同时检测的能力，能如实地反映细胞内各物质成分种类和含量。
目前而言，所发展出的单细胞质谱仪均是基于多种离子化方法，这些方法能够对不同类型的样品进行解吸附/离子化，主要包括电喷雾/纳喷雾离子化(electrospray/nano-electrospray ionization，ESI/Nano-ESI)、激光剥蚀/激光解吸附离子化(laserablation/laser desorption ionization，LA/LDI)以及二次离子电离(secondaryionization mass spectrometry，SIMS)等。被离子化后的物质具有不同的质量，质量不同的离子在磁场的作用下到达检测器的时间不同，其结果为质谱图。
光镊是利用光强度分布的梯度力和散射力俘获和操纵微小粒子的工具。该技术在微小粒子的捕获和搬运、皮牛级力的测量、微机械与微器件的组装等领域得到广泛的应用。特别在生命科学领域，光镊技术以其非接触式、无损探测的本质特性显示了其无与伦比的优势，对于推动生命科学的发展和微生命体的操纵发挥了巨大的作用。光镊俘获的粒子尺度可以从几纳米到几十微米，而这刚好是单个细胞所处的尺度范围之内，因此其能够对单个细胞个体进行有效的俘获及操作。
上述的基于离子化方法的质谱仪技术均需要对单细胞进行破坏并对细胞内的物质成分进行提取，如何实现单细胞的实时、原位、动态检测是生命科学提出的一项很有挑战性的难题。本发明结合单细胞光纤光镊技术，提出的光动力谐振式单细胞质谱仪是基于单细胞俘获光纤光镊系统的质谱仪，其对单细胞质谱测量的实现原理与现存的基于物质离子化的质谱仪不同，它是依靠周期性变化的光动力来对细胞内不同结构和物质成分进行扫频式扭转激励谐振，不同质量的结构和物质具备有不同的谐振频率，因此通过对激励谐振频率的扫描，使得这些结构和物质逐个种类谐振响应，再通过收集散射信号光并解调的方法，便能实现细胞质谱的测量。其能够实现对单细胞的实时、原位、动态质谱检测功能，具备有十分重要的科学意义和应用价值。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种螺旋多芯光纤扭动式单细胞质谱仪。
本发明的目的是这样实现的：
一种螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪。它由俘获激光光源1-1，谐振问询探测光源1-2，单模光纤2-1、2-2，函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，1×6光纤耦合器6，多芯光纤耦合器7，照明光源8，载物台9，显微物镜10，CCD11，计算机12，螺旋四芯光纤13，单细胞14，环形器15，滤光片16，平衡光电探测器17，带有FFT档的示波器18和微操手19组成。所述系统中：(1)俘获光束由单模光纤2-1引出，经过光强度调制器和隔离器后，由1×6光纤耦合器分成等功率的6路，由四芯光纤耦合器分别输入两根螺旋四芯光纤的周边纤芯，两根螺旋四芯光纤输出的俘获光束相向传输，其出射光束携带有轨道角动量，可以在俘获细胞的同时给予细胞一个扭矩；(2)函数发生器用于对光强度调制器的控制，改变俘获光的强度，使其在准静态俘获的光强基础上实现变频扫描的交流调制，从而周期性改变施加于被俘获细胞上的扭矩大小，使得细胞及其内部的细胞器或大分子发生逐个的谐振响应；(3)谐振问询探测光经由螺旋四芯光纤的中间芯传输，出射于细胞上，其后向散射信号包含有谐振信息，散射信号再经由中间芯反向传输，由平衡光电探测器接收，去除直流信号并将交流信号放大，再将时域信号经由傅立叶变换变换至频域，便可以得到细胞谐振频谱，由带有FFT档的示波器18显示，该频谱对应于细胞的质谱分布。
活体单细胞的内部结构和成分极其复杂，这里将被俘获细胞当作多层级的谐振子，建立等效于带有阻尼的弹簧式谐振子模型。具体描述为：细胞整体为第一层谐振子，里面的各个细胞器为第二层谐振子，大分子和其他纳米结构为第三层谐振子。由于细胞和细胞器以及内部的大分子的质量各不相同，其各自的谐振频率不同，并且具备一一对应关系，故当俘获光束以不同频率进行强度调制扫描时，俘获光束对细胞的扭动振动频率会随之扫描式改变，不同质量的谐振子会依次谐振响应，用连续的问询探测光进行谐振问询，其后向散射光含有不同的谐振信号，从而得到细胞的质谱分布信息。
所述的螺旋四芯光纤具备有一个中间纤芯和围绕中间芯螺旋分布的三个周边纤芯，周边纤芯用于传输俘获光束，中间芯用于谐振问询探测光和后向散射光的传输。
所述的两根螺旋四芯光纤由微操手进行微调，使得其相对放置，且两光纤的纤端均制备有旋转对称的锥台结构，能够对周边纤芯所传输的俘获光进行全内反射，从端面出射并交叉汇聚。为了满足全内反射汇聚，锥台底角α需满足：α≥arcsin(n1/n2)，n1为被测物质环境折射率，n2为螺旋四芯光纤纤芯折射率。
所述的系统可以使用光强度调制器实现其中一根螺旋四芯光纤内的俘获光的功率扫频式调制，另一根四芯螺旋光纤俘获光功率不变，如此造成两个捕获势阱对细胞的扭矩不同，在实现对单细胞俘获并扫频式扭转激振的同时，将细胞低频旋转，从而获取单细胞的360度合成质谱。
所述的螺旋四芯光纤也可以是螺旋七芯光纤。
所述的俘获激光光源和谐振问询探测光源的波长不同。
本发明具备以下多项明显优点：
(1)本发明采用双光纤光镊技术，其能实现单细胞的有效俘获，能够稳定测量其质谱。
(2)所采用的螺旋四芯光纤及其端面的锥台结构，其输出光场具备有轨道角动量，不仅能对细胞进行扭转激励谐振，还能使其低频旋转，从而获取单细胞的360度合成质谱，具备有更完备，更丰富的质谱信息。
(3)相对于现存的基于离子化的单细胞质谱技术来说，本发明无需对细胞产生创伤，无需对单细胞进行复杂的样本提取和离子化处理，同时具备有实时、原位、动态检测细胞质谱的特点。
(4)相比较于荧光标记的单细胞研究方法，本发明灵敏度高、无需标记，能进行多组分的同时检测，还能获取分子的结构信息，这对细胞生物学的研究十分有利。
(四)附图说明
图1是螺旋四芯光纤的结构示意图，其中(a)为截面图，(b)为三维图。
图2是螺旋七芯光纤的结构示意图，其中(a)为截面图，(b)为三维图。
图3是螺旋四芯光纤的周边芯输出的俘获光经由光纤端的旋转对称锥台结构全内反射，交叉汇聚后的光场，(a)为三维视图，(b)为端面视图。
图4是单根螺旋四芯光纤在锥台的作用下，交叉汇聚光场对单细胞的捕获及旋转作用示意图，(a)为三维视图，(b)为端面视图。
图5是单细胞的带有阻尼的弹簧式谐振子的等效模型示意图。
图6是螺旋四芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪的系统示意图。
图7是(a)为对称放置的双螺旋四芯光纤对单细胞的准静态俘获及扭转激振示意图，(b)为单细胞在准静态俘获下扭转激振的受力分析。
图8为输入螺旋多芯光纤周边纤芯的光强，其在准静态俘获的光强基础上实现变频扫描的交流调制。
图9为实施例2中所述的单细胞360度低频旋转并且扭转激振的系统示意图。
图10为实施例2中所述单细胞360度合成质谱的获得原理示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体的附图和实施例来进一步阐述本发明。
首先，本发明可以采取的螺旋多芯光纤具备有一个中间纤芯，和若干个围绕中间纤芯、周期性螺旋圆周分布的周边纤芯，例如图1所示的螺旋四芯光纤，或者如图2所示的螺旋七芯光纤。在两图中，(a)为光纤的端面示意图，(b)为螺旋多芯光纤的三维示意图。在本发明中，螺旋多芯光纤的周边纤芯用于传输被调制的俘获光，中间纤芯用于传输谐振问询探测光和后向散射的信号光。以下以螺旋四芯光纤为例进行说明。
其次，在螺旋四芯光纤13的一端具备有精细研磨而成的旋转对称圆台结构，如图3(a)所示。该锥台结构能够对周边纤芯a，b，c所传输的俘获光束19进行全内反射，从端面出射并交叉汇聚。为了满足全内反射汇聚，锥台底角α需满足：α≥arcsin(n1/n2)，n1为被测物质环境折射率，n2为螺旋四芯光纤周边纤芯a，b，c的折射率。图3(b)是从端面的视角看去，周边纤芯a，b，c内的多光束由于锥台的全反射作用而交叉汇聚示意图。交叉聚焦的多光束光场具备有角动量，如图4所示，单细胞14在多光束交叉汇聚的光场下受到一个扭矩作用，该扭矩可使得单细胞14旋转。
本发明将被俘获细胞14当作多层级的谐振子，可以等效于带有阻尼的弹簧式谐振子模型，如图5所示。具体描述为：细胞整体为第一层谐振子，里面的各个细胞器为第二层谐振子，大分子和其他纳米结构为第三层谐振子。改变俘获光束的强度大小就可以改变作用于细胞上的扭矩的大小。由于细胞和细胞器以及内部的大分子的质量各不相同，其各自的谐振频率不同，并且具备一一对应关系，故当俘获光束以不同频率进行强度调制扫描时，俘获光束对细胞的扭动振动频率会随之扫描式改变，不同质量的谐振子会依次谐振响应，用连续的问询探测光进行谐振问询，其后向散射光含有不同的谐振信号，从而得到细胞的质谱分布信息。
对于上述的多层级的带有阻尼的弹簧式谐振子模型，应该利用动力矩阵的形式来描述其运动状态。考虑阻尼作用和周期性的激振力，其运动方程可以描述为：
令
为细胞结构的质量矩阵，
为阻尼矩阵，
为刚度矩阵，
为细胞器所受的激振力矩阵。即上式可写作：
MX″(t)+CX′(t)+KX(t)＝F(t)
(2)
利用傅里叶变换将方程变换到频域形式，有：
(-ω2M+iωC+K)X(ω)＝F(ω) (3)
定义阻抗矩阵：
因此运动方程可以写作：
阻抗矩阵D描述了各个细胞器的所有固有特性，包括其质量，固有频率与模态振型。由上述方程可以看出，通过施加变频扫描的光动力作为激振力矩阵
并通过测得问询光束的反射信号的强度变化，来得到位移响应矩阵
这样就可以反演得到包含有细胞质量分布和结构信息的阻抗矩阵D。
实施例1：螺旋四芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪。
图6是螺旋四芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪的系统示意图，图7为对称放置的一对螺旋四芯光纤对单细胞的准静态俘获及扭转激振原理图。该系统由俘获激光光源1-1，谐振问询探测光源1-2，单模光纤2，函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，1×6光纤耦合器6，多芯光纤耦合器7，照明光源8，载物台9，显微物镜10，CCD11，计算机12，螺旋四芯光纤13，单细胞14，环形器15，滤光片16，平衡光电探测器17，带有FFT档的示波器18和微操手19组成。其中，俘获光源1-1采用波长为980nm的激光，俘获光束20由单模光纤2引出，经过光强度调制器4和隔离器5后，由1×6光纤耦合器分成等功率的6路，由四芯光纤耦合器7分别输入两根螺旋四芯光纤13的周边纤芯。经过微操手19的精细微调，使得两根螺旋四芯光纤13输出的俘获光束20相向传输，其出射光束携带有角动量，可以在俘获细胞14的同时给予细胞14一对扭矩，由于两根螺旋四芯光纤13的手性相同，故相向传输的交叉汇聚光束能够对细胞施加的一对扭矩方向相反。函数发生器3用于对光强度调制器4的控制，改变俘获光束20的强度，使其在准静态俘获的光强基础上实现变频扫描的交流调制，从而周期性改变施加于被俘获细胞14上的扭矩大小。图8是俘获光束20的强度随时间周期性交流变化，周期为T，等效静态的准静态俘获光强为Itrap。由于细胞及其内部的细胞器或大分子质量不同，其谐振频率不同，当光强扫频式调节时(即改变周期T)，细胞及其内部的细胞器或大分子发生逐个的谐振响应。
光源1-2的波长与俘获光束19的波长不同，可以为1064nm，其用于谐振问询的探测光21。谐振问询探测光21经由单模光纤2引出，四芯光纤连接器7连接，输入其中一根螺旋四芯光纤13的中间芯传输，出射于细胞14上，其后向散射信号22包含有谐振信息，后向散射信号22再经由中间芯反向传输，经过滤光片16后，由平衡光电探测器17接收，去除直流信号并将交流信号放大，再将时域信号经由傅立叶变换变换至频域，便可以得到细胞谐振频谱，由带有FFT档的示波器18显示，该频谱对应于细胞的质谱分布。
实施例2：用于获取单细胞360度合成质谱的螺旋四芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪。
如图9所示，实施例1中的系统可做如下的变化：俘获光束19由单模光纤2引出光源1-1后，经由1×2耦合器6-1分成两路，将光强度调制器4放置于其中的一路上，使其只对一根螺旋四芯光纤周边纤芯的光强进行扫频式调制，另一根螺旋四芯光纤俘获光功率不变(如图10所示)。这样，两边对细胞14施加的时均扭矩不等，便能在实现对单细胞俘获并扫频式扭转激振的同时，将细胞14低频旋转，从而获取单细胞的360度合成质谱。
Claims (5)
1.一种螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪，其特征是：它由俘获激光光源(1-1)，谐振问询探测光源(1-2)，单模光纤(2-1、2-2)，函数发生器(3)，光强度调制器(4)，隔离器(5)，1×6光纤耦合器(6)，多芯光纤耦合器(7)，照明光源(8)，载物台(9)，显微物镜(10)，CCD(11)，计算机(12)，螺旋四芯光纤(13)，单细胞(14)，环形器(15)，滤光片(16)，平衡光电探测器(17)，带有FFT档的示波器(18)和微操手(19)组成，所述质谱仪中：(1)俘获光束由单模光纤(2-1)引出，经过光强度调制器和隔离器后，由1×6光纤耦合器分成等功率的6路，由四芯光纤耦合器分别输入两根螺旋四芯光纤的周边纤芯，两根螺旋四芯光纤输出的俘获光束相向传输，其出射光束携带有轨道角动量，可以在俘获细胞的同时给予细胞一个扭矩；(2)函数发生器用于对光强度调制器的控制，改变俘获光的强度，使其在准静态俘获的光强基础上实现变频扫描的交流调制，从而周期性改变施加于被俘获细胞上的扭矩大小，使得细胞及其内部的细胞器或大分子发生逐个的谐振响应；(3)谐振问询探测光经由螺旋四芯光纤的中间芯传输，出射于细胞上，其后向散射信号包含有谐振信息，散射信号再经由中间芯反向传输，由平衡光电探测器接收，去除直流信号并将交流信号放大，再将时域信号经由傅立叶变换变换至频域，便可以得到细胞谐振频谱，由带有FFT档的示波器(18)显示，该频谱对应于细胞的质谱分布。
2.根据权利要求1所述的螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪，其特征是：所述的两根螺旋四芯光纤相对放置，且其纤端制备有旋转对称的锥台结构，用于螺旋的周边纤芯传输的俘获光束的聚焦，实现大的光捕获势阱。
3.根据权利要求1所述的螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪，其特征是：所述的质谱仪可以使用光强度调制器实现一根螺旋四芯光纤内的俘获光的功率扫频式调制，另一根四芯螺旋光纤俘获光功率不变，如此造成两个捕获势阱对细胞的扭矩不同，在实现对单细胞俘获并扫频式扭转激振的同时，将细胞低频旋转，从而获取单细胞的360度合成质谱。
4.根据权利要求1至3任一项所述的螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪，其特征是：所述的螺旋四芯光纤也可以是螺旋七芯光纤。
5.根据权利要求1所述的螺旋多芯光纤扭动式谐振单细胞质谱仪，其特征是：所述的俘获激光光源(1-1)和谐振问询探测光源(1-2)的波长不同。
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Application publication date: 20190906 Assignee: Guilin Photon Power Technology Co.,Ltd. Assignor: GUILIN University OF ELECTRONIC TECHNOLOGY Contract record no.: X2023980045805 Denomination of invention: Spiral multi-core fiber torsion resonant single cell mass spectrometer Granted publication date: 20210608 License type: Common License Record date: 20231105 |