CN110208360B - 光动力谐振式单细胞质谱仪及单细胞质谱获得方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种光动力谐振式单细胞质谱仪及单细胞质谱获得方法。它由变频扫描强度调制型光镊模块(A)、谐振问询质谱探测模块(B)和光学成像模块(C)组成，其中变频扫描强度调制型光镊模块(A)能够捕获单细胞并利用光动力对其进行变频扫描式激振，谐振问询质谱探测模块(B)能够探测、收集并处理包含有单细胞质量分布信息的散射光信号，光学成像模块用于单细胞操作时的实时成像。本发明不仅能用于单细胞捕获操作，还可用于单细胞的质谱测量。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种光动力谐振式单细胞质谱仪及单细胞质谱获得方法，可用于单细胞质谱的测量，属于质谱仪器和单细胞分析技术领域。
(二)背景技术
细胞是组成生命体的基本单元，了解一个细胞中发生的生命活动对于我们认识生命过程有具有十分重要的价值。单细胞技术是当前生物学技术的前沿，可以给科学家提供许多新的生物学信息，不仅可以检验过去经典方法的结论，还可以发现许多新的规律。
不同的细胞内个体之间具有差异性，为了如实地反映细胞在结构和功能上对生物系统的正常运转所起到的作用，就必须从单细胞水平上对细胞中物质的组成和含量进行分析研究。但是单细胞分析研究却由于细胞的极小体积、极多的物质种类、极少的物质含量以及不同物质间显著的浓度差异而一度受阻。由于细胞内不同物质的质量有差异，因此质谱是一种很适合于单细胞分析的检测方法，它具有无需标记、极高的灵敏度以及多物质同时检测的能力，能如实地反映细胞内各物质成分种类和含量。
目前而言，所发展出的单细胞质谱仪均是基于多种离子化方法，这些方法能够对不同类型的样品进行解吸附/离子化，主要包括电喷雾/纳喷雾离子化(electrospray/nano-electrospray ionization，ESI/Nano-ESI)、激光剥蚀/激光解吸附离子化(1aserablation/laser desorption ionization，LA/LDI)以及二次离子电离(secondaryionization mass spectrometry，SIMS)等。被离子化后的物质具有不同的质量，质量不同的离子在磁场的作用下到达检测器的时间不同，其结果为质谱图。
上述的质谱仪技术均需要对单细胞进行破坏并对细胞内的物质成分进行提取，如何实现单细胞的实时、原位、动态检测是生命科学提出的一项很有挑战性的难题。本发明提出的光动力谐振式单细胞质谱仪是基于单细胞俘获光镊系统的质谱仪，其对单细胞质谱测量的实现原理与现存的基于物质离子化的质谱仪不同，它是依靠周期性变化的光动力来对细胞内不同结构和物质成分进行扫频式激励谐振，不同质量的结构和物质具备有不同的谐振频率，因此通过对激励谐振频率的扫描便能实现细胞质谱的测量。其能够实现对单细胞的实时、原位、动态质谱检测功能，具备有十分重要的科学意义和应用价值。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种光动力谐振式单细胞质谱仪及单细胞质谱获得方法。
本发明的目的是这样实现的：
该光动力谐振式单细胞质谱仪由变频扫描强度调制型光镊模块(A)、谐振问询质谱探测模块(B)和光学成像模块(c)组成。所述系统中：1)变频扫描强度调制型光镊模块(A)的俘获光束的强度能够被周期性调制，并且调制的频率连续扫描式可调，该俘获光束不仅能够对单细胞实现准静态俘获，并且随着光强调制频率的扫频式变化，单细胞及其内部的细胞器、大分子会被逐一激励谐振；2)谐振问询质谱探测模块(B)利用问询光束对被捕获并谐振激励的细胞进行问询，然后收集并处理散射的包含有单细胞质量分布信息的散射光信号；3)光学成像模块(C)用于细胞的俘获操作的实时成像。
所述的变频扫描强度调制型光镊模块(A)的俘获光束的强度能够通过电光调制器进行周期性调制，该光束能够实现细胞的准静态俘获，并且由于光强被周期性调制，其分布于细胞表面及其内部的局部辐射压力的大小会发生周期性调制，当这种周期性的调制频率从小到大被扫描时，被俘获细胞及其内部的细胞器，大分子等会因为谐振频率的不同而逐一谐振响应。
所述的谐振问询质谱探测模块(B)具备有强度稳定的连续的谐振问询光源和光电探测处理模块。谐振问询光源发出的问询探测光和变频扫描强度调制型光镊模块(A)的俘获光共用光路，并且其波长不同于俘获光波长。当被俘获细胞在变频扫描强度调制型光镊模块(A)变频扫描并且使得细胞及其亚结构逐级谐振时，作用于细胞上的谐振问询光会被散射。散射的光信号包含有细胞及其内部结构和物质的谐振位移信息，该散射信号被光电探测器所接收，经过光电转换和信号去噪处理，滤除直流，取交流并放大后，将时域信号通过傅立叶变换到频域，得到一系列的谐振频谱信息，这些谐振频谱信息与细胞及其内部亚结构的质量一一对应。
所述的变频扫描强度调制型光镊模块(A)的光镊形式可以是单光束空间光镊，也可以是双光束空间光镊。
所述的变频扫描强度调制型光镊模块(A)的光镊形式可以是具备有空间光相位调制器的涡旋光束光镊。该光镊不仅能够通过强度调制器实现光强的周期性调制，也可以实现俘获光束的相位调制，使俘获光束为参数可控的涡旋光束。
所述变频扫描强度调制型光镊模块(A)的光镊为涡旋光束光镊时，其能在俘获细胞的同时使细胞低频旋转，如此相当于从不同的角度实现细胞及其亚结构的激励谐振，谐振问询质谱探测模块(B)便能够测得细胞的360度合成质谱。
由于细胞具备有细胞器和细胞骨架，并且大部分由有弹性的生物膜和大分子构成，因此可以将细胞及其内部的细胞器及更小的纳结构看作有弹性的小球，并建立细胞结构的多层级阻尼谐振子物理模型，第一层阻尼谐振子是将细胞作为一个整体而言的阻尼谐振子；第二层阻尼谐振子是细胞壳体内部，以细胞质作为参照阻尼液体，内部各种细胞器可等效于若干个待测质量的、具有阻尼作用的谐振子；第三层为细胞器内部的纳结构等效谐振子或大生物分子团；当外界施加不同声波振动时，细胞及其内部作为具有多个层级的分布式阻尼谐振子将依照各个谐振子的谐振频率逐个响应，从而其响应与谐振子各自的质量成正比。如果能够测得每个部分的谐振频率，则能够将各个部分的结构质量按照频率展开，从而获得细胞及其亚结构的质谱分布曲线。
由此，提出一种单细胞质谱探测方法：
1)使用光镊对单细胞进行静态俘获；
2)变频扫描式周期性改变俘获光束强度，其对俘获细胞及其内部的细胞器、大分子的辐射压力会扫频式变化，由于细胞和细胞器以及内部的大分子的质量各不相同，其各自的谐振频率不同，并且具备一一对应关系，当俘获光束以不同频率进行强度调制扫描时，其对俘获细胞及其内部的细胞器、大分子的辐射压力会扫频式变化，不同质量的谐振子会依次谐振响应；
3)用连续的问询探测光进行共光路问询，其后向散射光含有不同质量信息的谐振位移信号，对获得的信号进行处理并反演，从而得到细胞的质谱分布信息。
本发明能够实现对单细胞的实时、原位、动态质谱检测功能，不仅能对不同单细胞内部的结构及组成成分进行定性分析，还能对其各个组成成分含量进行定量分析。因此具备有十分重要的科学意义和应用价值。
(四)附图说明
图1是细胞结构的多层级阻尼谐振子物理模型。
图2是双光束型光动力谐振式单细胞质谱仪的装置示意图。
图3是双光束型光动力谐振式单细胞质谱仪的激励谐振及探测原理图。
图4是变频扫描强度调制型光镊模块(A)中俘获光束的强度调制示意图，其准静态俘获功率为Itrap，调制周期为T。
图5是单光束光镊型光动力谐振式单细胞质谱仪的装置示意图。
图6是单光束光镊型光动力谐振式单细胞质谱仪的激励谐振及探测原理图。
图7是涡旋光镊型光动力谐振式单细胞质谱仪的装置示意图。
图8是拓扑数为2的涡旋光场的相位图和实际光场分布图。
图9是涡旋光镊型光动力谐振式单细胞质谱仪的激励谐振及探测原理图。
(五)具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：双光束光镊型光动力谐振式单细胞质谱仪
由于细胞具备有细胞器和细胞骨架，并且大部分由有弹性的生物膜和大分子构成，因此本发明将细胞9及其内部的细胞器9-1及更小的纳结构9-2看作有弹性的小球，并建立细胞结构的多层级阻尼谐振子物理模型，如图1所示。第一层阻尼谐振子是将细胞9作为一个整体而言的阻尼谐振子，其阻尼为细胞所处环境液体作为阻尼参照液体；第二层阻尼谐振子是细胞壳体内部的细胞器9-1，这些大小不同的细胞器可等效于若干个待测质量的、具有阻尼作用的谐振子，其以细胞质作为参照阻尼液体；第三层为细胞9和细胞器9-1内部的纳结构(大生物分子团)9-2等效谐振子，以细胞质为参照阻尼液体。
本实施例以双光束光镊型谐振式单细胞质谱仪为例，说明本发明的单细胞激励谐振和质谱测量原理。
双光束型光动力谐振式质谱仪的系统组成示意图如图2所示。整个系统包含有：捕获光源1-1(波长为980nm)、探测光源1-2(波长为1310nm)、扩束准直透镜组2-1，2-2，2-3，2-4和2-5、函数发生器3、光强度调制器4、反射镜5、二向色镜6-1和6-2、分光棱镜7-1，7-2和7-3、显微物镜8-1和8-2、单细胞9、照明光源10、聚焦透镜11-1和11-2、滤光片12-1和12-2、CCDl3、光电探测器14、示波器(带有FFT档)15、空间光相位调制器16、孔径光阑17以及可调光衰减器18-1和18-2。这些器件可分为三个功能模块：变频扫描强度调制型光镊模块(A)、谐振问询质谱探测模块(B)和光学成像模块(C)。
其中变频扫描强度调制型光镊模块(A)的光路组成是双光束光镊的光路，函数发生器3用于控制光强度调制器4，对俘获光场的强度进行周期性扫频调制，实现对细胞9及细胞内的不同结构和成分的依次激励谐振；空间光相位调制器16用于俘获光场的相位及强度分布的调制；可调光衰减器18-1和18-2是为了保证光镊系统中两束相向传输的俘获光束的强度大小一致，实现稳定的俘获势阱。谐振问询质谱探测模块(B)用于细胞9及其内部结构共振的问询探测，其中探测光源1-2为1310nm的连续稳定的光源，和其中的一路俘获光束共光路输出，但是其强度远小于俘获光束的强度，因此对俘获力的影响可以忽略不计。当细胞9被扫频激励谐振时，细胞9后向散射的探测信号光被光电探测器14收集，经过滤除直流、交流放大并进行傅立叶变换处理，在示波器15上显示出不同频率的谐振峰，这些谐振峰就对应与不同质量的细胞结构和组成成分，峰值的高低表示该成分的含量大小。光学成像模块(C)用于细胞操作的实时成像。
下面以细胞整体，也就是第一层等效的阻尼谐振子为例，对其进行激励共振原理分析：
如图3所示，细胞9被相向传输的两束激光19形成的势阱稳定俘获，其质心所受合力必然为零。但是，细胞表面的局部所受到的光的辐射压力分量却并不为零。因此，当俘获光19的光强在强度调制器4的控制下周期性变化时(如图4所示)，其所受时间平均合力仍旧为零，相当于有个等效的Itrap实现等效的准静态捕获，而周期性的强度I(t)变化会导致所俘获细胞表面的局部光辐射压力Ff(t)的周期性变化。由于细胞的细胞膜具有很好的弹性，如上所述，可以将细胞整体作为一个阻尼谐振子，该阻尼谐振子在Ff(t)的作用下做拉伸-收缩的受迫振动(图3中实线9a表示收缩，虚线9b表示拉伸)，这个时候对细胞9的振动方程为：
如果考虑到细胞内部复杂的结构及质量分布的话，情况会复杂的多。当使用光镊将其捕获并采用周期性光强调制的方法，来改变其捕获力的时候，细胞内部的各类细胞器会有不同的动态响应。当外界施加的激励按照频率从低到高完成不同频率的扫描振动激励时，各个细胞器可以看作多层级的分布式阻尼谐振子，它们将依照各自的本征谐振频率逐个响应，而其响应信号与谐振子各部分的质量与结构相关，如图1所示。如果能够测得每个部分的谐振频率，则能够将各个部分的结构质量按照频率展开，从而获得细胞及其亚结构的质谱分布特性曲线。
此时，我们不能简单地将整个细胞内部的动力响应看作单自由度的受迫振动，而是应该利用动力矩阵的形式来描述其运动状态。考虑阻尼作用和周期性的激振力，其运动方程可以描述为：
令
为细胞结构的质量矩阵，
为阻尼矩阵，
为刚度矩阵，
为细胞器所受的激振力矩阵。即上式可写作：
MX″(t)+CX′(t)+KX(t)＝F(t) (3)
利用傅里叶变换将方程变换到频域形式，有：
(-ω2M+iωC+K)X(ω)＝F(ω) (4)
定义阻抗矩阵：
因此运动方程可以写作：
阻抗矩阵D描述了各个细胞器的所有固有特性，包括其质量，固有频率与模态振型。由上述方程可以看出，通过施加变频扫描的光动力作为激振力矩阵
并通过测得问询光束的反射信号的强度变化，来得到位移响应矩阵
这样就可以反演得到包含有细胞质量分布和结构信息的阻抗矩阵D。
实施例2：单光束型光动力谐振式单细胞质谱仪
单光束型光动力谐振式细胞质谱仪也包含上述的三个功能模块，但是其相比较于实施例1，结构更简单些，其只有一束的强度周期性调制扫频的强聚焦光束19-1实现细胞9的准静态捕获和扫频激励共振。如图5所示，其系统包含有：捕获光源1-1(波长为980nm)、探测光源1-2(波长为1310nm)、扩束准直透镜组2-1，2-2和2-3、函数发生器3、光强度调制器4、反射镜5、二向色镜6-1和6-2、分光棱镜7、显微物镜8、单细胞9、照明光源10、聚焦透镜11-1和11-2、滤光片12-1和12-2、CCDl3、光电探测器14以及示波器(带有FFT档)15。
如图6所示，细胞被聚焦的单光束19-1稳定俘获，其质心所受合力必然为零。但是，细胞表面的局部所受到的光的辐射压力分量却并不为零。因此，当俘获光的光强在强度调制器的控制下周期性变化时(如图4所示)，其所受合力仍旧为零，相当于有个等效的Itrap实现等效的准静态捕获，而周期性的强度I(t)变化会导致所俘获细胞表面的局部光辐射压力Ff(t)的周期性变化，细胞9的形状会在舒张(9a)-压缩(9b)间周期性变化。当周期性驱动力Ff(t)的驱动频率接近与细胞9的本征频率时，细胞9将会发生谐振，此时细胞9对问询探测光信号20的后向散射光21的强度会有明显的周期性变化。当俘获光强I(t)以不同的调制频率扫描时，细胞9及其内部作为具有多个层级的分布式阻尼谐振子将依照各个谐振子的谐振频率逐个响应，从而其响应与谐振子各自的质量成正比。如果能够测得每个部分的谐振频率，则能够将各个部分的结构质量按照频率展开，从而获得细胞及其亚结构的质谱分布曲线。
实施例3：涡旋光镊型光动力谐振式单细胞质谱仪
本实施例和实施例2的区别在于，本实施例在俘获光路中增加了一个空间光相位调制器16(如图7所示)，该器件能对俘获光场的相位和强度分布进行精细的调控，因此俘获光束可以是具有角动量的涡旋光束。如图8所示，(a)是拓扑数为2时的涡旋光的相位图，(b)是经过空间光相位调制器实现的拓扑数为2的相应的光场分布图。如图9所示，涡旋光场19-2不但能够对细胞9进行准静态俘获，还能使得俘获的单细胞9获得角动量，使其低频旋转。在旋转单细胞9的同时，对其扫频激励谐振，便可以获得细胞的360度合成质谱。
Claims (5)
1.一种光动力谐振式单细胞质谱仪，其特征是：它由变频扫描强度调制型光镊模块(A)、谐振问询质谱探测模块(B)和光学成像模块(C)组成，所述质谱仪：1)变频扫描强度调制型光镊模块(A)的俘获光束的强度能够被周期性调制，并且调制的频率连续扫描式可调，该俘获光束不仅能够对单细胞实现准静态俘获，并且随着光强调制频率的扫频式变化，单细胞及其内部的细胞器、大分子会被逐一激励谐振；2)谐振问询质谱探测模块(B)利用问询光束对被捕获并谐振激励的细胞进行问询，然后收集并处理散射的包含有单细胞质量分布信息的散射光信号；3)光学成像模块(C)用于细胞的俘获操作的实时成像。
2.根据权利要求1所述的光动力谐振式单细胞质谱仪，其特征是：所述的变频扫描强度调制型光镊模块(A)的光镊形式可以是单光束空间光镊，也可以是双光束空间光镊。
3.根据权利要求1所述的光动力谐振式单细胞质谱仪，其特征是：所述的变频扫描强度调制型光镊模块(A)的光镊形式可以是具备有空间光相位调制器的涡旋光束光镊。
4.根据权利要求1或权利要求3中任一项所述的光动力谐振式单细胞质谱仪，其特征是：所述的光镊为涡旋光束光镊时，其能在俘获细胞的同时使细胞低频旋转，谐振问询质谱探测模块(B)便能够测得细胞的360度合成质谱。
5.一种单细胞质谱探测方法，其特征是：
1)使用光镊对单细胞进行静态俘获；
2)变频扫描式周期性改变俘获光束强度，其对俘获细胞及其内部的细胞器、大分子的辐射压力会扫频式变化，由于细胞和细胞器以及内部的大分子的质量各不相同，其各自的谐振频率不同，并且具备一一对应关系，当俘获光束以不同频率进行强度调制扫描时，其对俘获细胞及其内部的细胞器、大分子的辐射压力会扫频式变化，不同质量的谐振子会依次谐振响应；
3)用连续的问询探测光进行共光路问询，其后向散射光含有不同质量信息的谐振位移信号，对获得的信号进行处理并反演，从而得到细胞的质谱分布信息。
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Application publication date: 20190906 Assignee: Guilin Photon Power Technology Co.,Ltd. Assignor: GUILIN University OF ELECTRONIC TECHNOLOGY Contract record no.: X2023980045805 Denomination of invention: Photodynamic Resonant Single Cell Mass Spectrometer and Method for Obtaining Single Cell Mass Spectrometer Granted publication date: 20210629 License type: Common License Record date: 20231105 |