CN110208237B - 基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：它由俘获光源1‑1，问询光源1‑2，单模光纤2，函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，光纤耦合器6，可调光纤衰减器7，功率计8，波分复用器9，多芯光纤连接器10，多芯光纤11，照明光源12，载物台13，显微物镜14，CCD15，计算机16，滤光片17‑1、17‑2，平衡光电探测器18，带有FFT档的示波器19，拉曼光谱仪20和微操手21组成。本发明可用于单细胞的俘获、单细胞姿态调整、细胞质谱获取和细胞拉曼光谱获取，在单细胞分析技术领域具有多功能集成的独特优势。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，可用于单细胞的捕获，姿势调整以及其质谱和拉曼光谱的多功能测量，属于单细胞分析仪器技术领域。
(二)背景技术
细胞是组成生命体的基本单元，了解一个细胞中发生的生命活动对于我们认识生命过程有具有十分重要的价值。单细胞技术是当前生物学技术的前沿，可以给科学家提供许多新的生物学信息，不仅可以检验过去经典方法的结论，还可以发现许多新的规律。传统的细胞生物学依据细胞的来源组织、自身外在形态，以及分泌物等特征对细胞群体进行分类和研究。这些技术和分析手段在疾病诊断和细胞与细胞间的相互作用等领域取得了显著的研究成果。然而，随着细胞分析技术的不断提高，人们越来越发现细胞之间具有个体差异性。即使是在相同条件下培养的同源细胞，其形态及其特性仍旧存在一定的差异。这些差异的来源是细胞内随时发生的化学反应的随机性。在细胞内所发生的随机过程可能会导致细胞的某些参数的结果存在多个稳定态，而传统的群体细胞检测技术只能给出这些稳态的平均结果。因此，为了了解不同细胞个体之间随机性导致的各种差异，单细胞分析技术的发展就显得尤为重要。
正是由于不同的细胞个体之间具有差异性，为了如实地反映细胞在结构和功能上对生物系统的正常运转所起到的作用，就必须从单细胞水平上对细胞中物质的组成和含量进行分析研究。但是单细胞分析研究却由于细胞的极小体积、极多的物质种类、极少的物质含量以及不同物质间显著的浓度差异而一度受阻。由于细胞内不同物质的质量有差异，因此质谱是一种很适合于单细胞分析的检测方法，它具有无需标记、极高的灵敏度以及多种物质同时检测的能力，能如实地反映细胞内各物质成分种类和含量。
目前而言，所发展出的单细胞质谱仪均是基于多种离子化方法，这些方法能够对不同类型的样品进行解吸附/离子化，主要包括电喷雾/纳喷雾离子化(electrospray/nano-electrospray ionization，ESI/Nano-ESI)、激光剥蚀/激光解吸附离子化(laserablation/laser desorption ionization，LA/LDI)以及二次离子电离(secondaryionization mass spectrometry，SIMS)等。被离子化后的物质具有不同的质量，质量不同的离子在磁场的作用下到达检测器的时间不同，其结果为质谱图。这些单细胞质谱检测技术需要将单细胞进行破坏并对细胞内的物质成分进行提取。
光镊是利用光强度分布的梯度力和散射力俘获和操纵微小粒子的工具。该技术在微小粒子的捕获和搬运、皮牛级力的测量、微机械与微器件的组装等领域得到广泛的应用。特别在生命科学领域，光镊技术以其非接触式、无损探测的本质特性显示了其无与伦比的优势，对于推动生命科学的发展和微生命体的操纵发挥了巨大的作用。光镊俘获的粒子尺度可以从几纳米到几十微米，而这刚好是单个细胞所处的尺度范围之内，因此其能够对单个细胞个体进行有效的俘获及操作。
拉曼光谱技术是通过光与物质相互作用后，产生拉曼散射光谱来反映物质内部结构和分子振动信息的一门技术。结合光镊技术，该技术能够在单细胞分析中起到重要的作用，能够在实现单细胞的稳定俘获和其拉曼光谱的快速、稳定、无创获取，2008年，J.W.Chan等人将传统光镊技术与拉曼光谱探测相结合，实现了单个酵母菌细胞拉曼光谱的测量，并通过拉曼光谱对细胞的生命活性特征做了表征(Analytical Chemistry，2008，80(6)：2180)。
如上述的，质谱技术、光镊技术和拉曼光谱技术是研究单细胞的化学组成及生命活动规律探寻的重要手段。但是现有的质谱技术均是基于对单细胞内物质提取并离子化的过程，这就难以避免对细胞的破坏，并且操作繁琐。本发明提出的基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其对单细胞质谱测量的实现原理与现存的基于物质离子化的质谱仪不同，它是在结合单光纤光镊技术，实现单细胞准静态俘获的基础上，依靠周期性变化的光动力来对细胞内不同结构和物质成分进行扫频式激励谐振，单细胞内不同质量的结构和物质逐个种类谐振响应，再通过收集散射问询信号光并解调的方法，实现细胞质谱的测量。更重要的是，本发明还具备有单细胞拉曼光谱的获取功能。光镊的微操作、质谱和拉曼光谱的多功能结合无疑为单细胞分析技术提供了更强大的手段和更丰富的信息，在生命科学领域的重要意义毋庸置疑。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种基于多芯光纤，结合了单光纤光镊技术、单细胞质谱技术和拉曼光谱技术的活体单细胞多功能谱仪。
本发明的目的是这样实现的：
一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，它由俘获光源1-1，问询光源1-2，单模光纤2，函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，光纤耦合器6，可调光纤衰减器7，功率计8，波分复用器9，多芯光纤连接器10，多芯光纤11，照明光源12，载物台13，显微物镜14，CCD15，计算机16，滤光片17-1、17-2，平衡光电探测器18，带有FFT档的示波器19，拉曼光谱仪20和微操手21组成。所述系统中：俘获光源1-1的光束由单模光纤2引出，经过光强度调制器4和隔离器5后，由光纤耦合器6分成等功率的N-1路；每一路俘获光束通过可调光纤衰减器7控制强度，由功率计8监控每路的功率；问询光源同样通过一个光纤耦合器6分成等功率的N-1路；俘获光束和问询光束分别由N-1个波分复用器9耦合后，由多芯光纤连接器10输入多芯光纤11的N-1个圆周分布的周边纤芯，经过多芯光纤11端面的锥台结构反射聚焦，能够实现细胞的俘获、细胞的姿势调整、细胞质谱谐振和拉曼光谱激发；多芯光纤11的中间纤芯用于收集并传输谐振信号光和拉曼信号光，经过耦合器分成两路，分别被平衡光电探测器和拉曼光谱仪接收，实现单细胞质谱和拉曼光谱的测量。
一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其所采用的多芯光纤具备有一个中间芯和N-1个同轴圆周分布的周边纤芯，N≥4；周边纤芯用于俘获光束和问询光束的传输，中间芯用于后向散射的谐振信号光和拉曼信号光的收集和传输。
一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其所采用的多芯光纤的纤端制备有精细研磨而成的旋转对称的反射锥台结构，用于周边纤芯内传输光束的反射会聚，形成光捕获势阱。为了满足全内反射汇聚，锥台底角α需满足：α≥arcsin(n1/n2)，n1为细胞所处液态环境折射率，n2为多芯光纤周边纤芯折射率。
一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，该系统具备有捕获和调整单细胞姿态的功能：光强度调制器控制俘获光强不变而稳定地输出，可调光纤衰减器控制四芯光纤周边纤芯内的每路俘获光束的强度，可以实现单细胞的俘获和姿态调整。
一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，该多功能谱仪具备有单细胞质谱获取的功能：函数发生器用于对光强度调制器的控制，改变俘获光的强度，使其在准静态俘获的光强基础上实现变频扫描的交流调制，改变细胞及其内部结构的光辐射压力，使得细胞及其内部的细胞器或大分子发生逐个的谐振响应；与捕获光共光路的谐振问询光信号，出射于细胞上，其后向散射信号包含有谐振信息，散射信号经由中间芯传输，由平衡光电探测器接收，去除直流信号并将交流信号放大，再将时域信号经由傅立叶变换变换至频域，便可以得到细胞谐振频谱，由带有FFT档的示波器显示，该频谱对应于细胞的质谱分布。
一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，该多功能谱仪具备有单细胞拉曼光谱获取的功能：保持俘获光束强度不变，关闭问询光源，多芯光纤光镊在俘获单细胞的同时进行拉曼激发，中间芯通道收集并传输后向散射的拉曼信号光，经过滤光片滤除激发光后进入拉曼光谱仪分析。
一种多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：该多功能谱仪通过光镊对单细胞的俘获及姿态调整功能，调整细胞到不同的俘获姿态，在不同的姿态下进行单细胞的质谱和拉曼光谱的激发，可得到单细胞的合成质谱和合成拉曼光谱。
一种单细胞质谱获取方法，具体描述为：(1)将被俘获细胞当作多层级的谐振子，可以等效于带有阻尼的弹簧式谐振子模型，具体描述为：细胞整体为第一层谐振子，里面的各个细胞器为第二层谐振子，大分子和其他纳米结构为第三层谐振子。由于细胞和细胞器以及内部的大分子的质量各不相同，其各自的谐振频率不同，并且具备一一对应关系；(2)当俘获光束以不同频率进行强度调制扫描时，俘获光束对细胞的辐射压力会随之扫频式改变，不同质量的谐振子会依次谐振响应；(3)用连续的问询探测光进行谐振问询，当有谐振子被激励谐振时，后向散射的问询光强会在时域上变化，因此后向散射问询光包含有不同的谐振信号；(4)平衡光电探测器接收到后向散射的问询光信号，去除直流并发大交流，再做FFT变换至频域，得到细胞的谐振频谱，即对应于细胞的质谱。
本发明至少具备有以下的明显优点：
(1)提出一种单细胞质谱分析方法。相比较于传统的单细胞质谱分析方法，本发明提出的质谱分析方法具有无创、实时、原位和提供动态质谱检测的特点。
(2)本发明将单细胞捕获操纵技术、质谱技术和拉曼光谱技术集成在同一根多芯光纤探针当中。光镊技术能够控制操纵单细胞的形态，质谱技术和拉曼光谱技术能提供丰富的细胞结构和化学组成信息。因此本发明能够全方位、多功能地实现单细胞的分析。
(3)本发明所提出的光纤探针将多个单细胞分析功能集成于一根多芯光纤之内，而光纤探针具备有集成度高、操作灵活性高的特点，能够实现活体单细胞的在体快速分析。
(四)附图说明
图1是三种可采用的多芯光纤，其中(a)为四芯光纤，(b)为五芯光纤，(c)为七芯光纤。
图2是四芯光纤的纤端的锥台结构示意图。
图3(a)是四芯光纤连接器的结构示意图，(b)是所使用的石英毛细管的结构图。
图4是基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪系统示意图。
图5是实施例中所述的四芯光纤活体单细胞多功能谱仪用于细胞姿态调整原理示意图。
图6是实施例中所述的四芯光纤活体单细胞多功能谱仪用于细胞拉曼光谱获取的原理示意图。
图7是单细胞多层级谐振子模型图。
图8是实施例中所述的四芯光纤活体单细胞多功能谱仪用于细胞质谱获取的原理示意图。
(五)具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例来进一步阐述本发明。
实施例：
本发明中所使用的多芯光纤是具备有一个中间芯和多个圆周分布的周边纤芯的多芯光纤，如图1所示，可以是四芯光纤(a)、五芯光纤(b)或者七芯光纤(c)。
本实施例以四芯光纤为例，对发明进行详细的说明。
如图2所示，在作为光纤光镊探针的四芯光纤的纤端，制备有精细研磨而成的旋转对称圆台结构。该圆台用于将四芯光纤环状分布的周边纤芯内传输的光束全内反射，使其在光纤端面出射后，在离锥台上端面一段距离处汇聚，这样的聚焦光场形成了较深的俘获势阱，能非接触式稳定俘获单细胞粒子。为了让周边光束能实现全内反射汇聚，锥台底角α需满足：α≥arcsin(n1/n2)，n1为被测细胞所处液态环境折射率，n2为多芯光纤周边纤芯折射率。
四芯光纤11通过使用如图3所示的四芯光纤连接器10使得各个纤芯分别和四根单芯单模光纤10-1相连接。图3(a)所示的是四芯光纤连接器10的原理示意图，单芯单模光纤10-1首先和双包层光纤10-2对芯焊接，两种光纤具备有相近的数值孔径和相等的纤芯直径；双包层光纤10-2插入具备有四个匹配微孔的石英毛细管10-3内，石英毛细管10-3的结构如图3(b)所示，其微孔的直径稍大于双包层光纤10-2直径几个微米；微孔的分布和石英毛细管的直径和四芯光纤11的结构成比例，那么加热插入了双包层光纤的石英毛细管，并进行绝热拉锥，使得双包层光纤10-2的内包层直径减小到与四芯光纤11的纤芯直径一致，如此便能和四芯光纤11对芯连接，使得四根单芯单模光纤传输的光分别注入四芯光纤11的四个纤芯内。
图4所示的是基于四芯光纤的单细胞多功能谱仪的系统示意图，它由俘获光源1-1，问询光源1-2，单模光纤2，光函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，光纤耦合器6，可调光纤衰减器7，功率计8，波分复用器9，多芯光纤连接器10，四芯光纤11，照明光源12，载物台13，显微物镜14，CCD15，计算机16，滤光片17-1、17-2，平衡光电探测器18，带有FFT档的示波器19，拉曼光谱仪20和微操手21组成。俘获光源1-1的光束由单模光纤2引出，经过光强度调制器4和隔离器5后，由光纤耦合器6分成等功率的三路；每一路俘获光束通过可调光纤衰减器7控制强度，由功率计8监控每路的功率；问询光源1-2同样通过一个光纤耦合器6分成等功率的三路；俘获光束和问询光束分别由三个波分复用器9耦合后，由四芯光纤耦合器11输入四芯光纤的三个周边纤芯，经过四芯光纤11端面的锥台结构反射聚焦，能够实现细胞的俘获、细胞的姿势调整、细胞质谱谐振和拉曼光谱激发；四芯光纤11的中间纤芯用于收集并传输谐振信号光和拉曼信号光，经过耦合器6分成两路，分别被平衡光电探测器18和拉曼光谱仪20接收，实现单细胞质谱和拉曼光谱的测量。
所述系统中照明光源12、载物台13、显微物镜14，、CCD15和计算机16构成系统的成像部分，能够对细胞实时成像，微操手21能控制光纤探针的精细调整。
下面分别对本发明的多功能特性做具体说明。
(1)单细胞俘获及姿态调整功能：
在单细胞俘获方面，无论是光纤光镊还是空间光镊都已经有了大量的研究，本发明除了具备有单细胞俘获功能之外，还能通过调整俘获光场的分布，来对细胞进行姿态调整。
本发明采用980nm激光作为俘获光源1-1。函数发生器3控制光强度调制器4，使得输出的俘获光束23强度稳定不变，输入四芯光纤11的三个周边纤芯a、b、c。在单细胞22俘获和姿态调整的过程中，问询光束并不起作用，因此可以关闭问询光源1-2，四芯光纤11内只有俘获光束23传输。
如图5所示，俘获光束23通过四芯光纤11纤端的圆锥台结构反射汇聚后，形成光俘获势阱，对单细胞22进行俘获。通过光路中的可调节光纤衰减器8调节四芯光纤11的每个周边纤芯中俘获光束23的强度，以调节汇聚光场的分布，对细胞22的俘获姿态进行微调整。在示意图5中采用椭圆形的细胞22(如酵母菌细胞)，通过俘获光场的微调整，可以使得细胞22沿长轴(图5(a))或者沿短轴(图5(b))被俘获。
(2)单细胞拉曼光谱获取功能：
如图6所示，俘获光束23的光强为Itrap(如图6(b)的左图所示)，单细胞22被稳定输出的俘获光场俘获，由于锥台的汇聚作用，俘获光场的能量密度较高，能够有效实现单细胞22的拉曼光谱的激发。四芯光纤11的中间纤芯将后向散射的拉曼信号光25收集并后向传输，经过四芯光纤连接器10接出。在系统图中(图4)，拉曼信号光25经过滤光片17-2，滤除强的瑞利散射光后输入拉曼光谱仪20进行分析，得到单细胞22的拉曼光谱，如图6(b)中的右图所示。
结合光镊对单细胞的微调整功能，能实现不同角度下对单细胞拉曼光谱的激发及获取，为单细胞分析提供了更丰富、更准确的拉曼信息。
(3)单细胞质谱的获取功能：
本发明提出一种新颖的单细胞质谱测量方法：
(1)如图7所示，将被俘获单细胞22当作多层级的谐振子，可以等效于带有阻尼的弹簧式谐振子模型，具体描述为：细胞整体为第一层谐振子，里面的各个细胞器为第二层谐振子，大分子和其他纳米结构为第三层谐振子。由于细胞和细胞器以及内部的大分子的质量各不相同，其各自的谐振频率不同，并且具备一一对应关系；(2)当俘获光束以不同频率进行强度调制扫描时，俘获光束对细胞的辐射压力会随之扫频式改变，以辐射压力为外源周期性变化的驱动力，不同质量的谐振子会依次谐振响应；(3)用连续的问询探测光进行谐振问询，当有谐振子被激励谐振时，后向散射的问询光强会在时域上变化，因此后向散射问询光包含有不同的谐振信号；(4)平衡光电探测器接收到后向散射的问询光信号，去除直流并发大交流，再做FFT变换至频域，得到单细胞22的谐振频谱，即对应于细胞的质谱。
如系统图(图4)和图8所示，函数发生器3控制光强度调制器4，使得俘获光束23在静态俘获光强Itrap的基础上有一个周期性的交流调制，周期为T，如图8(b)左图所示。如此的俘获光束23不仅能够实现单细胞22的准静态俘获，还能够周期性改变单细胞22表面和其内部结构受到的辐射压力的大小，这个周期性变化的辐射压力作为外源驱动力。当改变光强度调制器4调节光强的频率，使其在1Hz～1GHz间连续扫频式变化，单细胞22及其内部的各结构成分，由于质量不同，逐个谐振响应。问询光24的强度保持恒定不变，为Iinq，如图8(b)右图所示。当谐振发生时，单细胞22对共光路传输的问询光24的后向散射的光强度会发生变化。四芯光纤11的中间纤芯收集并反向传输谐振信号光26，通过四芯光纤连接器10接出，经过滤光片17-1，输入平衡光电探测器18。去除直流并发大交流，由带有FFT档的示波器19进行傅立叶变换，将时域的信号转换至频域，呈现出来的频谱便对应于单细胞22的质谱分布。
相对于传统的质谱检测方法来说，本发明所提出的质谱检测方法无需对单细胞内的物质进行提取，可直接对其实现原位、实时的质谱测量，具有突出的优势和重要的意义。
Claims (7)
1.一种基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：它由俘获光源(1-1)，问询光源(1-2)，单模光纤(2)，函数发生器(3)，光强度调制器(4)，隔离器(5)，光纤耦合器(6)，可调光纤衰减器(7)，功率计(8)，波分复用器(9)，多芯光纤连接器(10)，多芯光纤(11)，照明光源(12)，载物台(13)，显微物镜(14)，CCD(15)，计算机(16)，滤光片(17-1、17-2)，平衡光电探测器(18)，带有FFT档的示波器(19)，拉曼光谱仪(20)和微操手(21)组成；所述单细胞多功能谱仪中：俘获光源(1-1)的光束由单模光纤(2)引出，经过光强度调制器(4)和隔离器(5)后，由光纤耦合器(6)分成等功率的N-1路；每一路俘获光束通过可调光纤衰减器(7)控制强度，由功率计(8)监控每路的功率；问询光源同样通过一个光纤耦合器(6)分成等功率的N-1路；俘获光束和问询光束分别由N-1个波分复用器(9)耦合后，由多芯光纤连接器(10)输入多芯光纤(11)的N-1个圆周分布的周边纤芯，经过多芯光纤(11)端面的锥台结构反射聚焦，能够实现细胞的俘获、细胞的姿势调整、细胞质谱谐振和拉曼光谱激发；多芯光纤(11)的中间纤芯用于收集并传输谐振信号光和拉曼信号光，经过耦合器分成两路，分别被平衡光电探测器和拉曼光谱仪接收，实现单细胞质谱和拉曼光谱的测量。
2.根据权利要求1所述的基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：所采用的多芯光纤具备有一个中间芯和N-1个同轴圆周分布的周边纤芯，N≥4；周边纤芯用于俘获光束和问询光束的传输，中间芯用于后向散射的谐振信号光和拉曼信号光的收集和传输。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：所采用的多芯光纤的纤端制备有精细研磨而成的旋转对称的反射锥台结构，用于圆周分布的周边纤芯内传输光束的反射汇聚，形成光捕获势阱。
4.根据权利要求1所述的基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是该多功能谱仪具备有捕获单细胞和调整其姿态的功能：光强度调制器控制俘获光强不变地稳定输出，可调光纤衰减器控制多芯光纤周边纤芯内的每路俘获光束的强度，使汇聚光场分布变化，可以实现单细胞的俘获和姿态的调整。
5.根据权利要求1所述的基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是该多功能谱仪具备有单细胞质谱获取的功能：函数发生器用于对光强度调制器的控制，改变俘获光的强度，使其在准静态俘获的光强基础上实现变频扫描的交流调制，改变细胞及其内部结构的光辐射压力，使得细胞及其内部的细胞器或大分子发生逐个的谐振响应；与捕获光共光路的谐振问询光，出射于细胞上，其后向散射信号包含有谐振信息，散射信号经由中间芯传输，由平衡光电探测器接收，去除直流信号并将交流信号放大，再将时域信号经由傅立叶变换变换至频域，便可以得到细胞谐振频谱，由带有FFT档的示波器显示，该频谱对应于细胞的质谱分布。
6.根据权利要求1所述的基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是该多功能谱仪具备有单细胞拉曼光谱获取的功能：保持俘获光束强度不变，关闭问询光源，多芯光纤光镊在俘获单细胞的同时进行拉曼激发，中间芯通道收集并传输后向散射的拉曼信号光，经过滤光片滤除激发光后进入拉曼光谱仪分析。
7.根据权利要求1所述的基于多芯光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：该多功能谱仪通过光镊对单细胞的俘获及姿态调整功能，调整细胞到不同的俘获姿态，在不同的姿态下进行单细胞的质谱和拉曼光谱的激发，可得到单细胞的多角度合成质谱和合成拉曼光谱。
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