CN111855623B - 一种光电联用检测仪 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供了一种光电联用检测仪，该检测仪的激光器产生的激光通过正置荧光显微镜的物镜聚集在待检测样品上，以激发待检测样品产生荧光信号；采集器采集正置荧光显微镜输出的待检测样品的荧光信号；第一探针的输入端及第二探针的输入端分别用于与待检测样品两端的电极连接；第一探针的输出端与电信号放大器的输入端电连接；第二探针的输出端与触发件电连接；电信号放大器的输出端与触发件电连接；触发件用于接收、保存经电信号放大器放大的电信号，并触发激光器，以使激光器产生激光。应用本发明实施例提供的检测仪实现超高时空分辨率的光电联用，能够解决荧光显微镜时空分辨率不足的问题。

Description

一种光电联用检测仪
技术领域
本发明涉及单分子检测技术领域，特别是涉及一种光电联用检测仪。
背景技术
生物大分子是生命体生物特征的直接执行者，而生物大分子的微观结构特征及其动力学信息，是实现、调控其生物学功能的基础和关键。因此考察生物体微观结构及动力学信息，是理解其结构-功能关系的重要研究内容。
传统的生物大分子的检测主要是依赖于单分子荧光检测技术。通过荧光检测手段获取生物大分子的微观结构特征及其动力学信息，从而揭示生物物理过程，揭开生命的奥秘。
但是，单分子荧光检测技术是通过测量发光基团或荧光标记物的变化间接获取被测物信息，所得到的荧光信号无法本质地、连续地体现被测物所经历的反应历程，使得其时间分辨率较低，一般只能达到亚毫秒级别；而生物大分子的微观结构特征及其动力信息特征往往发生在微秒级别；因此，传统的单分子荧光检测技术可能会在时间尺度上遗漏生物过程中的重要信息。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种光电联用检测仪，能够通过电学测试手段同步测量，解决正置荧光显微镜时空分辨率不足的问题。具体技术方案如下：
一种光电联用检测仪，包括：光学系统和电学系统；
其中，所述光学系统包括：正置荧光显微镜、激光器和采集器；
所述电学系统包括：探针单元、电信号放大器和触发件；
所述探针单元包括：第一探针和第二探针；
所述激光器产生的激光通过所述正置荧光显微镜的物镜聚集在待检测样品上，以激发所述待检测样品产生荧光信号；
所述采集器，用于采集所述正置荧光显微镜输出的所述待检测样品的荧光信号；
所述第一探针的输入端及所述第二探针的输入端分别用于与所述待检测样品两端的电极连接；
所述第一探针的输出端与所述电信号放大器的输入端电连接；
所述第二探针的输出端与所述触发件电连接；
所述电信号放大器的输出端与所述触发件电连接；
所述触发件用于接收、保存经所述电信号放大器放大的电信号，并触发所述激光器，以使所述激光器产生激光。
进一步地，所述检测仪还包括：第一终端，
所述第一终端与所述触发件电连接；
所述触发件还用于向所述第一终端发送所接收的电信号；
所述第一终端用于展示所述触发件所发送的电信号。
进一步地，所述第一终端还用于对所述触发件发送的电信号进行拟合处理，得到拟合后的电信号曲线。
进一步地，所述采集器包括：电荷耦合器和光信号放大器；
所述电荷耦合器用于采集所述正置荧光显微镜输出的荧光信号，并向所述光信号放大器输出荧光信号；
所述光信号放大器与第二终端电连接，以展示所述光信号放大器输出的荧光信号。
进一步地，所述第二终端还用于处理所述光信号放大器输出的荧光信号，并利用预先采集的明场图像所包含的光信号与所处理的荧光信号，提取荧光信号中相对所述明场图像边界所对应的荧光点，并利用所述荧光点构造边界曲线。
进一步地，所述正置荧光显微镜包括：照明光源、第一滤色镜、第二滤色镜、第一球面透镜、第二球面透镜、二色镜和反射镜：
其中，所述第一滤色镜的入光侧置于所述激光器和所述照明光源的发射光侧，用于接收所述激光器和所述照明光源发射的光信号；
所述第一球面透镜置于所述第一滤色镜的出光侧，且位于所述二色镜的入光侧；
所述二色镜位于所述第二球面透镜的入光侧和所述待检测样品之间，用于反射经过所述第一球面镜的激光至所述待检测样品上，并透射所述待检测样品产生的荧光信号；
所述反射镜置于所述第二球面透镜的出光侧，且位于所述第二滤色镜的入光侧；用于反射所述第二球面镜输出的荧光信号至所述第二滤色镜；
所述第二滤色镜用于输出反射镜反射的荧光信号。
进一步地，所述正置荧光显微镜还包括：光强均化器；
所述光强均化器置于所述激光器和所述照明光源的发光侧，且位于所述第一滤色镜的入光侧，用于均匀照明光源发射的光信号。
进一步地，所述正置荧光显微镜还包括：激光面积调节器；
所述激光面积调节器置于所述第一滤色镜的入光侧，且位于所述光强均化器的出光侧，用于提供可变光栏。
进一步地，所述正置荧光显微镜还包括：扩束整形器；
所述扩束整形器置于所述激光器的发射光侧，且位于所述光强均化器的入光侧，用于输出平行的光信号。
进一步地，所述正置荧光显微镜还包括：光机元件；
所述光机元件置于所述反射镜的出光侧，且位于所述第二滤色镜的入光侧，用于调节光斑的大小。
进一步地，所述正置荧光显微镜为二维成像分辨率小于或等于20nm，且三维成像分辨率小于或等于50nm的显微镜。
进一步地，所述正置荧光显微镜为超分辨显微镜。
进一步地，所述电信号放大器为：前置放大器。
进一步地，所述触发件具体包括：接收模块、保存模块和触发模块；
其中，所述接收模块，用于接收所述电信号放大器输出的放大的电信号；
所述保存模块，用于保存所述接收模块输出的电信号；
所述触发模块，用于当所述接收模块接收到电信号，触发所述激光器工作。
进一步地，所述触发件还包括：滤波模块；
所述滤波模块，用于对所述接收模块输出的电信号进行滤波处理，并向所述保存模块输出滤波处理后的电信号。
进一步地，所述触发件为：锁相放大器。
进一步地，所述检测仪还包括：可移动平台；
所述可移动平台用于放置所述待检测样品，并可带动所述待检测样品在水平面内移动。
进一步地，所述检测仪还包括：减震台；
所述减震台用于放置所述可移动平台。
进一步地，所述检测仪还包括：温控组件；
所述温控组件置于所述可移动平台和所述减震台之间，用于调控所述待检测样品的温度。
进一步地，所述探针单元为探针台；
所述探针台固定置于所述减震台上。
进一步地，所述激光器固定安装在所述正置荧光显微镜上。
本发明实施例提供的一种光电联用检测仪，该光电联合检测仪包括正置荧光显微镜、激光器、采集器、第一探针、第二探针、电信号放大器和触发件，所述采集器，用于采集所述正置荧光显微镜输出的所述待检测样品的荧光信号；所述第一探针的输入端及所述第二探针的输入端分别用于与所述待检测样品两端的电极连接；所述第一探针的输出端与所述电信号放大器的输入端电连接；所述第二探针的输出端与所述触发件电连接；所述电信号放大器的输出端与所述触发件电连接；相对于现有技术的单分子正置荧光显微镜，本发明实施例提供的检测仪通过采集器采集的正置荧光显微镜输出的光信号和触发件保存的待检测样品的电信号的相辅作用，能够解决正置荧光显微镜时空分辨率不足的问题。当然，实施本发明的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例提供的一种光电联用检测仪的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的第一种正置荧光显微镜的结构示意图；
图3为本发明实施例提供的第二种正置荧光显微镜的结构示意图；
图4为本发明实施例提供的第三种正置荧光显微镜的结构示意图；
图5为本发明实施例提供的第四种正置荧光显微镜的结构示意图；
图6为本发明实施例提供的第五种正置荧光显微镜的结构示意图；
图7为本发明实施例提供的第一种触发件的结构示意图；
图8为本发明实施例提供的第二种触发件的结构示意图；
图9为本发明实施例提供的连接有待检测样品的功能化器件的示意图；
图10为本发明实施例提供的待检测样品的电信号的示意图。
其中，1-正置荧光显微镜；2-激光器；3-采集器；4-第一探针；5-第二探针；6-待检测样品；7-电信号放大器；8-触发件；11-照明光源；12-第一滤色镜；13-第二滤色镜；14-第一球面透镜；15-第二球面透镜；16-二色镜；17-反射镜；18-光强均化器；19-激光面积调节器；20-扩束整形器；21-光机元件；81-接收模块；82-保存模块；83-触发模块；84-滤波模块。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参见图1，图1为本发明实施例提供的一种光电联用检测仪的结构示意图，所述检测仪包括：光学系统和电学系统；
其中，所述光学系统包括：正置荧光显微镜1、激光器2和采集器3；
所述电学系统包括：探针单元、电信号放大器7和触发件8；
所述探针单元包括：第一探针4和第二探针5；
所述激光器2产生的激光通过所述正置荧光显微镜1的物镜聚集在待检测样品6上，以激发所述待检测样品6产生荧光信号；
所述采集器3，用于采集所述正置荧光显微镜1输出的所述待检测样品6的荧光信号；
所述第一探针4的输入端及所述第二探针5的输入端分别用于与所述待检测样品6两端的电极连接；
所述第一探针4的输出端与所述电信号放大器7的输入端电连接；
所述第二探针5的输出端与所述触发件8电连接；
所述电信号放大器7的输出端与所述触发件8电连接；
所述触发件8用于接收、保存经所述电信号放大器7放大的电信号，并触发所述激光器2，以使所述激光器2产生激光。
在本发明的具体实施过程中，待检测样品6，例如生物大分子等可以固定于功能化器件表面。所说的功能化器件包括但不限于具有纳米间隙的石墨烯器件、点功能化修饰的硅基器件等；
具体实施过程中，待检测的样品，例如生物大分子可以通过分子桥化合物固定于功能化器件表面；
所说的分子桥是指能与功能化器件连接，且具有能与待检测的样品，例如具有与生物大分子相连的功能团的化合物或具有可以直接与功能化器件相连的生物大分子等；且当功能化器件与分子桥连接后，在测试条件下能够产生电信号。
本文中，所说的激光也可以理解为待检测样品6对应的激发光，待检测样品6受到激发光的激发后，会产生荧光信号，进而被采集器3采集，得到待检测样品6的正置荧光显微镜图像。
但是对于大多生物样品而言，样品需要预先进行荧光标记，才能采集其正置荧光显微镜图像；但是荧光标记存在漂白现象，因此对于荧光标记的样品，难以实现长时间连续的荧光检测。
正是由于荧光检测技术所存在的时间分辨率低及荧光漂白等现象，使得仅仅依靠荧光检测技术可能会导致在时间尺度上遗漏生物过程中的信息的问题。在传统的实验中，上述问题一般是通过大量重复实验进行规避，但是在单分子的测试中造成的误差会得到与事实相去甚远甚至相悖的结果。因此，本发明实施例提供的光电联合检测仪在传统荧光检测手段的基础上，辅以电学检测手段对待检测样品6进行检测，解决了原有单分子荧光技术中存在的荧光漂白，时间分辨率不足等问题。
上述激发器2可以采用均匀线激发镜组，能够避免现有技术一般激光器2中能量损失和分布不均的缺点，可有效降低正置荧光显微镜1对激光器2的功率需求。
上述激光器2产生的激光通过所述正置荧光显微镜1的物镜聚集在待检测样品6上，以激发所述待检测样品6产生荧光信号的实现方式为：将上述激光器前置于所述正置荧光显微镜1上。
上述激光器2前置于上述正置荧光显微镜1的一种实现方式为：上述激光器可以固定安装在所述正置荧光显微镜1上，也可以固定安装在预设的固定架或震动台上，以使所述激光器产生的激光能够通过所述正置荧光显微镜1的物镜聚集在待检测样品6上，并激发所述待检测样品6产生荧光信号。
可见，上述激光器前置于所述正置荧光显微镜1上相对于现有技术中激光器2倒置于所述正置荧光显微镜1而言，更利于与现有硅基工业结合应用，并且便于安装和拆卸。
上述第一探针4和第二探针5分别置于上述待检测样品6两端的电极上，用于将待检测样品6与电信号放大器7、触发件8构成回路，以测试待检测样品6的电信号。
在具体实施过程中，第一探针4和第二探针5分别置于与固定有待检测样品6的功能化器件两端电极上。
上述触发件8用于接收、保存经所述电信号放大器7放大的电信号，并触发所述激光器2和所述采集器3，以使所述激光器2产生激光和所述采集器3采集荧光信号。
也就是，触发件8用于负责接收电信号和控制激光器2发射激光达到同步，且所述触发件8用于为整个回路提供直流或交流形式的源漏脉冲偏压。
结合上述采集器3采集的荧光信号和触发件8保存的电信号，能够确定采集器3采集的每帧光谱图像即荧光信号与电信号在时间上的关系，将光谱成像与电学分析关联起来，为完成对生物过程的个体时空行为的综合分析提供基础。
上述电信号放大器7可以为前置放大器，不仅能够放大弱电信号，还能够减少外界对电信号的干扰。
上述光电联用检测仪可以包括用于处理电信号和/或光信号的终端，也可以不包括该终端，本发明实施例对此并不限定。
上述终端可以为处理器、也可以是显示器，还可以是手机或电脑等电子设备。
上述正置荧光显微镜1为以正置放置的方式放置的荧光显微镜，也就是，使所述激光器2产生的激光通过正置放置的荧光显微镜的物镜聚集在待检测样品6上，以激发所述待检测样品6产生荧光信号；
采集器3可以采用EMCCD(Electron-Multiplying CCD，电子倍增CCD)，EMCCD是探测领域内灵敏度极高的一种高端光电探测产品。
为了降低荧光标记物的漂白效应对EMCCD的影响，则EMCCD需要具备极高的灵敏度，因此该EMCCD需要具备：量子产量不小于90％，激光的强度不小于50mW，其中640nm激光功率不小于1W，且可采集纳米级的二维或三维多光谱图像。
基于上述分析，则上述正置荧光显微镜1可以选取二维成像分辨率小于或等于20nm，且三维成像分辨率小于或等于50nm的显微镜，以使得采集器能够采集到清晰的图像。
由于超分辨显微镜的极限分辨率低于光学显微镜的极限分辨率，即200nm。因此，上述正置荧光显微镜1可以选用超分辨显微镜，超分辨显微镜能够为实验者提供清晰度更高的图像。
上述正置荧光显微镜1还可以使用尼康(NIKON)提供的突破光衍射极限的超分辨率显微镜系统或S-NIM系统和德国蔡司透镜(ZEISS，Carl Zeiss Jena)的ELYRAP.1(超高分辨率光激活定位显微系统Photoactivated Localization Microscopy PALM)构成的正置荧光显微镜1。且上述正置荧光显微镜1的物镜可以采用高数值孔径、高放大倍数物镜或压电石英控制物镜，且该物镜上安装有焦平面漂移矫正系统。
上述正置荧光显微镜1可以选购于尼康的型号为N-STORM的正置荧光显微镜。
上述触发件8可以为锁相放大器，该锁相放大器可以从干扰极大的环境中分离出特定载波频率信号的放大器，进一步提高电信号抗干扰能力。
上述检测仪是放置在实验屏蔽暗箱中测试待检测样品6，以屏蔽外界对测试过程的影响。
上述外界可以为外界光线、外界噪音或外界灰尘等。
上述光电联合检测仪的工作原理为：当所述触发件8接收到所述电信号放大器7放大的电信号时，则触发所述激光器2工作，以使激光器2产生激光，并保存接收到的电信号，便于通过这些电信号进行研究和分析。激光器产生的激光通过所述正置荧光显微镜1的物镜聚集在待检测样品6上，以激发所述待检测样品6产生荧光信号，所述待检测样品6产生的荧光信号通过正置荧光显微镜1的物镜输入至所述正置荧光显微镜1中，此时，采集器3实时采集所述正置荧光显微镜1输出的待检测样品6的荧光信号，并将上述荧光信号保存，便于通过荧光信号和电信号对待检测样品6进行后期的研究和分析。
当需要荧光信号与电信号联用时，结合触发件8保存电信号的时序信息以及荧光信号显示的空间信息，在采集器保存的图像数据基础上显示不同延时和成像深度的图形结果。当需要对采集的图像进行拆分和整合时，将采集器获取的含有一维位置信息和光谱信息的数据，与空间位置扫描之后的与一维位置信息对应的二维位置信息合并，形成包含二或三维位置信息和光谱信息的光谱成像数据。
值得一提的是，目前商品化的正置荧光显微镜1的空间分辨率10-100纳米以内，利用电学系统测试待检测样品6的时间分辨率在微纳秒级别，而利用本发明实施提供的光电联合检测仪的时间分辨率横向可达20nm，轴向50nm，通过随机光学重构显微术可实现单分子成像；时间分辨率在1纳秒。
由此可见，本发明实施例的光电联合检测仪包括正置荧光显微镜1、激光器2、采集器3、第一探针4、第二探针5、电信号放大器7和触发件8，所述激光器2产生的激光通过所述正置荧光显微镜1的物镜聚集在待检测样品6上，以激发所述待检测样品6产生荧光信号；所述采集器3，用于采集所述正置荧光显微镜1输出的所述待检测样品6的荧光信号；所述第一探针4的输入端及所述第二探针5的输入端分别用于与所述待检测样品6两端的电极连接；所述第一探针4的输出端与所述电信号放大器7的输入端电连接；所述第二探针5的输出端与所述触发件8电连接；所述电信号放大器7的输出端与所述触发件8电连接；所述触发件8用于接收、保存经所述电信号放大器7放大的电信号，并触发所述激光器2，以使所述激光器2产生激光，相对于现有技术的正置荧光显微镜1通过采集器3采集的正置荧光显微镜1输出的光信号和触发件8保存的待检测样品6的电信号的相辅作用，能够解决正置荧光显微镜1时空分辨率不足的问题。
当上述光电联合检测仪包括上述终端时，本发明提出一种实现方式，具体为：上述检测仪包括：第一终端，
所述第一终端与所述触发件8电连接；
所述触发件8还用于向所述第一终端发送所接收的电信号；
所述第一终端用于展示所述触发件8所发送的电信号。
其中，上述实现方式的工作原理为：上述触发件8向第一终端发送电信号，上述触发件8接收到电信号后，上述第一终端保存并展示接收到的电信号，以供实验者后期处理。
另外，上述触发件8还用于当接收到第一终端发送的表征电信号已经接收成功的信息后，删除上述电信号。
可见，本实施例提供的第一终端与触发件8电连接，用于展示触发件8发送的电信号，不仅能够供给实验者直观观测到的荧光信号，还能够减轻触发件8存储负担。
在本发明提出的一种实施例中，所述第一终端还用于对所述触发件8发送的电信号进行拟合处理，得到拟合后的电信号曲线。
其中，在第一终端中可以安装QUB软件，利用该QUB软件对上述电信号所包括的电流数据进行拟合，得到拟合后的电信号曲线，并对拟合后的电信号曲线进行统计分析。
上述QUB软件是用于分析和模拟单分子数据的基于隐马尔科夫模型的开源软件，可以对数据进行多态的拟合，从每个电信号上提取其停留时间，得到每个单分子导电态的平均寿命，从而计算出模拟待检测样品中单分子在动态过程中的反应速率；进而根据经典热力学和动力学公式，可以计算出单分子间反应的动力学和热力学参数。
可见，本实施例的第一终端还用于对所述触发件8发送的电信号进行拟合处理，得到拟合后的电信号曲线，能够为实验者提供待需处理后的结果。
在本发明的一种实施例中，所述采集器3包括：电荷耦合器和光信号放大器；
所述电荷耦合器用于采集所述正置荧光显微镜1输出的荧光信号，并向所述光信号放大器输出荧光信号；
所述光信号放大器与第二终端电连接，以展示所述光信号放大器输出的荧光信号。
其中，上述第一终端和第二终端可以是同一个终端，也可以是不同的两个终端，本发明实施例对此并不限定。
光信号放大器可以为锁相放大器，也可以为前置放大器，均用于放大第二终端发送的荧光信号。
电荷耦合器也叫电荷耦合件，是一种用电荷量表示信号大小，用耦合方式传输信号的探测元件，具有自扫描、感受波谱范围宽、畸变小、体积小、重量轻、系统噪声低、功耗小、寿命长、可靠性高等—系列优点，并可做成集成度非常高的组合件。
上述第二终端还用于存储所获取的光信号放大器输出的荧光信号，以备后续实验者使用。
在一种实现方式中，上述触发件8还用于与所述电荷耦合器电连接，用于在接收到电信号放大器7发送的电信号后，控制电荷耦合器工作。
可见，该实现方式的触发件8能够提高光电联合检测仪的智能化。
可见，本实施例的采集器3的电荷耦合器用于采集所述正置荧光显微镜1输出的光信号，并向所述光信号放大器输出荧光信号；光信号放大器与第二终端电连接，以展示所述光信号放大器输出的光信号，使得该采集器3能够具备自扫描、感受波谱范围宽、畸变小、体积小、重量轻、系统噪声低、功耗小、寿命长和可靠性高等特点。
可以在上述第二终端上安装用于重构出超越衍射极限的超分辨图像的软件，以使第二终端获取采集器采集的荧光信号后，能够显示出利用该软件处理后的图像。
在本发明的一种实施例中，上述第二终端还用于处理所述光信号放大器输出的荧光信号，并利用预先采集的明场图像所包含的光信号与所处理的荧光信号，提取荧光信号中相对所述明场图像边界所对应的荧光点，并利用所述荧光点构造边界曲线。
其中，光信号放大器可以是锁相放大器，也可以是前置放大器，本发明实施例对此并不限定。
上述第二终端对采集器3输出的荧光信号重构出超越衍射极限的超分辨图像作为荧光图像即荧光信号，并利用预先采集的明场图像和处理后的荧光图像，提取荧光信号中相对所述明场图像边界所对应的荧光点，构造出由荧光点构成的、含有光强度标尺的成像图像，利用成像图像计算发光面积、光子强度的相关参数，以供使用者参考。
可见，本实施例的第二终端还用于处理所述光信号放大器输出的荧光信号，并将预先采集的明场图像对应的光信号与所处理的光信号进行融合，输出所融合后的荧光信号，不仅能够处理荧光信号，还能够为实验者提供良好的体验效果。
在本发明的一种实施例中，如图2所示，所述正置荧光显微镜1包括：照明光源11、第一滤色镜12、第二滤色镜13、第一球面透镜14、第二球面透镜15、二色镜16和反射镜17：
其中，所述第一滤色镜12的入光侧置于所述激光器2和所述照明光源11的发射光侧，用于接收所述激光器2和所述照明光源11发射的光信号；
所述第一球面透镜14置于所述第一滤色镜12的出光侧，且位于所述二色镜16的入光侧；
所述二色镜16位于所述第二球面透镜15的入光侧和所述待检测样品6之间，用于反射经过所述第一球面镜14的激光至所述待检测样品6上，并透射所述待检测样品6产生的荧光信号；
所述反射镜17置于所述第二球面透镜15的出光侧，且位于所述第二滤色镜13的入光侧；用于反射所述第二球面镜15输出的荧光信号至所述第二滤色镜13；
所述第二滤色镜13用于输出反射镜17反射的荧光信号。
其中，上述照明光源11可以是白炽灯，也可以是LED灯，本发明实施例对此并不限定。
上述第一滤色镜12和上述第二滤色镜13分别是由多张滤色片构成的元件。
上述触发件8还用于与所述正置荧光显微镜1电连接，用于当接收到电信号放大器7发送的电信号后，控制所述正置荧光显微镜1第一滤色镜12中滤色片的选取或/和第二滤色镜13中滤色片的选取，或/和，控制触发采集器3工作以及工作的时长。
正置荧光显微镜1的工作原理为：照明光源11产生和激光器2产生的光信号射入至第一滤色镜12，第一滤色镜12消除上述光信号所带来的反光信号，并将消除反光信号的光信号射入至第一透镜，透射第一滤色镜12后的光信号输入至第一透镜后以平行光形式发射至二色镜16中，二色镜16位反射经过所述第一球面镜的光信号即激光信号至所述待检测样品6上，并透射所述待检测样品6产生的荧光信号，上述荧光信号经过反射镜17反射至第二透镜后聚成光斑，并经过第二滤色镜13消除反光信号后输出。
可见，本实施例的第一滤色镜12的一侧置于所述激光器2和所述照明光源11的发射光侧，所述第一球面透镜14置于所述第一滤色镜12的另一侧，且位于所述二色镜16的入光侧；所述二色镜16位于所述第二球面透镜15的入光侧和所述待检测样品6之间，所述反射镜17置于所述第二球面透镜15的出光侧，且位于所述第二滤色镜13的入光侧；用于反射所述第二球面镜输出的荧光信号至所述第二滤色镜13；所述第二滤色镜13用于输出反射镜17反射的荧光信号。该正置荧光显微镜1能够将一种波长的激光信号发射至待检查样品上，同时将待检测样品6激发产生与该波长相关的荧光信号，并输出该荧光信号，该正置荧光显微镜1不仅结构简单，而且易于操作。
由于照明光源11不均匀，可能会影响激光器2发射的光信号，基于上述问题，本发明实施例提出一种实现方式，如图3所示，具体为：所述正置荧光显微镜1还包括：光强均化器18；
所述光强均化器18置于所述激光器2和所述照明光源11的发光侧，且位于所述第一滤色镜12的入光侧，用于均匀照明光源11发射的光信号。
其中，光强均化器18能够提高照明光源11发射光信号的均匀度，也就是，使得照明光源11发射出光信号获得的光斑更加均匀。
可见，本实施例的光强均化器18置于所述激光器2和所述照明光源11的发射光侧，且位于所述第一滤色镜12的入光侧，不仅能够均匀照明光源11发射的光信号，而且能够减少照明光源11对激光器2发射光信号的影响。
在本发明的一种实施例中，如图4所示，所述正置荧光显微镜1还包括：激光面积调节器19；
所述激光面积调节器19置于所述第一滤色镜12的入光侧，且位于所述光强均化器18的出光侧，用于提供可变光栏。
其中，激光面积调节器19可自动连续调节光栏，以供可变光栏。
可见，本实施例提供的激光面积调节器19能够通过调节光栏，不仅能够减弱强光的干扰，而且还能够提高荧光信号质量。
在本发明的一种实施例中，如图5所示，所述正置荧光显微镜1还包括：扩束整形器20；
所述扩束整形器20置于所述激光器2的发射光侧，且位于所述光强均化器18的入光侧，用于输出平行的光信号。
其中，扩束整形器20为一种激光束匀化扩束整形装置。
激光器2发射的光束一般呈高斯分布，扩束整形器20可以将高斯光束整形成平行光束。
可见，本实施例提供的扩束整形器置于所述激光器2的发射光侧，且位于所述光强均化器18的入光侧，能够将激光器2发射的光信号转化成平行的光信号，使得发射至待检测样品6的光信号更加均匀。
在本发明的一种实施例中，如图6所示，所述正置荧光显微镜1还包括：光机元件21；
所述光机元件21置于所述反射镜17的出光侧，且位于所述第二滤色镜13的入光侧，用于调节光斑的大小。
光机元件21通过对反射镜17反射的荧光信号进行调整，得到预设大小的光斑。
可见，本实施例提供的光机元件21置于所述反射镜17的出光侧，且位于所述第二滤色镜13的入光侧，能够对反射镜17反射的荧光信号所形成的光斑的大小进行调整，以使得调整后光斑构成的图像更加清晰。
在本发明的一种实施例中，如图7所示，所述触发件8具体包括：接收模块81、保存模块82和触发模块83；
其中，所述接收模块81，用于接收所述电信号放大器7输出的放大的电信号；
所述保存模块82，用于保存所述接收模块81输出的电信号；
所述触发模块83，用于当所述接收模块81接收到电信号，触发所述激光器2工作。
上述接收模块81可以为用于接收电信号放大器7输出的电信号的导电体；
上述保存模块82可以为单片存储器或多个单片存储器并联或串联构成的存储器。
上述触发模块83可以为单片机，也可以是控制器，也就是，当接收到电信号时，就触发激光器2产生激光，以使得采集器3采集到正置荧光显微镜1的光信号与触发模块83保存的电信号尽可能同步，以便利于后期对光信号和电信号基于同一时序进行分析。
可见，本实施例提供的所述接收模块81，用于接收所述电信号放大器7输出的放大的电信号；所述保存模块82，用于保存所述接收模块81输出的电信号；所述触发模块83，用于当所述接收模块81接收到电信号，触发所述激光器2工作。该触发件8结构简单，易于维修。
在本发明的一种实施例中，如图8所示，所述触发件8还包括：滤波模块84；
所述滤波模块84，用于对所述接收模块81输出的电信号进行滤波处理，并向所述保存模块82输出滤波处理后的电信号。
其中，上述滤波模块84可以为滤波器，该滤波器的输入端与所述接收模块81的输出端电连接，滤波器的输出端与保存模块82的输入端电连接，用于对接收模块81输出的电信号进行滤波。
可见，本实施例的滤波模块84能够对所述接收模块81输出的电信号进行滤波处理，且向所述保存模块82输出滤波处理后的电信号，使得能够降低外界信号对电信号的干扰性，提高电信号的信噪比。
在一种实施例中，所述检测仪还包括：可移动平台；
所述可移动平台用于放置所述待检测样品6，并可带动所述待检测样品6在水平面内移动。
具体实施过程中，可移动平台可以用于放置固定有待检测样品6的功能化器件。
通过调整上述可移动平台在水平面中的位置，以使待检测样品6置于上述正置荧光显微镜1的物镜下，便于激光透过该物镜聚集在上述待检测样品6上。
可见，本实施例提供的可移动平台可带动所述待检测样品6在水平面内移动，该可移动平台不仅结构简单，还便于利用正置荧光显微镜1对焦，从而为实验者带来良好的体验效果。
在实际应用场景中，由于外界环境的干扰，待检测样品6可能存在被晃动的现象，基于此，本发明实施例提供一种实现方式，具体为：所述检测仪还包括：减震台；
所述减震台用于放置所述可移动平台。
可见，本实施例提供的减震台用于放置所述可移动平台，能够尽量降低待检测样品6出现晃动的现象，进而避免采集器3和触发件8分别采集的光信号和电信号不准确的现象。
在本发明的一种实施例中，所述检测仪还包括：温控组件；
所述温控组件置于所述可移动平台和所述减震台之间，用于调控所述待检测样品6的温度。
其中，通过温控组件可以通过调控可移动平台的温度，进而达到调控待检测样品6的温度。
在实际应用中，温控组件可使得待测试样品的温度控制在-120℃到200℃之间，甚至精度可达±0.001℃。
可见，本实施例提供的温控组件置于所述可移动平台和所述减震台之间，能够调控待检测样品6的温度，从而使得采集器3采集的光信号和触发件8采集的电信号更加平稳和准确。
由于待检测样品连接于功能化器件之上，功能化器件尺寸很小，肉眼难以将第一探针4和第二探针5准确地放置在待检测样品6的两端，为了提高检测效率，本发明提出一种实现方式，具体为：所述探针单元为探针台；
所述探针台固定置于所述减震台上。
可见，本实施例提供的探针台固定置于所述减震台上，能够准确地将探针置于待检测样品6两端的电极，提高检测效率。
下面通过本发明提供的光电联用检测仪，对F1-ATP酶样品进行检测：
(1)构建功能化器件：参考文献(Jie Li,Gen He,Hiroshi Ueno,Chuancheng Jia,Hiroyuki Noji,Chuanmin Qi,and Xuefeng Guo,Direct Real-Time Detection ofSingle Proteins Using SIlicon Nanowire-based Electrical Circuits,Nanoscale2016,8,16172.)中记载的方法，制备具有点功能化修饰的硅基器件，并使表面带上Si-OH键，用于和后续目标分子进行有效键合，从而形成功能化器件；
(2)采用下式(1)所示的分子桥，使待检测F1-ATP酶与分子桥相连接；连接有F1-ATP酶的功能化器件如图9所示；
Figure BDA0002040407400000191
(3)将连接有F1-ATP酶的功能化器件的两端分别与第一探针4和第二探针5接触，通过第一探针4和第二探针5对样品施加偏压，并得到样品反馈的电信号图，如图10所示；图10中规律可重复的双稳态波动信号是由F1-ATP酶水解过程中β亚基构象变化引起的表面电场的变化导致的电流的改变而产生的。与现有F1-ATP酶水解过程的数据进行比对，可得知，F1催化周期当中包含ATP裂解Pi释放两个连续过程。通过QUB软件对图10所示的电学检测信号的数据进行双稳态模拟后，得到两种不同电流导电态的各个脉冲平台的停留时间。将获得的各态的寿命进行分布统计，在37℃下，结合时间，确定出ATP裂解和Pi释放的平均时长分别为13ms，1.07ms和0.53ms。由此结果表明，我们的电学系统测试的时间分辨率是亚微秒级别的。因此，与光学系统相结合，可以弥补光学系统时间尺度上的不足，防止遗漏生物过程中的重要信息。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (21)

1.一种光电联用检测仪，其特征在于，包括：光学系统和电学系统；
其中，所述光学系统包括：正置荧光显微镜（1）、激光器（2）和采集器（3）；
所述电学系统包括：探针单元、电信号放大器和触发件；
所述探针单元包括：第一探针（4）和第二探针（5）；
所述激光器（2）产生的激光通过所述正置荧光显微镜（1）的物镜聚集在待检测样品（6）上，以激发所述待检测样品（6）产生荧光信号，所述待检测样品（6）为生物大分子；
所述待检测样品（6）通过分子桥化合物固定于功能化器件表面上；所述功能化器件包括具有纳米间隙的石墨烯器件或点功能化修饰的硅基器件；
所述采集器（3），用于采集所述正置荧光显微镜（1）输出的所述待检测样品（6）的荧光信号；
所述第一探针（4）的输入端及所述第二探针（5）的输入端分别用于与固定有所述待检测样品（6）的所述功能化器件两端的电极连接；
所述第一探针（4）的输出端与所述电信号放大器（7）的输入端电连接；
所述第二探针（5）的输出端与所述触发件（8）电连接；
所述电信号放大器（7）的输出端与所述触发件（8）电连接；
所述触发件（8）用于接收、保存经所述电信号放大器（7）放大的电信号，当所述触发件（8）接收到所述电信号放大器（7）放大的电信号时触发所述激光器（2），以使所述激光器（2）产生激光；触发件（8）用于负责接收所述电信号和控制所述激光器（2）发射激光达到同步。
2.如权利要求1所述的检测仪，其特征在于，所述检测仪还包括：第一终端，
所述第一终端与所述触发件（8）电连接；
所述触发件（8）还用于向所述第一终端发送所接收的电信号；
所述第一终端用于展示所述触发件（8）所发送的电信号。
3.如权利要求2所述的检测仪，其特征在于，所述第一终端还用于对所述触发件（8）发送的电信号进行拟合处理，得到拟合后的电信号曲线。
4.如权利要求1所述的检测仪，其特征在于，所述采集器（3）包括：电荷耦合器和光信号放大器；
所述电荷耦合器用于采集所述正置荧光显微镜（1）输出的荧光信号，并向所述光信号放大器输出荧光信号；
所述光信号放大器与第二终端电连接，以展示所述光信号放大器输出的荧光信号。
5.如权利要求4所述的检测仪，其特征在于，所述第二终端还用于处理所述光信号放大器输出的荧光信号，并利用预先采集的明场图像所包含的光信号与所处理的荧光信号，提取荧光信号中相对所述明场图像边界所对应的荧光点，并利用所述荧光点构造边界曲线。
6.如权利要求1所述的检测仪，其特征在于，所述正置荧光显微镜（1）包括：照明光源（11）、第一滤色镜（12）、第二滤色镜（13）、第一球面透镜（14）、第二球面透镜（15）、二色镜（16）和反射镜（17）：
其中，所述第一滤色镜（12）的入光侧置于所述激光器（2）和所述照明光源（11）的发射光侧，用于接收所述激光器（2）和所述照明光源（11）发射的光信号；
所述第一球面透镜（14）置于所述第一滤色镜（12）的出光侧，且位于所述二色镜（16）的入光侧；
所述二色镜（16）位于所述第二球面透镜（15）的入光侧和所述待检测样品（6）之间，用于反射经过所述第一球面透镜的激光至所述待检测样品（6）上，并透射所述待检测样品（6）产生的荧光信号；
所述反射镜（17）置于所述第二球面透镜（15）的出光侧，且位于所述第二滤色镜（13）的入光侧；用于反射所述第二球面透镜输出的荧光信号至所述第二滤色镜（13）；
所述第二滤色镜（13）用于输出反射镜（17）反射的荧光信号。
7.如权利要求6所述的检测仪，其特征在于，所述正置荧光显微镜（1）还包括：光强均化器（18）；
所述光强均化器（18）置于所述激光器（2）和所述照明光源（11）的发光侧，且位于所述第一滤色镜（12）的入光侧，用于均匀照明光源（11）发射的光信号。
8.如权利要求7所述的检测仪，其特征在于，所述正置荧光显微镜（1）还包括：激光面积调节器（19）；
所述激光面积调节器（19）置于所述第一滤色镜（12）的入光侧，且位于所述光强均化器（18）的出光侧，用于提供可变光栏。
9.如权利要求8所述的检测仪，其特征在于，所述正置荧光显微镜（1）还包括：扩束整形器（20）；
所述扩束整形器（20）置于所述激光器（2）的发射光侧，且位于所述光强均化器（18）的入光侧，用于输出平行的光信号。
10.如权利要求9所述的检测仪，其特征在于，所述正置荧光显微镜（1）还包括：光机元件（21）；
所述光机元件（21）置于所述反射镜（17）的出光侧，且位于所述第二滤色镜（13）的入光侧，用于调节光斑的大小。
11.如权利要求10所述的检测仪，其特征在于，所述正置荧光显微镜（1）为二维成像分辨率小于或等于20nm，且三维成像分辨率小于或等于50nm的显微镜。
12.如权利要求11所述的检测仪，其特征在于，所述正置荧光显微镜（1）为超分辨显微镜。
13.如权利要求1所述的检测仪，其特征在于，所述电信号放大器（7）为：前置放大器。
14.如权利要求13所述的检测仪，其特征在于，所述触发件（8）具体包括：接收模块（81）、保存模块（82）和触发模块（83）；
其中，所述接收模块（81），用于接收所述电信号放大器（7）输出的放大的电信号；
所述保存模块（82），用于保存所述接收模块（81）输出的电信号；
所述触发模块（83），用于当所述接收模块（81）接收到电信号，触发所述激光器（2）工作。
15.如权利要求14所述的检测仪，其特征在于，所述触发件（8）还包括：滤波模块（84）；
所述滤波模块（84），用于对所述接收模块（81）输出的电信号进行滤波处理，并向所述保存模块（82）输出滤波处理后的电信号。
16.如权利要求1或15所述的检测仪，其特征在于，所述触发件（8）为：锁相放大器。
17.如权利要求1所述的检测仪，其特征在于，所述检测仪还包括：可移动平台；
所述可移动平台用于放置所述待检测样品（6），并可带动所述待检测样品（6）在水平面内移动。
18.如权利要求17所述的检测仪，其特征在于，所述检测仪还包括：减震台；
所述减震台用于放置所述可移动平台。
19.如权利要求18所述的检测仪，其特征在于，所述检测仪还包括：温控组件；
所述温控组件置于所述可移动平台和所述减震台之间，用于调控所述待检测样品（6）的温度。
20.如权利要求18所述的检测仪，其特征在于，所述探针单元为探针台；
所述探针台固定置于所述减震台上。
21.如权利要求1所述的检测仪，其特征在于，所述激光器（2）固定安装在所述正置荧光显微镜（1）上。
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