CN104535481A - 成像流式细胞仪 - Google Patents

Abstract

成像流式细胞仪，涉及生物学和医学的光学仪器领域，解决了现有成像流式细胞仪系统存在的离焦量和速度测量的能量利用率低、结构复杂和成本高的问题。本发明引入偏振光学系统，可以得到一些关于待测样品更加丰富的生物信息，主要由样品进样单元、激光光源、测速-对焦单元、成像单元和中央控制单元组成。同时基于激光后向散射光斑成像原理，完成待测样品的速度检测和细胞仪的自动对焦功能。通过分析一个阵列光传感器不同感测位置处待测样品光信号强度的时序信号和传感器探测面上光信号强度的分布即可同时得到细胞运动速度和离焦量，且测量更精确、直观地得到，激光后向散射的方式能量利用率更高、信噪比更好，单光路探测结构更加简单。

Description

成像流式细胞仪

技术领域

本发明涉及生物学和医学的光学仪器技术领域，具体涉及一种成像流式细胞仪。

背景技术

流式细胞术是一种用以对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球，细菌，小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。在生物学与医学领域，当需要对大量的细胞进行扫描时，流式细胞仪完全牺牲空间分辨率，可以获得高的检测速度，数十千个细胞每秒。成像流式细胞仪不仅能够获得大量细胞的群体分析数据，而且还能够实时看到细胞图像，每一步的分析结果都可以通过图像进行确认。当需要获得细胞形态及内部结构信息时，相对于传统的流式细胞仪，成像流式细胞仪有着更大的优势。

目前，成像流式细胞仪已经在国际上获得了极大的重视，以美国MerckMillipore旗下的Amnis公司为代表已经做出了性能不错的成像流式细胞仪，型号有Image Stream Mark II和Flow Sight等，能实时捕获每个流动细胞最多可以达到12幅高分辨率图像，检测速率可达5000细胞/秒，并具有更强荧光灵敏度。成像流式细胞仪一般可以采用超高灵敏度EM CCD(Electron-Multiplying CCD)或是TDI CCD(Time Delay Integration CCD)。

成像流式细胞仪需要对快速流动的细胞进行显微成像，通常需要克服两个主要问题：自动对焦功能和流动样品带来的拖尾。

1)流式细胞仪的液流系统中运动的细胞均具有一定的漂移，漂移的离轴量一般在几个μm，显微物镜的焦深也在微米量级，因此，成像流式细胞仪必须具备一个自动对焦功能模块。

2)流式细胞仪的样品流动速度一般在几个mm/s，细胞与相机之间存在相对运动，造成虚像拖尾问题。Amnis的产品采用时间延迟积分(TDI)相机，保证细胞像的流动与TDI相机的行扫描的完全同步，这种相对静止的状态可以克服拖尾问题，并且TDI的延时积分功能有效提高了系统的灵敏度。因此，TDI相机的同步必须具备一个细胞速度检测功能模块。

Amnis的产品具有专门的细胞速度检测和自动对焦装置，其根据激光共焦和光栅调制的原理测试细胞速度，其系统采用高能激光侧向照明运动的细胞，两路分光的光学系统通过高灵敏度的光电倍增管(PMT)探测器接收被光栅调制的细胞侧向散射能量，根据两路探测器光栅调制信号调制度的比较计算获得细胞的离焦量，根据探测器光栅调制信号的频率计算运动细胞的速度。然而，该系统中速度检测和自动对焦装置采用激光的侧向散射，能量的利用率不高，需要高功率激光器和高灵敏度的探测器，成本较高；速度检测和自动对焦装置通过PMT探测器接收的光栅调制信号强度的变化和频率，通过一定算法间接地提取细胞离焦量和速度，测试过于复杂，不够直观；速度检测和自动对焦装置采用两路分光探测细胞散射光，结构复杂，成本较高；速度检测和自动对焦装置的光学系统出瞳必须在系统本身的外部，增大了设计难度和光学结构的复杂性。

发明内容

为了解决现有成像流式细胞仪系统存在的离焦量和速度测量的能量利用率低、结构复杂和成本高的问题，本发明提供一种成像流式细胞仪。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的成像流式细胞仪，包括：

中央控制单元；

由进样装置和待测样品组成的样品进样单元，所述待测样品在进样装置中逐个匀速通过进样装置上的成像检测区域；

由正向照明和侧向照明组成的激光光源，所述正向照明包括LED光源和第一聚焦镜，作为待测样品的明场照明，所述侧向照明包括第一激光器、第二激光器、第三激光器、合束镜一、合束镜二、整形镜和第二聚焦镜，作为待测样品的暗场照明和荧光激发；

由第四激光器、准直镜、分光镜、聚焦镜组、与中央控制单元相连的阵列光传感器、与中央控制单元相连的微位移机构组成的测速-对焦单元；

由中继镜组一、用于限制待测样品成像视场的视场光阑、与中继镜组一关于视场光阑中心对称的中继镜组二、光谱分光镜组、成像物镜、与中央控制单元相连的光电成像传感器、与中央控制单元相连的偏转轮、固定在微位移机构上的显微物镜组成的成像单元，所述视场光阑放置在由中继镜组一与中继镜组二形成的中间像面处；

所述第四激光器的激光经准直镜准直成一束±1°的准直激光束，经分光镜反射、显微物镜聚焦至待测样品上，待测样品后向反射的散射光依次经显微物镜会聚、分光镜反射、聚焦镜组聚焦至阵列光传感器上，中央控制单元采集阵列光传感器探测面上的待测样品光信号强度并计算出待测样品离焦量，中央控制单元根据此离焦量控制微位移机构运动同时带动显微物镜进行精确调焦，完成自动对焦；

自动对焦后，所述中央控制单元根据在阵列光传感器探测面上不同感测位置处待测样品光信号强度的时序信号计算得到待测样品的运动速度，中央控制单元将此运动速度信号作为光电成像传感器的同步信号反馈给光电成像传感器；

测速后，所述LED光源的光线经第一聚焦镜聚焦至处于成像检测区域的待测样品上，第一激光器的激光依次经合束镜二和合束镜一合束、整形镜整形、第二聚焦镜聚焦至处于成像检测区域的待测样品上，第二激光器的激光依次经合束镜二和合束镜一合束、整形镜整形、第二聚焦镜聚焦至处于成像检测区域的待测样品上，第三激光器的激光依次经合束镜二和合束镜一合束、整形镜整形、第二聚焦镜聚焦至处于成像检测区域的待测样品上；所述待测样品被激光激发出的有效信号光依次经分光镜、中继镜组一和视场光阑后形成中间像，中间像的光束经中继镜组二准直成平行光，该平行光依次经偏转轮滤波或检偏、光谱分光镜组堆栈分光、成像物镜聚焦至光电成像传感器上，得到待测样品图像。

所述侧向照明还包括一个或三个起偏器，当起偏器为一个时，将该起偏器设置在整形镜和第二聚焦镜之间；当起偏器为三个时，三个起偏器分别分布在第一激光器前端、第二激光器前端和第三激光器前端，三个起偏器分别给予每个激光器的激光束在合束之前不同的偏振态。

所述LED光源功率为2W，中心波长为450nm；所述第一激光器用于暗场照明，功率为80mw，中心波长为785nm；所述第二激光器用于荧光激发，功率为90mw，中心波长为561nm；所述第三激光器用于荧光激发，功率为150mw，中心波长为488nm；所述合束镜一为长波通二向色镜，中心波长为488nm；所述合束镜二为长波通二向色镜，中心波长为561nm；所述整形镜为阵列微透镜平顶整形器件；所述第二聚焦镜为正透镜组。

所述第四激光器选用高功率半导体激光器，连续发光工作模式，功率为20mw，中心波长为830nm，带宽为1nm。

所述分光镜作为共光路的分光器件，选用短波通二向色镜，反射激发波长830nm的波段，透射小于激发波长830nm的短波光。

所述阵列光传感器采用电荷耦合器件、电子倍增电荷耦合器件、雪崩光电二极管传感器、光电倍增管中的一种或多种，所述阵列光传感器分辨率为1024，像素大小为7μm，光谱响应范围为700～1100nm。

所述聚焦镜组的焦距为90mm；所述微位移机构选用带闭环控制的压电位移台，量程为50μm，分辨率为0.05μm。

所述显微物镜放大倍率为40倍，焦距为4.5mm，数值孔径为0.75，视场为60μm×128μm；所述视场光阑的中空尺寸为0.5mm×3mm。

所述中央控制单元包括电源、与电源相连的CPU、与CPU通过PCI总线相连的采集卡一、与CPU通过PCI总线相连的采集卡二；所述微位移机构和偏转轮分别通过I/O口与CPU相连，所述阵列光传感器与采集卡一相连，所述光电成像传感器与采集卡二相连，所述采集卡一接收阵列光传感器的信号，所述采集卡二接收光电成像传感器的信号。

所述光谱分光镜组由六个长波通二向色镜组成，六个长波通二向色镜的分光波段分别为420～480nm、480～560nm、560～600nm、600～640nm、640～745nm、745～800nm，六个长波通二向色镜分别对应六个分光通道，每个分光通道对应一个分光波段，通过改变六个长波通二向色镜之间的角度改变对应分光通道的方向；通过六个长波通二向色镜对接收的平行光进行堆栈分光后分别通过六个分光通道出射。

本发明的有益效果是：本发明采用基于激光光斑成像原理的测速-对焦装置进行样品的自动对焦和速度检测，通过分析一个阵列光传感器不同感测位置处待测样品光信号强度的时序信号和传感器探测面上光信号强度的分布即可同时得到细胞运动速度和离焦量，且测量更精确、直观地得到，激光后向散射的方式能量利用率更高、信噪比更好，单光路探测结构更加简单；各光源负责明场照明、暗场照明和荧光激发，样品的速度信号通过中央控制单元反馈给成像单元作为TDI相机的同步，最终完成流式样品的清晰成像；本发明增加偏振光学模块，偏振光的激发和成像可以使成像流式细胞仪获得更多、更有意义的生物医学信息。

附图说明

图1为本发明的成像流式细胞仪的结构示意图。

图2为本发明的成像流式细胞仪的控制流程图。

图3为自动对焦过程示意图。

图4为阵列光传感器探测面上待测样品的光信号强度分布图。

图5为待测样品的速度检测过程示意图。

图6为阵列光传感器探测面上不同感测位置处待测样品光信号强度的时序信号分布图。

图7为中央控制单元的结构示意图。

图中：100、样品进样单元，101、进样装置，102、待测样品，200、激光光源，201、LED光源，202、第一聚焦镜，203a、第一激光器，203b、第二激光器，203c、第三激光器，204a、合束镜一，204b、合束镜二，205、整形镜，206、第二聚焦镜，207、起偏器，300、测速-对焦单元，301、第四激光器，302、准直镜，303、分光镜，304、聚焦镜组，305、阵列光传感器，306、微位移机构，400、成像单元，401、显微物镜，402、中继镜组一，403、视场光阑，404、中继镜组二，405、光谱分光镜组，406、成像物镜，407、光电成像传感器，408、偏转轮，500、中央控制单元，501、电源，502、CPU，503、采集卡一，504、采集卡二。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

如图1所示，本发明的成像流式细胞仪基于激光后向散射光斑成像原理，同时引入偏振光学系统，完成待测样品102的速度检测和细胞仪的自动对焦功能，可以得到一些关于待测样品102更加丰富的生物信息，主要由样品进样单元100、激光光源200、测速-对焦单元300、成像单元400和中央控制单元500组成。

样品进样单元100主要由进样装置101和待测样品102组成，在进样装置101中，待测样品102依次逐个匀速通过成像检测区域，成像检测区域指的是进样装置101上的某一位置(只要位于进样装置101上即可)，待测样品102可以是病毒、细胞、微球或小型模式生物等。

激光光源200主要由LED光源201、第一聚焦镜202、第一激光器203a、第二激光器203b、第三激光器203c、合束镜一204a、合束镜二204b、整形镜205、第二聚焦镜206、一个或三个起偏器207组成。激光光源200包括正向和侧向照明两部分，正向照明作为待测样品102的明场照明，正向照明包括LED光源201和第一聚焦镜202，LED光源201的功率为2W，中心波长为450nm。侧向照明作为待测样品102的暗场照明和荧光激发，侧向照明包括第一激光器203a、第二激光器203b、第三激光器203c、合束镜一204a、合束镜二204b、整形镜205、第二聚焦镜206、一个或三个起偏器207，第一激光器203a用于暗场照明，功率为80mw，中心波长为785nm；第二激光器203b用于荧光激发，功率为90mw，中心波长为561nm；第三激光器203c用于荧光激发，功率为150mw，中心波长为488nm；合束镜一204a为长波通二向色镜，中心波长为488nm；合束镜二204b为长波通二向色镜，中心波长为561nm；整形镜205为阵列微透镜平顶整形器件；第二聚焦镜206为正透镜组；起偏器207将各个照明光源给予一定的偏振态，如线偏振、圆偏振等，当有一个起偏器207时，将该起偏器207设置在整形镜205和第二聚焦镜206之间位置；当有三个起偏器207时，三个起偏器207分别分布在第一激光器203a前端、第二激光器203b前端和第三激光器203c前端，三个起偏器207分别给予每个激光器的激光束在合束之前不同的偏振态。

测速-对焦单元300采用激光光斑成像原理，用于准直激光束的后向散射测试。测速-对焦单元300主要由第四激光器301、准直镜302、分光镜303、聚焦镜组304、阵列光传感器305和微位移机构306组成。第四激光器301具有一定的视场角，可以仅在一个方向具有视场角，并且发出准直激光束，第四激光器301选用高功率半导体激光器，连续发光工作模式，功率为20mw，中心波长为830nm，带宽为1nm；准直镜302接收第四激光器301的激光束，使最后输出的准直激光束视场角为±1°；分光镜303作为共光路的分光器件，选用短波通二向色镜，反射激发波长830nm的波段，透射小于激发波长830nm的短波光，满足对待测样品102明场照明、暗场照明和荧光成像波段的高透过率；聚焦镜组304的焦距为90mm；阵列光传感器305可以采用电荷耦合器件、电子倍增电荷耦合器件、雪崩光电二极管传感器或光电倍增管，也可以采用多个探测器如雪崩光电二极管、光电倍增管的阵列结构，本实施方式中，阵列光传感器305具体选择线阵的高速、高灵敏度CCD成像器件，分辨率为1024，像素大小为7μm，光谱响应范围为700～1100nm；微位移机构306选用带闭环控制的压电位移台，量程为50μm，分辨率为0.05μm。

成像单元400主要由显微物镜401、中继镜组一402、视场光阑403、中继镜组二404、光谱分光镜组405、成像物镜406、光电成像传感器407和偏转轮408组成。显微物镜401固定在微位移机构306上，通过微位移机构306运动带动显微物镜401进行精确调焦，显微物镜401作为高分辨率成像光学系统，放大倍率为40倍，焦距为4.5mm，数值孔径为0.75，视场为60μm×128μm；通过中继镜组一402与中继镜组二404的设置形成一个中间像面，视场光阑403放置在由中继镜组一402与中继镜组二404形成的中间像面处，视场光阑403的中空尺寸为0.5mm×3mm，视场光阑403用于限制待测样品102成像视场，中继镜组一402和中继镜组二404关于视场光阑403中心对称，中继镜组一402和中继镜组二404的焦距均为36mm；光谱分光镜组405由6片长波通二向色镜组成，6片长波通二向色镜的分光波段分别为420～480nm、480～560nm、560～600nm、600～640nm、640～745nm、745～800nm，这6个长波通二向色镜形成6个光谱通道，每个光谱通道分别对应上述六个分光波段；成像物镜406对多波段成像，在以上6个光谱通道下均能清晰成像，焦距为225mm；光电成像传感器407可以采用高灵敏度TDI CCD(Time Delay Integration CCD)；偏转轮408用于选择成像单元400的偏振态和光波长。

如图7所示，中央控制单元500主要由电源501、CPU502、采集卡一503和采集卡二504组成。电源501与CPU502相连，为整个中央控制单元500供电；微位移机构306和偏转轮408分别通过I/O口与CPU502相连；阵列光传感器305与采集卡一503相连，光电成像传感器407与采集卡二504相连，采集卡一503接收阵列光传感器305的信号，采集卡二504接收光电成像传感器407的信号，采集卡一503和采集卡二504分别通过PCI总线与CPU502相连。

如图2所示，系统启动和初始化，初始化样品进样单元100、激光光源200、测速-对焦单元300、成像单元400和中央控制单元500；进样单元100初始化包括样品进样装置101初始化；激光光源200初始化包括LED光源201、第一激光器203a、第二激光器203b和第三激光器203c初始化；测速-对焦单元300初始化包括第四激光器301、阵列光传感器305和微位移机构306初始化；成像单元400初始化包括光电成像传感器407和偏转轮408初始化；中央控制单元500初始化包括电源501、CPU502、采集卡一503和采集卡二504初始化。

初始化后完成用户参数设置，启动进样程序，在进样装置101中，待测样品102依次逐个匀速通过成像检测区域，直到液流稳定后启动调焦程序，如图3所示，第四激光器301发出的波长830nm的激光经过准直镜302准直成一束±1°的准直激光束，该准直激光束依次经过分光镜303反射、显微物镜401会聚后聚焦至待测样品102上，待测样品102后向反射的散射光依次经过显微物镜401会聚、分光镜303反射、聚焦镜组304会聚后聚焦至阵列光传感器305上，在阵列光传感器305探测面上获得待测样品102对应的聚焦光斑，通过采集卡一503采集阵列光传感器305探测面上的待测样品102光信号强度并将其传输给CPU502，利用CPU502分析阵列光传感器305探测面上的待测样品102光信号强度分布并计算出待测样品102的离焦量，利用CPU502根据待测样品102的离焦量控制闭环的微位移机构306运动同时带动显微物镜401进行精确调焦，完成整个自动对焦过程。

如图3和图4所示，第四激光器301和准直镜302发出准直激光束从显微物镜401边缘入射，显微物镜401的焦距为4.5mm，数值孔径NA为0.75，聚焦镜组304的焦距为90mm，垂轴放大倍率β为20，其中待测样品102的离焦量设为Z，则阵列光探测器305上获得的待测样品102对应的聚焦光斑位移W为：

$W=2*Z*\frac{\mathrm{NA}}{\sqrt{1-{\mathrm{NA}}^2}}*\mathrm{\β}=45\·Z$

阵列光探测器305的分辨率为1024，像素大小为7μm，对应调焦精度0.15μm，光谱响应范围为700～1100nm，调焦范围最大能够达到76μm，能够完成该细胞仪的自动对焦功能。

如图5所示，完成自动对焦后，启动测速程序，利用CPU502根据在阵列光传感器305探测面上不同感测位置处运动中的待测样品102光信号强度的时序信号计算得到待测样品102的运动速度，通过采集卡二504采集运动速度信号并将其反馈给光电成像传感器407，作为光电成像传感器407的同步信号。

如图5和图6所示，A～H为待测样品102的光信号路径，待测样品102首先沿着路径A遭遇照射，并且逐渐地在后续时间沿着其他路径遭遇照射，其中，路径H为光信号的最后路径。根据各个光信号路径的时序信号，就可以得到不同时刻待测样品102所到达的具体位置，进而提取待测样品102的运动速度，反馈给光电成像传感器407同步信号得到待测样品102的图像。

经过自动对焦和测速程序之后，启动成像程序，首先LED光源201发出的波长450nm的光经过第一聚焦镜202聚焦至处于成像检测区域的待测样品102上，第一激光器203a发出的波长785nm的激光依次经过合束镜二204b和合束镜一204a(仅通过波长785nm的激光束)合束作用、整形镜205整形激光束、起偏器207将该激光束改造为特定偏振态后经过第二聚焦镜206聚焦至处于成像检测区域的待测样品102上，第二激光器203b发出的波长561nm的激光依次经过合束镜二204b和合束镜一204a(仅通过波长561nm的激光束)合束作用、整形镜205整形激光束、起偏器207将该激光改造为特定偏振态后经过第二聚焦镜206聚焦至处于成像检测区域的待测样品102上，第三激光器203c发出的波长488nm的激光依次经过合束镜二204b和合束镜一204a(仅通过波长488nm的激光束)合束作用、整形镜205整形激光束、起偏器207将该激光改造为特定偏振态后经过第二聚焦镜206聚焦至处于成像检测区域的待测样品102上；显微物镜401完成高分辨率待测样品102成像，待测样品102被激光激发出的有效信号光依次经过分光镜303(可通过488nm、561nm和785nm三个波长激光束)、中继镜组一402和视场光阑403后形成中间像，视场光阑403用于限制待测样品102成像视场，中间像的光束再经过中继镜组二404准直成平行光入射至偏转轮408，该平行光被偏转轮408进行滤波或检偏作用后又被光谱分光镜组405中的6片长波通二向色镜堆栈分光，多光谱被分解为6个波段并且分别通过6个光谱通道出射至成像物镜406，经成像物镜406聚焦至光电成像传感器407上，进而拍摄得到待测样品102的图像。

Claims (10)

1.成像流式细胞仪，其特征在于，包括：

中央控制单元(500)；

由进样装置(101)和待测样品(102)组成的样品进样单元(100)，所述待测样品(102)在进样装置(101)中逐个匀速通过进样装置(101)上的成像检测区域；

由正向照明和侧向照明组成的激光光源(200)，所述正向照明包括LED光源(201)和第一聚焦镜(202)，作为待测样品(102)的明场照明，所述侧向照明包括第一激光器(203a)、第二激光器(203b)、第三激光器(203c)、合束镜一(204a)、合束镜二(204b)、整形镜(205)和第二聚焦镜(206)，作为待测样品(102)的暗场照明和荧光激发；

由第四激光器(301)、准直镜(302)、分光镜(303)、聚焦镜组(304)、与中央控制单元(500)相连的阵列光传感器(305)、与中央控制单元(500)相连的微位移机构(306)组成的测速-对焦单元(300)；

由中继镜组一(402)、用于限制待测样品(102)成像视场的视场光阑(403)、与中继镜组一(402)关于视场光阑(403)中心对称的中继镜组二(404)、光谱分光镜组(405)、成像物镜(406)、与中央控制单元(500)相连的光电成像传感器(407)、与中央控制单元(500)相连的偏转轮(408)、固定在微位移机构(306)上的显微物镜(401)组成的成像单元(400)，所述视场光阑(403)放置在由中继镜组一(402)与中继镜组二(404)形成的中间像面处；

所述第四激光器(301)的激光经准直镜(302)准直成一束±1°的准直激光束，经分光镜(303)反射、显微物镜(401)聚焦至待测样品(102)上，待测样品(102)后向反射的散射光依次经显微物镜(401)会聚、分光镜(303)反射、聚焦镜组(304)聚焦至阵列光传感器(305)上，中央控制单元(500)采集阵列光传感器(305)探测面上的待测样品(102)光信号强度并计算出待测样品(102)离焦量，中央控制单元(500)根据此离焦量控制微位移机构(306)运动同时带动显微物镜(401)进行精确调焦，完成自动对焦；

自动对焦后，所述中央控制单元(500)根据在阵列光传感器(305)探测面上不同感测位置处待测样品(102)光信号强度的时序信号计算得到待测样品(102)的运动速度，中央控制单元(500)将此运动速度信号作为光电成像传感器(407)的同步信号反馈给光电成像传感器(407)；

测速后，所述LED光源(201)的光线经第一聚焦镜(202)聚焦至处于成像检测区域的待测样品(102)上，第一激光器(203a)的激光依次经合束镜二(204b)和合束镜一(204a)合束、整形镜(205)整形、第二聚焦镜(206)聚焦至处于成像检测区域的待测样品(102)上，第二激光器(203b)的激光依次经合束镜二(204b)和合束镜一(204a)合束、整形镜(205)整形、第二聚焦镜(206)聚焦至处于成像检测区域的待测样品(102)上，第三激光器(203c)的激光依次经合束镜二(204b)和合束镜一(204a)合束、整形镜(205)整形、第二聚焦镜(206)聚焦至处于成像检测区域的待测样品(102)上；所述待测样品(102)被激光激发出的有效信号光依次经分光镜(303)、中继镜组一(402)和视场光阑(403)后形成中间像，中间像的光束经中继镜组二(404)准直成平行光，该平行光依次经偏转轮(408)滤波或检偏、光谱分光镜组(405)堆栈分光、成像物镜(406)聚焦至光电成像传感器(407)上，得到待测样品(102)图像。

2.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述侧向照明还包括一个或三个起偏器(207)，当起偏器(207)为一个时，将该起偏器(207)设置在整形镜(205)和第二聚焦镜(206)之间；当起偏器(207)为三个时，三个起偏器(207)分别分布在第一激光器(203a)前端、第二激光器(203b)前端和第三激光器(203c)前端，三个起偏器(207)分别给予每个激光器的激光束在合束之前不同的偏振态。

3.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述LED光源(201)功率为2W，中心波长为450nm；所述第一激光器(203a)用于暗场照明，功率为80mw，中心波长为785nm；所述第二激光器(203b)用于荧光激发，功率为90mw，中心波长为561nm；所述第三激光器(203c)用于荧光激发，功率为150mw，中心波长为488nm；所述合束镜一(204a)为长波通二向色镜，中心波长为488nm；所述合束镜二(204b)为长波通二向色镜，中心波长为561nm；所述整形镜(205)为阵列微透镜平顶整形器件；所述第二聚焦镜(206)为正透镜组。

4.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述第四激光器(301)选用高功率半导体激光器，连续发光工作模式，功率为20mw，中心波长为830nm，带宽为1nm。

5.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述分光镜(303)作为共光路的分光器件，选用短波通二向色镜，反射激发波长830nm的波段，透射小于激发波长830nm的短波光。

6.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述阵列光传感器(305)采用电荷耦合器件、电子倍增电荷耦合器件、雪崩光电二极管传感器、光电倍增管中的一种或多种，所述阵列光传感器(305)分辨率为1024，像素大小为7μm，光谱响应范围为700～1100nm。

7.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述聚焦镜组(304)的焦距为90mm；所述微位移机构(306)选用带闭环控制的压电位移台，量程为50μm，分辨率为0.05μm。

8.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述显微物镜(401)放大倍率为40倍，焦距为4.5mm，数值孔径为0.75，视场为60μm×128μm；所述视场光阑(403)的中空尺寸为0.5mm×3mm。

9.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述中央控制单元(500)包括电源(501)、与电源(501)相连的CPU(502)、与CPU(502)通过PCI总线相连的采集卡一(503)、与CPU(502)通过PCI总线相连的采集卡二(504)；所述微位移机构(306)和偏转轮(408)分别通过I/O口与CPU(502)相连，所述阵列光传感器(305)与采集卡一(503)相连，所述光电成像传感器(407)与采集卡二(504)相连，所述采集卡一(503)接收阵列光传感器(305)的信号，所述采集卡二(504)接收光电成像传感器(407)的信号。

10.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述光谱分光镜组(405)由六个长波通二向色镜组成，六个长波通二向色镜的分光波段分别为420～480nm、480～560nm、560～600nm、600～640nm、640～745nm、745～800nm，六个长波通二向色镜分别对应六个分光通道，每个分光通道对应一个分光波段，通过改变六个长波通二向色镜之间的角度改变对应分光通道的方向；通过六个长波通二向色镜对接收的平行光进行堆栈分光后分别通过六个分光通道出射。