JP2019508710A - ブリルアン光散乱に基づくラベルフリーサイトメトリーのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年12月22日に出願された米国仮特許出願第62/270,982号、2016年5月20日に出願された米国仮特許出願第62/339,512号、2016年4月15日に出願された米国仮特許出願第62/323,176号及び2016年11月21日に出願された米国仮特許出願第62/425,070号の恩典を主張し、それらの特許出願は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
本発明の検証の一例として、図2の構成を用いて多重化ブリルアン分光法の空間分解能を実証するために実験が実施された。この実験において、光源として、単一モード532nm連続波レーザーが使用され、サンプルとして、メタノールを含むプラスチックキュベットが使用された。照明経路(y軸に沿っている)内の対物レンズ211は、0.0175の開口数(NA)を有し、検出経路(x軸に沿っている)内の対物レンズ220は0.1のNAを有する。VIPA224は、17GHzの自由スペクトル領域(FSR)と、20mmの入射窓とを有する。カメラ227は、電子増倍電荷結合素子(EMCCD:electron multiplying coupled charge device)である。サンプル(プラスチックキュベット)と対物レンズ220との間にナイフエッジが配置された。ナイフエッジは、並進ステージを用いて、y方向に沿って動かすことができる。ナイフエッジをy方向に向かって動かすとき、キュベットからの散乱信号が部分的に遮断される。ナイフエッジの変位と、カメラの記録された信号とを比較することによって、分光法の空間分解能を取得することができる。図4a〜図4eは、ナイフエッジが異なる位置にあったときにカメラによって取り込まれた原画像を示す。これらの画像において、スペクトル領域内の複数のスペクトル次数が示された。各次数は3つの縞のグループを含み、両側に2つのブリルアン周波数(ストークス及び反ストークスシフト)と、その間にレーザー周波数とを有する。図4fは、ナイフエッジの動きと測定された変位との間の線形関係を示す。カメラの1ピクセルはサンプルの2.45μmのサイズに対応することが示された。また、図2に示されるような現在の構成は、800μm程度の大きいサンプルを測定することができ、結果として、300点より多くの点を同時に測定できることを示す。
例2は、図7に示されるような本発明の実施形態による、多重化(ライン走査)ブリルアン分光法の特性評価に関連する。図7は、ミラー724と、対物レンズ711、713及び714と、ビームコリメーション用の球面レンズ715と、円柱レンズ716、718及び719と、結像用の球面レンズ722とを含む、ライン走査ブリルアン分光法構成を例示する。一実施形態において、中間像面内に空間フィルター又はアパーチャ725が位置決めされ、サンプルから到来する焦点外の光が除去される。
2次元及び3次元結像
例3は、図7による多重化ブリルアン分光法に基づく2次元及び3次元結像の特性評価に関連する。
本発明の例示的な構成が図26に示される。垂直偏光レーザービーム2628が最初に偏光ビームスプリッター(PBS)2634によって反射され、対物レンズ2632によって底部側からマイクロ流体チャネル2624の中央に合焦する。一実施形態において、ブリルアン散乱を励起するための光源として、11mW単一モード直線偏光532nm cwレーザー(Torus、Laser Quantum社)が使用された。4分の1波長板(QWP)2626に起因して、合焦したビームは円偏光される。後方散乱光が同じ対物レンズ2632によって収集され、QWP2626に再び通される。円偏光した光は最終的に、PBS2634によって完全に透過する水平偏光した光に変換される。散乱光は、その後、ミラー2630によって導光され、ファイバーカップリングレンズ(FC)2636によってブリルアン分光計2638に結合される。ブリルアン分光計2638は、交差軸構成において、標準的な2ステージ仮想画像化フェーズドアレイ(VIPA)によって構成される。マイクロ流体チャネル2624の上側に、チャネル2624内部の細胞の流動状況を監視するために、明視野顕微鏡が構築された。破線矢印は、チャネル2624内部の細胞の流動方向を示す。照明のために赤色LED2616が使用され、ブリルアンビームを遮断するためにロングパスフィルターが使用された。一例として、限定はしないが、LED2616の波長は660nmとすることができ、ロングパスフィルターはFEL0600、Thorlabs社とすることができる。合焦したブリルアンビームの場所は、ロングパスフィルター(LP)2612を取り外すことによってあらかじめ決定された。ブリルアン信号に及ぼすLED光2616の影響を排除するために、ブリルアン分光計2638の前方に狭帯域フィルターが配置された。一実施形態において、分光計のデータを測定サンプルの対応する場所に割り当てることができるように、CCDカメラ2610及びブリルアン分光計2638をLab VIEWプログラムによって同期させた。一実施形態において、実験中に、分光計のサンプリング時間が50msと設定された。図27a〜図27dは、細胞内の複数の点においてブリルアン周波数を取得することに基づく、細胞流動実験の測定手順を示す。実験が行われているとき、ブリルアン分光計2638は絶えず信号を記録する。細胞がビームの場所を通り抜けるとき(矢印によって示される白色の点)、そのブリルアンシフトが測定される。
図26の構成において使用されるチップは、入口においてシースフロー構成を備える単一の一直線のチャネル2624を有する。一実施形態において、チャネルの断面は150μm(幅)×50μm(深さ)のサイズを有し、長さは約50mmである。チップは顕微鏡の2Dステージ上に組み付けられ、細胞懸濁液をチャネルの中に送り込むためのシリンジポンプに接続される。シースフロー技法を用いて、細胞をチャネルの中央に位置合わせすることができる。一実施形態において、流速は約20μm/s〜40μm/sである。全体的なスループットは一時間あたり細胞約160個から300個まで変化し、平均では一時間あたり細胞230個である。
細胞が培養され、Mg2+及びCa2+不含のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の溶液内に再懸濁される。一実施形態において、最終的な細胞濃度は、100万細胞/ml〜1000万細胞/mlである。クロマチン脱凝縮実験の場合、古い培地が吸引され、完全な成長培地内の100ng/mLトリコスタチンA(TSA)溶液と置き換えられる。その後、細胞は2時間、インキュベートされる。インキュベーション後に、細胞が、0.25%トリプシンEDTAを用いて採取され、250×gにおいて5分間、遠心分離され、約250万細胞/mLにおいて、Mg2+及びCa2+不含のPBSに再懸濁された。細胞核を蛍光染色する場合、Vybrant DyeCycle Ruby染料(ThermoFisher社)が使用され、推奨プロトコルに従った。要するに、50万細胞/mLの濃度を有する細胞懸濁液に1μL染料が添加され、十分に混合される。最終的な染料濃度は5μMである。その後、その混合物は37℃で15分〜30分間、インキュベートされ、光から保護される。その際、細胞は、洗浄することなく、蛍光実験の準備ができている。一実施形態において、実験のために、NIH 3T3細胞株が使用される。
本発明の一実施形態において、細胞懸濁液が、シリンジポンプを用いて、マイクロ流体チャネルの中に徐々に送り込まれる。チャネル内に細胞が満たされると、ポンプが停止される。数分後に、細胞はチャネルの底部に沈殿するが、依然として、丸みを帯びた形状を保持する。その後、レーザービームスポットの高さが細胞の中心に調整され、顕微鏡のステージを走査することによって、水平面において2D走査が実行される。走査のステップサイズは、両方の次元において0.5μmと設定される。一実施形態において、実験のために、NIH 3T3細胞株が使用される。
緩衝液内に懸濁された細胞は一般に丸い形状を有する。一実施形態において、細胞の直径は10μmから20μmに及ぶ。合焦したブリルアンビームは約0.5μmのスポットサイズを有するので、細胞がビームスポットを横切って流れるときに複数の位置を測定することができる。一実施形態において、流動実験中に、ブリルアン分光計は、20Hzの速度において絶えずデータを取得する。図27a〜図27dは、測定手順を例示する。具体的には、図27a〜図27cは、異なる時点(t1、t2及びt3)において細胞がマイクロ流体チャネルを通って流れる場合を示す。スケールバーは30μmである。矢印によって示される白色の点は、レーザービームスポットの場所である。図27dにおいて、ブリルアン信号の時間トレースが提示される。点は測定データであり、実線は見やすくするために引いた線である。
懸濁された細胞は丸みを帯びた形状を有し、それは簡単にするために球として近似することができる。シースフローの助けを借りて、細胞がマイクロ流体チャネルを通って流れるときに、細胞の中心を幅方向においてレーザービームスポットの場所に位置合わせすることができる。チャネルの深さが細胞サイズより大きいので、細胞の中心は、深さ方向において細胞ごとに異なることになる。このような場合には、細胞がレーザービームスポットを横切って進むときに、各単一細胞の直径を含む断面内の1つのラインがサンプリングされることになる。細胞流動中のブリルアン周波数シフトの測定値が、細胞集団の機構を表すのを確実にするために、それらの測定値が、細胞の中心を通る断面の画像と比較される。具体的には、細胞の2D画像が、図29aに示されるように取得された。図29bは、2つの曲線2902及び2904の重ね合わせによって当てはめられる細胞集団の全体的な機構を表す、図29aの画像データの全ての分布を示す。細胞がレーザーを横切るラインに沿った一群の点に対応するブリルアンフローデータの分布が図29cにプロットされ、曲線2908及び2906の重ね合わせによって当てはめられる。図29bの2Dブリルアン画像データを図27cのブリルアンフローデータと比較することによって、両方の分布が2ピークシグネチャを有することが観測される。より重要なことに、両方の分布に関するこれら2つのピークのブリルアンシフトは同じであり、すなわち、7.57GHz及び7.80GHzである。したがって、フローデータが、細胞集団の機械的特性を正確に明らかにすると結論付けられる。
懸濁された細胞を球であると見なすと、固定されたビームスポットによって1つの直径が検知されるように、細胞がシースフローを介して位置合わせされる。しかしながら、実際の実験において、垂直方向における細胞の場所はわずかに上下変動するので、ビームスポットは実際には、その直径を通る断面をマッピングしている。図28cの2ピークシグネチャを更に検証するために、蛍光染料を用いて、細胞の細胞核のみを染色した。図30に示されるように、明視野(I)、蛍光(II)及びブリルアン2D(IV)の画像が取得された。明視野画像及び蛍光画像を含む融合画像(III)をブリルアン画像と比較することによって、ヒストグラム3002及び3004によってそれぞれ示されるように、細胞核のブリルアンシグネチャを細胞骨格のブリルアンシグネチャから容易に分離することができる。集団内の細胞間の小さな差を考えるとき、細胞内の複数の点においてブリルアン周波数を取得することに基づいて流動実験から取得されたデータの分布は、細胞結像からの分布に類似しているはずであり、それが、図30と図28cとの間の高い類似度によって確認される。したがって、図28cの流動データの2つのピークがそれぞれ細胞核及び細胞骨格のシグネチャに対応することが検証される。
クロマチンはDNA及びタンパク質の複合物であり、細胞核内に染色体を形成する。その機能は、細胞の細胞核に収まるように、かつDNA構造及び配列を保護するように、DNAを小さな体積の中に効率的に詰め込むことである。研究の積み重ねが、クロマチンの凝縮レベルが細胞核の剛性に密接に関連することを示唆する。例えば、クロマチン脱凝縮の結果として、細胞核の剛性が低下する。逆に、クロマチン凝縮の増加が、細胞核の硬化につながる。一実施形態において、機械的サイトメトリーを用いて、TSA、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤によって引き起こされるクロマチン脱凝縮の影響を特徴付けた。
Claims (88)
- サンプル内の複数の点においてブリルアン散乱スペクトルに関連付けられる1つ以上の指標を同時に取得する方法であって、
第1の方向に沿って光ビームによって前記サンプルを照明することと、
前記照明光ビームに応答して前記サンプルから放射されるブリルアン散乱光を収集することと、
前記ブリルアン散乱光を、スペクトル分散を誘発する光学配置に送り、前記ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンを生成する検出ユニットに送ることであって、前記光学配置及び前記検出ユニットは第2の方向に沿って位置決めされることと、
前記検出ユニット上で前記ブリルアン散乱光の前記空間スペクトルパターンを検出することであって、前記照明光ビームに沿った前記サンプルの複数の点が同時に測定されることと、
前記検出ユニットにおいて、各空間点における前記スペクトルパターンを較正することと、
前記検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において前記1つ以上のブリルアン指標を計算することと、
を含む、方法。 - 前記1つ以上のブリルアン指標は、ブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、各測定サンプル点において計算された前記1つ以上のブリルアン指標に基づいて、前記サンプルの画像を生成することを更に含み、結像中に前記サンプルが前記照明光ビームに対して動いているか、又は結像中に前記照明光ビームが静止した前記サンプルに対して動いている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第1の方向と前記第2の方向との間の角度は0度より大きい任意の角度である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- スペクトル分散を誘発する前記光学配置は、仮想画像化フェーズドアレイ(VIPA)、ファブリ−ペローエタロン又はエシェル格子を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- スペクトル分散を誘発する前記光学配置は、前記サンプルから前記検出ユニットへの光路内の前記空間スペクトルパターンのサイズ、形状及び/又は角度の広がりを変更する光学要素を更に備える、請求項5に記載の方法。
- 前記サンプルは、生物有機体、組織又は生体細胞を含む、生体サンプルである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体サンプルはマイクロ流体デバイスの1つ以上のチャネル内にある、請求項7に記載の方法。
- 前記生体細胞は懸濁されるか、2D基体に付着しているか、又は3D細胞外マトリックス内で培養される、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記生体細胞は生細胞である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 各測定サンプル点における前記1つ以上のブリルアン指標は、前記サンプルの物理的特性を示す、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルの物理的特性は、粘弾性率、密度、屈折率、電歪、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記生体サンプルの前記物理的特性は、前記サンプルから生成される前記ブリルアン散乱光の前記スペクトルに基づいて取得される、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記サンプルを含む容器内にペンシルビームを生成するために第1のレンズによって前記照明光ビームを再整形することを更に含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のレンズに入射する前記照明光ビームを再整形する空間光変調器又は変形可能ミラー、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル容器内に生成される前記ブリルアン散乱光を第2のレンズによって収集することと、第3のレンズの焦点面において中間像を生成することとを更に含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中間像の倍率が、前記測定サンプル点の角分散を最小化するように最適化される、請求項16に記載の方法。
- 中間像面内で空間フィルター又はアパーチャを用いて、前記サンプルから到来する焦点外の光を除去することを更に含む、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記方法は、第2の結像系を用いて、前記検出ユニット上に前記中間像を投影することを更に含み、前記VIPAを含む、スペクトル分散を誘発する前記光学配置は、前記第2の結像系の無限遠空間内にある、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、球面レンズによって前記ブリルアン散乱光をコリメートすることと、前記コリメートされた光を円柱レンズによってz方向において前記VIPA上に合焦させることとを更に含み、異なる位置からのコリメートされたビームが前記VIPAに関するxy平面において異なる角度を有する、請求項5又は6に記載の方法。
- 幾つかの円柱レンズ及び球面レンズによって前記VIPAの出力光を変更し、前記ブリルアン空間スペクトルパターンの焦点を前記検出ユニット上に厳密に合わせることを更に含む、請求項20に記載の方法。
- 前記方法は、第1のレンズアレイによって前記ブリルアン散乱光をコリメートすることを更に含み、前記第1のレンズアレイの各レンズレットが前記中間像の一部からの光のみを受光し、像全体が複数の部分に分割され、各部分がレンズレットによって独立してコリメートされる、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記方法は、一対の円柱レンズによって、前記VIPAの前記出力光を、第2のレンズアレイのレンズレットの口径に合うように圧縮することを更に含み、前記ブリルアン空間スペクトルパターンは、前記第2のレンズアレイの前方焦点面において生成され、前記検出ユニット上に結像される、請求項22に記載の方法。
- 前記照明光は、その中心値に固定されるか、又はその中心値付近において調整可能である、UV、可視光又はIR方式の単一波長を有する照明源によって与えられる、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正ステップは、前記検出ユニット上で、前記光学配置の異なる回折次数によって生成された異なるレーザーライン又は弾性散乱ライン間の距離を測定することを更に含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正ステップは、既知のブリルアン特性の基準物質を用いて、スペクトル分散を誘発する前記光学配置の前記スペクトル分散特性を計算することを更に含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記照明光ビームはレーザー源によって生成され、前記検出ユニットは、CCD、CMOSカメラ、又は検出器のアレイである、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、狭帯域フィルターを用いて前記空間スペクトルパターン内の前記レーザーラインを吸収することを更に含み、前記狭帯域フィルターは、吸収ガスセル及びファブリ−ペローエタロンデバイスからなる群から選択される、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記照明源の前記波長及び前記狭帯域フィルターによって吸収される前記波長は互いにロックされる、請求項28に記載の方法。
- サンプル内の複数の点においてブリルアン散乱スペクトルに関連付けられる1つ以上のブリルアン指標を同時に取得するシステムであって、
第1の方向に沿って光ビームによって前記サンプルを照明する照明源と、
前記照明光ビームに応答して、前記サンプルから放射されるブリルアン散乱光を収集する1つ以上のレンズと、
前記1つ以上のレンズから前記ブリルアン散乱光を受光する光学配置であって、該光学配置はスペクトル分散を誘発する、光学配置と、
前記ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンを検出する検出ユニットであって、前記1つ以上のレンズ、前記光学配置及び前記検出ユニットは、第2の方向に沿って位置決めされ、前記照明光ビームに沿った前記サンプルの複数の点が同時に測定される、検出ユニットと、
プロセッサであって、
前記検出ユニットにおいて、各空間点における前記スペクトルパターンを較正するための命令と、
前記検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において前記1つ以上のブリルアン指標を計算するための命令と、
を実行する、プロセッサと、
を備える、システム。 - 前記1つ以上のブリルアン指標は、ブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項30に記載のシステム。
- 各測定サンプル点において計算された前記1つ以上のブリルアン指標に基づいて、前記サンプルの画像が生成され、結像中に前記サンプルが前記照明光ビームに対して動いているか、又は結像中に前記照明光ビームが静止した前記サンプルに対して動いている、請求項30又は31に記載のシステム。
- 前記第1の方向と前記第2の方向との間の角度は0度より大きい任意の角度である、請求項30〜32のいずれか一項に記載のシステム。
- スペクトル分散を誘発する前記光学配置は、仮想画像化フェーズドアレイ(VIPA)、ファブリ−ペローエタロン又はエシェル格子を含む、請求項30〜33のいずれか一項に記載のシステム。
- スペクトル分散を誘発する前記光学配置は、前記サンプルから前記検出ユニットへの光路内の前記空間スペクトルパターンのサイズ、形状及び/又は角度の広がりを変更する光学要素を更に含む、請求項34に記載のシステム。
- 前記サンプルは、生物有機体、組織又は生体細胞を含む、生体サンプルである、請求項30〜35のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記生体サンプルはマイクロ流体デバイスの1つ以上のチャネル内にある、請求項36に記載のシステム。
- 前記生体細胞は懸濁されるか、2D基体に付着しているか、又は3D細胞外マトリックス内で培養される、請求項36又は37に記載のシステム。
- 前記生体細胞は生細胞である、請求項36〜39のいずれか一項に記載のシステム。
- 各測定サンプル点における前記1つ以上のブリルアン指標は、前記サンプルの物理的特性を示す、請求項30〜39のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記サンプルの物理的特性は、粘弾性率、密度、屈折率、電歪及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項40に記載のシステム。
- 前記生体サンプルの前記物理的特性は、前記サンプルから生成される前記ブリルアン散乱光の前記スペクトルに基づいて取得される、請求項40又は41に記載のシステム。
- 前記照明光ビームは、前記サンプルを含む容器内にペンシルビームを生成するために第1のレンズによって再整形される、請求項30〜42のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記光学配置は、第1のレンズに入射する前記照明光ビームを再整形する空間光変調器又は変形可能ミラーを含む、請求項30〜43のいずれか一項に記載のシステム。
- サンプル容器内に生成される前記ブリルアン散乱光は、第2のレンズによって収集され、第3のレンズの焦点面において中間像を生成する、請求項30〜44のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記中間像の倍率が、前記測定サンプル点の角分散を最小化するように最適化される、請求項45に記載のシステム。
- 中間像面内に、前記サンプルから到来する焦点外の光を除去する空間フィルター又はアパーチャを更に備える、請求項45又は46に記載のシステム。
- 前記システムは、前記検出ユニット上に前記中間像を投影する第2の結像系を更に備え、前記VIPAを含む、スペクトル分散を誘発する前記光学配置は、前記第2の結像系の無限遠空間内にある、請求項45〜47のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ブリルアン散乱光は球面レンズによってコリメートされ、前記コリメートされた光を円柱レンズによってz方向において前記VIPA上に合焦させ、異なる位置からのコリメートされたビームが前記VIPAに関するxy平面において異なる角度を有する、請求項34に記載のシステム。
- 前記ブリルアン空間スペクトルパターンの焦点を前記検出ユニット上に厳密に合わせるために、前記VIPAの出力光が幾つかの円柱レンズ及び球面レンズによって変更される、請求項49に記載のシステム。
- 前記ブリルアン散乱光は第1のレンズアレイによってコリメートされ、前記第1のレンズアレイの各レンズレットが前記中間像の一部からの光のみを受光し、像全体が複数の部分に分割され、各部分がレンズレットによって独立してコリメートされる、請求項34に記載のシステム。
- 前記VIPAの前記出力光は、一対の円柱レンズによって、第2のレンズアレイのレンズレットの口径に合うように圧縮され、前記ブリルアン空間スペクトルパターンは、前記第2のレンズアレイの前方焦点面において生成され、前記検出ユニット上に結像される、請求項51に記載のシステム。
- 前記照明光は、その中心値に固定されるか、又はその中心値付近において調整可能である、UV、可視光又はIR方式の単一波長を有する照明源によって与えられる、請求項30〜52のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記較正ステップは、前記検出ユニット上で、前記光学配置の異なる回折次数によって生成された異なるレーザーライン又は弾性散乱ライン間の距離を測定することを更に含む、請求項30〜53のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記較正ステップは、既知のブリルアン特性の基準物質を用いて、スペクトル分散を誘発する前記光学配置の前記スペクトル分散特性を計算することを更に含む、請求項30〜54のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記照明光ビームはレーザー源によって生成され、前記検出ユニットは、CCD、CMOSカメラ、又は検出器のアレイである、請求項30〜55のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記システムは、前記空間スペクトルパターン内の前記レーザーラインを吸収する狭帯域フィルターを更に備え、前記狭帯域フィルターは、吸収ガスセル及びファブリ−ペローエタロンデバイスからなる群から選択される、請求項30〜56のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記照明源の前記波長及び前記狭帯域フィルターによって吸収される前記波長は互いにロックされる、請求項57に記載のシステム。
- 生体細胞を分類する方法であって、
媒質内に前記生体細胞を含む、生体サンプルを有する容器を設けることと、
前記生体サンプルを照明し、前記生体細胞及び前記媒質内からブリルアン散乱光を生成することと、
各生体細胞内の複数の点においてブリルアン散乱スペクトルを測定することと、
前記測定されたブリルアン散乱スペクトルに基づいて、前記生体細胞内の異なる空間点における細胞内物理的特性に関連する1つ以上のブリルアン指標を抽出することと、
前記生体細胞内の異なる空間点における前記細胞内物理的特性に基づいて、前記生体細胞を分類することと、
を含む、方法。 - 前記ブリルアン散乱スペクトルに関連付けられる前記1つ以上のブリルアン指標は、ブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及び、その組み合わせからなる群から選択される、請求項59に記載の方法。
- 前記サンプルの物理的特性は、粘弾性率、密度、屈折率、電歪及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項59又は60に記載の方法。
- 前記生体細胞内の異なる空間点における細胞内物理的特性を抽出する前記ステップは、
前記生体細胞内の各測定点を含む、ブリルアン周波数シフトに関するヒストグラムをプロットすることと、
前記ヒストグラムを当てはめるためにガウス分布の線形重ね合わせを適用することと、
前記ヒストグラム内の各ピークを特定することであって、該ピークは前記細胞内の異なる領域からの機械的シグネチャを表すことと、
前記ヒストグラムから前記媒質に関連付けられるデータを除去することと、
を更に含み、前記生体細胞内の異なる空間点における前記機械的特性は、前記特定された機械的シグネチャに相関がある、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。 - 前記1つ以上のブリルアン指標は、多次元ヒストグラムを作成して生体細胞を分類するために、蛍光散乱、ラマン散乱、前方散乱及び側方散乱と組み合わせて使用される、請求項59〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体細胞内の異なる空間点において細胞内物理的特性を抽出する前記ステップは、画像を形成することと、前記特定された物理的シグネチャ内の空間による違いに基づいて、パラメーターを分割することとを更に含む、請求項62に記載の方法。
- 前記容器はマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルであり、前記生体細胞は前記マイクロ流体チャネルを通って流れる、請求項59〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体細胞は懸濁された状態にあるか、2D基体に付着しているか、又は3D細胞外マトリックス内で培養される、請求項59〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブリルアン散乱の元の場所を識別するために、そして前記マイクロ流体チャネル内の特定の場所に前記照明光ビームを導光するために、前記ブリルアン光スペクトルパターンと同時に明視野2D画像が取得される、請求項59〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブリルアン周波数シフトは、点走査モードにおいて、又は多重化走査モードにおいて測定される、請求項59〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抽出された物理的特性は、単一の生体細胞又は生体細胞の集団の分析結果を指している、請求項59〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抽出されたヒストグラムは、細胞質及び細胞核にそれぞれ対応する2つのピークを有する、請求項59〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞核を細胞質から分離するために、2D明視野細胞画像及び2D蛍光細胞画像を含む融合画像を、前記ブリルアン周波数シフトに基づく細胞画像と比較することを更に含む、請求項59〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の細胞内機械的特性に基づいて、改変された生体細胞を無傷の生体細胞から区別することを更に含み、前記細胞は細胞骨格又は細胞核等の細胞内成分を標的にする薬物によって改変される、請求項59〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞内物理的特性を用いて、その異なる物理的特性に基づいて細胞を選別する、請求項59〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 生体細胞を分類するシステムであって、
媒質内に前記生体細胞を含む、生体サンプルを有する容器と、
前記生体細胞及び前記媒質内からブリルアン散乱光を生成するために、前記生体サンプルを照明する照明源と、
各生体細胞内の複数の点においてブリルアン散乱スペクトルを測定する分光計と、
前記分光計と通信するプロセッサであって、
前記測定されたブリルアン散乱スペクトルに基づいて、前記生体細胞内の異なる空間点における細胞内物理的特性に関連する1つ以上のブリルアン指標を抽出するための命令と、
前記生体細胞内の異なる空間点における前記細胞内物理的特性に基づいて、前記生体細胞を分類するための命令と、
を実行する、プロセッサと、
を備える、システム。 - 前記ブリルアン散乱スペクトルに関連付けられる前記1つ以上のブリルアン指標は、ブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項74に記載のシステム。
- 前記サンプルの前記物理的特性は、粘弾性率、密度、屈折率、電歪及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項74又は75に記載のシステム。
- 前記生体細胞内の異なる空間点における細胞内物理的特性を抽出するための前記命令は、
前記生体細胞内の各測定点を含む、ブリルアン周波数シフトに関するヒストグラムをプロットするための命令と、
前記ヒストグラムを当てはめるためにガウス分布の線形重ね合わせを適用するための命令と、
前記ヒストグラム内の各ピークを特定するための命令であって、該ピークは前記細胞内の異なる領域からの機械的シグネチャを表す、命令と、
前記ヒストグラムから前記媒質に関連付けられるデータを除去するための命令と、
を更に含み、前記生体細胞内の異なる空間点における前記機械的特性は、前記特定された機械的シグネチャに相関がある、請求項74〜76のいずれか一項に記載のシステム。 - 前記1つ以上のブリルアン指標は、多次元ヒストグラムを作成して生体細胞を分類するために、蛍光散乱、ラマン散乱、前方散乱及び側方散乱と組み合わせて使用される、請求項74〜77のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記生体細胞内の異なる空間点における細胞内物理的特性を抽出するための前記命令は、画像を形成するための命令と、前記特定された物理的シグネチャ内の空間による違いに基づいて、パラメーターを分割するための命令とを更に含む、請求項77に記載のシステム。
- 前記容器はマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルであり、前記生体細胞は前記マイクロ流体チャネルを通って流れる、請求項74〜79のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記生体細胞は懸濁された状態にあるか、2D基体に付着しているか、又は3D細胞外マトリックス内で培養される、請求項74〜80のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ブリルアン散乱の元の場所を識別するために、そして前記マイクロ流体チャネル内の特定の場所に前記照明光ビームを導光するために、前記ブリルアン光スペクトルパターンと同時に、明視野2D画像が取得される、請求項74〜81のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ブリルアン周波数シフトは、点走査モードにおいて、又は多重化走査モードにおいて測定される、請求項74〜82のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記抽出された物理的特性は、単一の生体細胞又は生体細胞の集団の分析結果を指している、請求項74〜83のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記抽出されたヒストグラムは、細胞質及び細胞核にそれぞれ対応する2つのピークを有する、請求項74〜84のいずれか一項に記載のシステム。
- 細胞核を細胞質から分離するために、2D明視野細胞画像及び2D蛍光細胞画像を含む融合画像を、前記ブリルアン周波数シフトに基づく細胞画像と比較するための命令を更に含む、請求項74〜85のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記システムは、前記細胞の細胞内機械的特性に基づいて、改変された生体細胞を無傷の生体細胞から区別するための命令を更に含み、前記細胞は、細胞質又は細胞核等の細胞内成分を標的とする薬物によって改変される、請求項74〜86のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記細胞内物理的特性を用いて、その異なる物理的特性に基づいて細胞を選別する、請求項74〜87のいずれか一項に記載のシステム。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
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---|---|---|---|---|
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US11408770B2 (en) * | 2017-10-30 | 2022-08-09 | University Of Maryland, College Park | Brillouin imaging devices, and systems and methods employing such devices |
US10929716B2 (en) * | 2018-09-12 | 2021-02-23 | Molecular Devices, Llc | System and method for label-free identification and classification of biological samples |
US11060912B2 (en) | 2018-12-06 | 2021-07-13 | University Of Maryland, College Park | Multi-stage parallel spectroscopy systems and methods |
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CN109856807B (zh) * | 2019-02-15 | 2020-12-22 | 哈尔滨工程大学 | 一种基于透镜阵列的二次分像方法 |
CN110426372B (zh) * | 2019-07-16 | 2021-10-22 | 南昌航空大学 | 一种扫频式布里渊散射体弹性模量成像检测方法 |
CN110907318B (zh) * | 2019-11-07 | 2021-02-09 | 中国科学院遥感与数字地球研究所 | 一种近地面大气总悬浮颗粒物质量浓度遥感物理估算方法 |
WO2021174207A1 (en) * | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Intelon Optics, Inc. | Contactless inspection of reproductive cellular structures using optical measurement of biomechanical properties |
US11879827B2 (en) | 2020-04-29 | 2024-01-23 | Becton, Dickinson And Company | Methods for modulation and synchronous detection in a flow cytometer and systems for same |
WO2022031815A1 (en) * | 2020-08-04 | 2022-02-10 | University Of Maryland, College Park | Full-field brillouin microscopy systems and methods |
EP3978905A1 (en) | 2020-10-02 | 2022-04-06 | Université Côte d'Azur | Optoacoustic monitoring device for cell characterization |
CN112697179B (zh) * | 2020-11-17 | 2023-06-20 | 浙江工业大学 | 一种基于AdaBoost的布里渊频移提取方法 |
CN114371147B (zh) * | 2021-12-30 | 2024-03-29 | 北京无线电计量测试研究所 | 可准确测量介质横向与纵向声学声子速度的共焦显微装置 |
FR3144659A1 (fr) * | 2022-12-30 | 2024-07-05 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Dispositif et procédé d’analyse par spectroscopie Brillouin |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0772066A (ja) * | 1993-03-17 | 1995-03-17 | Shinichi Ito | 高純度物質中微粒子散乱光検出装置及び分散式ファブリ・ペロー型分光装置並びに平行平面鏡の製造方法及び波長安定化装置 |
US20090004670A1 (en) * | 2007-06-29 | 2009-01-01 | Jingwu Zhang | Methods for fabricating surface enhanced fluorescent (sef) nanoparticles and their applications in bioassays |
US20090323056A1 (en) * | 2007-05-04 | 2009-12-31 | The General Hospital Corporation | Methods, arrangements and systems for obtaining information associated with a sample using optical microscopy |
US20120302862A1 (en) * | 2011-04-29 | 2012-11-29 | The General Hospital Corporation | Methods and arrangements for obtaining information and providing analysis for biological tissues |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8920571D0 (en) | 1989-09-12 | 1989-10-25 | Carr Robert J G | Examination of objects of macromolecular size |
US5784162A (en) * | 1993-08-18 | 1998-07-21 | Applied Spectral Imaging Ltd. | Spectral bio-imaging methods for biological research, medical diagnostics and therapy |
ATE191750T1 (de) | 1996-01-23 | 2000-04-15 | Rapigene Inc | Verfahren und zusammenstellungen zur sequenzbestimmung von nukleinsäuremolekulen |
EP1300681A4 (en) | 2000-07-12 | 2004-07-14 | Orient Cancer Therapy Co Ltd | MEANS FOR TESTING IMMUNE FUNCTION |
US8184298B2 (en) * | 2008-05-21 | 2012-05-22 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Spatial light interference microscopy and fourier transform light scattering for cell and tissue characterization |
US8810796B2 (en) * | 2009-04-21 | 2014-08-19 | Michigan Aerospace Corporation | Light processing system and method |
CN102439393B (zh) * | 2009-05-15 | 2014-08-20 | 密歇根宇航公司 | 范围成像激光雷达 |
US20120225475A1 (en) * | 2010-11-16 | 2012-09-06 | 1087 Systems, Inc. | Cytometry system with quantum cascade laser source, acoustic detector, and micro-fluidic cell handling system configured for inspection of individual cells |
US9498122B2 (en) | 2013-06-18 | 2016-11-22 | Avedro, Inc. | Systems and methods for determining biomechanical properties of the eye for applying treatment |
JP6143289B2 (ja) | 2013-07-16 | 2017-06-07 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 水晶体の弾性測定方法、水晶体の弾性測定装置、及び水晶体の老視判定装置 |
WO2015010119A2 (en) | 2013-07-19 | 2015-01-22 | The General Hospital Corporation | System, method and arrangements for modifying optical and mechanical properties of biological tissues |
EP3054833B1 (en) | 2013-10-11 | 2022-11-16 | Alcon Inc. | Diagnosis system and method of using the same |
CN103884703B (zh) | 2014-03-10 | 2016-10-05 | 北京理工大学 | 分光瞳激光差动共焦布里渊-拉曼光谱测量方法及装置 |
WO2017053592A1 (en) | 2015-09-23 | 2017-03-30 | The Regents Of The University Of California | Deep learning in label-free cell classification and machine vision extraction of particles |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0772066A (ja) * | 1993-03-17 | 1995-03-17 | Shinichi Ito | 高純度物質中微粒子散乱光検出装置及び分散式ファブリ・ペロー型分光装置並びに平行平面鏡の製造方法及び波長安定化装置 |
US20090323056A1 (en) * | 2007-05-04 | 2009-12-31 | The General Hospital Corporation | Methods, arrangements and systems for obtaining information associated with a sample using optical microscopy |
US20090004670A1 (en) * | 2007-06-29 | 2009-01-01 | Jingwu Zhang | Methods for fabricating surface enhanced fluorescent (sef) nanoparticles and their applications in bioassays |
US20120302862A1 (en) * | 2011-04-29 | 2012-11-29 | The General Hospital Corporation | Methods and arrangements for obtaining information and providing analysis for biological tissues |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LINDSAY, S. M. ET AL.: "Correction of Brillouin linewidths measured by multipass Fabry-Perot spectroscopy", APPLIED OPTICS, vol. Vo. 16, No. 5, JPN6020038933, 1977, pages 1404 - 1407, ISSN: 0004614801 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20200138996A (ko) * | 2019-06-03 | 2020-12-11 | 주식회사 브릴리온포토닉스 | 프로브형 브릴루앙 광산란 측정 장치 |
KR102394398B1 (ko) * | 2019-06-03 | 2022-05-06 | 주식회사 브릴리온포토닉스 | 프로브형 브릴루앙 광산란 측정 장치 |
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