BR112018068866B1

BR112018068866B1 - Classificação de células utilizando um citômetro de fluxo de fluorescência de alto rendimento

Info

Publication number: BR112018068866B1
Application number: BR112018068866-5A
Authority: BR
Inventors: Eric Diebold; Keegan Owsley; Jonathan Lin
Original assignee: Bd Biosciences
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2022-11-29
Also published as: CA3018065A1; EP3430376A1; CN109564151B; US20210356381A1; JP2019513236A; US20200209140A1; ZA201806386B; JP7130562B2; US12078587B2; JP2024119909A; US20230076378A1; US20190234863A1; KR102527830B1; KR102641469B1; WO2017161247A1; KR20220002706A; JP7502361B2; US11774343B2; US10620111B2; US10324019B2

Abstract

Em um aspecto, a invenção trata de um método de classificação de células num sistema de citometria de fluxo é descrito, que inclui iluminação de uma célula com radiação tendo pelo menos duas frequências ópticas deslocadas uma da outra por uma radiofrequência para eliciar radiação fluorescente da célula, detectar a radiação fluorescente para gerar dados de fluorescência temporal, e processar os dados de fluorescência temporal para chegar a uma decisão de triagem referente à célula sem gerar uma imagem (isto é, uma imagem de pixel por pixel) da célula com base nos dados de fluorescência. Em outras palavras, enquanto os dados de fluorescência podem conter dados de imagem que permitiriam a geração de um mapa de intensidade de fluorescência pixel por pixel, o método chega à decisão de triagem sem gerar um tal mapa. Em alguns casos, a decisão de triagem pode ser feita com uma latência inferior a cerca de 100 microssegundos. Em algumas modalidades, o método acima de classificar células pode ter uma resolução sub-celular, por exemplo a decisão de classificação pode ser baseada em características de um componente da célula. Em outras formas de realização, em que mais de duas frequências ópticas deslocadas em frequência são empregadas,(...).

Description

Pedido Relativo

[001] O presente pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório Número 62/309.806 intitulado "Classificação de Células Utilizando um Citômetro de Fluxo de Fluorescência de Alto Rendimento", o qual foi depositado em 17 de Março de 2016 e o qual está aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Direitos Governamentais

[002] Esta invenção é financiada pela National Science Foundation, Grant No. NSF 1447381. O Governo tem certos direitos nesta invenção.

Antecedentes

[003] A presente invenção refere-se geralmente a dispositivos e métodos para determinar características de partículas que fluem através de um citômetro de fluxo, por exemplo, através de análise de fluorescência de amostras, e mais especificamente a dispositivos e métodos para classificar partículas, por exemplo, classificar células em um citômetro de fluxo com base, por exemplo, em suas características.

[004] O isolamento de subpopulações ou mesmo células únicas de populações heterogêneas tem uma variedade de aplicações em biologia e biomedicina modernas. Algumas técnicas convencionais para separar subpopulações de células incluem classificação de célula ativada por fluorescência (FACS), classificação de célula ativada magnética (MACS), microdissecção de captura a laser, e classificação de rede de DEP. Estas técnicas, apesar de empregadas rotineiramente em aplicações de classificação de célula, apresentam um número de desvantagens. Por exemplo, FACS, a qual é amplamente utilizada através de todas as áreas de biologia de célula, não possui resolução subcelular e com isto toma as decisões de classificação com base somente em uma média de parâmetros de uma célula. Mais ainda, métodos de classificação convencionais com base em formação de imagem de células não são geralmente capazes de serem utilizados em aplicações de separação de células de alto desempenho devido à sua alta latência em tomar decisões de classificação.

[005] Consequentemente, existe uma necessidade para métodos e sistemas aperfeiçoados para classificar células, por exemplo, em um sistema de citometria de fluxo.

Sumário

[006] Em um aspecto, um método para determinar uma característica de uma partícula está descrito, o qual inclui iluminar uma partícula conforme esta flui através de um sistema de citometria de fluxo com um feixe ótico modulado em radiofrequência de modo a obter pelo menos uma resposta radiativa da partícula, detectar a resposta radiativa que emana da partícula para gerar dados de forma de onda temporais associados com a resposta radiativa, e processar os dados de forma de onda para obter uma estimativa de pelo menos uma característica da partícula. Em algumas modalidades, a etapa de processamento é executada sem gerar uma imagem da partícula com base nos dados de forma de onda. Em algumas modalidades, a resposta radiativa pode ser qualquer uma de radiação fluorescente ou dispersa. Em algumas modalidades, a etapa de processamento é suficientemente rápida de modo que uma latência associada com a obtenção da estimativa de pelo menos uma característica da partícula é igual ou menor do que aproximadamente 100 microssegundos, por exemplo, igual a ou menor do que aproximadamente 20 microssegundos.

[007] Em algumas modalidades, o feixe ótico modulado em radiofrequência inclui pelo menos duas frequências óticas separadas uma da outra por pelo menos uma radiofrequência. Em tais modalidades, a etapa de processamento pode incluir analisar pelo menos uma frequência de batida associada com a pelo menos uma radiofrequência detectada na dita resposta radiativa para determinar a estimativa da pelo menos uma característica da partícula.

[008] O método acima pode ser empregado para determinar estimativas de uma variedade de diferentes características da partícula. Por meio de exemplo, a característica da partícula pode ser pelo menos um de um tamanho dimensional da partícula, uma razão de tamanhos da partícula ao longo de duas diferentes dimensões, co- localização de radiação fluorescente emitida por dois ou mais marcadores associados com a partícula, um grau de pontuação da resposta radiativa, uma medida da distribuição espacial de uma radiação fluorescente emanada da partícula, uma medida de localização ou orientação da partícula, uma medida de excentricidade da partícula, uma medida da similaridade da partícula para uma partícula de referência, uma combinação de um ou mais componentes de Fourier espaciais da partícula, uma medida do grau no qual a partícula fica em um ponto focal da radiação de iluminação.

[009] Em um aspecto relativo, a estimativa da pelo menos uma característica da partícula pode ser utilizada para chegar a uma decisão de classificação referente àquela partícula.

[0010] Em um aspecto relativo, um método para determinar uma ou mais características de uma partícula está descrito, o qual inclui iluminar uma partícula conforme esta flui através de um sistema de citometria de fluxo com uma radiação que tem pelo menos duas frequências óticas deslocadas uma da outra por uma radiofrequência para obter radiação fluorescente da partícula, detectar a radiação fluorescente da partícula para gerar dados de fluorescência temporais, e processar os dados de fluorescência temporais para obter uma estimativa de pelo menos uma característica da partícula. Em algumas moda- lidades, a etapa de processamento é executada sem gerar uma imagem de fluorescência com base nos dados de fluorescência temporais. Em algumas modalidades, a etapa de processamento pode incluir uma ou mais frequências de batida que modulam os dados de fluorescência temporais para obter a dita estimativa da pelo menos uma característica da partícula. Em algumas modalidades, a etapa de processamento é suficientemente rápida de modo que uma latência associada com obter a dita estimativa de pelo menos uma característica da partícula é menor do que aproximadamente 100 microssegundos, por exemplo, menor do que aproximadamente 20 microssegundos.

[0011] Em algumas modalidades, a característica determinada pode estar associada com um componente interno da partícula. Em algumas modalidades, a característica determinada pode ser qualquer uma de um tamanho dimensional da partícula, uma razão de tamanhos da partícula ao longo de duas diferentes dimensões, co- localização de radiação fluorescente emitida por dois ou mais marcadores associados com a partícula, um grau de pontuação da radiação fluorescente, uma medida da distribuição espacial da radiação fluorescente, uma medida de localização ou orientação da partícula, uma medida de excentricidade da partícula, uma medida da similaridade da partícula para uma partícula de referência, uma combinação de um ou mais componentes de Fourier espaciais da partícula, uma medida do grau no qual a partícula fica em um ponto focal da radiação de iluminação.

[0012] Em algumas modalidades, a etapa de iluminar a partícula inclui expor a partícula a um feixe de radiação ótica que compreende pelo menos dois pequenos feixes cada um tendo uma das ditas pelo menos duas frequências óticas de modo que os ditos pequenos feixes iluminam pelo menos duas localizações espaciais dentro da partícula. Em algumas modalidades, as duas localizações espaciais iluminadas são parcialmente sobrepostas.

[0013] Em algumas modalidades, a partícula pode ser tingida com pelo menos dois marcadores de fluorescência, onde cada marcador está configurado para emitir radiação fluorescente em resposta à iluminação por radiação tendo uma das frequências óticas. Em tais modalidades, o método pode ainda incluir coletar e digitalizar os sinais de fluorescência emanados destes marcadores para gerar formas de onda de fluorescência temporais cada uma correspondendo a um dos marcadores. As formas de onda de fluorescência podem ser processadas para obter uma medida de co-localização dos sinais de fluorescência. Por meio de exemplo, o processamento das formas de onda de fluorescência pode incluir aplicar um filtro de passagem alta ou passagem de banda a pelo menos uma das formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda filtrada seguida por uma multiplicação por pontos das formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda multiplicativa, integrar a forma de onda multiplicativa para obter um valor integrado, e comparar o valor integrado com um limite prede- finido para obter uma medida de co-localização. Em algumas modali-dades, a determinação de uma medida de co-localização pode incluir aplicar um filtro de passagem alta ou passagem de banda a pelo menos uma das formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda filtrada seguida por uma multiplicação por pontos das formas de onda para gerar uma forma de onda multiplicativa resultante, integrar a forma de onda multiplicativa para obter um valor integrado, subtrair um valor de fundo do valor integrado e escalar o valor resultante por intensidade para gerar um valor finalizado, e comparar o valor finalizado com um limite predefinido para obter uma medida de co-localização.

[0014] Em algumas modalidades do método acima, a etapa de processar compreende obter uma estimativa de um tamanho lateral da partícula ao longo de uma direção substancialmente perpendicular à direção de fluxo de partícula no sistema de citometria de fluxo.

[0015] Em algumas modalidades do método acima, a forma de onda de fluorescência é empregada para obter uma estimativa de um tamanho lateral da partícula elevando ao quadrado a forma de onda, aplicando um filtro de passagem de banda na forma de onda elevada ao quadrado, integrando a forma de onda filtrada, e comparando o valor integrado com um limite predefinido.

[0016] Em algumas modalidades, uma estimativa do tamanho de partícula em uma direção paralela à direção de fluxo de partícula no citômetro de fluxo pode ser obtida com base em uma duração temporal de um pulso de radiação fluorescente que emana da partícula em resposta à etapa de iluminação.

[0017] Em algumas modalidades, as estimativas do tamanho da partícula em uma direção perpendicular e em uma direção paralela à direção de fluxo de partícula podem ser utilizadas para obter uma estimativa da razão de aspecto da partícula.

[0018] Os métodos acima podem ser aplicados a uma variedade de diferentes partículas. Por meio de exemplo, a partícula pode ser qualquer uma de uma célula, um pequeno organismo (por exemplo, o nematóide c. elegans), uma gota, uma micropartícula, uma nanopartí- cula, uma partícula viral, uma bactéria, um exossoma, ou um produto farmacêutico. Em algumas modalidades, a partícula pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula doente.

[0019] Em um aspecto relativo, a estimativa da pelo menos uma característica da partícula pode ser utilizada para chegar a uma decisão de classificação referente àquela partícula, como abaixo discutido em mais detalhes.

[0020] Em um aspecto relativo, um método para determinar uma característica de uma partícula está descrito, o qual inclui iluminar uma partícula com um feixe ótico modulado em radiofrequência de modo a obter qualquer uma de radiação fluorescente e dispersa da partícula, detectar a radiação fluorescente ou dispersa que emana da partícula para gerar dados de forma de onda de fluorescência ou dispersão temporais, e processar qualquer uma dos dados de fluorescência e dispersão para obter uma estimativa de pelo menos uma característica da partícula. Em algumas modalidades, a etapa de processamento pode ser executada sem gerar uma imagem da partícula com base nos dados de forma de onda de fluorescência ou dispersão temporais. Em algumas tais modalidades, a etapa de processamento é suficientemente rápida de modo que uma latência associada com a obtenção da estimativa de pelo menos uma característica da partícula é menor do que aproximadamente 100 microssegundos, por exemplo, menor do que aproximadamente 20 microssegundos.

[0021] Em algumas modalidades do método acimas, a característica da partícula pode incluir pelo menos um de um tamanho dimensional da partícula, uma razão de tamanhos da partícula ao longo de duas diferentes dimensões, co-localização de radiação fluorescente emitida por dois ou mais marcadores associados com a partícula, um grau de pontuação da radiação fluorescente, uma medida da distribuição espacial da radiação fluorescente, uma medida de localização ou orientação da partícula, uma medida de excentricidade da partícula, uma medida da similaridade da partícula para uma partícula de referência, uma combinação de um ou mais componentes de Fourier espaciais da partícula, uma medida do grau no qual a partícula fica em um ponto focal da radiação de iluminação.

[0022] Em algumas modalidades, tanto a radiação fluorescente quanto dispersa emanadas de uma partícula podem ser detectadas para gerar dados de forma de onda de fluorescência e dispersão. Os dados de fluorescência podem ser utilizados para obter uma estimativa de um tamanho lateral da partícula em uma direção substancialmente perpendicular à direção de fluxo de partícula e os dados de forma de onda de dispersão podem ser empregados para obter uma estimativa de um tamanho da partícula em uma direção paralela à direção de fluxo de partícula no dito sistema de citometria de fluxo.

[0023] Em algumas modalidades, as estimativas da pelo menos uma característica da partícula podem ser utilizadas para chegar a uma decisão de classificação com relação àquela partícula conforme a partícula flui através do citômetro de fluxo.

[0024] Em um aspecto relativo, um método para executar citome- tria de fluxo auxiliada por computador está descrito, o qual inclui introduzir uma amostra que contém uma pluralidade de partículas em um citômetro de fluxo, obter, de uma ou mais medições de citômetro de fluxo, estimativas de pelo menos uma característica de partícula para a dita pluralidade de partículas, onde a dita etapa de obtenção compreende iluminar uma partícula conforme esta flui através do citômetro de fluxo com uma radiação que tem pelo menos duas frequências óticas deslocadas uma da outra por uma radiofrequência, por exemplo, uma radiofrequência em uma faixa de aproximadamente 50 MHz a aproximadamente 250 MHz, para obter uma resposta radiativa da partícula, detectar a resposta radiativa da partícula para gerar dados de forma de onda temporais associados com a resposta. O método pode ainda incluir processar os dados de forma de onda temporais para obter um valor da dita pelo menos uma característica de partícula, tal como aquelas acima discutidas, analisando uma ou mais frequências de ba-tida que modulam os ditos dados de forma de onda temporais, e identificar, através de um processador de computador, uma porta indicativa de uma ou mais das ditas partículas que têm um calor da dita característica de partícula dentro de uma faixa predefinida. Por meio de exemplo, a resposta radiativa pode ser qualquer uma de radiação fluorescente, dispersa ou transmitida.

[0025] Em um aspecto, um método para classificar células em um sistema de citometria de fluxo está descrito, o qual inclui iluminar uma célula com uma radiação que tem pelo menos duas frequências óticas deslocadas uma da outra por uma radiofrequência para obter radiação fluorescente da célula, detectar a radiação fluorescente para gerar dados de fluorescência temporais, e processar os dados de fluorescência temporais para chegar a uma decisão de classificação referente à célula. Em algumas modalidades, a decisão de classificação pode ser feita sem gerar uma imagem (isto é, uma imagem de pixel por pixel) da célula com base nos dados de fluorescência. Em outras palavras, apesar dos dados de fluorescência poderem conter dados de imagem que permitiriam gerar um mapa de intensidade de fluorescência de pixel por pixel, o método chega na decisão de classificação sem gerar tal mapa. Em alguns casos, a decisão de classificação pode ser feita com uma latência menor do que aproximadamente 100 microssegundos. Em algumas modalidades, o método de classificar células acima pode ter uma resolução subcelular, por exemplo, a decisão de classificação pode ser baseada em características de um componente da célula. Em algumas modalidades nas quais mais do que duas frequências óticas deslocadas em frequência são empregadas, um único deslocamento de radiofrequência é empregado para separar as frequências óticas enquanto que em outras tais modalidades uma pluralidade de diferentes deslocamentos é empregada.

[0026] A etapa de processamento pode incluir analisar uma ou mais frequências de batida que modulam os dados de fluorescência de modo a chegar na decisão de classificação. As frequências de batida podem corresponder às diferenças entre as frequências das frequências óticas deslocadas em frequência de rádio. Por exemplo, quando o feixe ótico inclui dois pequenos feixes, os quais interferem em uma célula iluminada e têm duas frequências óticas separadas por uma radio- frequência, a frequência de batida corresponde à diferença entre as frequências óticas. A frequência de batida está tipicamente na faixa de frequência de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente 250 MHz.

[0027] Em algumas modalidades, a etapa de processamento pode incluir operar sobre os dados de fluorescência para obter uma estimativa de uma característica da célula e tomar a decisão de classificação com base nesta estimativa. Uma variedade de diferentes características da célula pode ser empregada. Por exemplo, a característica da célula pode referir a uma característica de componente celular e/ou o modo que a célula, ou um seu componente, responde à radiação de excitação. Por meio de exemplo, a característica de célula pode estar associada com uma organela interna da célula, tal como o tamanho de seu núcleo. Alguns exemplos de características de célula que podem ser empregados incluem, sem limitação, tamanho de célula, uma razão de tamanhos da célula ao longo de diferentes dimensões, co- localização de radiação de fluorescência emitida por dois ou mais marcadores associados com a célula, uma razão dos tamanhos do citoplasma da célula para seu núcleo, um grau de pontuação de radiação fluorescente emitida da célula, uma medida da distribuição espacial da radiação fluorescente, uma medida de localização e/ou orienta-ção da célula, uma medida da excentricidade da célula, uma medida da similaridade da célula para uma célula de referência, uma combinação de um ou mais componentes de Fourier espaciais da célula, uma medida do grau no qual a célula fica em um ponto focal da radiação de iluminação. Deve ser compreendido que os presentes ensinamentos não estão limitados às características enumeradas, mas podem ser utilizados em conexão com qualquer característica adequada da célula.

[0028] Em algumas modalidades, a etapa de processamento é su-ficientemente rápida de modo que uma latência associada com a che- gada na decisão de classificação é menor do que aproximadamente 100 microssegundos, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 10 microssegundos a aproximadamente 100 microssegundos, ou em uma faixa de aproximadamente 20 microssegundos a aproximadamente 80 microssegundos, ou em uma faixa de aproximadamente 30 mi- crossegundos a aproximadamente 50 microssegundos.

[0029] Em algumas modalidades, o feixe ótico está configurado de modo que uma frequência ótica na qual cada uma de uma pluralidade de localizações espaciais dentro da célula é iluminada corresponde a uma diferente das frequências óticas deslocadas em radiofrequência. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, o feixe ótico pode incluir a pluralidade de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados cada um dos quais tem um deslocamento de radiofrequência em relação ao outro.

[0030] Em algumas modalidades, a célula pode ser tingida com pelo menos dois marcadores de fluorescência e a radiação ótica está configurada para obter a radiação fluorescente destes marcadores. A radiação fluorescente pode ser coletada e digitalizada para gerar formas de onda de fluorescência temporais (isto é, formas de onda que indicam a intensidade de fluorescência como uma função de tempo) cada uma correspondendo a um dos marcadores. A etapa de processamento inclui operar sobre as formas de onda para obter uma medida de co-localização dos sinais de fluorescência que correspondem aos marcadores de fluorescência e tomar a decisão de classificação com base na estimativa de co-localização. Especificamente, o método pode incluir aplicar um filtro de passagem alta ou passagem de banda a pelo menos uma das formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda filtrada seguida por uma multiplicação por pontos das formas de onda para gerar uma forma de onda multiplicativa resultante, integrar a forma de onda multiplicativa para obter um valor integrado, e comparar o valor integrado com um limite predefinido para obter uma medida de co-localização. Em algumas modalidades, a determinação de uma medida de co-localização pode incluir aplicar um filtro de passagem alta ou passagem de banda a pelo menos uma das formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda filtrada seguida por uma multiplicação por pontos das formas de onda para gerar uma forma de onda multiplicativa resultante, integrar a forma de onda multiplicativa para obter um valor integrado, subtrair um valor de fundo do valor integrado e escalar o valor resultante por intensidade para gerar um valor finalizado, e comparar o valor finalizado com um limite predefinido para obter uma medida de co-localização. Uma medida de co-localização pode ser empregada para chegar a uma decisão de classificação com relação à célula.

[0031] Em algumas modalidades, a etapa de processamento inclui operar sobre os dados de fluorescência para obter uma estimativa de um tamanho da célula e tomar a decisão de classificação com base no tamanho de célula estimado. Por meio de exemplo, os dados de fluorescência podem ser analisados para obter uma estimativa do tamanho de célula em uma direção de fluxo de célula (isto é, ao longo de uma direção substancialmente paralela à direção de fluxo de célula) em um sistema de citometria de fluxo ou um tamanho lateral da célula (por exemplo, em uma direção ortogonal à direção de fluxo de célula). Em algumas tais modalidades, o tamanho de célula na direção de fluxo de célula pode ser estimado com base em uma duração temporal de um pulso da radiação fluorescente emitida pela célula. Ainda, uma estimativa do tamanho lateral da célula pode ser obtida elevando ao quadrado os dados de fluorescência detectados, aplicando um filtro de passagem de banda nos dados de fluorescência elevados ao quadrado, integrar os dados filtrados, e comparando os dados filtrados com um limite predefinido. Em alguns casos, a etapa de processamento inclui operar sobre os dados de fluorescência para obter uma razão de tamanho de célula ao longo de duas diferentes dimensões e utilizar a razão para tomar a decisão de classificação.

[0032] Em algumas modalidades, uma célula está identificada com dois marcadores de fluorescência um dos quais está acoplado na membrana da célula e o outro no núcleo da célula. A radiação ótica aplicada na célula está configurada para obter fluorescência de ambos os marcadores. Os sinais de fluorescência emitidos por ambos os marcadores são detectados em dois diferentes canais e analisados para obter uma estimativa de uma razão do tamanho do citoplasma em relação àquele do núcleo. Uma decisão de classificação referente a esta célula é feita com base nesta razão.

[0033] Em algumas modalidades, o método inclui obter uma transformada de Fourier dos dados de fluorescência e determinar frequências na transformada diferentes do que as radiofrequências utilizadas para modular a radiação ótica empregada para obter a radiação de fluorescência da célula. Uma soma dos valores de transformada de Fourier nestas diferentes frequências pode ser obtida e comparada com um limite predefinido para tomar a decisão de classificação. Por meio de exemplo, as diferentes frequências podem ser uma ou mais frequências entre aquelas frequências utilizadas para modular a radiação ótica.

[0034] Em um aspecto relativo, um método para classificar células em um sistema de citometria de fluxo está descrito, o qual compreende iluminar uma célula com radiação que tem duas ou mais frequências óticas deslocadas uma da outra por uma ou mais radiofrequências para obter a radiação fluorescente da célula, detectar a radiação fluorescente para gerar dados de fluorescência temporais, e processar os dados de fluorescência temporais para chegar a uma decisão de classificação referente à célula com uma latência igual a ou menor do que aproximadamente 100 microssegundos. Por meio de exemplo, a decisão de classificação pode ser feita com uma latência em uma faixa de aproximadamente 10 microssegundos a aproximadamente 100 mi- crossegundos, ou em uma faixa de aproximadamente 20 microsse- gundos a aproximadamente 80 microssegundos, ou em uma faixa de aproximadamente 30 microssegundos a aproximadamente 50 micros- segundos.

[0035] No método acima, a etapa de processamento pode incluir operar sobre os dados de fluorescência para obter uma estimativa de pelo menos uma característica da célula e tomar a decisão de classificação com base nesta estimativa. Ainda, a etapa de processamento pode incluir analisar a modulação dos dados de fluorescência em uma ou mais frequências de batida associadas com interferência das frequências óticas da radiação ótica de modo a chegar à decisão de classificação.

[0036] Em outro aspecto, um método para classificar células em um sistema de citometria de fluxo está descrito, o qual inclui introduzir uma pluralidade de células, cada uma das quais está associada com pelo menos uma fluoróforo, em uma região de interrogação ótica uma de cada vez em uma taxa maior do que aproximadamente 1000 células por segundo para iluminar cada uma das células com radiação ótica modulada em radiofrequência de modo a obter radiação fluorescente do(s) fluoróforo(s). Para cada célula, a radiação fluorescente emitida da célula é detectara para gerar uma forma de onda de frequência de tempo, e a forma de onda é processada para chegar a uma decisão de classificação referente à célula. O método pode ainda incluir guiar a célula para dentro de um de uma pluralidade de contentores com base nesta decisão de classificação.

[0037] Em outro aspecto, um método para classificar partículas (por exemplo, partículas biológicas tais como células) está descrito, o qual inclui iluminar uma partícula com um feixe ótico modulado em ra-diofrequência de modo a obter qualquer uma de radiação fluorescente e dispersa da partícula, detectar a radiação fluorescente ou dispersa (ou transmitida) que emana da partícula para gerar dados de forma de onda de fluorescência ou dispersão (ou transmissão), e processar qualquer um dos dados de fluorescência e dispersão (ou transmissão) para tomar uma decisão de classificação referente à partícula sem computar uma imagem (isto é, um mapa de intensidade de fluorescência ou dispersão (ou transmitido) pixel por pixel) da partícula com base nos dados. O feixe ótico pode ser, por exemplo, um feixe de laser. Ainda, o feixe ótico pode ter, em algumas modalidades, uma frequência ótica em uma faixa de aproximadamente 300 THz a aproximadamente 1000 THz. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, a modulação de radiofrequência do feixe ótico pode ser conseguida modulando o feixe em radiofrequências em uma faixa de aproximadamente 50 MHz a aproximadamente 250 MHz, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 100 MHz a aproximadamente 200 MHz. Ainda, em algumas modalidades, o feixe ótico modulado em radiofrequência pode incluir uma pluralidade de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados cada um dos quais tem um deslocamento de radiofrequência em relação ao outro. No método acima, a etapa de processamento pode incluir analisar uma ou mais frequências de batida detectada em qualquer uma da radiação fluorescente ou dispersa para chegar na decisão de classificação. As frequências de batida podem corresponder às frequências óticas da radiação ótica que ilumina uma partícula (por exemplo, uma célula).

[0038] Em um aspecto relativo, um sistema para determinar a característica de uma partícula está descrito, o qual inclui um sistema de iluminação para iluminar uma partícula com radiação ótica modulada em radiofrequência, um sistema de detecção para detectar qualquer uma de radiação fluorescente e dispersa que emana da partícula em resposta à dita iluminação para gerar dados de fluorescência ou dispersão, e um módulo de análise em comunicação com o dito sistema de detecção para receber os ditos dados de fluorescência e dispersão e processar os ditos dados para calcular uma estimativa de pelo menos uma característica da partícula. Em algumas modalidades, o módulo de análise pode calcular uma estimativa de pelo menos uma característica da partícula sem formar uma imagem da partícula com base nos ditos dados de fluorescência ou dispersão. Por meio de exemplo, a pelo menos uma característica da partícula pode incluir qualquer um de um tamanho dimensional da partícula, uma razão de tamanhos da partícula ao longo de duas diferentes dimensões, co-localização de radiação de fluorescência emitida por dois ou mais marcadores associados com a partícula, um grau de pontuação de radiação fluorescente emitida da partícula, uma medida da distribuição espacial da radiação fluorescente, uma medida de localização ou orientação da partícula, uma medida de excentricidade da partícula, uma medida da similaridade da partícula para uma partícula de referência, uma combinação de um ou mais componentes de Fourier espaciais da partícula, uma medida do grau no qual a partícula fica em um ponto focal da radiação de iluminação.

[0039] O sistema acima pode ser empregado para obter uma estimativa de pelo menos uma característica de uma variedade de diferentes partículas. Por meio de exemplo, a partícula pode ser qualquer uma de uma célula, uma microvisícula, um fragmento celular, um li- possama, uma gota, e um pequeno organismo. Em algumas modalidades, a partícula é uma célula, e a característica determinada é uma razão de tamanhos do citoplasma e núcleo da célula.

[0040] Em algumas modalidades do sistema acima, o sistema de iluminação pode incluir um feixe ótico que compreende uma pluralida- de de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados que tem frequências óticas separadas uma da outra por pelo menos uma radiofrequência. Em algumas tais modalidades, o sistema de iluminação pode incluir uma fonte para gerar um feixe de laser, um único de- fletor acústico-ótico (AOD) que recebe o dito feixe de laser, e um gerador comb de radiofrequência (RF) para aplicar uma pluralidade de sinais de acionamento de RF para o dito AOD para difratar o dito feixe de laser recebido na dita pluralidade de pequenos feixes angularmente separados.

[0041] Em outro aspecto, um sistema para classificar partículas (por exemplo, partículas biológicas) está descrito, o qual inclui um sistema de iluminação para iluminar uma partícula com radiação modulada em radiofrequência, um sistema de detecção para detectar qualquer uma radiação fluorescente e dispersa (ou transmitida) que emana da partícula em resposta à iluminação para gerar dados de fluorescência ou dispersão (ou dados transmitidos), um módulo de análise em comunicação com o sistema de detecção para receber os dados de fluorescência e/ou dispersão (ou transmissão) e processar os dados para chegar a uma decisão de classificação referente à partícula sem formar uma imagem da partícula com base nos dados de fluorescência e/ou dispersão (ou transmissão), e um atuador capaz de desviar as partículas de seu percurso de fluxo, se necessário, para contentores separados com base na dita decisão de classificação. Em algumas modalidades, a radiação modulada em radiofrequência pode estar na forma de feixe ótico composto de uma pluralidade de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados, cada um dos quais tem um deslocamento de radiofrequência em relação ao outro.

[0042] Uma compreensão adicional de vários aspectos da invenção pode ser obtida por referência à descrição detalhada seguinte em conjunto com os desenhos associados, os quais estão resumidamente abaixo descritos.

Breve Descrição dos Desenhos

[0043] Figura 1 apresenta esquematicamente um sistema de acordo com uma modalidade da invenção,

[0044] Figura 2A é um perfil exemplar, esquemático de um feixe Gaussiano em um plano perpendicular à direção de propagação do feixe,

[0045] Figura 2B é um perfil de feixe top-hat, esquemático obtido passando o feixe Gaussiano mostrado na Figura 2A através de um formador de feixe top-hat e focalizando o feixe de saída do formador de feixe,

[0046] Figura 3 apresenta esquematicamente componentes de um formador de feixe top-hat exemplar,

[0047] Figura 4 apresenta esquematicamente perfis de feixe em seção transversal de uma pluralidade de feixes comb de RF,

[0048] Figura 5 apresenta esquematicamente uma sobreposição dos feixes comb de RF apresentados na Figura 4 e um feixe de LO que tem um perfil de feixe top-hat,

[0049] Figura 6 apresenta esquematicamente o feixe combinado mostrado na Figura 5 iluminando uma amostra sob análise,

[0050] Figura 7 apresenta esquematicamente níveis de energia exemplares de um fluoróforo hipotético,

[0051] Figura 8 apresenta esquematicamente uma curva de absorção que corresponde ao fluoróforo hipotético da Figura 7,

[0052] Figura 9A apresenta esquematicamente um sistema de detecção de acordo com uma modalidade dos presentes ensinamentos, o qual inclui uma fibra ótica para transmissão de radiação de fluorescência,

[0053] Figura 9B apresenta esquematicamente outro sistema de detecção de acordo com uma modalidade dos presentes ensinamen- tos no qual a radiação de fluorescência propaga através de espaço livre para alcançar uma pluralidade de fotodetectores,

[0054] Figura 9C apresenta esquematicamente braços de geração de imagem de um campo brilhante e um campo escuro para utilização em algumas modalidades dos presentes ensinamentos,

[0055] Figura 9D apresenta esquematicamente um sistema de detecção para utilização em algumas modalidades dos presentes ensinamentos, o qual inclui um braço de detecção para gerar uma imagem de um campo brilhante e um braço de detecção o qual integra as capacidades para a detecção de radiação de excitação dispersa de uma amostra assim como radiação de fluorescência emitida pela amostra,

[0056] Figura 10 apresenta esquematicamente que um sinal de fluorescência gerado por um fotodetector em uma modalidade de um sistema de acordo com a presente invenção pode ser amplificado por um amplificador e o sinal amplificado pode ser analisado por um módulo de análise para construir uma imagem de fluorescência de uma amostra sob análise,

[0057] Figuras 11A e 11B apresentam várias etapas em um método de acordo com uma modalidade da presente invenção para análise de sinal de fluorescência obtido iluminando uma amostra com um feixe combinado composto de uma pluralidade de feixes comb de RF e um feixe de LO perfilado top-hat,

[0058] Figura 12 apresenta esquematicamente componentes selecionados de uma implementação de hardware exemplar de um módulo de análise de acordo com uma modalidade de a presente invenção,

[0059] Figuras 13A e 13B apresentam várias etapas em outro método de acordo com uma modalidade da invenção para análise de sinal de fluorescência obtido iluminando uma amostra com um feixe combinado composto de uma pluralidade de feixes comb de RF e um feixe de LO perfilado top-hat,

[0060] Figuras 14A e 14B apresentam várias etapas em ainda outro método de acordo com uma modalidade da invenção para análise de sinal de fluorescência obtido iluminando uma amostra com um feixe combinado composto de uma pluralidade de feixes comb de RF e a feixe de LO perfilado top-hat,

[0061] Figura 15A apresenta esquematicamente a iluminação de uma amostra por um feixe perfilado top-hat em uma única frequência de excitação,

[0062] Figura 15B é uma vista esquemática de um sistema de acordo com uma modalidade dos presentes ensinamentos que permite medições de tempo de vida de fluorescência e formação de imagem de tempo de vida de fluorescência,

[0063] Figura 16A é um fluxograma que apresenta várias etapas para determinar uma estimativa de pelo menos uma característica de uma partícula que flui através de um sistema de citometria de fluxo,

[0064] Figura 16B apresenta esquematicamente um sistema de acordo com uma modalidade para determinar uma estimativa de pelo menos uma característica de uma partícula que flui através de um sistema de citometria de fluxo,

[0065] Figura 16AA é um fluxograma que apresenta várias etapas em um método de acordo com uma modalidade para comutar partículas em um sistema de citometria de fluxo com base em valores de uma ou mais característica de partículas,

[0066] Figura 16C é um fluxograma que apresenta várias etapas em uma modalidade para tomar uma decisão de classificação com base em co-localização de radiação de fluorescência emitida de uma partícula, por exemplo, uma célula, em dois ou mais diferentes canais de frequência,

[0067] Figura 17 apresenta esquematicamente formas de onda de tempo-frequência de fluorescência hipotéticas que correspondem a dois canais e seu produto utilizado no método mostrado no fluxograma da Figura 16,

[0068] Figura 18A mostra imagens de fluorescência de quatro células identificadas como A, B, C, e D, incluindo imagens de fluorescência verde e vermelha obtidas marcando as células com um corante verde e um corante vermelho assim como imagens de campo brilhante, campo escuro,

[0069] Figura 18B mostra o sinal de domínio de tempo de fluorescência verde medido para as células mostradas na Figura 18A,

[0070] Figura 18C mostra o sinal de domínio de tempo de fluorescência vermelha medido para as células mostradas na Figura 18A,

[0071] Figura 18D mostra, para cada célula, uma forma de onda de domínio de tempo de co-localização obtida multiplicando as formas de onda de fluorescência vermelha e verde normalizadas mostradas nas Figuras 18B e 18C e passando a forma de onda resultante através de um filtro de passagem baixa,

[0072] Figura 19 mostra os valores dos sinais filtrados integrados para cada uma das células A, B, C, e D (a linha tracejada nesta figura representa o limite de classificação),

[0073] Figura 20 é um fluxograma que apresenta várias etapas em uma classificação de célula com base em um tamanho de célula de acordo com uma modalidade de a presente invenção,

[0074] Figura 21A apresenta esquematicamente uma célula hipotética iluminada por um feixe hipotético que compreende uma pluralidade de pequenos feixes modulados em radiofrequência,

[0075] Figura 21B apresenta esquematicamente uma forma de onda de fluorescência hipotética obtida da célula iluminada mostrada na Figura 21A assim como uma forma de onda obtida elevando ao quadrado a forma de onda de fluorescência,

[0076] Figura 22 é um fluxograma que apresenta várias etapas em um método para classificar células com base na razão de aspecto da célula,

[0077] Figura 23A é um fluxograma que apresenta várias etapas em um método para estimar a razão do tamanho de um núcleo da célula e do citoplasma da célula,

[0078] Figura 23B é um fluxograma que apresenta várias etapas em um método para classificar células com base na razão estimada do tamanho de um núcleo da célula e do citoplasma da célula,

[0079] Figura 24A é um fluxograma que apresenta várias etapas em um método para estimar granularidade celular de radiação de fluorescência emitida de células,

[0080] Figura 24B é um fluxograma que apresenta várias etapas em um método para classificar células com base em estimar a granu- laridade celular de radiação de fluorescência emitida das células,

[0081] Figura 25 mostra esquematicamente frequências de modulação utilizadas para modular um feixe ótico empregado no método descrito no fluxograma da Figura 24 para obter radiação de fluorescência das células,

[0082] Figura 26 apresenta esquematicamente um sistema de classificação que incorpora os presentes ensinamentos para classificar células,

[0083] Figura 27 apresenta esquematicamente uma implementação exemplar do módulo de análise / controle empregado no sistema da Figura 26,

[0084] Figura 28 é um fluxo que apresenta várias etapas em um método exemplar para determinar uma característica ou uma partícula e utilizando esta característica para tomar uma decisão de classificação de acordo com uma modalidade, e

[0085] Figura 29 é um gráfico de dispersão de momentos centrais de segunda ordem vertical e horizontal para uma pluralidade de célu- las.

Descrição Detalhada

[0086] Os presentes ensinamentos referem-se geralmente métodos e sistemas para determinar uma ou mais características de partículas, tais como células, em um citômetro de fluxo, e utilizar estas características em algumas modalidades para classificar as partículas. Em modalidades abaixo discutidas, os métodos empregam processadores de computador para sua implementação. Vários termos abaixo utilizados para descrever os presentes ensinamentos têm seu significado comum na técnica, a menos declarado de outro modo. Por exemplo, o termo "fluoróforo" é aqui utilizado consistente com o seu significado costumeiro na técnica para referir a um composto químico fluorescente que pode emitir radiação em resposta à iluminação por radiação de excitação.

[0087] Os termos "citometria" e "citometria de fluxo" são também consistentes com seus significados costumeiros na técnica. Especifi-camente, o termo "citometria" pode referir a uma técnica para identificar e/ou classificar ou de outro modo analisar células. O termo "cito- metria de fluxo" pode referir a uma técnica citométrica na qual as células presentes em um fluxo de fluido podem ser identificadas, e/ou classificadas, ou de outro modo analisadas, por exemplo, identificando-as com marcadores fluorescentes e detectar os marcadores fluorescentes através de excitação radiativa. Os termos "aproximadamente" e "substancialmente" como aqui utilizados para denotar uma variação máxima de 10%, ou 5%, com relação a uma propriedade que inclui valores numéricos.

[0088] Os ensinamentos da presente invenção para determinar características de partículas, tais como células, e classificar as partículas podem ser implementados em uma variedade de diferentes modos. Os dados de fluorescência e/ou dispersão empregados para tomar de- cisões de classificação podem ser obtidos utilizando uma variedade de sistemas. Em algumas modalidades, a partícula é iluminada por um feixe ótico que tem uma pluralidade de radiofrequência pequenos feixes deslocados em radiofrequência e a fluorescência de partícula é coletada e analisada de acordo com os presentes ensinamentos para tomar uma decisão de classificação. Alguns exemplos de tais sistemas para obter dados de fluorescência de partículas nos quais os presentes ensinamentos podem ser incorporados estão abaixo descritos seguidos por uma descrição detalhada de métodos e sistemas para classificar partículas de acordo com os presentes ensinamentos.

[0089] Por meio de exemplo, a Figura 1 apresenta esquematicamente um sistema 10 para executar citometria no qual os presentes ensinamentos para classificar partículas podem ser incorporados. O sistema 10 pode ser operado em três modos operacionais. Como abaixo discutido em mais detalhes, em um modo operacional, uma amostra sob estudo pode ser iluminada concorrentemente com uma pluralidade de frequências de excitação, cada uma das quais pode ser obtida, por exemplo, deslocando a frequência central de um feixe de laser. Mais especificamente, uma pluralidade de localizações de amostra pode ser concorrentemente iluminada por um feixe de laser que é gerado misturando um feixe de laser de referência (aqui também referido como um feixe de oscilador local) com uma pluralidade de feixes de laser deslocados em radiofrequência de modo que cada localização de amostra seja iluminada pelo feixe se referência e um dos feixes deslocados em radiofrequência para excitar um fluoróforo de interesse naquela localização, se presente. Em algumas modalidades, o feixe se referência pode este próprio ser gerado através de deslocamento de radiofrequência de um feixe de laser. Assim, cada localização espacial da amostra pode ser "sinalizada" com uma diferente frequência de batida que corresponde a uma diferença entre a frequência do feixe se referência e aquela de um dos feixes deslocados em radiofrequência. Em outras palavras, a radiação de fluorescência emitida pelo fluoróforo codificará espacialmente as frequências de batida. A emissão de fluo-rescência pode ser detectada e seus componentes de frequência podem ser analisados para construir uma imagem de fluorescência da amostra.

[0090] Em outro modo operacional, uma amostra pode ser iluminada sucessivamente sobre um intervalo de tempo por um feixe de laser em uma pluralidade de frequências de excitação. Em algumas tais modalidades, as frequências de excitação podem ser obtidas aplicando um sinal de acionamento variável no tempo a um defletor acústico-ótico (AOD), o qual recebe um feixe de laser. Em muitas modalidades, o feixe de laser tem uma frequência na faixa de centenas de terahertz (THz), por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 300 THz a aproximadamente 1000 THz. O sinal de acionamento aplicado no AOD está tipicamente na faixa de radiofrequência, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 10 MHz a aproximadamente 250 MHz. A passagem do feixe de laser através do AOD gera uma pluralidade de feixes difratados, cada um correspondendo a uma diferente ordem de difração. Apesar do feixe difratado zero não exibir nenhum deslocamento de frequência em relação à frequência do feixe de laser de entrada, os feixes difratados de ordem mais alta exibem um deslocamento de frequência em relação à frequência do feixe de laser de entrada que corresponde à frequência do sinal de acionamento ou um seu múltiplo. Em algumas modalidades, a feixe difratado de primeira ordem que tem uma frequência que corresponde à frequência do feixe de laser de entrada deslocado pelo sinal de acionamento é empregado como o feixe de excitação para excitar um fluoróforo de interesse, se presente em uma amostra sob análise. Como o sinal de acionamento varia ao longo do tempo, a frequência e deslocamento angular do feixe difratado de primeira ordem também varia, por meio disto permitindo a iluminação da amostra em diferentes frequências de excitação em diferentes localizações. A emissão de fluorescência, se existir, de cada localização iluminada pode ser coletada e analisada para construir uma imagem de fluorescência da amostra.

[0091] Em ainda outro modo operacional, o sistema 10 pode ser operado para iluminar uma pluralidade de localizações de uma amostra concorrentemente por uma única frequência de excitação, a qual pode ser gerada, por exemplo, deslocando a frequência central de um feixe de laser por uma radiofrequência. Por exemplo, a extensão horizontal da amostra pode ser iluminada por um feixe de laser em uma única frequência de excitação. A radiação de fluorescência detectada pode ser utilizada para analisar o conteúdo de fluorescência da amostra, por exemplo, uma célula / partícula.

[0092] Assim, uma vantagem do sistema 10, entre outras abaixo discutidas, é que este provê uma significativa flexibilidade em obter dados de emissão de fluorescência em diferentes modos sem uma necessidade de utilizar diferentes instrumentos ou fazer quaisquer modificações mecânicas no sistema quando mudando entre diferentes modos operacionais.

[0093] Em certas modalidades, os sistemas incluem uma ou mais fontes de luz. Em alguns casos, a fonte de luz é uma fonte de luz de banda estreita, que inclui mas não limitada a um LED de comprimento de onda estreito, laser ou uma fonte de luz de banda larga acoplada a um ou mais filtros de passagem de banda óticos, grades de difração, monocromadores ou qualquer sua combinação os quais em combinação produzem uma banda estreita de luz de iluminação. Em certos casos, a fonte de luz é um laser de único comprimento de onda, tal como um laser de diodo de único comprimento de onda (por exemplo, um laser de 488 nm). Em algumas modalidades, os sistemas em obje- to incluem uma única fonte de luz (por exemplo, um laser). Em outras modalidades, os sistemas em objeto incluem duas ou mais diferentes fontes de luz, tal como 3 ou mais diferentes fontes de luz, tal como 4 ou mais diferentes fontes de luz e incluindo 5 ou mais diferentes fontes de luz. Por exemplo, os sistemas podem incluir uma primeira fonte de luz (por exemplo, um laser) que emite um primeiro comprimento de onda e uma segunda fonte de luz que emite um segundo comprimento de onda. Em outras modalidades, os sistemas incluem uma primeira fonte de luz que emite um primeiro comprimento de onda, uma segunda fonte de luz que emite um segundo comprimento de onda e uma terceira fonte de luz que emite um terceiro comprimento de onda.

[0094] Cada fonte de luz pode ter um comprimento de onda o qual varia de 300 nm a 1000 nm, tal como de 350 nm a 950 nm, tal como de 400 nm a 900 nm e incluindo de 450 nm a 850 nm. Em certas modalidades, a fonte de luz tem um comprimento de onda que corresponde a uma absorção máxima de um ou mais fluoróforos (como abaixo descrito). Por exemplo, a fonte de luz pode emitir luz que tem um comprimento de onda que está na faixa de um ou mais de 280- 310 nm, 305-325 nm, 320-350 nm, 340-375 nm, 370-425 nm, 400-450 nm, 440- 500 nm, 475-550 nm, 525-625 nm, 625-675 nm e 650-750 nm. Em certas modalidades, cada fonte de luz emite luz que tem um comprimento de onda que é selecionado de 348 nm, 355 nm, 405 nm, 407 nm, 445 nm, 488 nm, 640 nm e 652 nm.

[0095] O sistema 10 inclui uma fonte de radiação de laser 12 que gera um feixe de laser 14. Por meio de exemplo, o feixe de laser pode ter uma frequência em uma faixa de aproximadamente 1000 THz a aproximadamente 300 THz, que corresponde a um comprimento de onda de vácuo em uma faixa de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 1000 nm. O diâmetro de feixe do feixe de laser (por exemplo, a cintura de feixe quando um Feixe de laser Gaussiano é empregado) pode estar, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm. Sem nenhuma perda de generalidade, nesta modalidade o laser 12 emite radiação em um comprimento de onda de 488 nm com um diâmetro de feixe de aproximadamente 1 mm.

[0096] A frequência do feixe de laser pode ser selecionada com base em uma aplicação(ões) específica(s) para a qual o sistema está destinado. Especificamente, como abaixo discutido em mais detalhes, a frequência de laser pode ser adequada para excitar uma transição eletrônica de um fluoróforo de interesse, por exemplo, através de absorção da radiação, de modo a fazer com que o fluoróforo emita radiação de fluorescência em uma frequência mais baixa. Uma variedade de fontes de laser pode ser empregada. Alguns exemplos de tais fontes de laser incluem, sem limitação, Sapphire 488-SF, comercializada por Coherent, Inc. of Santa Clara, CA U.S.A., Genesis MX-488-1000- STM (Coherent, Inc.), OBIS 405-LX (Coherent, Inc.), Stadus 405-250 comercializada por Vortran Laser Technology, Inc. of Sacramento, CA U.SA., e LQC-660-110 of Newport Corporation of Irvine, CA U.S.A. Sem nenhuma perda de generalidade, na presente modalidade o feixe de laser é assumido ter um perfil de intensidade Gaussiano em um plano perpendicular para sua direção de propagação.

[0097] Um espelho 16 recebe o feixe de radiação de laser 14 e direciona o feixe de laser através de reflexão para um defletor acústico-ótico (AOD) 18. Nesta modalidade, o AOD 18 está montado sobre um suporte de prendedor de poste ajustável (A) que permite a rotação do AOD ao redor de um eixo geométrico perpendicular à direção de propagação do feixe 14. Um sintetizador digital direto (DDS) 20 que opera sob o controle de um controlador 21 pode aplicar um ou mais sinais de acionamento ao AOD 18. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, estes sinais de acionamento podem abranger uma faixa de frequência de aproximadamente 50 MHz a aproximadamente 250 MHz. Por exemplo, os sinais de acionamento aplicados ao AOD podem variar de aproximadamente 55 MHz a aproximadamente 255 MHz, tal como de aproximadamente 60 MHz a aproximadamente 200 MHz, tal como de aproximadamente 65 MHz a aproximadamente 175 MHz, tal como de aproximadamente 70 MHz a aproximadamente 150 MHz e incluindo de aproximadamente 75 MHz a aproximadamente 125 MHz. Em algumas modalidades, os sinais de acionamento podem ser separados uns dos outros por uma frequência em uma faixa de apro-ximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 4 MHz. Por exemplo, os sinais de acionamento podem ser separados uns dos outros por uma frequência de aproximadamente 0,2 MHz a aproximadamente 3,9 MHz, tal como de aproximadamente 0,3 MHz a aproximadamente 3,8 MHz, tal como de aproximadamente 0,4 MHz a aproximadamente 3,7 MHz, tal como de aproximadamente 0,5 MHz a aproximadamente 3,6 MHz e incluindo de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente 3,5 MHz. Nesta modalidade, um amplificador de potência eletrônico 21' amplifica os sinais de radiofrequência gerados pelo DDS 20 para aplicação ao AOD 18.

[0098] No modo operacional no qual uma amostra é iluminada concorrentemente com uma pluralidade de frequências de excitação, o gerador comb de RF 20 aplica uma pluralidade de sinais de acionamento de RF concorrentemente ao AOD 18. Por meio de exemplo, o número de sinais de acionamento de RF simultaneamente aplicados pode estar em uma faixa de aproximadamente 20 a aproximadamente 200. A interação do feixe de laser e dos sinais de acionamento resulta na geração de uma pluralidade de feixes de laser angularmente separados cada um tendo um deslocamento de frequência que corresponde a um dos sinais de acionamento relativo à frequência do feixe de laser gerada pelo laser 12. Sem ser limitado a nenhuma teoria especí- fica, em um AOD, um transdutor piezoelétrico pode gerar fônos de ra-diofrequência em um cristal, por exemplo, um cristal de quartzo, e a dispersão dos fótons óticos do feixe de laser por tais fônos de radio-frequência pode resultar na geração de feixes de laser deslocados em frequência. Um destes feixes deslocados em frequência 22 é aqui referido como um feixe de "oscilador local" (LO) e o restante dos feixes deslocados em frequência 24 são aqui referidos como "feixes comb de RF". A separação angular dos feixes deslocados em frequência pode ser, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 1 milirradiano a aproximadamente 100 milirradianos. Por exemplo, a separação angular dos feixes deslocados em frequência pode variar de 2 milirradianos a aproximadamente 95 milirradianos, tal como de 3 milirradianos a aproximadamente 90 milirradianos, tal como de 4 milirradianos a apro-ximadamente 85 milirradianos, tal como de 5 milirradianos a aproxi-madamente 80 milirradianos e incluindo de 10 milirradianos a aproxi-madamente 75 milirradianos.

[0099] Os feixes de LO e comb de RF passam através de uma 26, a qual é nesta modalidade uma lente positiva com um comprimento focal de aproximadamente 50 mm. Após a passagem através da lente 26, o feixe de laser de LO é interceptado por um espelho 28, o qual redireciona o feixe de LO em uma diferente direção (nesta modalidade em uma direção substancialmente ortogonal à direção de propagação original do feixe de LO). O espelho 28 está posicionado em relação aos feixes comb de RF de modo que estes feixes não atingem o espelho 28 e propagam para uma lente 30 (a qual nesta modalidade tem um comprimento focal de 200 mm). Neste modo, o feixe de LO e os feixes comb de RF são direcionados ao longo de diferentes direções de propagação. A utilização do espelho de capitação 28 em um modo acima descrito permite utilizar um único AOD para gerar tanto o feixe de LO quanto os feixes comb de RF e combina-los em um modo abai- xo discutido para gerar um feixe de excitação para iluminar uma amostra. A utilização de um único AOD, ao invés de múltiplos AODs (por exemplo, dois AODs, um para gerar o feixe de LO e o outro para gerar os feixes comb de RF), simplifica o projeto do sistema e ainda permite uma utilização eficiente do sistema em múltiplos distintos modos operacionais, como abaixo discutido em mais detalhes.

[00100] Em algumas modalidades, o perfil de feixe do feixe de LO é modificado antes de recombinar com os feixes comb de RF. Por exemplo, o perfil de feixe do feixe de LO pode ser ajustado (aumentado ou diminuído) em dimensão espacial, forma de feixe, intensidade, distribuição espacial de feixe, ou qualquer sua combinação. Em certas modalidades, as dimensões espaciais do perfil de feixe do feixe de LO são modificadas. Por exemplo, o perfil de feixe pode ser ajustado para alongar o perfil de feixe em uma ou mais dimensões, tal como ao longo de um eixo geométrico que é ortogonal ao eixo geométrico longitudinal de uma corrente de fluxo. Em um exemplo de acordo com estas modalidades, a dimensão espacial (por exemplo, em uma ou mais dimensões) do perfil de feixe pode ser aumentada por 1% ou mais, tal como por 2% ou mais, tal como por 3% ou mais, tal como por 5% ou mais, tal como por 10% ou mais, tal como por 25% ou mais, tal como por 50% ou mais, tal como por 75% ou mais, tal como por 90% ou mais, tal como por 1,5 vezes ou mais, tal como por 2 vezes ou mais, tal como por 3 vezes ou mais e incluindo por 5 vezes ou mais. Em outro exemplo de acordo com estas modalidades, a dimensão espacial (por exemplo, em uma ou mais dimensões) do perfil de feixe pode ser diminuída por 1% ou mais, tal como por 2% ou mais, tal como por 3% ou mais, tal como por 5% ou mais, tal como por 10% ou mais, tal como por 25% ou mais, tal como por 50% ou mais, tal como por 75% ou mais, tal como por 90% ou mais, tal como por 1,5 vezes ou mais, tal como por 2 vezes ou mais, tal como por 3 vezes ou mais e incluindo por 5 vezes ou mais.

[00101] Em outras modalidades, a forma de feixe doe feixe de LO é modificada. Por exemplo, a forma de feixe pode ser modificada para alongar o perfil de feixe em uma ou mais dimensões. Em certos casos, a forma de feixe do feixe de LO é alongada em um plano perpendicular à direção de propagação do feixe de LO. Em certas modalidades, a forma do perfil de feixe de LO é mudada de um perfil de feixe circular para um perfil de feixe oval que é alongado em um eixo geométrico ortogonal ao eixo geométrico longitudinal da corrente de fluxo. Em outras modalidades, a forma do perfil de feixe de LO é mudada de um perfil de feixe circular para um perfil de feixe retangular que tem uma dimensão longa em um eixo geométrico ortogonal ao eixo geométrico longitudinal da corrente de fluxo. Em ainda outras modalidades, a intensidade do feixe de LO é modificada. Por exemplo, a intensidade do feixe de LO pode ser aumentada, tal como por 1% ou mais, tal como por 2% ou mais, tal como por 3% ou mais, tal como por 5% ou mais, tal como por 10% ou mais, tal como por 25% ou mais, tal como por 50% ou mais, tal como por 75% ou mais, tal como por 90% ou mais, tal como por 1,5 vezes ou mais, tal como por 2 vezes ou mais, tal como por 3 vezes ou mais e incluindo por 5 vezes ou mais. Em certas modalidades, a intensidade do feixe de LO é modificada para coincidir com a intensidade do feixe comb de RF. Por exemplo, o feixe de LO pode ter uma intensidade que difere da intensidade dos feixes comb de RF por 10% ou menos, tal como por 9% ou menos, tal como por 8% ou menos, tal como por 7% ou menos, tal como por 6% ou menos, tal como por 5% ou menos, tal como por 4% ou menos, tal como por 3% ou menos, tal como por 2% ou menos, tal como por 1% ou menos, tal como por 0,01% ou menos e incluindo onde a intensidade do feixe de LO difere dos feixes comb de RF por 0,001% ou menos. Em certos casos, as intensidades do feixe de LO e dos feixes comb de RF são idênticas.

[00102] Em ainda outras modalidades, a distribuição espacial do perfil de feixe pode também ser modificada. Por exemplo, o feixe de LO pode ser modificado de modo que a intensidade do feixe de LO não é mais Gaussiana em uma ou mais dimensões. Por exemplo, o feixe de LO pode ser modificado para ter uma distribuição Gaussiana ao longo de um primeiro eixo geométrico que é paralelo ao eixo geométrico longitudinal da corrente de fluxo e não Gaussiana ao longo de um segundo eixo geométrico que é ortogonal ao eixo geométrico longitudinal da corrente de fluxo.

[00103] Qualquer protocolo de formação de feixe pode ser empregado para modificar o perfil de feixe do feixe de LO, incluindo mas não limitado a protocolos de formação de feixe refrativos e difrativos. Em algumas modalidades, o feixe de LO é modificado por um formador de feixe top-hat.

[00104] Nesta modalidade, o feixe de LO propaga para outra lente positiva 32 (a qual nesta modalidade tem um comprimento focal de aproximadamente 200 mm). A combinação da lente 26 e da lente 32 amplia e colima o feixe de LO de modo a apropriadamente preencher a abertura traseira de um formador de feixe top-hat 34. Mais especificamente, o feixe de LO 22 passa através da lente 32 e é refletido pelos espelhos 33 e 35 para o formador de feixe top-hat 34.

[00105] O formador de feixe top-hat 34 forma a frente de fase do feixe de LO Gaussiano para permitir a formação de um perfil de intensidade top-hat. Mais especificamente, o feixe de laser LO 22' que sai do formador de feixe top-hat é refletido por um divisor de feixe 44 e é focalizado pela lente 46 (a qual nesta modalidade tem um comprimento focal de 100 mm) por sobre um plano de imagem intermediário 48. O feixe de laser sobre o plano de imagem intermediário 48 tem um perfil de intensidade top-hat ao longo de uma direção horizontal em um plano perpendicular à direção de propagação do feixe. Similar ao AOD 18, nesta modalidade, o divisor de feixe 44 está montado sobre um suporte de prendedor de poste ajustável (B). Nesta modalidade, o formador de feixe top-hat gera um perfil de feixe top-hat no qual a polarização de radiação é substancialmente uniforme ao longo da direção top-hat do feixe (ao longo da direção horizontal nesta modalidade).

[00106] Por meio de ilustração, a Figura 2A apresenta esquematicamente o perfil de intensidade Gaussiano do LO feixe de laser conforme este entra no formador de feixe top-hat. Como mostrado esquematicamente na Figura 2B, sobre o plano de imagem intermediário 48, o feixe de laser de LO exibe um perfil de feixe que está distendido na direção horizontal (em uma direção perpendicular à página nesta ilustração) e é substancialmente constante ao longo de cada linha horizontal que estende através do perfil, por exemplo, a linha horizontal A, mas varia verticalmente de acordo com um perfil Gaussiano.

[00107] Uma variedade de formadores de feixe top-hat pode ser empregada. Por meio de exemplo, elementos óticos refrativos que têm uma superfície asférica ou elementos óticos difrativos podem ser utilizados para produzir feixes com frentes de fase espacial apropriadas, os quais, após focalização por uma lente, produzirão um padrão de perfil top-hat no plano focal da lente. Múltiplos fatores de forma existem para tais formadores de feixe top-hat, e uma variedade de implementações desta proposta está disponível para criar a forma de feixe de LO apropriada na amostra em várias modalidades dos presentes ensinamentos. Por exemplo, Patente U.S. Número 6.295.168 intitulada "Sistema ótico refrativo que converte um feixe de laser para um feixe de topo plano colimado" e Patente U.S. Número 7.400.457 intitulada "formador de feixe de topo plano retangular", ambas as quais estão aqui incorporadas por referência em suas totalidades, descrevem sistemas de formação de feixe que podem ser empregados como o for- mador de feixe de topo plano em um sistema de acordo com algumas modalidades dos presentes ensinamentos. Por meio de ilustração, A Figura 3 é uma reprodução da Figura 1 da Patente U.S. Número 7.400.457 (com diferentes números de referência) que apresenta esquematicamente um sistema de formação de feixe 300 para prover um feixe quadrado ou um retangular, o qual inclui duas lentes acilíndricas ortogonalmente dispostas 302 e 304. A primeira lente acilíndrica 302 é para formar um feixe incidente A ao longo do eixo geométrico X e a segunda lente acilíndrica 304 para formar o feixe incidente A ao longo do eixo geométrico Y. As duas lentes acilíndricas cruzadas estão adaptadas para prover um feixe se laser retangular resultante B que tem um perfil de topo plano ao longo do eixo geométrico X. A superfície de entrada 302a da lente acilíndrica 302 é uma superfície acilíndri- ca convexa que tem um raio de curvatura variável que é menor no centro da superfície e aumenta uniformemente na direção de ambas as extremidades X da lente. A segunda lente acilíndrica 304 é similar à primeira lente acilíndrica mas está ortogonalmente disposta em relação à lente 302 de modo a formar o feixe ao longo do eixo geométrico Y. Os perfis de superfícies de entrada 302a/304a, e superfícies de saída 302b/304b das lentes 302 e 304 podem ser independentemente selecionados como uma função dos perfis X e Y do feixe incidente A e o perfil de intensidade desejado do feixe retangular resultante B (Ver, por exemplo, colunas 5 e 6 da patente).

[00108] Um exemplo de um formador de feixe top-hat comercialmente disponível que pode ser empregado inclui, por exemplo, DTH- lD-0.46deg-4mm comercializado por Osela, Inc. of Lachine, Canada.

[00109] Como abaixo discutido em mais detalhes, a utilização de um formador de feixe para distender o feixe de LO ao longo da direção horizontal provê um número de vantagens. Por exemplo, esta pode assegurar que a combinação do feixe de LO e dos feixes comb de RF ilumina uma pluralidade de localizações de amostra com uma intensidade de iluminação substancialmente similar, de modo a coincidir as intensidades dos feixes de LO e comb de RF através da totalidade das localizações de amostra, por meio disto criando uma modulação de amplitude de intensidade do sinal de fluorescência com alta profundidade de modulação. Na ausência de tal coincidência de intensidade, o sistema de formação de imagem pode ter uma pequena visão e pode não utilizar todas as frequências (pixels) que aciona o AOD. Como a profundidade de modulação do sinal de fluorescência desempenha um importante papel na capacidade do sistema reconstruir uma imagem de fluorescência da amostra, uma profundidade de modulação uniformemente alta das frequências de batida de excitação em todos os pixels é especificamente vantajosa para a operação do sistema. Ainda, as amplitudes de sinais eletrônicos aplicados ao AOD para gerar os feixes comb de RF podem ser ajustadas controlando a saída do sinte- tizador digital direto (por exemplo, empregando o controlador 21) de modo a equalizar os feixes comb de RF de modo que suas intensidades sejam iguais àquela do feixe de LO através de todas as localizações espaciais nas quais os feixes comb de RF e o feixe de LO sobrepõem. Esta característica provê uma vantagem em que esta assegura uma alta profundidade de modulação da modulação de amplitude de intensidade da radiação de fluorescência.

[00110] Referindo novamente à Figura 1, os feixes comb de RF 24 têm imagens formadas através da combinação das lentes 26 e 30 por sobre um plano de imagem intermediário 38. Mais especificamente, os feixes comb de RF 24 passam através da lente 26 e não atingem o espelho 28 para alcançar a lente 30, a qual direciona os feixes comb de RF através de espelhos 40 e 42 para o plano de imagem intermediário 38.

[00111] A Figura 4 apresenta esquematicamente a distribuição de um número exemplar de feixes comb de RF no plano de imagem intermediário 38 (sem perda de generalidade, o número de feixes comb de RF é selecionado para ser 6 para propósitos de ilustração (identificadas como RF1, ... , RF6), apesar de que outros números podem também ser empregados). Como mostrado na Figura 4, no plano de imagem intermediário 38, os feixes comb de RF 24 estão espacialmente separados uns dos outros ao longo da direção horizontal. Em outras modalidades, dois ou mais dos feixes comb de RF 24 podem parcialmente sobrepor. Assim, a combinação das lentes 26 e 30 transforma feixes comb de RF angularmente separados em um conjunto de feixes espacialmente separados que abrangem sobre uma extensão horizontal.

[00112] Referindo novamente à Figura 1, como acima discutido, o divisor de feixe 44 recebe o feixe de laser 22' que sai do formador de feixe top-hat 34 e reflete este feixe para a lente 46, a qual por sua vez focaliza o feixe sobre o plano de imagem intermediário 48 no qual o feixe de LO exibe um perfil de feixe top-hat. O divisor de feixe também recebe os feixes comb de RF 24 do plano de imagem intermediário 38 e permite a passagem dos feixes comb de RF através do mesmo. A lente 46 focaliza os feixes comb de RF 24 por sobre o plano de imagem intermediário 48 para serem combinados com o feixe de LO que tem um perfil de feixe top-hat para gerar um feixe combinado 49.

[00113] Por meio de ilustração, a Figura 5 apresenta esquematicamente um perfil exemplar do feixe combinado 49 em um plano perpendicular ao seu eixo geométrico de propagação. O perfil de intensidade do feixe combinado é gerado como uma sobreposição do perfil de intensidade do feixe de LO top-hat (mostrado esquematicamente pelo quadrado) e aqueles dos feixes comb de RF 24 (cada um mostrado esquematicamente por um dos círculos). Como abaixo discutido em mais detalhes, esta sobreposição do feixe de LO e dos feixes comb de RF provê, ao longo de uma extensão horizontal, uma pluralidade de frequências de batida cada uma correspondendo a uma localização espacial ao longo daquela extensão horizontal. Quando iluminando uma extensão horizontal de uma amostra, a radiação de fluorescência emitida de uma localização da amostra codifica, através de modulação de amplitude, a frequência de batida associada com radiação que ilumina aquela localização.

[00114] Referindo novamente à Figura 1, uma lente positiva 50 (lente de 200 mm nesta modalidade) e uma lente de objetiva 52, montada nesta modalidade sobre um suporte de prendedor de poste ajustável C, formam um telescópio para transferir a imagem no plano intermediário 48 por sobre uma amostra que flui através de uma célula de fluxo 54. Nesta modalidade, um espelho 56 reflete o feixe combinado 49 para a lente 50, e um espelho dicroico 58 reflete o feixe de luz combinado após a sua passagem através da lente 50 na direção da lente de objetiva 52.

[00115] Como mostrado esquematicamente na Figura 6, o feixe combinado 49 concorrentemente ilumina uma pluralidade de localizações espaciais 60 de uma amostra 62 que flui através da célula de fluxo 54. Assim, cada localização 60 é iluminada pela sobreposição de um dos feixes comb de RF com uma porção do feixe de laser de LO em forma de top-hat. Nestas localizações espaciais, a radiação excitará um fluoróforo de interesse na amostra, se presente. Mais especificamente, nesta modalidade, o feixe de LO e os feixes comb de RF excitam concorrentemente o fluoróforo, por exemplo, através causando uma sua transição eletrônica para um estado eletrônico excitado, em uma pluralidade de localizações de amostra 60.

[00116] Em algumas modalidades, a amostra pode incluir um fluido que flui, no qual uma pluralidade de células é arrastada. Em alguns casos, as células podem ser identificadas com um ou mais marcado- res fluorescentes (fluoróforos). Alguns exemplos de marcadores fluo-rescentes incluem, sem limitação, proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP, YFP, RFP), anticorpos identificados com fluoróforos (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína) (FITC), ficoeritrina (PE), alofi- cocianina (APC)), manchas de ácido nucleico (por exemplo, 4',6- diamidino-2-fenilindole (DAPI), SYT016, iodeto de propídio (PI)), manchas de membrana de células (por exemplo, FMI-43), e corantes da função célula (por exemplo, Fluo-4, Indo-1). Em outros casos, fluorófo- ros endógenos presentes em células podem ser empregados para obter radiação fluorescente das células. Como abaixo discutido em mais detalhes, tais fluoróforos exógenos ou endógenos são submetidos à excitação eletrônica em resposta à radiação de iluminação e emitem radiação fluorescente (tipicamente em uma frequência mais baixa do que a frequência de excitação), a qual é coletada e analisada.

[00117] Por meio de ilustração e sem ser limitado a nenhuma teoria específica, a Figura 7 mostra níveis de energia hipotéticos que corresponde a um estado eletrônico de terra A assim como dois estados eletrônicos excitados B e C de um fluoróforo. O fluoróforo pode ser excitado de seu estado eletrônico de terra (A) para o estado eletrônico excitado (B) através de absorção de energia de radiação. O fluoróforo pode então relaxar no estado excitado inferior B, por exemplo, através de uma transição sem radiação mediada por modos vibracionais do fluoróforo. O fluoróforo pode adicionalmente relaxar do estado eletrônico inferior C para o estado de terra, através de uma transição ótica, por meio disto emitindo radiação de fluorescência em uma frequência menor que aquela da frequência de excitação. Deve ser compreendido que este exemplo hipotético está provido somente para propósitos de ilustração, e não indica o único mecanismo pelo qual a radiação de fluorescência pode ser emitida.

[00118] Em muitos casos, o fluoróforo pode absorver radiação ele- tromagnética sobre uma faixa de frequências para ser excitado do estado de terra para o estado eletrônico excitado. Por meio de ilustração, a Figura 8 mostra uma curva de absorção para o fluoróforo hipotético discutido em conexão com a Figura 7. Em uma implementação de uma modalidade de acordo com os presentes ensinamentos a frequência de LO pode ser selecionada para coincidir com a frequência que corresponde à absorção de pico de um fluoróforo de interesse. Os feixes deslocados em radiofrequência podem ter frequências separadas da absorção de pico por suas respectivas frequências de batida. Tipicamente, estas separações de frequência são pequenas em comparação com a largura de banda de absorção do fluoróforo de modo a evitar qualquer degradação da frequência de excitação. Por meio de exemplo e somente por meio de ilustração, as linhas tracejadas A e B apresentam esquematicamente a frequência do feixe de LO e um dos feixes comb de RF (as figuras não estão desenhadas em escala para facilidade de descrição). A iluminação concorrente de uma localização espacial da amostra tanto pelo feixe de laser de LO quando um dos feixes comb de RF apresentados resulta em radiação de fluorescência exibindo uma modulação de amplitude em uma frequência de batida que corresponde a uma diferença entre as frequências de feixe de LO e comb de RF.

[00119] Novamente por meio de ilustração e sem ser limitado a nenhuma teoria específica, o campo elétrico aplicado ao fluoróforo através de sua iluminação concorrente pelo feixe de LO e um dos feixes comb de RF pode ser matematicamente definido como segue:

[00120] em que,

[00121] Ecom denota o campo elétrico do feixe combinado,

[00122] ERF denota a amplitude do campo elétrico associado com um dos feixes comb de RF,

[00123] ELO denota a amplitude do campo elétrico associado com o feixe de LO,

[00124] wo denota a frequência do feixe de laser gerado pelo laser 12,

[00125] WRF denota o deslocamento de frequência associado com o feixe comb de RF, e

[00126] WLO denota o deslocamento de frequência associado com o feixe de LO.

[00127] A intensidade da radiação de fluorescência emitida em resposta à uma sobreposição dos campos elétricos dos feixes LO e comb de RF exibiria uma modulação em uma frequência de batida que corresponde a (WRF - WLO). Com isto, a radiação de fluorescência que emana de cada localização espacial da amostra iluminada por sobreposição do feixe de LO e um dos feixes comb de RF exibe uma modulação em uma frequência de batida que corresponde à diferença entre o deslocamento de radiofrequência associado com o feixe de LO e aquele associado com o feixe comb de RF que iluminam a localização espacial.

[00128] Como o processo de emissão de fluorescência requer uma quantidade de tempo finita (tipicamente 1- 10 nanossegundos para flu- oróforos orgânicos comuns), a fluorescência emitida não exibirá uma alta profundidade de modulação se a frequência de batida de excitação for muito alta. Assim, em muitas modalidades, as frequências de batida de excitação são selecionadas para serem consideravelmente menos do que 1/Tf, onde Tf é o tempo de vida de fluorescência característico do fluoróforo. Em alguns casos, as frequências de batida de excitação podem ser menores do que 1/Tf por 1% ou mais, tal como por 2% ou mais, tal como por 3% ou mais, tal como por 5% ou mais, tal como por 10% ou mais, tal como por 25% ou mais, tal como por 50% ou mais, tal como por 75% ou mais, tal como por 90% ou mais, tal co- mo por 1,5 vezes ou mais, tal como por 2 vezes ou mais, tal como por 3 vezes ou mais e incluindo por 5- vezes ou mais. Por exemplo, as frequências de batida de excitação podem ser menores do que 1/Tf por 0,01 MHz ou mais, tal como por 0,05 MHz ou mais, tal como por 0,1 MHz ou mais, tal como por 0,5 MHz ou mais, tal como por 1 MHz ou mais, tal como por 5 MHz ou mais, tal como por 10 MHz ou mais, tal como por 25 MHz ou mais, tal como por 50 MHz ou mais, tal como por 100 MHz ou mais, tal como por 250 MHz ou mais, tal como por 500 MHz ou mais e incluindo 750 MHz ou mais. Em algumas modalidades, o fotodetector está configurado para detectar luz (por exemplo, luminescência tal como fluorescência) da amostra irradiada. Em algumas modalidades, o fotodetector pode incluir um ou mais detectores tal como 2 ou mais detectores, tal como 3 ou mais detectores, tal como 4 ou mais detectores, tal como 5 ou mais detectores, tal como 6 ou mais detectores, tal como 7 ou mais detectores e incluindo 8 ou mais detec-tores. Qualquer protocolo de detecção de luz pode ser empregado, incluindo mas não limitado a sensores de pixel ativo (APSs), fotodio- dos de quadrante, sensores de imagem, dispositivos acoplados de mudança (CCDs), dispositivos acoplados em carga intensificada (ICCDs), diodos emissão de luz, contadores de fótons, bolômetros, detectores piroelétricos, fotorresitores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotocondutores ou fotodiodos de ponto de quantum e sua combinação, entre outros fotodetectores. Em algumas modalidades, fotodetectores de interesse estão configurados para detectar luz que varia de 350 nm a 1200 nm, tal como de 450 nm a 1150 nm, tal como de 500 nm a 1100 nm, tal como de 550 nm a 1050 nm, tal como de 500 nm a 1000 nm e incluindo de 400 nm a 800 nm. Em certas modalidades, o fotodetector configurado para detectar luz que no máximo de emissão da luminescência, tal como em 395 nm, 421 nm, 445 nm, 448 nm, 452 nm, 478 nm, 480 nm, 485 nm, 491 nm, 496 nm, 500 nm, 510 nm, 515 nm, 519 nm, 520 nm, 563 nm, 570 nm, 578 nm, 602 nm, 612 nm, 650 nm, 661 nm, 667 nm, 668 nm, 678 nm, 695 nm, 702 nm, 711 nm, 719 nm, 737 nm, 785 nm, 786 nm, ou 805 nm.

[00129] Em algumas modalidades, a radiação de fluorescência emitida pela amostra pode ser coletada em uma variedade de diferentes modos, por exemplo, ao longo de um percurso ótico que é perpendicular à direção de propagação do feixe de excitação. Em outras modalidades, a radiação de fluorescência é detectada em uma epi-direção.

[00130] Referindo novamente à Figura 1, nesta modalidade, a radiação de fluorescência emitida por um ou mais fluoróforos presentes na amostra iluminada passa através da lente de objetiva 52 e é transmitida através do espelho dicroico 58 para alcançar um fotodetector 64. Mais especificamente, nesta modalidade, a lente 65 focaliza a radiação fluorescente transmitida através do espelho dicroico 58 por sobre uma abertura de fenda 66. A radiação fluorescente que é transmitida através da fenda passes através de um filtro de emissão de fluorescência 68 para alcançar o fotodetector 64. A abertura de fenda 66 (ou um filtro ótico em outras modalidades abaixo discutidas) disposta na frente do fotodetector substancialmente permite a passagem da radiação de fluorescência emitida de um plano específico da amostra enquanto rejeitando uma emissão de fluorescência fora do plano. Ainda, a filtro de emissão de fluorescência 68, por exemplo, um filtro de pas-sagem de banda, permite a passagem de radiação de fluorescência para o fotodetector 64 enquanto substancialmente bloqueando a passagem de radiação em outras frequências.

[00131] O fotodetector 64 tem uma largura de banda de RF suficiente para detectar e transmitir sinais da faixa inteira das frequências de batida. Alguns exemplos de fotodetectores adequados incluem, sem limitação, a tubo fotomultiplicador, fotodiodo de avalanche, fotodi- odo de PIN, e um fotodetector híbrido, entre outros. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, um tubo fotomultiplicador comercializado por Hamamatsu Corporation pode ser empregado (por exemplo, R3896, R10699, H11462). O fotodetector gera um sinal, por exemplo, um sinal analógico nesta modalidade, em resposta à detecção da radiação de fluorescência recebida.

[00132] Por meio de outro exemplo e com referência à Figura 9A, a radiação de fluorescência emitida pela amostra em resposta à iluminação concorrente pelo feixe de LO e os feixes comb de RF espacialmente separados passa através da lente de objetiva 52 e do espelho dicroico 58 para ser acoplada através de uma lente 100 por sobre uma fibra ótica de multimodo 102, a qual estende de uma extremidade mais próxima 102a para uma extremidade mais distante 102b. Mais especificamente, a extremidade mais próxima 102a da fibra ótica 102 está posicionada na proximidade do plano focal da lente 100 de modo a receber a radiação fluorescente. Uma lente outcoupling 104, acoplada na extremidade mais distante 102b da fibra ótica, colima a radiação que sai da fibra.

[00133] Em muitos casos, a radiação de excitação que ilumina a amostra excita múltiplos fluoróforos (por exemplo, fluoróforos orgânicos) que podem ter espectros de absorção de radiação amplos o bastante de modo que as frequências de excitação caem dentro dos espectros de absorção de múltiplos fluoróforos na amostra. Cada fluoró- foro então emitira uma radiação de fluorescência em uma diferente frequência. Sem perda de generalidade e para propósitos de ilustração, nesta modalidade, o sistema de detecção inclui quatro tubos fo- tomultiplicadores 106, 108, 110 e 112, cada um dos quais recebe uma porção da radiação colimada que corresponde à radiação de fluorescência emitida por um de quatro fluoróforos excitados pela radiação de excitação na amostra iluminada. Mais especificamente, um espelho dicroico 114 reflete a radiação de fluorescência emitida por um dos fluoróforos em uma primeira frequência para o tubo fotomultiplicador 106 enquanto permitindo que a radiação de fluorescência em outras frequências atravesse. Outro espelho dicroico 116 reflete a radiação de fluorescência emitida por um diferente fluoróforo em uma diferente segunda frequência para o tubo fotomultiplicador 108 enquanto permitindo que o restante da radiação que contém radiação de fluorescência emitida por ainda outro fluoróforo em uma terceira frequência alcance um terceiro espelho dicroico 118, o qual reflete esta radiação de fluorescência para o tubo fotomultiplicador 110. O espelho dicroico 118 permite que o restante da radiação que inclui a radiação de fluorescência emitida por um quarto fluoróforo em uma quarta frequência de radiação atravesse para alcançar o tubo fotomultiplicador 112.

[00134] Uma pluralidade de filtros de passagem de banda 120, 122, 124, e 126, cada um centrado em uma das quatro frequências de fluorescência, estão colocados na frente dos tubos fotomultiplicadores 106, 108, 110, e 112, respectivamente. O sinal detectado por cada um dos tubos fotomultiplicadores é analisado em um modo abaixo discutido para gerar uma imagem de fluorescência na respectiva frequência de fluorescência. Em algumas modalidades, ao invés de utilizar múltiplos fotodetectores, um único fotodetector, por exemplo, um único tubo fotomultiplicador pode ser utilizado para detectar a radiação de fluorescência, por exemplo, a frequência de fluorescência que corresponde à emissão de um único fluoróforo.

[00135] Em algumas modalidades, a amostra flui através da célula de fluxo diferentes linhas horizontais da amostra são iluminadas e a radiação de fluorescência associada com cada linha horizontal é detectada por um ou mais fotodetectores, tais como os fotomultiplicado- res 106, 108, 110 e 112.

[00136] A Figura 9B apresenta esquematicamente um sistema de detecção similar àquele acima discutido em conexão com a Figura 9A exceto que este sistema de detecção, ao invés de utilizar uma fibra ótica, a radiação de fluorescência que contém a emissão de fluorescência de uma pluralidade de fluoróforos que passa através do espelho dicroico 58 propaga no espaço livre para alcançar os tubos foto- multiplicadores 106, 108, e 112. Mais especificamente, a lente 100 focaliza a radiação de fluorescência por sobre uma abertura 126 disposta entre as lentes 100 e 104, onde a abertura pode rejeitar uma radiação fora de foco. A lente 104 colima a radiação que passa através da abertura, onde a radiação colimada é distribuída entre os tubos foto- multiplicadores em um modo acima discutido em conexão com a Figura 9A.

[00137] Em algumas modalidades, o sistema 10 pode estar configurado para prover uma imagem de campo escuro e uma imagem de campo brilhante da amostra (da célula de fluxo na ausência da amostra) utilizando a radiação de excitação. Por meio de exemplo, a Figura 9C apresenta esquematicamente uma modalidade do sistema 10 que inclui dois braços de detecção 200 e 202 para detectar, respectivamente, uma imagem de campo escuro e uma imagem de campo brilhante da amostra.

[00138] Mais especificamente, o braço de detecção 200 está posicionado perpendicular à propagação da radiação de excitação de modo a receber uma porção da radiação de excitação que é dispersa pela amostra que flui através da célula de fluxo. O braço de detecção 200 inclui duas lentes 204 e 206 que coletivamente direcionam pelo menos uma porção da radiação de excitação dispersa pela amostra para dentro de um ângulo sólido estendido para baixo pela lente 204 por sobre um tubo fotomultiplicador 208. Mais especificamente, a lente 204 colima a radiação dispersa recebida e a lente 206 focaliza a radiação dispersa colimada por sobre o tubo fotomultiplicador 208. Nesta modali- dade, um filtro de passagem de banda apropriado 210 está disposto na frente do tubo fotomultiplicador 208 para permitir a passagem de radiação que tem a frequência desejada para o tubo fotomultiplicador 208 enquanto bloqueando a radiação em frequências indesejadas. A saída do tubo fotomultiplicador 208 pode ser processada em um modo conhecido na técnica, por exemplo, por um módulo de análise tal como aquele abaixo discutido para gerar uma imagem de campo escuro.

[00139] O braço de detecção 202 por sua vez inclui duas lentes 212 e 214, onde a lente 212 colima a radiação de excitação que sai da célula de fluxo em uma direção para frente (substancialmente ao longo da direção de propagação da radiação de excitação que entra na célula de fluxo 54) e a lente 214 focaliza a radiação colimada por sobre um fotodetector 216. Um filtro apropriado 218, por exemplo, um filtro de passagem de banda, disposto na frente do fotodetector permite a transmissão das frequências de excitação para o fotodetector 216 enquanto substancialmente bloqueando outras frequências de radiação. A saída do fotodetector 216 pode ser processada em um modo conhecido na técnica para gerar uma imagem de campo brilhante da célula de fluxo.

[00140] Assim, o braço de detecção 200 detecta a radiação de excitação que é dispersa pelo fluido que flui através da célula, e o braço de detecção 202 detecta a radiação de excitação que é transmitida através da célula de fluxo. Quando nenhum fluido está fluindo através da célula de fluxo, o sinal detectado pelo tubo fotomultiplicador 208 é baixo e o sinal detectado pelo fotodetector 216 já que existe pouca dispersão da radiação de excitação que passa através da célula de fluxo e com isto uma grande percentagem, e em alguns casos toda, da radiação de excitação é transmitida através da célula de fluxo. Em contraste, o fluido de uma amostra de fluido através da célula de fluxo pode fazer com que o sinal gerado pelo tubo fotomultiplicador 208 au- mente devido à dispersão de uma porção da radiação de excitação pela amostra, e o sinal gerado pelo fotodetector 216 diminui conforme o nível da radiação de excitação transmitida através da célula de fluxo diminui.

[00141] Por meio de exemplo adicional e com referência à Figura 9D, em uma modalidade de um sistema de acordo com os presentes ensinamentos, um braço de detecção 220a posicionado em relação à célula de fluxo 54 em uma direção substancialmente ortogonal à direção de propagação da radiação de excitação inclui fotodetectores para detectar tanto a radiação de fluorescência emitida por uma pluralidade de fluoróforos na amostra quanto a radiação de excitação que é dispersa pela amostra. Mais especificamente, o braço de detecção 220 inclui lentes 222 e 224 que direcional a radiação de fluorescência assim como a radiação dispersa de excitação por sobre uma abertura 226, a qual rejeita a radiação não focalizada. Uma lente 228 colima a radiação que passa através da abertura. Um espelho dicroico 230 reflete a porção da radiação nas frequências de excitação por sobre um tubo fotomultiplicador 232 para detecção de uma imagem de campo escuro enquanto permitindo a radiação de fluorescência atravessar. Um filtro apropriado 232a, por exemplo, um filtro de passagem de banda, disposto na frente do tubo fotomultiplicador 232 permite a passagem de radiação em frequências de excitação para o tubo fotomulti- plicador 232 enquanto bloqueando as frequências de radiação indese- jadas. Outro espelho dicroico 234 reflete a radiação de fluorescência emitida por um fluoróforo em uma primeira frequência por sobre um tubo fotomultiplicador 236 enquanto permitindo a passagem de radiação de fluorescência emitida por outros fluoróforos em outras frequências. Outro espelho dicroico 238 reflete a radiação de fluorescência emitida por outro fluoróforo em uma segunda frequência por sobre um tubo fotomultiplicador 240 enquanto permitindo a passagem de radia- ção de fluorescência emitida por ainda outro fluoróforo em uma terceira frequência, onde é detectada pelo tubo fotomultiplicador 242. Similar às modalidades anteriores, uma pluralidade de filtros 236a, 240a, e 242a está disposta na frente dos tubos fotomultiplicadores 236, 240, e 242, respectivamente, para permitir a transmissão de radiação em frequências desejadas enquanto substancialmente bloqueando as frequências de radiação indesejadas.

[00142] Com referência continuada à Figura 9D, esta implementação de um sistema de acordo com os presentes ensinamentos ainda inclui outro braço de detecção 220b para gerar uma imagem de campo brilhante, por exemplo, em um modo discutido em conexão com a Figura 9C. Mais especificamente, o braço de detecção 202 inclui duas lentes 212 e 214 que focalizam a luz por sobre um fotodetector 216 para gerar uma imagem de campo brilhante da radiação de excitação. Um filtro 218, por exemplo, um filtro de passagem de banda, está colocado na frente do fotodetector 216 para permitir a passagem da radiação de excitação para o detector enquanto rejeitando as frequências de radiação indesejadas.

[00143] Referindo novamente à Figura 1 assim como a Figura 10, nesta modalidade, um amplificador de transimpedância 70 pode estar acoplado na saída do fotodetector 64 (ou cada um dos fotodetectores discutidos em conexão com as Figuras 9A-9D) para amplificar o sinal gerado pelo fotodetector. Uma unidade de análise de dados 72 (aqui também referida como um módulo de análise ou um analisador) recebe o sinal amplificado e analisa o sinal para gerar uma imagem de fluorescência da amostra. A unidade de análise de dados 72 pode ser implementada em hardware, firmware, e/ou software. Por meio de exemplo, um método para analisar os dados de fluorescência detectados pode estar armazenado em uma unidade de memória somente de leitura (ROM) do módulo de análise para ser acessado sob o controle de um processador para analisar o sinal de fluorescência recebido.

[00144] Como abaixo discutido em mais detalhes, o método de análise determina os componentes de frequência da saída variável no tempo do fotodetector e constrói uma imagem de fluorescência da amostra com base naqueles componentes de frequência. Uma variedade de métodos para determinar o conteúdo de frequência da saída do fotodetector pode ser empregada. Alguns exemplos de tais métodos adequados incluem, sem limitação, transformada de Fourier, detecção lock-in, filtragem, demodulação I/Q, detecção de homódina, e detecção heteródina.

[00145] Por meio de exemplo, as Figuras 11A e 11B mostram etapas de análise exemplares que podem ser executadas pelo módulo de análise 72 para gerar uma imagem de fluorescência da amostra. Na etapa (1), o sinal amplificado analógico é digitalizado para gerar dados de fluorescência digitalizados. Na etapa (2), uma porção apropriada (comprimento) dos dados digitalizados é selecionada para análise. Por exemplo, os dados de fluorescência que correspondem a uma linha iluminada da amostra (aqui também referido como um quadro) podem ser escolhidos para análise. Alternativamente, uma porção de um quadro de dados pode ser selecionada para análise.

[00146] Na etapa (3), uma transformada de Fourier dos dados selecionados é executada. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, uma Transformada de Fourier Rápida (FFT) dos dados é executada para determinar os componentes de frequência dos dados. Em algumas tais modalidades, os bins da FFT podem corresponder às frequências escolhidas para aquisição de dados. Por exemplo, para uma taxa de amostragem de 256 MHz, 256 amostras podem gerar bins de frequência que são separados um do outro por 1 MHz, por exemplo, de DC para 128 MHz. A análise de FFT provê frequências que correspondem as frequências de batida nas quais a emissão de fluorescência emitida exibe modulação de amplitude.

[00147] Com referência continuada às Figuras 11A e 11B, nesta modalidade, na etapa (4), uma medida da amplitude de cada componente de frequência presente nos dados de FFT é computado obtendo a raiz quadrada da soma de quadrados dos componentes reais e imaginários daquele componente de frequência. Como cada componente de frequência corresponde a uma das frequências de batida empregadas para obter a radiação de fluorescência de uma localização específica da amostra, a medida da amplitude do componente de frequência pode prover um valor de pixel para uma localização associada com aquele componente de frequência ao longo de uma linha horizontal da amostra. Neste modo, valores de pixel para uma imagem em uma linha horizontal da amostra podem ser determinados. As etapas acima podem ser repetidas para dados de fluorescência obtidos para cada linha horizontal da amostra conforma a amostra flui através da célula de fluxo em uma direção vertical. Os valores de pixels podem ser utilizados para construir uma imagem de fluorescência (etapa 5).

[00148] Como acima notado, o módulo de análise 72 pode ser implementada em hardware, firmware e/ou software utilizando técnicas conhecidas na técnica e de acordo com os presentes ensinamentos. Por meio de exemplo, a Figura 12 apresenta esquematicamente uma implementação exemplar do analisador 72, o qual inclui um conversor analógico para digital 74 para receber o sinal de fluorescência amplificado do amplificador 70 e digitalizar este sinal para gerar dados de fluorescência digitalizados. O módulo de análise ainda inclui uma unidade de processamento central (CPU) 76 para controlar a operação do módulo de análise, incluindo executar cálculos e operações lógicas. O módulo de análise também inclui uma ROM (memória somente de leitura) 78, RAM (memória de acesso randômico) 80 e memória permanente 82. Um barramento de comunicação 84 facilita a comunicação entre vários componentes do módulo de análise, incluindo as comunicações entre a CPU 76 e outros componentes. Os módulos de memória podem ser utilizados para armazenar instruções para analisar os dados de fluorescência e os resultados de análise. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, as instruções para análise de dados, por exemplo, instruções para executar as etapas acima discutidas em conexão com as Figuras 11A e 1 IB, podem ser armazenadas na ROM 78. A CPU pode empregar instruções armazenadas na ROM 78 para operar sobre dados de fluorescência digitalizados armazenados na RAM 80 para gerar uma imagem de fluorescência da amostra (por exemplo, uma imagem unidimensional ou bidimensional). A CPU pode efetuar o armazenamento da imagem de fluorescência na memória permanente 82, por exemplo, em um banco de dados. Como mostrado esquematicamente na Figura 12, o módulo de análise pode opcionalmente incluir uma unidade de processamento gráfico (GPU) 76' para executar cálculos de intensidades de pixel e outras quantidades dos dados recebidos (por exemplo, dados de fluorescência).

[00149] Em algumas modalidades, a demodulação de frequência do sinal de saída gerado pelo fotodetector pode ser conseguida utilizando técnicas de detecção de lock-in. Por meio de exemplo, com referência às Figuras 13A e 13B, em uma tal modalidade, o sinal de fluorescência amplificado é digitalizado (etapa 1) e diversas de cópias do sinal de fluorescência digitalizado são geradas (etapa 2), onde o número (N) das cópias digitalizadas corresponde ao número de frequências associadas com os feixes comb de RF. Cada cópia digitalizada do sinal é multiplicada com ondas de seno e cosseno que têm uma frequência que corresponde a uma frequência de batida igual a uma diferença entre as frequências de um dos feixes comb de RF e do feixe de LO para gerar uma pluralidade de sinais intermediários (etapa 2). Cada sinal intermediário é passado através de um filtro de passagem baixa (etapa 3), o qual tem uma largura de banda igual à metade do espaçamento de frequência entre as frequências comb de RF.

[00150] Para cada frequência de batida que corresponde a uma das frequências comb de RF (em outras palavras, para cada frequência que corresponde a uma localização espacial da amostra iluminada), a raiz quadrada da soma dos quadrados dos dois sinais intermediários filtrados que correspondem àquela frequência é obtida como uma medida da amplitude de um pixel de imagem que corresponde à localização de amostra iluminada pelo feixe de LO e o feixe comb de RF que têm esta frequência (etapa 4). Em algumas modalidades, múltiplos sinais de dados de fluorescência que correspondem à mesma frequência de batida (isto é, que correspondem à mesma localização de amostra) podem ser processados em um modo acima discutido e os valores de pixel podem ter a média calculada de modo a obter um valor de pixel médio.

[00151] As etapas acima podem ser repetidas para dados de fluorescência obtidos de cada linha horizontal da amostra conforme a amostra flui através da célula de fluxo em uma direção vertical. Os valores de pixels podem ser utilizados para construir uma imagem de fluorescência (etapa 5).

[00152] O método de detecção de lock-in acima pode ser implementado em software, firmware e/ou hardware. Por meio de exemplo, em uma modalidade o método de detecção de lock-in acima pode ser implementado utilizando uma rede de portas programáveis no campo (FPGA), especificamente se mais do que 6 frequências forem utilizadas. Em algumas modalidades, um amplificador de lock-in de múltiplas frequências, tal como o amplificador de múltiplas frequências HF2L-MF comercializado por Zurich Instruments of Zurich, Switzerland pode ser empregado.

[00153] Por meio de exemplo adicionais, em algumas modalidades a demodulação de frequência do sinal de fluorescência detectado pode ser conseguida empregando uma técnica de demodulação de imagem baseada em filtro de passagem de banda. Por referência às Figuras 14A e 14B, em uma modalidade de tal método de demodulação de frequência, o sinal de fluorescência provido pelo fotodetector 64 e o amplificador 70 é digitalizado (etapa 1) e diversas cópias do sinal digitalizado são geradas (etapa 2), onde o número (N) das cópias digitalizadas corresponde ao número de frequências associadas com os feixes comb de RF. Cada cópia do sinal digitalizado de fluorescência é filtrada passando aquele sinal através de um filtro de passagem de banda centrado em uma frequência de batida associada com um dos feixes comb de RF (isto é, uma frequência de batida associada com uma localização específica da amostra ) (etapa 3). Mais especificamente, cada filtro de passagem de banda está centrado em uma de N frequências de batida e tem uma largura de banda que é igual à metade do espaçamento de frequência entre frequências de batida adjacentes.

[00154] Um detector de envelope em cada frequência de batida é empregado para estimar, para cada linha horizontal, a amplitude de cada pixel que corresponde àquela frequência (etapa 4). Em alguns casos, uma pluralidade de valores de pixel que corresponde a um pixel, obtido processando múltiplos sinas fluorescentes que correspondem a uma localização de amostra associada com aquele pixel, tem a média calculada para obter um valor de pixel médio. As etapas acima podem ser repetidas para dados de fluorescência obtidos para cada linha horizontal da amostra conforme a amostra flui através da célula de fluxo em uma direção vertical. Os valores de pixels podem ser utilizados para construir uma imagem de fluorescência unidimensional ou bidimensional da amostra (etapa 5).

[00155] O módulo de análise pode também estar configurado para receber e processar os dados de imagem de campo brilhante e campo escuro. Por exemplo, com referência à Figura 9C e Figura 10, o módulo de análise 72 pode estar ainda configurado para receber os dados de imagem de campo escuro e campo brilhante dos fotodetectores 208 e 218 para gerar imagens de campo escuro e campo brilhante. Por exemplo, com referência à Figura 12, as instruções para gerar as imagens de campo escuro e campo brilhante, por exemplo, em um modo conhecido na técnica, podem ser armazenadas na memória permanente 82. O processador 76 pode empregar estas instruções para processar os dados de imagem de campo escuro e campo brilhante recebidos para gerar as imagens. O módulo de análise pode estar também configurado para gerar imagens compostas sobrepondo, por exemplo, uma imagem de fluorescência e uma ou ambas as imagens de campo brilhante e campo escuro.

[00156] As imagens de fluorescência assim como as imagens de campo brilhante e campo escuro geradas por um sistema de acordo com os presentes ensinamentos, tal como o sistema 10 acima, podem ser utilizadas por uma variedade de diferentes modos. Por exemplo, a imagem de fluorescência pode ser integrada para produzir um valor comparável com os dados produzidos por um citômetro de fluxo convencional. A imagem de fluorescência pode também ser analisada para determinar a localização da sonda fluorescente que dá origem àquela imagem (por exemplo, pode ser determinado se a sonda é o núcleo, citoplasma, localizada em organelas, ou no exterior de uma membrana de célula). Ainda, em algumas aplicações, múltiplas imagens fluorescentes obtidas detectando diferentes bandas de fluorescência, todas as quais tomadas da mesma célula, podem ser utilizadas para determinar o grau de co-localização de múltiplas sondas fluorescentes dentro de uma célula. Além disso, a análise de morfologia de célula, sinalização de célula, internalização, interação de célula-célula, morte de célula, ciclo de célula, e contagem de pontos (por exemplo, FISH), entre outros, são possíveis utilizando fluorescência de múltiplas cores, campo brilhante, e imagens de campo escuro.

[00157] Como acima notado, o sistema 10 pode ser operado em pelo menos três diferentes modos. Em um modo acima discutido, um feixe de LO e uma pluralidade de feixes comb de RF concorrentemente iluminam uma porção da amostra (por exemplo, localizações dispostas ao longo de uma extensão horizontal), e a radiação de fluorescência emitida das localizações iluminadas é detectada e analisada de modo a construir uma imagem de fluorescência da amostra. Em outro modo operacional, ao invés de aplicar uma pluralidade de sinais de acionamento de RF concorrentemente no AOD, uma rampa de frequência que contém os sinais de acionamento é aplicada no AOD de modo que a frequência do feixe de laser seja mudada ao longo do tempo de uma frequência de início (fi) para uma frequência final (f2). Para cada frequência de acionamento da rampa de frequência, a fre-quência do feixe de laser é deslocada por aquela frequência de acionamento e a amostra é iluminada pelo feixe de laser deslocado em frequência para obter a radiação de fluorescência da amostra. Em outras palavras, neste modo, o sistema é operado para obter a radiação de fluorescência da amostra iluminando a amostra sucessivamente sobre um intervalo temporal com uma pluralidade de frequências, as quais estão deslocadas da frequência de laser central. O deslocamento de frequência gerado pelo AOD é acompanhado por uma deflexão angular de modo que utilizando o mesmo percurso ótico, o feixe é es- caneado através da amostra em uma alta velocidade.

[00158] Mais especificamente, neste modo operacional, o sintetiza- dor de frequência de RF 10 é empregado para aumentar um sinal de acionamento aplicado no AOD 18 de uma frequência de início (f1 para uma frequência final (f2). Por meio de exemplo, a faixa de frequência sobre a qual o sinal de acionamento é aumentado pode ser de aproxi-madamente 50 MHz a aproximadamente 250 MHz. Em algumas mo-dalidades, o sinal de acionamento é aumentado de aproximadamente 100 MHz a aproximadamente 150 MHz. Nesta modalidade, a frequência de acionamento é mudada ao longo do tempo continuamente, por exemplo, para atingir uma alta velocidade. Em outras modalidades, a frequência de acionamento pode ser mudada em etapas discretas de uma frequência de início (fi) para uma frequência final (f2).

[00159] As frequências de acionamento são escolhidas de modo que o feixe deslocado em frequência não atingiria o espelho 28 e propagaria ao longo de um percurso ótico definido pela lente 26, lente 30, espelhos 40/42, um divisor de feixe 44, lente 46, espelho 56, lente 50, espelho 58 e a lente de objetiva 52 para iluminar uma porção da amostra que flui através do prendedor de amostra. A taxa de rampa é de preferência rápida o bastante de modo a melhorar e de preferência impedir, qualquer embaçamento na direção vertical de uma imagem de fluorescência a ser gerada com base na radiação de fluorescência emitida conforme a amostra flui através do feixe. Isto pode ser conseguido, por exemplo, coincidindo a taxa de rampa com a velocidade de fluxo da amostra. O tamanho de ponto de laser na amostra pode ser utilizado para estimar taxas apropriadas. Por meio de exemplo, para um tamanho de ponto de laser de 1 micrômetro, o tempo de escanea- mento através de 1 linha deve ser 10 microssegundos ou menos para uma velocidade de fluxo de amostra de 0,1 metros por segundo para evitar embaçamento de imagem.

[00160] A radiação de fluorescência emitida pela amostra em resposta à iluminação pela radiação de excitação é coletada e detectada em um modo acima discutido. Especificamente, com referência à Figura 10, a radiação de fluorescência é detectada pelo fotodetector 64. A fluorescência detectada é amplificada pelo amplificador 70 e o sinal amplificado é analisado pelo módulo de análise 72 para reconstruir uma imagem de fluorescência da amostra. A reconstrução da imagem é executada atribuindo uma localização de pixel horizontal para um tempo específico dentro do período de escaneamento da frequência de início (fi) até a frequência final (f2). Em oposição a analisar a amplitude de um componente de frequência para obter valores de pixel como no modo operacional acima, a proposta de demodulação utilizada neste modo operacional somente utiliza os valores de domínio de tempo do sinal de fluorescência detectado para atribuir valores para os pixels da imagem. O processo pode ser repetido conforme a amostra flui em uma direção vertical de modo a obter uma imagem de fluorescência bidimensional da amostra.

[00161] A radiação de fluorescência, se existir, emitida pela amostra é coletada pelo fotodetector 64. Referindo à Figura 10, a radiação de fluorescência detectada é amplificada pelo amplificador 70. O módulo de análise 72 recebe o sinal amplificado. Neste modo operacional, o módulo de análise analisa o sinal de fluorescência para determinar o conteúdo de fluorescência da amostra, por exemplo, uma célula / partícula. Como existe somente um feixe excitando a amostra neste modo operacional, nenhuma frequência de batida é gerada em resposta a excitar a amostra. Com isto, não existem informações de imagem no domínio de frequência do sinal de fluorescência. Ao invés, o sinal de fluorescência detectado tem informações de imagem codificadas no domínio de tempo. Neste modo operacional, uma imagem pode ser digitalmente reconstruída utilizando os valores de tempo do sinal de fluorescência detectado como a coordenada de pixel horizontal, e os valores de voltagem digitalizados do sinal de fluorescência como os valores de pixel (luminosidade). Cada escaneamento das frequências de acionamento aplicado ao AOD produz uma linha horizontal (fila) da imagem. A reconstrução de imagem é conseguida através de consecu- tivos escaneamentos conforme a amostra flui através da área de iluminação (ponto).

[00162] Em ainda outro modo operacional, o sistema 10 pode ser operado para iluminar uma pluralidade de localizações de uma amostra concorrentemente por uma única frequência de excitação, a qual pode ser gerada, por exemplo, deslocando a frequência central de um feixe de laser por uma radiofrequência. Mais especificamente, referindo novamente à Figura 1, em tal modo operacional uma única frequência de rádio de acionamento pode ser aplicada ao AOD 18 para gerar um feixe de laser que tem uma frequência que está deslocada em relação ao feixe de laser que entra no AOD 18. Ainda, o feixe de laser deslocado em frequência exibe um deslocamento angular em relação ao feixe de laser que entra no AOD de modo que o feixe de laser de radiofrequência é interceptado e refletido pelo espelho 28 na direção do formador de feixe top-hat 34 através da lente 32 e espelhos 33 e 35. O feixe que sai do formador de feixe top-hat é refletido pelo divisor de feixe 44 e é focalizado pela lente 46 por sobre o plano de imagem intermediário 48. Neste plano, como mostrado esquematicamente na Figura 15A, o feixe de laser 1000 mostra um perfil distendido ao longo da direção horizontal.

[00163] O feixe de laser horizontalmente distendido é refletido pelo espelho 56 para a lente positiva 50. Após a passagem através da lente 50, o feixe de laser é refletido pelo espelho 58 para a lente de objetiva 52. Como acima discutido, a lente positiva 50 e a lente de objetiva 52 formam um telescópio para transferir o feixe de laser perfilado em tophat do plano de imagem intermediário 48 por sobre uma amostra que flui através da célula de fluxo 54.

[00164] O feixe de laser horizontalmente distendido ilumina uma extensão horizontal da amostra para excitar um fluoróforo de interesse, se presente na amostra, ao longo daquela extensão horizontal. As- sim, neste modo operacional, ao contrário do primeiro modo operacional no qual uma pluralidade de localizações horizontais da amostra é iluminada em diferentes frequências de excitação, uma pluralidade de localizações horizontais da amostra é iluminada na mesma frequência de excitação. Este modo operacional não permite um usuário obter uma imagem de células ou partículas que fluem passando. No entanto, neste modo operacional, uma potência ótica mais alta pode tipicamente ser aplicada na amostra do que nos outros dois modos operacionais, o que pode ser útil para obter dados de razão de sinal para ruído mais altos se imagens não forem requeridas. Este modo operacional é acessível meramente alterando o sinal eletrônico que aciona o defletor acústico-ótico, sem uma necessidade de fazer quaisquer mudanças mecânicas no sistema.

[00165] Assim, o sistema 10 pode ser operado em três modos operacionais distintos para obter radiação de fluorescência de uma amostra.

[00166] Em algumas modalidades, as medições de tempo de vida de fluorescência podem ser executadas em cada posição espacial sobre a amostra, por exemplo, comparando as fases das batidas de cada um dos feixes deslocados em radiofrequência de oscilador local com a fase de um respectivo componente de radiofrequência no sinal de fluorescência detectado. Por meio de exemplo, a Figura 15B mostra um sistema 10', uma versão modificada do sistema 10 acima discutido, que permite tais medições de tempo de vida de fluorescência (certos componentes mostrados na Figura 1 não estão apresentados nesta figura para brevidade). Especificamente, uma porção dos feixes comb de RF incidente sobre o divisor de feixe 44 é refletida pelo divisor de feixe por sobre uma lente convergente 400 (por meio de ilustração nesta modalidade a lente 400 tem um comprimento focal de 200 mm, apesar de outros comprimentos focais poderem também ser utiliza- dos). A lente 400 focaliza aquela porção dos feixes comb de RF por sobre um fotodiodo 402, o qual detecta o feixe de excitação. A saída do fotodiodo 402 pode ser recebida pelo módulo de análise 72 (Ver, Figura 10). O módulo de análise pode prover uma demultiplexação de frequência do feixe de excitação, por exemplo, utilizando uma das técnicas de demodulação acima discutidas e determinar a fase de cada componente de frequência de rádio no feixe de excitação. Isto pode prover, para cada componente de radiofrequência no sinal de fluorescência detectado, uma fase de referência com a qual a fase daquele componente de radiofrequência pode ser comparada. Por exemplo, os componentes reais e imaginários de uma FFT do sinal excitação ou os componentes I e Q de demodulação do tipo lock-in podem ser empregados. Alternativamente, a saída do detector que detecta a imagem de campo brilhante da célula de amostra / fluxo pode ser utilizada para obter fases de referência com as quais as fases das frequências de batida de fluorescências podem ser comparadas.

[00167] Mais especificamente, o módulo de análise 72 pode prover demultiplexação de frequência do sinal de fluorescência detectado, por exemplo, em um modo acima discutido. Como será apreciado por alguém versado na técnica, para cada frequência de batida no sinal de fluorescência, a fase do componente de radiofrequência pode ser comparada com a respectiva fase de referência do feixe de excitação para obter medições de tempo de vida de fluorescência espacialmente resolvidas e uma imagem de tempo de vida de fluorescência.

[00168] Em certas modalidades, os sistemas em objeto incluem sistema de citometria de fluxo que empregam as configurações óticas acima descritas para detectar uma luz emitida por uma amostra em uma corrente de fluxo. Em certas modalidades, os sistemas em objeto são sistemas de citometria de fluxo os quais incluem um ou mais componentes dos citômetros de fluxo descritos nas Patentes U.S. Núme- ros 3.960.449; 4.347.935; 4.667.830; 4.704.891; 4.770.992; 5.030.002; 5.040.890; 5.047.321; 5.245.318; 5.317.162; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.620.842; 5.627.040; 5.643.796; 5.700.692; 6.372.506; 6.809.804; 6.813.017; 6.821.740; 7.129.505; 7.201.875;7.544.326; 8.140.300; 8.233.146; 8.753.573; 8.975.595; 9.092.034; 9.095.494; e 9.097.640, as descrições das quais estão aqui incorporadas por referência nas suas totalidades.

[00169] Como acima discutido, em algumas modalidades os sistemas em objeto estão configurados para formar imagem de partículas (por exemplo, células) em uma amostra que flui como uma corrente de fluxo, tal como a corrente de fluxo de um citômetro de fluxo. A taxa de fluxo de partículas na corrente de fluxo pode ser 0,00001 m/s ou mais, tal como 0,00005 m/s ou mais, tal como 0,0001 m/s ou mais, tal como 0,0005 m/s ou mais, tal como 0,001 m/s ou mais, tal como 0,005 m/s ou mais, tal como 0,01 m/s ou mais, tal como 0,05 m/s ou mais, tal como 0,1 m/s ou mais, tal como 0,5 m/s ou mais, tal como 1 m/s ou mais, tal como 2 m/s ou mais, tal como 3 m/s ou mais, tal como 4 m/s ou mais, tal como 5 m/s ou mais, tal como 6 m/s ou mais, tal como 7 m/s ou mais, tal como 8 m/s ou mais, tal como 9 m/s ou mais, tal como 10 m/s ou mais, tal como 15 m/s ou mais e incluindo 25 m/s ou mais. Por exemplo, dependendo do tamanho da corrente de fluxo (por exemplo, o orifício de bocal de fluxo), a corrente de fluxo pode ter uma taxa de fluxo nos sistemas em objeto de 0,001 μL/min ou mais, tal como 0,005 μL/min ou mais, tal como 0,01 μL/min ou mais, tal como 0,05 μL/min ou mais, tal como 0,1 μL/min ou mais, tal como 0,5 μL/min ou mais, tal como 1 μL/min ou mais, tal como 5 μL/min ou mais, tal como 10 μL/min ou mais, tal como 25 μL/min ou mais, tal como 50 μL/min ou mais, tal como 100 μL/min ou mais, tal como 250 μL/min ou mais e incluindo 500 μL/min ou mais.

[00170] Em alguns aspectos, métodos e sistemas estão descritos para prover uma estimativa de uma ou mais características de uma partícula, por exemplo, uma célula. Por meio de exemplo, a Figura 16A apresenta um fluxograma que apresenta várias etapas em um método exemplar de acordo com uma modalidade dos presentes ensinamentos para determinar uma ou mais características de uma partícula. Uma partícula é iluminada com um feixe ótico modulado em radiofrequência conforme a partícula flui através de um sistema de citometria de fluxo de modo a obter pelo menos uma resposta radiativa da partí-cula (etapa 1). Por meio de exemplo, o feixe ótico modulado em radiofrequência pode incluir pelo menos dois pequenos feixes que têm frequências óticas deslocadas uma da outra por uma radiofrequência. Em algumas modalidades, o deslocamento de radiofrequência pode estar em uma faixa de aproximadamente 10 MHz a aproximadamente 250 MHz. Por exemplo, o deslocamento de radiofrequência pode estar em uma faixa de aproximadamente 55 MHz a aproximadamente 225 MHz, tal como de aproximadamente 60 MHz a aproximadamente 200 MHz, tal como de aproximadamente 65 MHz a aproximadamente 175 MHz, tal como de 70 MHz a aproximadamente 150 MHz e incluindo de aproximadamente 75 MHz a aproximadamente 125 MHz. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, o feixe ótico modulado em radio-frequência pode ser gerado introduzindo um feixe de laser em um de- fletor acústico-ótico (AOD) e aplicando um ou mais sinais de acionamento em uma ou mais radiofrequências ao AOD de modo a gerar uma pluralidade de pequenos feixes angularmente separados que têm frequências óticas que estão deslocadas uma em relação à outra pelas ditas radiofrequências, por exemplo, em um modo acima discutido.

[00171] Em algumas modalidades, a resposta radiativa obtida da partícula em resposta à iluminação da partícula pelo feixe ótico modulado em frequência de rádio pode ser qualquer uma de radiação fluorescente e/ou dispersa.

[00172] Com referência continuada ao fluxograma da Figura 16A, a resposta radiativa que emana da partícula pode ser detectada (etapa 2) e os dados de forma de onda temporais associados com a resposta radiativa pode ser gerada (etapa 3). Uma variedade de modalidades de detecção de radiação e detectores, tais como aqueles acima discutidos, pode ser utilizada para detectar a resposta de radiação obtida. Em algumas modalidades, a forma de onda gerada pode ser dada de forma de onda de fluorescência e/ou dispersão. Os dados de forma de onda podem ser processados para obter uma estimativa de pelo menos uma característica da partícula. Em muitas modalidades, tal processamento dos dados de forma de onda para obter uma estimativa de pelo menos uma característica da partícula pode ser executado sem gerar uma imagem da partícula com base nos dados de forma de onda. Em algumas modalidades, a etapa de processamento inclui analisar uma ou mais frequências de batida que modulam os dados de forma de onda temporais para obter a estimativa de pelo menos uma característica da partícula. Em algumas modalidades, a etapa de pro-cessamento é executada suficientemente rápida de modo que uma latência associada com a obtenção de uma estimativa de pelo menos uma característica da partícula é menor do que aproximadamente 100 microssegundos.

[00173] Em algumas modalidades, o método acima pode ser utilizado para obter uma estimativa de qualquer um de um tamanho dimensional da partícula, uma razão de tamanhos da partícula ao longo de duas diferentes dimensões, co-localização de radiação de fluorescência emitida por dois ou mais marcadores associados com a partícula, ou um grau de pontuação da resposta radiativa (por exemplo, o grau de pontuação de radiação fluorescente emitida pela partícula), entre outros.

[00174] O método acima pode ser utilizado para obter estimativas de uma ou mais características de uma variedade de diferentes partículas. Por meio de exemplo, a partícula pode ser qualquer uma de uma célula, um pequeno organismo (por exemplo, o nematóide c. ele- gans), uma gota, uma micropartícula, uma nanopartícula, uma partícula viral, uma bactéria, um exossoma, ou um produto farmacêutico.

[00175] A Figura 16B apresenta esquematicamente um sistema 3000 de acordo com uma modalidade para estimar pelo menos uma característica de uma partícula, tal como uma célula. O sistema exemplar 3000 inclui um sistema de iluminação 3002 para iluminar uma ou mais partículas que fluem através de uma célula de um sistema de ci- tometria de fluxo com um feixe de laser ótico modulado em radiofrequência. Um detector 3004 pode detectar uma resposta radiativa da partícula, por exemplo, uma radiação fluorescente e/ou dispersa, em resposta à sua iluminação, e gerar um ou mais sinais indicativos da resposta radiativa. Um analisador 3006 pode receber o(s) sinal(is) do detector e gerar dados de forma de onda temporais e operar sobre estes dados de forma de onda de modo a derivar uma estimativa de uma ou mais características da partícula.

[00176] O analisador 3006 pode empregar uma variedade de diferentes métodos para analisar os dados de forma de onda para obter uma estimativa de uma ou mais características de uma partícula, tal como uma célula. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, uma partícula pode ser tingida com pelo menos dois marcadores de fluorescência, onde cada marcador está configurado para emitir radiação fluorescente em resposta à iluminação por radiação ótica modulada em radiofrequência. A radiação fluorescente pode ser detectada e digitalizada para gerar formas de onda de fluorescência cada uma correspondendo a um dos marcadores. O analisador pode operar sobre as formas de onda de fluorescência para obter uma medida de co- localização da radiação de fluorescência que emana dos marcadores. Especificamente, o analisador pode aplicar um filtro de passagem alta ou de passagem de banda a pelo menos uma das formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda filtrada seguida por uma multiplicação por pontos das formas de onda para gerar uma forma de onda multiplicativa resultante, integrar a forma de onda multiplicativa para obter um valor integrado, e comparar o valor integrado com um limite predefinido para obter uma medida de co-localização. Por meio de outro exemplo, em algumas modalidades, uma estimativa do tamanho de uma partícula ao longo de uma direção perpendicular ou paralela à direção do fluxo de partícula em um sistema de citometria de fluxo pode ser obtida. Por exemplo, em algumas tais modalidades, uma estimativa de uma tamanho de partícula em uma direção perpendicular à direção de fluxo de partícula pode ser obtida elevando ao quadrado uma forma de onda de fluorescência que corresponde à radiação fluorescente emitida pela partícula em resposta à iluminação por um feixe ótico modulado em radiofrequência, aplicando um filtro de passagem de banda na forma de onda elevada ao quadrado, integrar a forma de onda filtrada, e comparar o valor integrado com um limite predefinido. Ainda, em algumas modalidades, o analisador pode utilizar dados de dispersão para obter uma estimativa do tamanho de uma partícula em uma direção paralela à direção de fluxo de partícula.

[00177] Como abaixo discutido, uma ou mais características estimadas de uma partícula que flui através de um sistema de citometria de fluxo podem ser empregadas para chegar a uma decisão de classificação referente àquela partícula, isto é, se ou não classificar aquela partícula. Alguns exemplos de métodos de processamento que podem ser utilizados para operar os dados de forma de onda para obter uma estimativa de pelo menos uma característica de uma partícula estão abaixo discutidos no contexto de utilizar as estimativas de características de células que fluem através de um citômetro de fluxo para chegar a decisões de classificação referentes àquelas células. Deve ser com-preendido que tais métodos de processamento podem ser utilizados para obter estimativas de características de partícula outra do que células, e ainda as características estimadas podem não ser utilizadas para propósitos de classificação.

[00178] Em um aspecto relativo, métodos estão descritos para comutação automática (por exemplo, comutação assistida por computador) de uma população de partículas, por exemplo, células, que fluem através de um citômetro de fluxo com base em uma ou mais características das partículas. Por meio de exemplo, tal método pode comutar um subconjunto de uma pluralidade de partículas que flui através de um citômetro de fluxo com base nos tamanhos das partículas estando dentro de uma faixa predefinida. Por exemplo, com referência ao flu- xograma da Figura 16AA, tal método pode incluir introduzir uma amostra que contém uma pluralidade de partículas em um citômetro de fluxo (etapa 1), e obter, de uma ou mais medições de citômetro de fluxo, estimativas de pelo menos uma característica de partícula para a pluralidade das partículas (etapa 2). A etapa de obter pelo menos uma característica de partícula pode incluir iluminar uma partícula conforme esta flui através do citômetro de fluxo com radiação que tem pelo menos duas frequências óticas deslocadas uma da outra por uma radio-frequência para obter uma resposta radiativa da partícula, detectar a resposta radiativa da partícula para gerar dados de forma de onda temporais associados com a resposta, e processar os ditos dados de forma de onda temporais para obter um valor da dita pelo menos uma característica de partícula analisando uma ou mais frequências de batida que modulam os ditos dados de forma de onda temporais. O método pode ainda incluir identificar, através de um processador de computador, uma porta indicativa de uma ou mais partículas que tem um valor da característica de partícula que fica dentro de uma faixa prede- finida. Por meio de exemplo, as partículas que têm um tamanho dimensional (por exemplo, um tamanho lateral) dentro de uma faixa pre- definida podem ser comutadas.

[00179] Um sistema tal como o sistema apresentados na Figura 16B pode ser empregado para executar os métodos de comutação acima. Por exemplo, o analisador 3006 pode estar programado para determinar uma estimativa de pelo menos uma característica de uma pluralidade de partículas, por exemplo, com base na análise das uma ou mais frequências de batida na radiação fluorescente emitida por aquelas partículas em resposta à iluminação por feixe ótico modulado em radiofrequência, e determinar se a estimativa da característica de uma partícula está dentro de uma faixa predefinida de modo a chegar a uma decisão de comutação com relação àquela partícula (por exemplo, se a característica determinada estiver dentro de uma faixa prede- finida, a partícula será comutada). Em algumas modalidades, os ensinamentos da Patente U.S. Número 8.990.047 intitulada "Limiar de Vizinhança em Comutação de Densidade de Modelo Misto ", como modificados com base nos presentes ensinamentos podem ser utilizados para comutar partículas que fluem através de um citômetro de fluxo. A Patente U.S. Número 8.990.047 está por meio disto incorporada por referência em sua totalidade.

[00180] Em alguns aspectos, métodos e sistemas estão descritos para classificar células com base em interrogação destas células através de radiação ótica modulada em radiofrequência, por exemplo, um feixe de radiação ótica que compreende duas ou mais frequências óticas separadas uma da outra por uma ou mais radiofrequências. Em algumas modalidades, o feixe ótico pode incluir uma pluralidade de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados cada um dos quais tem um deslocamento de radiofrequência em relação ao outro. Em alguns casos, a utilização de tal feixe permite iluminar diferen- tes localizações dentro de uma partícula (por exemplo, uma célula) em diferentes frequências óticas deslocadas em radiofrequência. Como abaixo discutido em mais detalhes, tais métodos podem prover uma decisão de classificação empregando um sinal variado no tempo gerado pelas células em resposta à iluminação pelo feixe ótico sem uma necessidade de computar uma imagem de fluorescência com base no(s) sinal(is) detectado(s). Apesar de várias modalidades dos métodos de acordo com os presentes ensinamentos serem abaixo discutidas abaixo no contexto de classificar células (por exemplo, em um sistema de citometria de fluxo), os métodos aqui descritos podem também ser empregados para classificar outros tipos de partículas, tais como, pequenos organismos (por exemplo, o nematóide c. elegans), gotas, micropartículas, nanopartículas, partículas virais, bactérias, exossomas, ou produtos farmacêuticos. Em algumas modalidades, as partículas que podem ser classificadas utilizando os presentes ensinamentos podem ter um tamanho (por exemplo, um tamanho máximo) em uma faixa de aproximadamente 50 nanômetros a aproximadamente 1 milímetro, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 100 nanômetros a aproximadamente 1 micrômetro.

[00181] Ainda, em muitas modalidades, os métodos de classificação aqui discutidos podem ser empregados para prover decisões de classificação com uma baixa latência, por exemplo, de modo que uma célula ou outra partícula possa ser classificada utilizando um aparelho de classificação que opera em um alto rendimento de partículas (por exemplo, mais do que 1000 operações de classificação por segundo podem ser executadas). Por meio de exemplo, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para tomar uma decisão de classificação com uma latência igual a ou menor do que aproximadamente 100 mi- crossegundos, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 10 microssegundos a aproximadamente 100 microssegundos, ou em uma faixa de aproximadamente 20 microssegundos a aproximadamente 80 microssegundos, ou em uma faixa de aproximadamente 30 microsse- gundos a aproximadamente 70, ou 50, microssegundos. O termo "la- tência" é aqui utilizado para indicar o lapso de tempo entre iluminar uma partícula, por exemplo, uma célula, com radiação de interrogação e chegar uma característica da partícula e/ou uma decisão de classificação referente àquela partícula.

[00182] Por meio de exemplo, o fluxograma da Figura 16C apresenta um método de acordo com uma modalidade para classificar partículas (por exemplo, células) com base no grau de co-localização de sinais de fluorescência que corresponde a dois ou mais fluoróforos (por exemplo, fluoróforos exógenos e/ou endógenos) que emanam das partículas. Sem nenhuma perda de generalidade, a partícula é assumida ser uma célula na discussão seguinte. Na etapa (1), uma célula é oticamente interrogada através de iluminação com um feixe de radiação ótica que inclui duas ou mais frequências óticas que estão separadas uma da outra por uma ou mais radiofrequências. Em alguns casos, o feixe ótico pode incluir uma pluralidade de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados cada um dos quais tem um deslocamento de radiofrequência em relação ao outro. A utilização de tal feixe permite iluminar diferentes localizações dentro da célula em diferentes frequências óticas, as quais são deslocadas uma da outra por uma ou mais radiofrequências. As frequências óticas podem ser selecionadas para excitar dois ou mais fluoróforos que são esperados es-tarem associados com a célula. Por exemplo, os fluoróforos podem ser moléculas de corante fluorescente com as quais a célula é sinalizada, por exemplo, através de tingimento. Por meio de exemplo, em algumas modalidades, as frequências óticas da radiação feixe podem estar em uma faixa de aproximadamente 300 THZ a aproximadamente 1000 THZ e a separação de radiofrequência entre as frequências óticas po- de estar, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 50 MHz a aproximadamente 250 MHz.

[00183] A radiação fluorescente que emana da célula excitada pode então ser coletada em dois (ou mais) canais de fluorescência separados, cada um dos quais corresponde à radiação fluorescente emitida por um dos fluoróforos (etapa 2). Isto pode ser conseguido, por exemplo, empregando a disposição de detector acima discutida em conexão com a Figura 9A. A radiação fluorescente coletada em cada canal pode ser digitalizada (etapa 3) e representada como uma sequência de tempo de valores de sinal (intensidade de fluorescência). Nesta e outras modalidades, tal sequência de tempo de valores de sinal, a qual pode codificar as frequências de batida presentes na radiação fluorescente é referida como forma de onda de frequência de tempo. A forma de onda de frequência de tempo digitalizada que corresponde a dois ou mais canais de fluorescência é temporalmente sincronizada (etapa 4) e normalizada (etapa 5). A normalização pode ser conseguida, por exemplo, dividindo cada forma de onda por seu valor máximo e multiplicando a forma de onda por um fator de escalagem.

[00184] Um filtro de passagem alta ou de passagem de banda pode ser aplicado a pelo menos uma das formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda filtrada (etapa 6). Em algumas modalidades, um filtro de passagem baixa é aplicado que permite a passagem de frequências menores do que aproximadamente 1 MHz, e substancialmente bloqueia frequências mais altas. Alguns exemplos de filtros de passagem baixa adequados incluem, sem limitação, filtros de resposta de impulso finito de domínio de tempo (FIR) ou filtros de domínio de Fourier.

[00185] As formas de onda podem então ser multiplicadas por pontos para obter uma forma de onda multiplicativa, e a forma de onda multiplicativa pode ser integrada para obter um valor integrado (etapa 7). Por meio de ilustração, a Figura 17 mostra uma rede 1700 que re-presenta o sinal de fluorescência digitalizado sequenciado no tempo normalizado filtrado detectada em um canal de fluorescência e uma rede 1701 que representa o sinal de fluorescência digitalizado se- quenciado no tempo normalizado filtrado detectado em outro canal de fluorescência, o qual é temporalmente sincronizado com a rede 1700 (para simplicidade, neste exemplo ilustrativo, o número de canais de fluorescência é escolhido para ser dois e o número de elementos de rede é escolhido para ser dez, deve ser compreendido que o número de canais de fluorescência pode ser mais do que 2 e o número de elementos de rede mais do que 10). Estes dados são aqui referidos como forma de onda de frequência de tempo. Uma rede resultante 1702 é obtida através de multiplicação por pontos dos dados nas redes 1700 e 1701.

[00186] O sinal de fluorescência temporal de cada canal inclui frequências de batida que corresponde à interferência de frequências óticas separadas em radiofrequência do feixe de radiação ótica. Como tal a multiplicação de seus respectivos dados digitalizados exibiria a soma e a diferença destas frequências. Se os sinais nos dois ou mais canais de fluorescência originarem de localizações espaciais substancialmente similares dentro da célula excitada, os dados de domínio de tempo resultantes obtidos através de multiplicação destes sinais incluiriam componentes de frequência em DC ou próximo de DC com base no grau de co-localização dos sinais em diferentes canais de fluorescência que emanam da célula excitada.

[00187] Na etapa (8), o resultado integrado é comparado com um limite predefinido para determinar se a célula interrogada exibe uma suficiente co-localização dos sinais de fluorescência para ser qualificada como uma célula que satisfaz o critério para classificação. Por exemplo, se o resultado integrado for igual ou exceder o limite predefi- nido, a célula seria selecionada para classificação. De outro modo, a célula não seria selecionada para classificação.

[00188] Por meio de ilustração adicional do método de co- localização acima, a Figura 18A mostra imagens de fluorescência de quatro células identificadas como A, B, C, e D, onde as células A e B eram leucócitos humanos tingidos com anti-CD45-FITC e Iodeto de Propídio (PI), e as células C e D eram células HeLa tingidas com Cal- ceína AM. Estes conjuntos de imagens contêm imagens de fluorescência de 2 cores obtidas detectando a fluorescência das células tingidas com os corantes acima mencionados, assim como imagens de campo brilhante e campo escuro. A Figura 18B mostra o sinal de domínio de tempo de fluorescência verde medida (FITC), e a Figura 18C mostra um sinal de domínio de tempo de fluorescência vermelha medida (Iodeto de Propídio), obtidos das células A, B, C, e D em resposta à iluminação destas células com radiação ótica batendo em frequências na faixa de 20 MHz - 60 MHz. A Figura 18D mostra, para cada célula, uma forma de onda de domínio de tempo de co-localização é obtida multiplicando as formas de onda de fluorescência vermelha e verde normalizadas e passando a forma de onda resultante através de um filtro de passagem baixa (filtro de passagem baixa de domínio de Fourier) para gerar um sinal filtrado.

[00189] A Figura 19 mostra os valores do sinal filtrado integrado para cada uma das células A, B, C, e D. A linha tracejada nesta figura representa o limite de classificação. Apesar dos sinais integrados para as células A e B estarem abaixo do limite de classificação, os sinais integrados para as células C e D estão acima do limite de classificação. Assim, uma decisão de classificação positiva é adotada para as células C e D (isto é, células C e D são selecionadas classificação) e uma decisão de classificação negativa é adotada para as células A e B.

[00190] O método de classificação acima com base em co- localização de fluorescência pode ser utilizado em uma variedade de aplicações, por exemplo, para análise de translocação.

[00191] Em outro aspecto, um método para classificar células em um sistema de citometria de fluxo com base em uma estimativa do tamanho de célula está provido, onde uma estimativa do tamanho de célula é obtida através de análise de radiação fluorescente emitida pela célula. Por exemplo, o método utiliza a duração de um pulso de fluorescência pulse que emana de uma célula para estimar a dimensão da célula ao longo da direção e analisa a potência contida em um sinal filtrado em passagem baixa obtido passando o quadrado do sinal de fluorescência através de um filtro de passagem baixa para executar uma decisão de classificação com base em uma estimativa de uma dimensão lateral da célula (por exemplo, uma dimensão da célula ortogonal à direção de fluxo de célula).

[00192] Mais especificamente, com referência à Figura 19, em uma modalidade, uma célula é oticamente interrogada através de iluminação com um feixe de radiação ótica que inclui duas ou mais frequências óticas que estão separadas uma da outra por uma ou mais radiofrequências (etapa 1). Similar às modalidades anteriores, o feixe ótico pode incluir, por exemplo, uma pluralidade de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados cada um dos quais tem um deslocamento de radiofrequência em relação ao outro. As frequências óticas podem ser selecionadas para excitar um ou mais fluoróforos exógenos e/ou endógenos associados com a célula. A célula passa através do feixe de radiação ótica e emite fluorescência em resposta à excitação pelo feixe. Sem perda de generalidade, nesta modalidade, a célula é assumida fluir em uma direção vertical através da iluminação feixe e a fluorescência emitida é detectada em uma direção lateral (horizontal) que é substancialmente ortogonal à direção de fluxo da célula.

[00193] Um sinal de fluorescência emanado da célula é então detectado e digitalizado para gerar uma forma de onda de frequência de tempo (etapa 2). A radiação de fluorescência detectada pode então ser analisada para estimar o tamanho de célula, como abaixo discutido. Em algumas modalidades, a duração de um pulso de dispersão de luz emanado da célula pode ser utilizada para estimar o tamanho de célula ao longo da direção de fluxo.

[00194] A duração de um pulso de fluorescência que emana de uma célula está relacionada com o tempo de contato da célula dentro do feixe de radiação ótica de interrogação, o qual está por sua vez relativo à dimensão do feixe em uma direção paralela à direção de fluxo, o tamanho de célula na direção do fluxo e à velocidade de fluxo da célula. Se o feixe que ilumina a célula tiver um diâmetro (H), e a velocidade de fluxo da célula for V, e a célula tiver um tamanho D (por exemplo, um diâmetro) na direção de fluxo, então o tamanho D pode ser aproximado pela seguinte relação: D = V *T-2~H Eq. (2)

[00195] onde T é a largura de pulso ótico detectada. Com isto, na etapa (3), o tamanho de célula na direção de fluxo é estimado com base na duração temporal da fluorescência ou pulso de dispersão de luz emanado da célula, por exemplo, utilizando a relação acima.

[00196] Com referência continuada ao fluxograma da Figura 20, de modo a estimar o tamanho lateral da célula, os dados de fluorescência digitalizados são elevados ao quadrado (etapa 4) e um filtro de passagem de banda é aplicado nos dados de fluorescência elevados ao quadrado (etapa 5). Os dados filtrados são então integrados para obter uma medida de potência de pulso integrada (etapa 6). A potência de pulso integrada pode prover uma medida do tamanho lateral da célula. Mais especificamente, com base na potência presente nas frequências de diferenças (as quais resultam como uma consequência da opera ção de elevação ao quadrado) que caem dentro da banda do filtro de passagem de banda, a potência de pulso integrada por prover uma medida do tamanho lateral da célula.

[00197] Na etapa (7), a estimativa do tamanho de célula na direção de fluxo e/ou a potência de pulso integrada associada com os dados filtrados podem ser empregadas para tomar uma decisão de classificação com relação à célula. Por exemplo, em algumas modalidades, o tamanho de célula estimado na direção de fluxo pode ser comparado com um primeiro limite e a potência de pulso integrada pode ser comparada com um segundo limite para tomar uma decisão de classificação. Por meio de exemplo, em alguns casos, se tanto o tamanho de célula estimado na direção de fluxo quanto a potência de pulso integrada excederem os respectivos limites, uma decisão de classificação positiva é feita (isto é, a célula é selecionada). Alternativamente, a decisão de classificação pode se basear somente na estimativa do tamanho de célula na direção do fluxo ou da potência de pulso integrada. Como adicionalmente abaixo discutido, em alguns casos, a razão dos tamanhos de célula vertical e horizontal estimados pode ser empregada para tomar uma decisão de classificação.

[00198] Por meio de ilustração adicional de tomar uma decisão de classificação com base em uma estimativa do tamanho lateral de uma célula, a Figura 21A apresenta esquematicamente uma célula hipotética iluminada por um feixe hipotético que compreende uma pluralidade de pequenos feixes modulados em radiofrequência com as modulações de radiofrequência estendendo de 15 MHz a 25 MHz separada umas das outras por 1 MHz. A linha tracejada apresenta esquematicamente uma vista em seção transversal da célula iluminada em um plano ortogonal à direção de iluminação. A radiação de fluorescência coletada da célula e digitalizada pode estar na forma de uma rede se- quenciada em tempo 2100 de valores de fluorescência digitalizados, como mostrado esquematicamente na Figura 21B (a rede está mostrada aqui somente para propósitos ilustrativos e não limita o número de elementos de rede que podem estar presentes em uma forma de onda de fluorescência real). A forma de onda 2100 é elevada ao quadrado para obter a forma de onda 2101. Um filtro de passagem de banda é então aplicado na forma de onda elevada ao quadrado de fluorescência 2101, onde o filtro permite a passagem de frequências de modulação selecionadas entre duas frequências fi e f2 (onde f2 > fi) enquanto substancialmente bloqueando aquelas frequências de modulação que são mais baixas do que fi ou maiores do que f2. Por meio de exemplo, o filtro de passagem de banda pode ser um filtro de passagem de banda FIR, apesar de que outros filtros adequados conhecidos na técnica podem também ser empregados. Os dados filtrados são indicativos da potência presente no pulso de fluorescência detectado em frequências de modulação entre fi e f2. Os dados filtrados são então integrados para obter uma medida da potência de pulso total em frequências entre fi e f2. Este resultado integrado pode então ser comparado com um valor limite para tomar uma decisão de classificação. Por exemplo, o tamanho lateral da célula pode ser estimado ser menor do que um certo valor com base no fato que o resultado integrado é menor do que o limite predefinido.

[00199] Neste exemplo, o tamanho de célula resulta na iluminação da célula por radiação ótica que tem modulações de radiofrequência que variam de aproximadamente i8 MHz a aproximadamente 2i MHz. Com isto, a diferença entre as frequências de modulação máxima e mínima no quadrado dos dados de fluorescência seria aproximadamente 6 MHz. Se a detecção de células que têm maiores tamanhos que resultariam em frequências de diferença no quadrado de seus dados de fluorescência em uma faixa de aproximadamente i0 MHz a aproximadamente i5 MHz fosse desejada, um filtro de passagem de banda que discriminaria contra frequências abaixo de 10 MHz e acima de 15 MHz poderia ser aplicado ao quadrado de dados de fluorescência. Neste exemplo, a aplicação de tal filtro de passagem de banda no quadrado dos dados de fluorescência não resultaria em um sinal suficientemente grande para indicar a presença de células que têm os tamanhos laterais desejados, já que as frequências de modulações de transferência no quadrado dos dados de fluorescência estão abaixo de 10 MHz.

[00200] O método de classificação acima com base em tamanho de célula pode ter uma variedade de diferentes aplicações, por exemplo, isolamento por tamanho de células de tumor circulantes (CTCs).

[00201] Em outro aspecto, um método para classificar células com base em razões de aspecto das está descrito. Por exemplo, com referência ao fluxograma da Figura 22, uma célula que passa através de uma região de interrogação ótica é excitada com radiação e a radiação de fluorescência emitida pela célula e coletada e digitalizada (etapa 1) para gerar uma forma de onda de frequência de tempo digitalizada. Os dados digitalizados são então analisados em um modo acima discutido para estimar o tamanho de célula de vertical (ao longo da direção de fluxo) (etapa 2) e os tamanhos de célula horizontais (ao longo de uma direção ortogonal da direção de fluxo) (etapa 3). Mais especificamente, o tamanho vertical da célula pode ser estimado utilizando a largura temporal de um pulso de fluorescência ou dispersão de luz (ou luz transmitida) emitido pela célula (etapa 2), e o tamanho horizontal da célula pode ser estimado utilizando, por exemplo, o método acima discutido baseado em aplicar um filtro de passagem de banda no quadrado dos dados de fluorescência (etapa 3). Na etapa (4), uma razão das estimativas da dos tamanhos vertical e horizontal da célula é determi-nado e comparado com um limite predefinido para tomar uma decisão de classificação com relação àquela célula. Por exemplo, em alguns casos, se a razão exceder o limite, uma decisão de classificação positiva pode ser feita com relação àquela célula.

[00202] O método de classificação acima baseado em uma razão de aspecto da célula pode ser utilizado, por exemplo, em análise de ciclo de célula, análise de DNA, etc.

[00203] Em outro aspecto, um método para determinar a razão do tamanho de um núcleo da célula em relação ao tamanho de seu citoplasma está descrito. Em algumas modalidades, tal razão pode ser empregada para tomar uma decisão de classificação. Com referência ao fluxograma da Figura 23A, em uma tal modalidade, uma célula é identificada (por exemplo, tingida) com dois marcadores de fluorescência, um dos quais residiria sobre a membrana da célula (limite do citoplasma) e o outro pode permear a membrana de célula e entrar no citoplasma e tingir o núcleo da célula (por exemplo, através de maqui- nário interno da célula) (etapa 1). Alguns exemplos de marcadores de fluorescência que adeririam na membrana de célula incluem qualquer anticorpo marcado com um fluoróforo que adere a uma proteína de membrana, tal como anti-CD45-FITC, ou anti-EpCAM-PE. Outras proteínas de superfície comuns que podem ser empregadas para aderir um marcador de fluorescência na membrana de célula incluem, por exemplo, CD3, CD4, CD8, etc. Alguns exemplos de tingimentos de flu-orescência nuclear adequados incluem, sem limitação, Iodeto de Pro- pídio, SYTO16, 7-AAD, e DAPI.

[00204] A célula é então iluminada com radiação de modo a excitar ambos os tipos de marcadores de fluorescência (etapa 2), e a fluorescência emitida é detectada e digitalizada em dois canais que correspondem à emissão de fluorescência da membrana de célula e de seu núcleo (etapa 3). Os dados de fluorescência que correspondem à membrana de célula são utilizados, por exemplo, em um modo acima discutido, para obter uma estimativa do tamanho do citoplasma, e os dados de fluorescência que correspondem ao núcleo são utilizados para obter uma estimativa do tamanho do núcleo (etapa 4). Por exemplo, a largura do pulso de fluorescência ou dispersão de luz em cada canal pode ser empregada, por exemplo, em um modo acima discutido, para estimar o tamanho de célula ao longo de uma dimensão (isto é, ao longo da direção de fluxo). Ainda, o tamanho lateral do citoplasma ou do núcleo pode ser estimado aplicando um filtro de passagem de banda no quadrado dos dados de fluorescência no respectivo canal em um modo acima discutido. O resultado de integrar estes dados filtrados em passagem de banda provê um valor para comparar com um limite predefinido de modo a classificar células que são maiores ou menores do que o limite. Ainda, as estimativas de tamanho da célula nas duas dimensões podem ser combinadas, por exemplo, obtendo a raiz quadrada da soma dos quadrados das estimativas de tamanho vertical e horizontal, para chegar a uma decisão de classificação com base em uma estimativa do tamanho de célula total.

[00205] Na etapa (5), a razão das estimativas de tamanho para o citoplasma e o núcleo é obtida, por exemplo, a razão dos tamanhos na direção vertical ou horizontal, ou a razão de tamanhos combinados.

[00206] Com referência ao fluxograma da Figura 23B, em algumas modalidades, a razão do tamanho do núcleo da célula em relação ao tamanho de seu citoplasma, a qual pode ser determinada, por exemplo, em um modo acima discutido e representado nas etapas (1) - (5) do fluxograma da Figura 23B, pode ser utilizada para tomar uma decisão de classificação. Por exemplo, a razão pode ser comparada com um limite predefinido para tomar uma decisão de classificação (etapa 6). Por meio de exemplo, se a razão exceder o limite, uma decisão de classificação positiva é feita (isto é, a célula é selecionada).

[00207] Por meio de exemplo, o método de classificação acima com base na razão de tamanho nuclear para citoplasma pode ser utilizado na classificação de células de tumor circulantes.

[00208] Em outro aspecto, um método para estimar a granularidade celular de radiação fluorescente emitida de células (pontuação de fluorescência) está descrito, o qual em algumas modalidades pode ser utilizado para classificar as células. Em outras palavras, uma decisão de classificação pode ser feita com base em se a radiação fluorescente emitida de uma célula pode ser caracterizada como emanando de uma distribuição intracelular difusa de centros de emissão, ou pode ser caracterizada como emanando de centros de emissão que não estão difusamente distribuídos dentro da célula.

[00209] Mais especificamente, com referência ao fluxograma apresentado na Figura 24A, em uma modalidade, uma célula que tem um e ou mais marcadores de fluorescência exógenos e/ou endógenos é iluminada com radiação ótica que tem ou mais frequências óticas separadas uma da outra por uma ou mais radiofrequências de modo a obter radiação de fluorescência do(s) marcador(es) (etapa 1). Similar às modalidades anteriores, em alguns casos, o feixe ótico pode incluir uma pluralidade de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados, cada um dos quais tem um deslocamento de radiofrequência em relação ao outro. Por meio de exemplo, com referência à Figura 25, em uma modalidade exemplar ilustrativa o feixe de radiação ótica pode incluir frequências de modulação f 1, f2, f3, f4, f5, os quais podem abranger, por exemplo, de 10 MHz (fi) a 15 MHz (f5) com uma separação de 0,5 MHz. Como abaixo discutido em mais detalhes, a pontuação da radiação de fluorescência emitida pode ser estimada pelo grau no qual a radiação de fluorescência emitida exibe frequências de modulação outras que aquelas empregadas para modular o feixe ótico (por exemplo, outras que f 1, f2, f3, f4, f5, nesta modalidade). As outras frequências, as quais podem ser frequências entre as frequências utilizadas para modular o feixe ótico, são aqui referidas como "frequências fora de pixel". Em outras palavras, a "fuga" de potência de fluorescência em frequências fora de pixel é indicativa do grau de pontuação da fluorescência emitida; quanto mais fuga mais é a pontuação da fluorescência emitida.

[00210] Referindo novamente ao fluxograma da Figura 24A, a radiação fluorescente pode ser coletada e digitalizada para gerar uma forma de onda de frequência de tempo (etapa 2). Na etapa (3), uma transformada de Fourier, por exemplo, uma Transformada de Fourier Rápida (FFT), da forma de onda inteira é obtida. Subsequentemente, a FFT gerada é normalizada para valores fixos para comparação intercé- lulas (etapa 4), por exemplo, dividindo a forma de onda de domínio de tempo por seu valor máximo e então reescalando a forma de onda pode uma constante desejada. A soma dos bins "fora de pixel" da FFT (isto é, os bins que correspondem a frequências entre as frequências de modulação presentes na radiação ótica de iluminação) é determinada (etapa 5). A soma é indicativa do grau de "fuga" de potência de fluorescência para frequências fora de pixel, e com isto uma medida do grau de pontuação da radiação fluorescente emitida.

[00211] Com referência à Figura 24B, em algumas modalidades, a medida do grau de pontuação da radiação fluorescente emitida, a qual pode ser determinada em um modo acima discutido e representada nas etapas (1) - (5) do fluxograma da Figura 24B, pode ser utilizada para classificar as células. Especificamente, na etapa (6), a soma dos bins "fora de pixel" da FFT, a qual é indicativa do grau de "fuga" de potência de fluorescência para frequências fora de pixel, pode ser comparada com um limite predefinido para tomar uma decisão de classificação. Por exemplo, quando é desejado classificar células que exibem um grau relativamente alto de pontuação de fluorescência, uma célula é classificada (selecionada) se a soma for maior do que o limite. Alternativamente, quando é desejado classificar células que exi- bem fluorescência difusa, uma célula é classificada se a soma for menor do que o limite.

[00212] Tal classificação de células com base na análise da radiação fluorescente emitida pode ser empregada em uma variedade de aplicações, tal como contagem de pontos, hibridização in-situ de fluorescência (FISH), transporte e localização intracelular, e análise de célula única baseada em gotícula.

[00213] Os métodos acima para tomar decisões de classificação para partículas (por exemplo, células que fluem em um sistema de ci- tometria de fluxo) podem ser implementados em uma variedade de modos. Por meio de exemplo, a Figura 26 apresenta esquematicamente um sistema exemplar 2600 para classificar células, o qual pode empregar os presentes ensinamentos para tomar uma decisão de classificação. O sistema 2600 pode incluir um contentor 2601 para armazenar um fluido de suspensão dentro do qual uma pluralidade de células está suspensa. O contentor de suspensão de células 2601 está fluidamente acoplado através de uma entrada 2602 a um conduto de amostra 2603, o qual pode ser formado, por exemplo, de um metal rígido tal como aço inoxidável. O conduto de amostra 2603 está disposto dentro de um recipiente 2604 que inclui uma porção cilíndrica superior 2604a que estende, através de uma porção afinada 2604b, para uma porção cilíndrica inferior 2604c que tem um menor diâmetro, o qual inclui um bocal 2605 em uma sua está fluidamente acoplado a uma fonte de fluido sinovial 2606. Um vibrador acústico 2608 (por exemplo, um acionador piezoeléctrico) está acoplado no bocal e está configurado para causar a vibração do bocal quando energizado por um gerador 2610. Por meio de exemplo, a frequência de vibração pode ser aproximadamente 60 kHz, apesar de que outras frequências de vibração podem ser utilizadas.

[00214] Em utilização, o fluido de suspensão armazenado no con- tentor 2601 é introduzido através da entrada 2602 no conduto 2603. Um fino fluxo do fluido que contém células que sai do contentor 2601 é arrastado pelo fluido sinovial e é carregado para o bocal 2605. O movimento vibratório do bocal pode ser configurado em um modo conhecido na técnica para dividir o fluxo através do bocal em uma pluralidade de gotículas D cada uma das quais contém uma única partícula de célula. Pelo menos algumas das células estão associadas com um ou mais fluoróforos endógenos e/ou exógenos, os quais podem emitir radiação fluorescente em resposta à iluminação por uma radiação de excitação. Uma ampla gama de fluoróforos pode ser utilizada. Em alguns casos, um fluoróforo pode estar preso a um anticorpo que reconhece um alvo (por exemplo, um receptor) sobre uma célula. Em alguns casos, um fluoróforo pode estar preso a uma entidade química que tem uma afinidade para a membrana de célula ou outra estrutura celular, por exemplo, o núcleo da célula. Ainda, em alguns casos, a célula pode ser identificada com uma combinação de diferentes fluoró- foros.

[00215] Com referência continuada à Figura 26, conforme cada célula passa através de uma região de interrogação 2612 esta é iluminada por um feixe de laser 2614 gerado por um sistema de iluminação 2616 para obter radiação fluorescente de um ou mais fluoróforos associados com a célula. Como acima discutido, o feixe de laser pode incluir uma pluralidade de frequências óticas que estão deslocadas uma em relação à outra por uma ou mais radiofrequências. Por meio de exemplo, o feixe ótico pode estar na forma de uma pluralidade de pequenos feixes angularmente ou espacialmente separados que têm deslocamentos de radiofrequência um em relação ao outro. A radiação fluorescente emitida da célula pode ser detectada por um sistema de detecção 2618, o qual pode incluir um ou mais fotodetectores. O fluorescente detectado pode ser analisado por um módulo de análise 2620, em um modo acima discutido, para tomar uma decisão de clas-sificação referente àquela célula.

[00216] Por meio de exemplo, a iluminação dos sistemas de detecção podem ser aquelas acima discutidas, por exemplo, em conexão com as Figuras 1-12. Deve, no entanto, ser compreendido que a prática dos presentes ensinamentos para classificação partícula não está limitada à utilização de qualquer iluminação e sistema de detecção específicos. Ao invés, uma variedade de diferentes sistemas pode ser empregada desde que estes provenham os dados necessários (por exemplo, dados de fluorescência e/ou dispersão) para utilização nos métodos acima para tomar decisões de classificação.

[00217] Referindo novamente à Figura 26, o sistema 2600 ainda inclui um colar de carregamento 2622, o qual é energizado por um circuito de carregamento 2623, o qual está por sua vez sob o controle do módulo de análise 2620. O colar de carregamento pode transmitir uma carga positiva, ou negativa a uma gotícula de célula conforme esta passa através do colar. Alternativamente, o colar pode permitir uma gotícula de célula atravessar sem transmitir uma carga a esta.

[00218] Mais especificamente, o módulo de análise 2620 pode empregar os ensinamentos acima para tomar uma decisão de classificação referente a célula. Com base nesta decisão, o módulo de análise pode determinar se a gotícula de célula precisa ser carregada, e se assim, qual polaridade de carga deve ter transmitida para a célula. O módulo de análise pode então controlar o circuito de carregamento 2623 para transmitir, através do colar 2622, a carga necessária para a gotícula de célula. A célula então passa através de um espaço entre um par de placas de deflexão 2624, o qual está disposto a jusante do colar 2622. Uma fonte de voltagem 2625 aplica uma voltagem a pelo menos uma das placas 2624 para estabelecer um campo elétrico entre as placas. O campo elétrico pode defletir o percurso das gotículas de célula negativa e positiva ao longo de diferentes direções de modo que estas possam ser coletadas, respectivamente, por tubos 2626b e 2626c do coletor de células 2626. As células que não são eletricamente carregadas pelo colar 2622 não são defletidas e são capturadas pelo tubo 2626a do coletor de células.

[00219] Os módulos de análise / controle aqui discutidos, tal como o módulo de análise / controle 2620, podem ser implementados em uma variedade de diferentes modos em hardware, firmware e/ou software utilizando técnicas conhecidas na técnica e de acordo com os presentes ensinamentos. Por meio de exemplo, a Figura 27 apresenta esquematicamente uma implementação exemplar 2700 do módulo de análise / controle 2620, a qual inclui um conversor analógico para digital 2702 para receber sinal(is) de fluorescência do sistema de detecção 2618 e digitalizar o(s) sinal(is) para gerar dados de fluorescência digitalizados. O módulo de análise / controle 2700 pode ainda incluir um processador 2704 para processar os dados de fluorescência de acordo com os presentes ensinamentos para chegar a uma decisão de classificação referente a uma célula sob interrogação. O módulo de análise / controle 2700 pode também incluir uma ROM (memória somente de leitura) 2706, RAM (memória de acesso randômico) 2708 e memória permanente 2710. Um barramento de comunicação 2712 facilita a comunicação entre vários componentes do módulo de análise. Os módulos de memória podem ser utilizados para armazenar instruções para analisar o(s) sinal(is) de fluorescência e os resultados de análise. Por exemplo, em algumas modalidades, instruções para analisar os dados de fluorescência para chegar a uma decisão de classificação de acordo com os presentes ensinamentos podem estar armazenadas na ROM 2706. O processador 2704 pode empregar estas instruções para operar sobre os dados de fluorescência digitalizados armazenados na RAM 2708 de modo a determinar uma decisão de clas- sificação. Em algumas modalidades, o processador pode estar imple-mentado como um ASIC (circuito integrado de aplicação específica) que está configurado para executar as instruções de acordo com os presentes ensinamentos para operar sobre os dados de fluorescência para chegar a uma decisão de classificação. Nesta modalidade o módulo de análise / controle 2700 pode ainda incluir um módulo de comunicação / controle 2714 para enviar sinais apropriados para o circuito de carregamento com base na decisão de classificação de modo a transmitir uma carga adequada para uma célula sob interrogação.

[00220] Como acima discutido, os métodos de acordo com os presentes ensinamentos operam sobre dados de fluorescência temporais para chegar a uma decisão de classificação para uma partícula (por exemplo, a célula) sem a necessidade de formar uma imagem de fluorescência de pixel por pixel da célula. Isto por sua vez permite classificar células com uma baixa latência, por exemplo, menos do que aproximadamente 100 microssegundos, o que por sua ver permite classificar células em uma alta. Por exemplo, os métodos de classificação de acordo com os presentes ensinamentos podem permitir classificar células a uma taxa igual a ou maior do que 1000 células por segundo, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente 1000 a aproximadamente 100.000 células por segundo.

[00221] Apesar de não limitados a nenhuma tecnologia de iluminação ou detecção específica, como acima notado, em algumas modalidades os métodos de classificação de célula de acordo com os presentes ensinamentos podem ser efetivamente utilizados em sistemas de citometria de fluxo que empregam multiplexação de domínio de frequência para excitar uma linha de pixels, cada um " identificado" em uma única radiofrequência gerada, por exemplo, batendo dois feixes baseados em deslocamento de frequência. Utilizando multiplexação de domínio de frequência, a radiação fluorescente (ou dispersa) de cen- tenas de pixels em uma única linha de uma imagem pode ser detectada e lida utilizando, por exemplo, um único tubo fotomultiplicador (PMT) para cada cor fluorescente ou direção dispersa. Como a excitação de cada pixel em uma linha de imagem é modulada em uma única frequência de batida, a taxa de pixels escala com a largura de banda de RF total do sistema, o que pode prover uma curta sensibilidade limitada a ruído em taxas de pixels de mais do que 100 MHz. Como acima discutido, os métodos de classificação de acordo com os presentes ensinamentos podem empregar os dados de imagem, os quais estão codificados em um formato de frequência de tempo, para executar decisões de classificação sem realmente computar a imagem.

[00222] Ainda, o sistema acima pode ser empregado para classificar partículas (por exemplo, células) com base na radiação dispersa que emana das partículas em resposta iluminação. A radiação dispersa pode ser detectada e analisada, por exemplo, em um modo acima discutido, para chegar a uma decisão de classificação.

[00223] Por meio de exemplos adicionais, as seguintes Patentes U.S. proveem informações referentes a sistemas de classificação que podem ser modificados de acordo os presentes ensinamentos para praticar os métodos e sistemas de classificação aqui apresentados: Patente U.S. Número 3.380.584 intitulada "Separador de Partículas", Patente U.S. Número 9.034.259 intitulada "Citômetro de fluxo e Cito- metria de fluxo", e Patente U.S. Número 7.417.734 intitulada "Sistema e Processo para Classificar Partículas Biológicas", cada uma das quais está aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[00224] Por meio de elucidação adicional, o Apêndice A provê informações adicionais referentes a vários aspectos dos presentes ensinamentos.

[00225] Aqueles versados na técnica apreciarão que várias mudanças podem ser feitas sem afastar do escopo dos presentes ensina- mentos. Especificamente, vários aspectos, estruturas, ou características de modalidades acima discutidas podem ser combinados em um modo adequado. Por exemplo, os sistemas de detecção discutidos em conexão com uma modalidade podem ser utilizados em outra modalidade.

Apêndice A

[00226] Como acima discutido, em algumas modalidades, dois ou mais pequenos feixes com uma modulação de amplitude de radiofrequência iluminam uma amostra em localizações espacialmente distintas. A interação entre a amostra e cada pequeno feixe pode produzir pelo menos um de sinais de emissão dispersos, de transmissão, e fluorescentes, cada um dos quais é modulado em amplitude com a radiofrequência correspondente do pequeno feixe. O sinal coletado pode ser representado com a soma das contribuições de cada pequeno feixe modulado:

[00227] onde S(t) representa o sinal coletado, Pi(t) representa o sinal de emissão disperso dependente de tempo, de transmissão, ou fluorescente associado com o io pequeno feixe, Am representa a profundidade de modulação do pequeno feixe, e w, e Φi representam a frequência e fase angular da modulação de radiofrequência do pequeno feixe, respectivamente. Uma representação de imagem da partícula pode ser derivada atribuindo cada pequeno feixe a uma diferente coluna da imagem, e cada momento no tempo a uma diferente linha da imagem. Esta representação de imagem está conectada no sinal coletado através da Transformada de Fourier:

[00228] onde F é uma matriz que implementa a Transformada de Fourier de tempo curto, W é uma matriz que mapeia os componentes de Fourier para pixels de imagem, e R é uma matriz que executa qual- quer pós-processamento de domínio de imagem linear desejado tal como filtragem, subtração de fundo, e correção de vinheta. Qualquer característica linear de uma partícula pode ser representada por uma multiplicação de matriz sobre uma imagem. Portanto, para uma matriz M que computa qualquer característica linear desejada, a característica pode ser computada diretamente, isto é, sem a necessidade de primeiro computar uma imagem, de sinais coletados através de:

[00229] onde Q é uma matriz que representa a transformação da representação de partícula presente para a característica linear desejada. Com isto qualquer característica linear pode ser computada inicialmente computando a matriz Q, por exemplo, offline em uma etapa de pré-processamento, então executando um produto de ponto como indicado na Eq. (5), por exemplo, online, para extrair a característica desejada. Em muitas modalidades, para todas as características, é desejado também subtrair do sinal de fundo para a característica. Este processo ser sumarizado como segue: Compute: Q = M - R - W - F Compute: Qbkg = M ■ R- Wbkg • F While data is being collected: If a particle is detected: Compute: D = Q - S(t) Else: Compute: Dbkg(i) = Qbkg • S(t) Compute: Dbkg = mean (Dbkg(i)) Yield: D — Dbkg

[00230] Como acima discutido, em algumas modalidades, uma ou mais características computadas de uma partícula podem ser empregadas para tomar uma decisão de classificação referente àquela partí- cula. Por meio de um exemplo adicional, a Figura 28 mostra um fluxo- grama que apresenta várias etapas em tal método de classificação. Em uma etapa inicial (1), as matrizes Q, e Q_bkg acima podem ser computadas com base em um aspecto de partícula desejado (característica). Subsequentemente, um sinal ótico disperso, transmitido ou emitido, por exemplo, de uma célula de fluxo de um citômetro de fluxo iluminado com radiação ótica modulada em radiofrequência, pode ser coletado e digitalizado (etapa 2). O sinal pode ser comparado com um cruzamento limite para determinar se o sinal é de uma partícula, isto é, se uma partícula estava presente (etapa 3). Se for determinado que uma partícula estava presente, cada sinal de amostra digitalizado é multiplicado por Q (etapa 4) seguido por integração do resultado em um único valor (etapa 5). Um sinal de fundo é subtraído do valor integrado (etapa 6) para obter uma estimativa do aspecto desejado (característica) da partícula. A decisão de classificação pode ser feita através de comparação da estimativa da característica com um limite (etapa 7). Com referência continuada ao fluxograma da Figura 28, um ou mais sinais digitalizados obtidos na ausência de uma partícula, podem ser multiplicados por Q_bkg (etapa 8), e diversas medidas de fundo podem ter a média calculada para obter a estimativa de fundo empregada na etapa (6).

[00231] Em algumas modalidades, vários momentos de um sinal recebido podem ser utilizados para obter informações a distribuição espacial de radiação dispersa, transmitida, ou emitida. Momentos de imagem são características de imagem linear de classe que representam a soma ponderada de pixels de acordo com a sua distância de uma origem arbitrária, tomada para alguma potência arbitrária:

[00232] Cada momento de imagem codifica diferentes informações sobre a distribuição espacial de luz dispersa, transmitida, ou emitida. Momentos de ordem mais alta ponderam pixels mais de acordo com a sua distância da origem, com cada momento provendo diferentes informações sobre a distribuição de sinal. Em várias modalidades, todas estas características podem ser computadas diretamente do sinal medido S(t) pré-computando um Q apropriado.

[00233] Os componentes de Fourier espaciais podem ser computados no mesmo modo, com M definido como segue:

[00234] Os componentes desejados podem ser selecionados antes de um experimento, e um Q separado pode ser pré-computado para cada um. Por meio de exemplo, os componentes Fourier podem ser utilizados para determinar se uma partícula está em foco de radiação de iluminação.

[00235] Algumas características de imagem envolvem transformações não lineares sobre os dados antes de extração de característica. Para um subconjunto de tais características, é possível representá-las como combinações não lineares de características lineares. Computar tais características pode envolver primeiro computar múltiplas características como na seção anterior em paralelo, então combinar os resultados em um modo não linear. Existem muitas características de imagem úteis que podem ser expressas por combinações não lineares de momentos de imagem. Por exemplo, o centro de massa dos pixels pode ser calculado pela razão de momentos de primeira e zero ordem:

[00236] Diversas outras características de partículas podem ser re-presentadas deste modo. Uma lista não exaustiva está na Tabela 1 abaixo; Tabela 1

[00237] Em algumas modalidades, momentos de segunda ordem centrais podem ser utilizados para discriminar dubletos. Partículas com altos momentos de segunda ordem em sinais de luz dispersa ou transmitida indicam uma maior distribuição de sinal. Por meio de exemplo, a Figura 29 mostra um gráfico de dispersão que corresponde a momentos centrais horizontais e verticais de uma pluralidade de células sanguíneas.

Co-localização e Similaridade

[00238] Em algumas modalidades, a similaridade entre uma partícula e uma referência podem ser computadas no mesmo modo que co- localização. No caso de co-localização, as duas formas de onda correspondem a diferentes detectores dirigidos para a mesma partícula; no caso de similaridade, as duas formas de onda correspondem ao mesmo detector dirigido para duas diferentes partículas. Um algoritmo exemplar para detectar a similaridade entre uma partícula e uma referência está abaixo sumarizado:

[00239] Façamos R representar a forma de onda que corresponde a uma partícula de referência, Filt ser um filtro de passagem alta ou passagem de banda que passa somente frequências moduladas, e N ser o número de pixels em uma representação de imagem da partícula de referência. O algoritmo então incluirá: ff =

[00240] Compute

[00241] Compute

[00242] Compute =

[00243] Para cada forma de onda de entrada S que corresponde a uma partícula sob estudo:

[00244] Retornar

como uma medida da similaridade da partícula com a partícula de referência.

Claims

1. Método para classificar células em um sistema de citometria de fluxo, caracterizado pelo fato de que compreende: iluminar uma célula com um feixe de radiação ótica que tem pelo menos duas frequências óticas deslocadas uma da outra por uma radiofrequência para obter radiação fluorescente da célula, detectar a radiação fluorescente para gerar dados de fluorescência temporais, e processar os ditos dados de fluorescência temporais para chegar a uma decisão de classificação referente à dita célula.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de processamento compreende operar sobre os ditos dados de fluorescência para obter uma estimativa de uma característica da célula e tomar a dita decisão de classificação com base na dita estimativa, em que a dita decisão de classificação é realizada sem gerar uma imagem de fluorescência com base nos ditos dados de fluorescência.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de processamento compreende analisar pelo menos uma frequência de batida associada com a dita radiofrequência nos ditos dados de fluorescência temporais para obter a dita estimativa de uma característica da célula.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita característica da célula compreende qualquer um de um tamanho dimensional da célula, uma razão de tamanhos da célula ao longo de duas diferentes dimensões, co-localização de radiação de fluorescência emitida por dois ou mais marcadores associados com a célula, uma razão de tamanhos do citoplasma e núcleo da célula, um grau de pontuação de radiação fluorescente emitida da célula, uma medida da distribuição espacial da radiação fluorescente, uma medida de localização ou orientação da célula, uma medida de excentricidade da célula, uma medida da similaridade da célula para uma célula de referência, uma combinação de um ou mais componentes de Fourier espaciais da célula, uma medida do grau no qual a célula fica em um ponto focal da radiação de iluminação.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de processamento é suficientemente rápida de modo que uma latência associada com chegar na dita decisão de classificação é menor do que aproximadamente 100 microssegundos.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito feixe ótico está configurado de modo que uma frequência ótica na qual cada uma de uma pluralidade de localizações espaciais dentro da célula é iluminada corresponde a uma diferente das ditas frequências óticas deslocadas em radiofrequência.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita célula é tingida com pelo menos dois marcadores de fluorescência e a dita radiação ótica está configurada para obter a radiação fluorescente dos ditos marcadores.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que ainda compreende coletar e digitalizar a radiação fluorescente emanada dos ditos marcadores para gerar formas de onda de fluorescência temporais cada uma correspondendo a um dos ditos marcadores.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de processamento compreende operar sobre as ditas formas de onda de fluorescência para obter uma medida co-localização dos ditos sinais de fluorescência que correspondem aos ditos marcadores de fluorescência e tomar a dita decisão de classificação com base na dita medida de co-localização.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de operar sobre as ditas formas de onda compreende: aplicar um filtro de passagem alta ou de passagem de banda a pelo menos uma das ditas formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda filtrada seguida por uma multiplicação por pontos das ditas formas de onda para gerar uma forma de onda multiplicativa resultante, integrar a dita forma de onda filtrada para obter um valor integrado, e comparar o valor integrado com um limite predefinido para obter a dita medida de co-localização; ou aplicar um filtro de passagem alta ou de passagem de banda a pelo menos uma das ditas formas de onda para gerar pelo menos uma forma de onda filtrada seguida por uma multiplicação por pontos das ditas formas de onda para gerar uma forma de onda multiplicativa resultante, integrar a dita forma de onda multiplicativa para obter um valor integrado, subtrair um valor de fundo do valor integrado e escalar o valor resultante por intensidade para gerar um valor finalizado, e comparar o valor finalizado com um limite predefinido para obter a dita medida de co-localização.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de processamento compreende operar sobre os ditos dados de fluorescência: para obter uma estimativa de um tamanho da célula e tomar a dita decisão de classificação com base no dito tamanho de célula estimado; ou para obter uma razão de tamanho de célula ao longo de duas diferentes dimensões e utilizar a dita razão para tomar a decisão de classificação.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende obter uma transformada de Fourier dos ditos dados de fluorescência, e determinar frequências na transformada diferentes das ditas radiofrequências, obter uma soma de valores de transformada de Fourier nas ditas diferentes frequências, e comparar a dita soma com um limite predefinido para tomar a decisão de classificação. para chegar a uma decisão de classificação referente à dita célula.

13. Sistema para classificar partículas, caracterizado pelo fato de que compreende: um sistema de iluminação para iluminar uma partícula com radiação ótica modulada em radiofrequência, um sistema de detecção para detectar qualquer uma de radiação fluorescente e dispersa que emana da partícula em resposta à dita iluminação para gerar dados de fluorescência ou dispersão, um módulo de análise em comunicação com o dito sistema de detecção para receber qualquer um dos ditos dados de fluorescência e dispersão e processar os ditos dados para chegar a uma decisão de classificação referente à dita partícula, e um atuador capaz de desviar as partículas de seu percurso de fluxo para contentores separados com base na dita decisão de classificação.

14. Sistema de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito módulo de análise chega na decisão de classificação sem formar uma imagem da partícula com base nos ditos dados de fluorescência ou dispersão.

15. Sistema de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito módulo de análise é configurado para processar os ditos dados suficientemente rápido de modo que uma latência associada com obter a dita decisão de classificação é menor do que aproximadamente 100 microssegundos.