JP7130562B2 - ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別 - Google Patents
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Description
Ecom=ERFej(ω0+ωRF)+ELOej(ω0+ωLO) 式(1)
ここで、
Ecomは、複合されたビームの電場を示し、
ERFは、RFコムビームの1つに関連する電場の振幅を示し、
ELOは、LOビームに関連する電場の振幅を示し、
φ0は、レーザー12によって生成されたレーザービームの周波数を示し、
φRFは、RFコムビームに関連する周波数シフトを示し、そして
φLOは、LOビームに関連する周波数シフトを示す。
D=V×T-2×H 式(2)
ここで、Tは、検出された光パルス幅である。したがって、ステップ(3)では、フローの方向の細胞サイズは、例えば上記の関係を使用して、細胞から発せられる蛍光または光散乱パルスの持続時間に基づいて推定される。
上述したように、いくつかの実施形態では、高周波振幅変調を伴う2つ以上のビームレットは、空間的に異なる位置で試料を照射する。試料と各ビームレットとの間の相互作用は、各々がビームレットの対応する高周波で振幅変調される散乱、透過、及び蛍光発光シグナルのうち少なくとも1つを生成し得る。収集されたシグナルは、各変調されたビームレットからの寄与の合計として表してもよい。
S(t)=ΣiPi(t)・(1+Amcos(ωit+φi)) 式(3)
式中、S(t)は、収集されたシグナルを表し、Pi(t)は、i番目のビームレットに関連する時間依存の散乱、透過、または蛍光発光シグナルを表し、Amはビームレットの変調深度を表し、wi及びφiは、それぞれ、ビームレットの高周波変調の角周波数及び相を表す。粒子の画像提示は、各ビームレットを画像の異なる列に割り当て、時間の各モーメントを画像の異なる行に割り当てることによって導出し得る。この画像提示は、フーリエ変換を介して収集されたシグナルに接続される。
Im(x,y)=R・W・F・S(t) 式(4)
ここで、Fは短時間フーリエ変換を実現する行列であり、Wはフーリエ成分を画像ピクセルにマッピングする行列であり、かつRは、フィルタリング、バックグラウンド減算、及びビネット補正などの任意の所望の線形画像領域後処理を実行する行列である。粒子の任意の線形特徴は、画像上の行列乗算によって表され得る。したがって、任意の所望の線形特徴を計算する行列Mに関して、特徴は、直接、すなわち、画像を最初に計算する必要なしに、以下を介して収集されたシグナルから、算出され得る。
M・Im(x,y)=M・R・W・F・S(t)=Q・S(t) 式(5)
Q=M・R・W・F 式(6)
式中、Qは、現在の粒子表現から所望の線形特徴への変換を表す行列である。したがって、任意の線形特徴は、行列Qを最初に計算することによって、例えば、前処理ステップにおいてオフラインで、次に式(5)に示すように、例えば、オンラインで、ドット積を実行することによって計算して、所望の特徴を抽出し得る。多くの実施形態では、すべての特徴について、この特徴へのバックグラウンドシグナルの寄与も差し引くことが望ましい。このプロセスは次のように要約してもよい。
計算する:Q=M・R・W・F
計算する:Qbkg=M・R・Wbkg・F
データを収集しながら、
ある粒子が検出される場合、
計算する:D=Q・S(t)
その他:
計算する:Dbkg(i)=Qbkg・S(t)
計算する:Dbkg=平均(Dbkg(i))
収率:D-Dbkg
M(u,v)=exp(-j2π(ux+vy)) 式(8)
いくつかの実施形態では、粒子と基準との間の類似性は、共局在化と同じ方法で計算され得る。共局在化の場合、2つの波形は、同じ粒子を検査する異なる検出器に相当する。類似の場合、2つの波形は、2つの異なる粒子を検査する同じ検出器に相当する。粒子と基準との間の類似性を検出するための例示的なアルゴリズムを以下に要約する。
D=S’・R’を計算し、
S2=||S’||2を計算する。
本出願は、2016年3月17日に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「Cell Sorting Using A High Throughput Fluorescence Flow Cytometer(ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別)」と題する仮出願番号62/309,806の優先権を主張する。
本発明は、国立科学財団、助成金番号NSF 1447381によって資金提供されている。政府は、本発明に一定の権利を有する。
Claims (15)
- フローサイトメトリーシステムにおいて細胞を選別する方法であって、
高周波によって互いにシフトされた少なくとも2つの光周波数を有する光学的放射線ビームで細胞を照射して前記細胞から蛍光放射線を誘発することと、
前記蛍光放射線を検出して時間蛍光データを生成することと、
前記時間蛍光データを処理して前記細胞に関する選別決定に達することと
を有しており、
前記時間蛍光データを処理することは、
前記時間蛍光データに関連するうなり周波数を分析して、前記細胞の特性の推定値を生成すること、
時間蛍光波形を生成し、前記時間蛍光波形に対応する蛍光シグナルの共局在化の尺度を得ること、
時間蛍光波形を生成し、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記波形の少なくとも1つに適用して、少なくとも1つのフィルタされた波形を生成し、続いて、前記波形の点ごとの乗算を行って乗算波形を生成し、前記フィルタされた波形を積分して積分値を取得し、前記積分値を所定の閾値と比較して共局在化の尺度を得ること、
時間蛍光波形を生成し、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記波形の少なくとも1つに適用して、少なくとも1つのフィルタされた波形を生成し、続いて、前記波形の点ごとの乗算を行って乗算波形を生成し、前記乗算波形を積分して積分値を取得し、前記積分値からバックグラウンド値を減算し、その結果値を強度でスケーリングして最終値を生成し、前記最終値を所定の閾値と比較して共局在化の尺度を得ること、及び、
前記時間蛍光データのフーリエ変換を取得し、前記細胞から蛍光放射線を誘発するために前記高周波とは異なるフーリエ変換の周波数を決定し、異なる周波数でのフーリエ変換値の合計を取得し、前記合計を所定の閾値と比較して選別決定を行うこと
の1つまたは複数を含む、
方法。 - 前記処理するステップは、
蛍光データを操作して前記細胞の特性の推定値を得ることと、前記推定値に基づいて前記選別決定を行うこととを含み、
前記選別決定は、前記蛍光データに基づいて蛍光画像を生成することなく行われる
請求項1に記載の方法。 - 前記処理するステップは、前記時間蛍光データ内の高周波に関連する少なくとも1つのうなり周波数を分析して、前記細胞の特性の推定値を得ることを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞の特性は、前記細胞の寸法サイズ、2つの異なる次元に沿った前記細胞のサイズの比、前記細胞に関連する2つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、前記細胞の細胞質及び核のサイズの比、前記細胞から放射された蛍光放射線の尖度、前記蛍光放射線の空間分布の尺度、前記細胞の位置または方向の尺度、前記細胞の離心率の尺度、基準細胞に対する前記細胞の類似性の尺度、前記細胞の1つ以上の空間フーリエ成分の組み合わせ、前記細胞が照射放射線の焦点内に存在する程度の尺度のうちのいずれかを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記処理するステップは、選別決定に到達することに関連する潜時が約100マイクロ秒未満となるように、十分に高速である、請求項1に記載の方法。
- 前記光学的放射線ビームは、前記細胞内の複数の空間位置の各々が照射される光周波数が、高周波シフトされた光周波数のうちの異なる周波数に相当するように構成される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、少なくとも2つの蛍光マーカーで染色されており、前記光学的放射線ビームが、前記蛍光マーカーから蛍光放射線を誘発するように構成されている、請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光マーカーの1つにそれぞれが対応する時間蛍光波形を生成するために、前記蛍光マーカーから発せられた蛍光放射線を収集してデジタル化することをさらに有する、請求項7に記載の方法。
- 前記処理するステップは、蛍光波形を操作して蛍光マーカーに相当する蛍光シグナルの共局在化の尺度を得ること、及び、共局在化の尺度に基づいて選別決定を行うことを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記蛍光波形を操作するステップは、
ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記蛍光波形の少なくとも1つに適用して、少なくとも1つのフィルタリングされた波形を生成すること、その後、前記蛍光波形を点ごとの乗算により結果の乗算波形を生成することと、フィルタリングされた波形を積分して積分値を得ることと、積分値を所定の閾値と比較して、前記共局在化の尺度を得ること、または、
ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記蛍光波形の少なくとも1つに適用して、少なくとも1つのフィルタリングされた波形を生成すること、その後、前記蛍光波形の点ごとの乗算により結果の乗算波形を生成することと、前記乗算波形を積分して積分値を得ることと、前記積分値からバックグラウンド値を減算し、結果値を強度でスケーリングして最終値を生成することと、前記最終値を所定の閾値と比較して前記共局在化の尺度を得ること
を含む、請求項9に記載の方法。 - 前記処理するステップは、前記時間蛍光データを操作して、
前記細胞のサイズの推定値を得て、推定された細胞のサイズに基づいて選別決定を行うこと、または、
2つの異なる次元に沿った細胞サイズの比を得ること、及び、この比を利用して選別決定を行うこと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記時間蛍光データのフーリエ変換を得ることと、前記細胞から蛍光放射線を誘発するための前記高周波と異なるフーリエ変換の周波数を決定することと、異なる周波数でのフーリエ変換値の合計を得ることと、この合計を所定の閾値と比較して選別決定を行うこととをさらに有する、請求項1に記載の方法。
- 粒子を選別するためのシステムであって、
高周波変調された光学的放射線で粒子を照射するための照射システムと、
照射に応答して前記粒子から発せられる蛍光放射線を検出して時間蛍光データを生成するための検出システムと、
前記時間蛍光データを受信し、このデータを処理して前記粒子に関する選別決定に到達するために前記検出システムと通信する分析モジュールと、
前記粒子をその流路から分別して選別決定に基づいて容器を選択し得るアクチュエータと
を備えており、
前記分析モジュールは、
前記時間蛍光データに関連するうなり周波数を分析して、前記粒子の特性の推定値を生成すること、
時間蛍光波形を生成し、前記時間蛍光波形に対応する蛍光シグナルの共局在化の尺度を得ること、
時間蛍光波形を生成し、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記波形の少なくとも1つに適用して、少なくとも1つのフィルタされた波形を生成し、続いて、前記波形の点ごとの乗算を行って乗算波形を生成し、前記フィルタされた波形を積分して積分値を取得し、前記積分値を所定の閾値と比較して共局在化の尺度を得ること、
時間蛍光波形を生成し、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記波形の少なくとも1つに適用して、少なくとも1つのフィルタされた波形を生成し、続いて、前記波形の点ごとの乗算を行って乗算波形を生成し、前記乗算波形を積分して積分値を取得し、前記積分値からバックグラウンド値を減算し、その結果値を強度でスケーリングして最終値を生成し、前記最終値を所定の閾値と比較して共局在化の尺度を得ること、及び、
前記時間蛍光データのフーリエ変換を取得し、前記粒子から蛍光放射線を誘発するために前記高周波とは異なるフーリエ変換の周波数を決定し、異なる周波数でのフーリエ変換値の合計を取得し、前記合計を所定の閾値と比較して選別決定を行うこと
の1つまたは複数により、前記時間蛍光データを処理する、
システム。 - 前記分析モジュールは、前記時間蛍光データに基づいて前記粒子の画像を形成することなく、選別決定に到達する、請求項13に記載のシステム。
- 前記分析モジュールは、選別決定に到達することに関連する潜時が約100マイクロ秒未満となるように、十分に高速に前記データを処理するように構成されている、請求項13に記載のシステム。
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