WO2007018087A1 - フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法 - Google Patents

フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007018087A1
WO2007018087A1 PCT/JP2006/315290 JP2006315290W WO2007018087A1 WO 2007018087 A1 WO2007018087 A1 WO 2007018087A1 JP 2006315290 W JP2006315290 W JP 2006315290W WO 2007018087 A1 WO2007018087 A1 WO 2007018087A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fluorescence
scattered light
light
signal
flow
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/315290
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masahiko Kanda
Original Assignee
Bay Bioscience Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bay Bioscience Kabushiki Kaisha filed Critical Bay Bioscience Kabushiki Kaisha
Priority to DE112006002091.9T priority Critical patent/DE112006002091B4/de
Priority to US11/988,386 priority patent/US7990525B2/en
Publication of WO2007018087A1 publication Critical patent/WO2007018087A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
    • G01N21/51—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid inside a container, e.g. in an ampoule
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1425—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry using an analyser being characterised by its control arrangement
    • G01N15/1427—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry using an analyser being characterised by its control arrangement with the synchronisation of components, a time gate for operation of components, or suppression of particle coincidences
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
    • G01N2015/1413—Hydrodynamic focussing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • G01N2015/1438—Using two lasers in succession
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • G01N2015/1454—Optical arrangements using phase shift or interference, e.g. for improving contrast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1477—Multiparameters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N2021/4704—Angular selective
    • G01N2021/4707—Forward scatter; Low angle scatter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6463—Optics
    • G01N2021/6471—Special filters, filter wheel
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers

Definitions

  • the present invention relates to a flow cytometer and a flow cytometry method.
  • a flow cytometer stains a large number of cell particles collected from living organisms (blood, etc.) with a fluorescent labeling reagent, arranges these cell particles in a row in the sheath flow, and laser light is applied to each cell particle.
  • the cells are identified by measuring scattered light (forward scattered light and side scattered light) generated from cell particles and various multicolor fluorescent light depending on the fluorescent dye.
  • the cell sorter uses electrical signals related to scattered light and fluorescence to selectively charge the droplets containing the sorted V ⁇ cell particles and form a DC electric field on the path of the droplets falling. Thus, specific cell particles can be selectively collected.
  • the conventional flow cytometer 101 shown in FIG. 7 generally has a hydrodynamic element for arranging cell particles stained with a fluorescent labeling reagent in a line in the sheath flow, and each cell particle has a different wavelength. And an optical element for irradiating a plurality of laser beams and receiving scattered light and fluorescence.
  • the hydrodynamic element includes a sample suspension supply part 110 for storing a sample suspension, a sheath liquid supply part 112 for storing and supplying a sheath liquid, It has a flow chamber 114 and a flow cell 116 connected downstream of the flow chamber 114.
  • the flow chamber 114 has a substantially cylindrical shape, and a suspension supply pipe 118 along its central axis. Is provided.
  • the sample suspension and sheath liquid stored in the sample suspension supply unit 110 and the sheath liquid supply unit 112 are suspended through the sample tube 120 and the sheath tube 122 by the pressures of the air pumps 111 and 113, respectively.
  • the liquid is supplied into the liquid supply pipe 118 and the flow chamber 114. This forms a sheath-like sheath flow (laminar flow) in which the sheath liquid wraps the sample suspension in a cylindrical shape, and the cell particles 105 contained in the sample suspension are aligned in a row in the flow cell 116. Can do.
  • the optical element includes first, second, and third light sources 130, 132, and 134 that continuously irradiate a plurality of laser beams (excitation light) having different wavelengths.
  • the first light source 130 is, for example, a DPSS laser (Diode Pumped Solid State Laser) that emits a blue laser beam (peak wavelength: 488 nm, output: 20 mW).
  • the second light source 134 is a diode laser that emits a red laser beam (peak wavelength: 635 nm, output: 20 mW)
  • the third light source 136 is an ultraviolet laser beam (peak wavelength: 375 nm, output: This is a diode laser that emits 8 mW).
  • the laser beam from the first, second, and third light sources 130, 132, 134 is obtained by using a light guide member including a condensing lens 136 and the like.
  • the light is condensed at 116 different first, second and third condensing positions Fl, F2, and F3, and these condensing positions are the distance between the condensing positions Fl and F2 and the condensing positions F2, F3. Is designed to be a predetermined distance d in the direction of the sheath flow (Z direction).
  • the optical element is configured to detect forward scattered light (FSC: Forward Scattering Light) generated by the first laser beam 130 being scattered by the cell particle 105.
  • the forward scattered light detection device 150 includes a photodetector 152 that detects forward scattered light of the first laser beam 130.
  • the first side scattered light Z fluorescence detector 1 40 includes a plurality of half mirrors 154, a bandpass filter 156, and a photomultiplier tube 158.
  • the second and third fluorescence detection devices 142 and 144 have one half mirror 154, two band pass filters 156, and a photomultiplier tube 158.
  • the first side scattered light Z fluorescence detector 140 according to the prior art detects side scattered light and fluorescence from the first light source (blue laser) 130, and similarly, second and third fluorescence detection.
  • the devices 14 2 and 144 detect fluorescence from the second light source (red laser) 132 and the third light source (ultraviolet laser) 1 34, respectively.
  • a plurality of laser beams that continuously oscillate are condensed at different condensing positions with an interval d, and scattered light and fluorescent light generated at the respective condensing positions are collected. Are detected independently and output to a signal processing device (not shown).
  • the signal processing device processes analog signals output from the forward scattered light detection device 150, the first side scattered light Z fluorescence detection device 140, and the second and third fluorescence detection devices 142 and 144. .
  • the signal processing apparatus performs the first laser beam.
  • the time force when the fluorescence excited by the first laser beam is detected The first delay time until the fluorescence excited by the third laser beam is detected, and the third time from the time when the fluorescence excited by the second laser beam is detected.
  • the second delay time until the fluorescence excited by the laser beam is detected is calculated, and the signals related to the fluorescence by the first and second laser beams are stored in the FIFO memory for the first and second delay times, respectively.
  • the signal processing device processes signals relating to a plurality of fluorescence and scattered light generated from one cell particle, and identifies this cell particle 105.
  • Patent Document 1 The conventional flow cytometer described above includes three light sources, whereas the flow cytometer described in International Patent Application Publication No. WO2004Z051238 (Patent Document 1) has two light sources.
  • the basic configuration is the same, and the contents described in Patent Document 1 are integrated here as a single unit for reference.
  • the delay time may vary depending on the flow rate of the sheath flow (ie, the pressure of the air pump with respect to the sample suspension and the sheath liquid), the environmental temperature, or the atmospheric pressure. It was impossible to set and maintain this properly, which reduced the accuracy of detection and sorting.
  • the present invention has been made in view of such problems, and one aspect thereof is that cell particles labeled with a plurality of fluorescent dyes without setting a delay time are formed by a plurality of laser light sources.
  • An object of the present invention is to provide a flow cytometer and a flow cytometry method capable of detecting a plurality of fluorescence generated by excitation.
  • another aspect of the present invention provides a flow cytometer and a flow cytometry method that can simplify the adjustment of the optical axis by unifying the optical axis that reaches the cell particles that are flowed during the sheath flow.
  • the purpose is to provide.
  • a plurality of light sources that irradiate a plurality of excitation lights having different wavelengths with a predetermined period and a different phase, and a plurality of excitation lights on the same incident optical path
  • a flow cytometer is provided that includes a light guide member that guides light and collects the dyed particles.
  • the particles flow in a sheath flow that intersects the incident optical path.
  • the flow cytometer detects a fluorescence generated by exciting each particle with a plurality of excitation lights, outputs a fluorescence signal, and converts the fluorescence signal into a phase of the excitation light.
  • a synchronization separation circuit that separates into a plurality of optical signal elements detected in synchronization with each other.
  • the fluorescence detector comprises a photomultiplier tube, and the photomultiplier voltage of the fluorescence detector is changed in response to each phase of the excitation light.
  • an amplification circuit that electrically amplifies the fluorescence signal is provided, and the amplification voltage of the amplification circuit is changed in response to each phase of the excitation light.
  • the apparatus includes a plurality of band-pass filters that are disposed on an emission optical path between the flow cell and each of the plurality of fluorescence detectors and selectively transmit fluorescence having a predetermined wavelength band.
  • the flow cytometer includes a scattered light detector that detects scattered light generated by scattering of each of a plurality of excitation lights with particles and outputs a scattered light signal, and each of the fluorescence detectors. This detects fluorescence in a predetermined period from the time when the scattered light signal exceeds a predetermined threshold.
  • the flow cytometer includes a scattered light detector that detects scattered light generated by scattering of each of a plurality of excitation lights with particles and outputs a scattered light signal.
  • the fluorescence detector includes at least one trigger fluorescence detector, and the fluorescence detector and the scattered light detector are each a point in time when the fluorescence signal detected by the trigger fluorescence detector exceeds a predetermined threshold value. And detect scattered light.
  • the flow cytometer detects forward scattered light generated by scattering of each of a plurality of excitation lights with particles and outputs a forward scattered light signal, a flow cell and a forward cell.
  • a forward-scattered light bandpass filter that is arranged on the outgoing light path between the scattered-light detector and selectively transmits forward-scattered light having a predetermined wavelength band, and each of the plurality of excitation lights is scattered by particles.
  • the side scattered light detector that detects the side scattered light generated in this manner and outputs a side scattered light signal is disposed on the outgoing light path between the flow cell and the side scattered light detector.
  • a side-scattered light bandpass filter that selectively transmits side-scattered light having the above wavelength band.
  • the plurality of light sources pulse-oscillate the plurality of excitation lights with a predetermined period and different phases.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a flow cytometer according to the present invention.
  • FIG. 2 is a timing chart of light pulses emitted from the light source in FIG. 1 and light pulse signals output from the photomultiplier tube.
  • FIG. 3 is a block diagram of the flow cytometer of FIG.
  • FIG. 4 is a timing chart of a forward scattered light pulse signal detected by the photodetector shown in FIG. 3.
  • FIG. 5 is a block diagram of the digital signal processing device shown in FIG.
  • FIG. 6 is a timing chart showing temporal transition of optical signal elements corresponding to each light source output from one photomultiplier tube shown in FIG.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing the configuration of a conventional flow cytometer.
  • FIG. 8 is a block diagram of the flow cytometer of FIG.
  • the flow cytometer 1 shown in FIG. 1 generally includes a hydrodynamic flow mechanism 2 for arranging cell particles stained with a fluorescent labeling reagent or the like in a row in a sheath flow, and a plurality of different wavelengths for each cell particle.
  • An optical mechanism 3 for irradiating laser light and receiving scattered light and fluorescence, and a signal processing device 4 for controlling and processing electric signals related to scattered light and fluorescence output from the optical mechanism 3 are provided.
  • the hydrodynamic flow mechanism 2 stores and supplies a sample suspension supply unit 10 for storing and supplying a sample suspension containing cell particles 5 to be analyzed and a sheath liquid. And a flow cell 16 connected to the downstream of the flow chamber 14.
  • the cell particles 5 to be analyzed are fluorescently labeled with a fluorescent labeling reagent such as a fluorescent dye or a fluorescently labeled monoclonal antibody.
  • a flow cytometer employing a flow cell will be described below.
  • the present invention is equally applicable to a jet 'in' air type flow cytometer. Is done.
  • the fluorescent labeling reagent is not limited to this, but, for example, FITC (Fluoresein) that emits yellow-green fluorescence when excited with blue excitation light, and similarly yellow-green when excited with blue excitation light.
  • PE R-phycoerythrin
  • PE Cy5 red fluorescence
  • PE—Cy7 infrared fluorescence
  • APC Allophycocyanin
  • the flow chamber 14 has a substantially cylindrical shape, and a suspension supply pipe 18 is disposed along the central axis thereof.
  • the sample suspension and sheath liquid stored in the sample suspension supply section 10 and the sheath liquid supply section 12 are suspended via the sample pipe 20 and the sheath pipe 22 by the pressures of the air pumps 11 and 13, respectively. It is supplied into the supply pipe 18 and the flow chamber 14.
  • a sheath-like sheath flow (laminar flow) is formed in which the sheath liquid wraps the sample suspension in a cylindrical shape.
  • the pressure of the sample suspension supply unit 10 to be slightly lower than the pressure of the case liquid supply unit 12, hydrodynamic narrowing occurs, and the sample suspension encased in the sheath liquid is reduced.
  • the flow diameter becomes very small, and the cell particles 5 contained in the sample suspension can be aligned in a row in the flow cell 16 (one cell particle 5 in the flow cell 16 is substantially equally spaced). Can be arranged).
  • the flow cell 16 has an orifice 24 at the lowermost portion, and a sheath flow including cell particles 5 that have passed through the flow cell 16 is jetted by the orifice 24 as well.
  • a vibration device such as a piezoelectric element (not shown)
  • droplets 26 for accommodating the respective cell particles 5 are formed.
  • the cell particle 5 to be sorted When the droplet 26 containing the specific cell particle 5 is sorted (when applied to a cell sorter), the cell particle 5 to be sorted immediately before the break 'off' point at which the droplet 26 is formed.
  • a charging portion (not shown) for charging the sheath flow containing the is disposed.
  • a pair of deflecting plates 28a and 28b applied with a predetermined voltage for example, a DC voltage of 6000 V
  • a predetermined voltage for example, a DC voltage of 6000 V
  • the optical mechanism 3 shown in FIG. 1 includes first, second, and third light sources 30, 32, and 34 that irradiate a plurality of laser beams (excitation light) of different wavelengths onto cell particles 5 aligned in the flow cell 16.
  • the first, second, and third light sources 30, 32, and 34 are arbitrary light sources and do not limit the present invention, but it is preferable to generate coherent light such as a laser beam.
  • the first light source 30 is a blue laser beam (peak wavelength: 488 nm, output: It may be a DPSS laser (Diode Pumped Solid State Laser) that emits 20 mW).
  • the second light source 32 is a diode laser that emits a red laser beam (peak wavelength: 635 nm, output: 20 mW).
  • the third light source 34 is an ultraviolet laser beam (peak wavelength: 375 nm, output: It may be a diode laser that emits 8 mW).
  • the light sources 30, 32, and 34 incorporate a modulator (not shown), and the modulator outputs an output from a clock pulse generation circuit 62 (see FIG. 5) described later.
  • the output pulse waveforms of the laser beams output from the light sources 30, 32, and 34 are controlled so as not to overlap each other. That is, the first, second, and third light sources 30, 32, and 34 have the first, second, and third phases ⁇ , ⁇ , ⁇ that are different in the same period.
  • the beam (excitation light) can be pulse-oscillated.
  • the oscillation frequency is set to 10 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the pulse width of each laser beam is 0.01 ⁇ sec or less.
  • any modulator can be used as the light source 30, 32, 34.
  • the DPSS laser light source 30 Primrose Co., Ltd., located in Baltimore, Maryland, USA.
  • the acousto-optic modulator (model TEM-85-10), which is commercially available from the company (Brimrose Corporation), is suitable for use with diode lasers of red and ultraviolet laser sources 32 and 34.
  • Each laser beam can be pulsed using a semiconductor modulator.
  • the peak intensity of the laser beam can be substantially increased and detection sensitivity can be improved.
  • the laser beams pulsed from the first, second, and third light sources 30, 32, and 34 are guided on the same optical path using the light guide member 36 as shown in FIGS. Then, the same irradiation position on the flow cell 16 is irradiated.
  • the components constituting the light guide member 36 include, for example, an optical fiber 37, a beam expander 38, a half mirror 39, and a condenser lens 40, and all or a part of these components of the light guide member 36. Can be moved in the X, Y, and Z directions to accurately guide the laser beams from the light sources 30, 32, and 34 along the same optical path. wear.
  • the optical mechanism 3 is a forward scattered light (FSC) generated by scattering the blue laser beam at the cell particle 5.
  • the front scattered light detector 42 detects the side scattered light (SSC: Side Scattering Light) generated by each laser beam scattered by the cell particle 5 and each laser beam generated by exciting the cell particle 5
  • a side scattered light Z fluorescence detection device 50 for detecting a plurality of fluorescent lights (FL) having various wavelengths.
  • the forward scattered light detector 42 has a bandpass filter (not shown, for example, a selected wavelength of 488 ⁇ 5 nm) that selectively transmits the blue laser beam, and the blue laser beam is scattered by the cell particles 5. The forward scattered light is detected.
  • the side scattered light Z fluorescence detector 50 detects side scattered light having the same three wavelengths as the laser beam and fluorescence having various wavelengths different from the laser beam wavelength from each light source. Is.
  • the forward scattered light detection device 42 the side scattered light Z fluorescence detection device 50, and the signal processing device 4 will be described in more detail with reference to FIGS.
  • the forward scattered light detection device 42 has a photodetector PD that detects forward scattered light (FSC) from the flow cell 16 via a condenser lens 44 (FIG. 3), and as described above, a blue laser Only the blue forward scattered light generated by the scattering of the blue laser beam by the cell particles 5 is detected through a bandpass filter (not shown) that selectively transmits the beam.
  • the forward scattered light detection device 42 outputs an electrical forward scattered light pulse signal whose voltage changes according to the intensity of the blue forward scattered pulse light to the signal processing device 4.
  • the photodetector PD detects forward scattered light generated by the single cell particle 5 moving in the Z direction in the flow cell 16 by scattering the blue laser beam.
  • the intensity of the forward scattered light pulse signal is increased or decreased over time.
  • the period T during which the forward scattered light pulse signal is detected is the size of the cell particle 5 moving through the flow cell 16 and the flow velocity of the sheath flow ( It depends on the pressure of the air pump 11). For example, when the pressure of the air pump 11 is about 30 psi and the cross-sectional area of the flow cell is about 20000 ⁇ m 2
  • the period T is known to be about 10 seconds.
  • the width w of one pulsed laser beam becomes 0.01 seconds, and within about a period T A 1000-pulse laser beam is alternately applied to the cell particle 5 from the three light sources, and about 333 pulses of the forward scattered light pulse signal of the blue laser beam are detected.
  • the width w of the laser beam is illustrated as being sufficiently large in order to facilitate the drawing.
  • the signal processing device 4 performs the forward scattered light pulse signal and the side scattered light th in the predetermined period T from the time when the output value V of the forward scattered light pulse signal exceeds the predetermined threshold voltage V.
  • a pulse signal and a fluorescence pulse signal are captured as data.
  • the light sources 30, 32, and 34 are respectively a blue laser beam (peak wavelength: 488 nm), a red laser beam (peak wavelength: 635 nm), and an ultraviolet laser beam (peak wavelength). : 375nm), and cell particles 5 are fluorescently labeled using fluorescent labeling reagents consisting of FITC, PE, PE-Cy 5, PE-Cy7, APC, APC-Cy5, Ho-Blue and Ho-Red. And
  • Side scattered light Z Fluorescence detection device 50 roughly includes a plurality of photomultiplier tubes PMTl to PMT6 that detect and amplify weak light electrically, and half mirrors (Half Mirror). HM1 to HM6 and band pass filters BPFl to BPF6 that transmit only light in a predetermined wavelength band.
  • the side scattered light Z fluorescence incident through the rod lens 54 is incident on the half mirror HM1, and part of it is reflected by the bandpass filter BPF1.
  • Bandpass filter BPF1 transmits only blue side scattered light having substantially the same wavelength band (488 nm ⁇ 5 nm) as the first light source 30, and the photomultiplier tube PMT1 is formed as shown in FIG. 2 (d).
  • the light pulse signal of blue side scattered light is output to the signal processor 4.
  • each of the photomultiplier tubes PMT2 to PMT6 detects complex fluorescence in which a plurality of fluorescences having different wavelengths are combined at the oscillation frequency and the phase of the blue, red, and ultraviolet laser beams.
  • each photomultiplier tube PMT2 to PMT6 preferably detects a plurality of fluorescences having different wavelengths.
  • the possible half mirrors HM2 to HM6 and bandpass filters BPF2 to BPF6 are used to selectively detect fluorescence having a specific wavelength band.
  • the light transmitted through the half mirror HM1 enters the half mirror HM2, and the wavelength of the half mirror HM2 is less than 73 Onm. It reflects light having a wavelength of and transmits light having a wavelength of 730 nm or more.
  • the light that has passed through the half mirror HM2 is incident on the bandpass filter BPF2, which transmits only light with a wavelength of 749 nm or more.
  • the photomultiplier tube PMT2 has the first, second, and third phases ⁇ , ⁇ , ⁇ that are irradiated with the first, second, and third lasers.
  • the optical pulse signals detected in the first, second, and third phases ⁇ , ⁇ , ⁇ which constitute a series of optical pulse signals detected by the photomultiplier tube PMT2, are described below.
  • Each is defined as an optical signal element S 1, S 2, S. That is, the optical signal elements S, S, S, S.
  • 21 22 23 21 22 corresponds to fluorescence having a wavelength of 749 nm excited by each light source 30, 32, 34.
  • the electron multiplier PMT2 is a series of optical pulse signals consisting of three optical signal elements S, S and S force.
  • the light reflected by the half mirror HM2 is incident on the half mirror HM3, and the half mirror HM3 reflects light having a wavelength of less than 600 nm and reflects light having a wavelength of 600 nm or more.
  • the light transmitted through the half mirror HM3 is split by the bandpass filter BPF3 that transmits only light having a wavelength band of 680 nm ⁇ 30 nm.
  • the photomultiplier tube PMT3 is shown in Fig. 2 (f). 1, second and third order ⁇ , ⁇ , ⁇
  • a series of light consisting of optical signal elements S, S, S force by detecting fluorescence having a wavelength band of nm
  • the fluorescence reflected by the half mirror HM3 enters the half mirror HM4, and the half mirror HM4 transmits light having a wavelength of less than 550 nm and reflects light having a wavelength of 550 nm or more.
  • the fluorescence reflected by the half mirror HM4 is split by the bandpass filter BPF4 that transmits only the fluorescent light having a wavelength band of 580 nm ⁇ 30 nm, and the photomultiplier tube PMT4 is shown in Fig. 2 (g).
  • the fluorescence reflected by the half mirror HM4 enters the half mirror HM5, and the half mirror HM5 transmits a wavelength of less than 505 nm and reflects a fluorescence of a wavelength of 505 nm or more.
  • the fluorescence reflected by the half mirror HM5 is spectrally separated by the bandpass filter BPF5 that transmits only the fluorescence having a wavelength band of 530 nm ⁇ 30 nm.
  • the photomultiplier tube PMT5 is shown in Fig. 2 (h). 1st, 2nd and 3rd orders ⁇ , ⁇ , ⁇
  • An optical pulse consisting of optical signal elements S, S, S force by detecting fluorescence having a wavelength band of 30 nm
  • the red laser beam excitation light does not produce fluorescence having a shorter wavelength than the excitation light, so the optical signal element S of the photomultiplier tube PMT5 shows a signal due to self-emission fluorescence. .
  • the fluorescence transmitted through the half mirror HM5 is spectrally separated by a bandpass filter BPF6 that transmits only the fluorescence having a wavelength band of 424 nm ⁇ 44 nm, and the photomultiplier tube PMT6 is shown in FIG. As shown, the first, second and third orders ⁇ , ⁇ , ⁇ ⁇ 424nm ⁇ 44
  • the signal processing device 4 includes a clock pulse generation circuit 62 and a laser drive circuit 64 connected to the clock pulse generation circuit 62.
  • the first to third light sources are provided. 30, 32, and 34 are pulse-driven at a constant frequency and different phases ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ).
  • the signal processing device 4 has a synchronization circuit 66, which is connected to a laser drive circuit 64, photomultiplier tubes ⁇ 1 to ⁇ 6, an amplifier circuit (AMP) 70, and a separation circuit 68.
  • a synchronization circuit 66 which is connected to a laser drive circuit 64, photomultiplier tubes ⁇ 1 to ⁇ 6, an amplifier circuit (AMP) 70, and a separation circuit 68.
  • AMP amplifier circuit
  • the signal processing device 4 receives the optical pulse signals from the photodetector PD and the photomultiplier tubes PMT1 to PMT6 from the phase ⁇ of the first to third laser light sources 30, 32, and 34. , ⁇ , ⁇ , and in the separation circuit 68, the photomultiplier tubes ⁇ 1 to ⁇ 6 are used for detection.
  • Each output optical pulse signal is separated into optical signal elements s as shown in Table 1.
  • the optical signal element S has infrared fluorescence ( ⁇ >
  • the optical signal element S is yellow-green fluorescence ( ⁇ generated by excitation with a blue laser beam.
  • the intensity of the light signal element S is determined by the fluorescence labeling reagent.
  • Ho-Red corresponds to yellow-green fluorescence (FL8) generated by excitation with an ultraviolet laser beam.
  • half mirrors HM2 to HM6 and bandpass filters BPF2 to BPF6 having arbitrary selected wavelengths are arranged between the flow cell 16 and the photomultiplier tubes PMT1 to PMT6.
  • the fluorescent light FL1 to FL8 depending on the wavelength of the light source and the fluorescent labeling reagent can be detected as an optical signal element separated from the optical pulse signals detected by the photomultiplier tubes PMT1 to PMT6.
  • the selection wavelength described above is only an example, and the present invention is similarly applied even when light is selected in another appropriate wavelength band. This comes out.
  • the separation circuit 68 may detect all the optical signal elements S in Table 1, but the light corresponding to the side scattered light (SSC) and the fluorescence (FL1 to FL6). You can design your logic to detect only signal element S!
  • the intensity of light detected by the photomultiplier tubes PMT1 to PMT6 largely depends on the wavelength, the configuration of the half mirror, the band pass filter, the size and properties of the cell particles, the staining conditions, and the like. That is, the above-described optical signal element S shown in Table 1 is composed of the light sources 30, 32.
  • the synchronization circuit 66 sets the first photomultiplier voltage HV of the photomultiplier tubes PMT1 to PMT6 to the first level.
  • ⁇ can be changed in synchronization.
  • the synchronization circuit 66 is connected to the optoelectronic circuit.
  • the photomultiplier voltage HV (see Table 2) of multipliers PMT1 to PMT6 is set to the phase ⁇ ,
  • the amplification voltage AMP of the amplification circuit 70 that electrically amplifies the optical pulse signal detected by the photomultiplier tubes PMT1 to PMT6 is switched and controlled as shown in Table 3 using the synchronization circuit 66. May be.
  • the optical signal elements S having a more uniform scale can be obtained by electrically amplifying each optical signal element S using the amplification voltage AMP that changes synchronously.
  • the flow cytometer 1 of the present embodiment detects scattered light and fluorescence in order to identify the cell particles 5 irradiated with the multicolor laser beam. It is preferable to detect the optical pulse signal (optical signal element S) only while the cell particles 5 pass through the flow cell 16 and each laser beam is irradiated. Otherwise, the signal processing device 4 has to process a huge amount of data relating to noise signals not related to the cell particles 5.
  • the signal processing device 4 of the present invention constantly monitors the output value V of the forward scattered light pulse signal, and the output value V is a predetermined threshold voltage V.
  • the output value V of the forward scattered light pulse signal exceeds the predetermined threshold voltage V.
  • the forward scattered light pulse signal, the side scattered light pulse signal, and the fluorescent pulse signal are captured as data in a predetermined period ⁇ from the time point. That is, the signal processing device 4 starts detecting the scattered light pulse signal and the fluorescent pulse signal using the output value V of the forward scattered light pulse signal as a trigger signal.
  • the output value V of the forward scattered light pulse signal is monitored in order to detect the trigger signal for starting the detection of the scattered light pulse signal and the fluorescent pulse signal.
  • the side scattered light pulse signal or any at least one fluorescent pulse signal may be monitored at all times. That is, detection of forward scattered light and fluorescent pulse signal is started from the time when the output value V of the side scattered light pulse signal exceeds a predetermined threshold voltage V.
  • At least one of the plurality of photomultiplier tubes PMT1 to PMT6 is set as the trigger photomultiplier tube PMT, and the fluorescence pulse detected by the trigger photomultiplier tube PMT is set.
  • the signal is constantly monitored, and the forward scattered light pulse signal and the side scattered light pulse are measured for a predetermined period T from when the output value V exceeds a predetermined threshold voltage V.
  • the signal processing device 4 changes the optical signal elements S (FL4), S (from the photomultiplier tube PMT2 in the predetermined period T as shown in FIGS. 6 (a) to (c), for example. FL6), S
  • the signal processor 4 digitally converts the forward scattered light pulse signal detected by the photodetector PD and each optical signal element S detected by the photomultiplier tube PMT and separated by the synchronization signal 66.
  • the analog Z-digital conversion circuit (AZD conversion circuit) 72 is provided.
  • the signal processing device 4 of the present embodiment has an area Z width Z height arithmetic circuit (AZWZH arithmetic circuit) 74, which allows light of a conventional analog waveform directly from the optical signal element S. Data that characterizes cell particles 5 corresponding to the area, width, height, etc. of the pulse signal can be quickly calculated. Then, the optical signal element S (FSC, SSC, FL1 to FL8) to be processed by the parameter selector circuit 76 is selected, and the compensation circuit 78 is similarly ij
  • the digital optical signal element S is used to compensate for the leakage of fluorescence between fluorescence having different wavelength spectra (fluorescence correction is performed).
  • the selected optical signal element S is amplified by the log Z linear amplification circuit 80 and output to the computer 82 and Z or the cell sorter 84.
  • the computer 82 When the computer 82 receives the digital pulse light signal for each cell particle 5, the computer 82 performs various operations. For example, a cell number frequency distribution (dot plot or histogram)
  • the cell sorter 84 can identify the cell particles 5 from the digital pulse optical signal and can sort the droplets containing the specific cell particles 5.
  • a plurality of laser beams are guided on the same optical path, so that it is not necessary to set a delay time as in the conventional flow cytometer and flow cytometry method. Forward and side scattered light and fluorescence from cell particles labeled with multiple fluorescent dyes can be detected. Furthermore, the adjustment of the optical axis from the light source to the flow cell can be greatly simplified.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

　本発明の１つの態様に係るフローサイトメータは、互いに異なる波長を有する複数の励起光を、所定の周期および互いに異なる位相で照射する複数の光源と、複数の励起光を同一の入射光路上に導光し、染色された粒子に集光する導光部材とを備える。本発明のフローサイトメータによれば、遅延時間を設定することなく、複数の蛍光色素により標識された細胞粒子が複数のレーザ光源により励起されて生じた複数の蛍光を検出することができる。

Description

明 細 書
フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法
技術分野
[0001] 本発明は、フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法に関する。
背景技術
[0002] バイオテクノロジの急速な発展に伴い、医学や生物学を含むさまざま分野で多数の 細胞などを自動的に分析 '分別するフローサイトメータおよびセルソータの需要がま すます増大しつつある。フローサイトメータは、概略、生体 (血液など)力も採取された 数多くの細胞粒子を蛍光標識試薬などで染色し、これらの細胞粒子をシースフロー 内で一列に配列し、細胞粒子のそれぞれにレーザ光を照射して、細胞粒子から生じ る散乱光 (前方散乱光および側方散乱光)と蛍光色素に依存するさまざまな多色蛍 光を測定することにより、細胞を同定するものである。また、同定するために収集され た散乱光と蛍光に関する情報を電気的信号に変換し、サンプル力 採取された大量 の細胞粒子を統計的に評価することにより、生体の病変などの状態を診断することが できる。さらにセルソータは、散乱光と蛍光に関する電気的信号を用いて、分取した Vヽ各細胞粒子を含む液滴を選択的に荷電し、この液滴が落下する経路上に直流電 場を形成することにより、特定の細胞粒子を選択的に収集することができる。
[0003] 以下、図 7および図 8を参照しながら、従来式のフローサイトメータを具体的に説明 する。図 7に示す従来式のフローサイトメータ 101は、概略、蛍光標識試薬などで染 色された細胞粒子をシースフロー内で一列に配列するための流体力学的要素と、各 細胞粒子に波長の異なる複数のレーザ光を照射し、散乱光および蛍光を受光する ための光学的要素とを備える。
[0004] 流体力学的要素は、図 7に示すように、サンプル懸濁液を貯蔵するためのサンプル 懸濁液供給部 110と、シース液を貯蔵 '供給するためのシース液供給部 112と、フロ 一チャンバ 114と、フローチャンバ 114の下流に連結されたフローセル 116とを有す る。
[0005] フローチャンバ 114は略円筒形状を有し、その中心軸に沿って懸濁液供給管 118 が配設されて ヽる。サンプル懸濁液供給部 110およびシース液供給部 112に貯蔵さ れたサンプル懸濁液およびシース液は、それぞれのエアポンプ 111, 113の圧力に より、サンプル管 120およびシース管 122を介して懸濁液供給管 118およびフローチ ヤンバ 114内に供給される。これにより、シース液がサンプル懸濁液を円筒状に包み 込む鞘状のシースフロー (層流）が形成され、サンプル懸濁液に含まれる細胞粒子 1 05をフローセル 116内で一列に整列させることができる。
[0006] 一方、光学的要素は、異なる波長を有する複数のレーザビーム (励起光)を連続的 に照射する第 1、第 2および第 3の光源 130, 132, 134を備える。第 1の光源 130は 、例えば、青色レーザビーム（ピーク波長： 488nm,出力： 20mW)を照射する DPSS レーザ（Diode Pumped Solid State Laser：半導体レーザ励起固体レーザ）である。ま た、第 2の光源 134は、赤色レーザビーム（ピーク波長： 635nm,出力： 20mW)を照 射するダイオードレーザで、第 3の光源 136は、紫外レーザビーム（ピーク波長： 375 nm,出力： 8mW)を照射するダイオードレーザである。
[0007] 従来技術によるフローサイトメータによれば、第 1、第 2および第 3の光源 130, 132 , 134からのレーザビームは、集光レンズ 136などからなる導光部材を用いて、フロー セル 116の互いに異なる第 1、第 2および第 3の集光位置 Fl, F2, F3に集光され、こ れらの集光位置は、集光位置 Fl, F2の間隔および集光位置 F2, F3の間隔がシー スフローの方向（Z方向）において所定の距離 dとなるように設計されている。
[0008] さらに、光学的要素は、図 8に示すように、第 1のレーザビーム 130が細胞粒子 105 で散乱して生じた前方散乱光 (FSC : Forward Scattering Light)を検出する前方散乱 光検出装置 150と、各レーザビームが細胞粒子 105で散乱して生じた側方散乱光（ SSC : Side Scattering Light)および青色レーザビームが細胞粒子 105を励起して生 じたさまざまな波長を有する複数の蛍光 (FL： fluorescent light)を検出する第 1の側 方散乱光 Z蛍光検出装置 140と、赤色レーザビームおよび紫外レーザビームが細 胞粒子 105を励起して生じたさまざまな波長を有する複数の蛍光を検出する第 2およ び第 3の蛍光検出装置 142, 144とを備える。
[0009] 前方散乱光検出装置 150は、図 8に示すように、第 1のレーザビーム 130の前方散 乱光を検出する光検出器 152を有する。また、第 1の側方散乱光 Z蛍光検出装置 1 40は、複数のハーフミラー 154、バンドパスフィルタ 156、および光電子増倍管 158 を有する。同様に、第 2および第 3の蛍光検出装置 142, 144は、 1つのハーフミラー 154と、 2つのバンドパスフィルタ 156および光電子増倍管 158を有する。なお、従来 技術による第 1の側方散乱光 Z蛍光検出装置 140は、第 1の光源 (青色レーザ） 130 による側方散乱光および蛍光を検出し、同様に、第 2および第 3の蛍光検出装置 14 2, 144は、それぞれ第 2の光源 (赤色レーザ） 132および第 3の光源 (紫外レーザ） 1 34による蛍光を検出する。
このように、これまでのフローサイトメータによれば、連続発振する複数のレーザビ ームが間隔 dを隔てた異なる集光位置に集光され、それぞれの集光位置で生じた散 乱光および蛍光を独立して検出し、図示しない信号処理装置に出力する。
[0010] 信号処理装置は、前方散乱光検出装置 150、第 1の側方散乱光 Z蛍光検出装置 140、さらに第 2および第 3の蛍光検出装置 142, 144から出力されたアナログ信号 を処理する。
上述のように、第 1、第 2および第 3のレーザビームはフローセル 116の間隔 dを隔 てた異なる集光位置に連続的に照射されるので、信号処理装置は、第 1のレーザビ ームにより励起された蛍光を検出した時点力 第 3のレーザビームにより励起された 蛍光を検出するまでの第 1の遅延時間、および第 2のレーザビームにより励起された 蛍光を検出した時点から第 3のレーザビームにより励起された蛍光を検出するまでの 第 2の遅延時間を算出し、第 1および第 2のレーザビームによる蛍光に関する信号を 、それぞれ第 1および第 2の遅延時間だけ FIFOメモリに格納した後に出力することに より、同一の細胞粒子を第 1、第 2および第 3のレーザビームで励起して生じた蛍光に 関する信号を同時に出力する。こうして、信号処理装置は 1つの細胞粒子から生じる 複数の蛍光および散乱光に関する信号を処理して、この細胞粒子 105を同定する。
[0011] 以上説明した従来式のフローサイトメータが 3つの光源を備えるのに対し、国際特 許出願公開第 WO2004Z051238号パンフレット (特許文献 1)に記載のフローサイ トメータが 2つの光源を有する点を除き、基本的構成は同等であり、特許文献 1に記 載された内容は、参考にここに一体のものとして統合される。
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0012] し力しながら、上記遅延時間は、シースフローの流速 (すなわち、サンプル懸濁液 およびシース液に対するエアポンプの圧力）、環境温度または大気圧などに依存し て変動し得るため、オペレータがこれを適正に設定'維持することは不可能であり、検 出およびソートの精度を低下させて ヽた。
[0013] また、複数の光源力 フローセルの異なる集光位置に導光するための複数の導光 部材が必要となり、光軸を調整することが極めて煩わしいものであった。
[0014] そこで本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、その 1つの態様は、 遅延時間を設定することなぐ複数の蛍光色素により標識された細胞粒子が複数の レーザ光源により励起されて生じた複数の蛍光を検出できるフローサイトメータおよ びフローサイトメトリ方法を提供することを目的とする。
[0015] また、本発明の別の態様は、シースフロー中に流送される細胞粒子に至る光軸を 単一化して、光軸の調整を簡素化できるフローサイトメータおよびフローサイトメトリ方 法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0016] 本発明の 1つの態様によれば、互いに異なる波長を有する複数の励起光を、所定 の周期および互いに異なる位相で照射する複数の光源と、複数の励起光を同一の 入射光路上に導光し、染色された粒子に集光する導光部材とを備えたフローサイトメ ータが提供される。
[0017] 本発明の別の態様によれば、互いに異なる波長を有する複数の励起光を、所定の 周期および互いに異なる位相で照射するステップと、複数の励起光を同一の入射光 路上に導光し、染色された粒子に集光するステップとを有するフローサイトメトリ方法 が提供される。
[0018] 好適には、粒子は、入射光路と交差するシースフロー中を流れる。
[0019] また、このフローサイトメータは、複数の励起光のそれぞれが粒子を励起して生じた 蛍光を検出し、蛍光信号を出力する複数の蛍光検出器と、蛍光信号を励起光の位 相のそれぞれに同期して検出される複数の光信号要素に分離する同期分離回路と を備える。 [0020] 好適には、蛍光検出器が光電子増倍管からなり、蛍光検出器の光電子増倍電圧を 励起光の位相のそれぞれに呼応して変化させる。
[0021] 択一的には、蛍光信号を電気的に増幅する増幅回路を備え、増幅回路の増幅電 圧を励起光の位相のそれぞれに呼応して変化させる。
[0022] 好適には、フローセルと複数の蛍光検出器のそれぞれとの間の出射光路上に配設 され、所定の波長帯を有する蛍光を選択的に透過させる複数のバンドパスフィルタと を備える。
[0023] また、このフローサイトメータは、複数の励起光のそれぞれが粒子で散乱して生じた 散乱光を検出し、散乱光信号を出力する散乱光検出器を備え、蛍光検出器のそれ ぞれは、散乱光信号が所定の閾値を超えた時点から所定の期間において蛍光を検 出する。
[0024] 択一的には、このフローサイトメータは、複数の励起光のそれぞれが粒子で散乱し て生じた散乱光を検出し、散乱光信号を出力する散乱光検出器を備え、複数の蛍光 検出器は、少なくとも 1つのトリガ蛍光検出器を含み、蛍光検出器および散乱光検出 器は、トリガ蛍光検出器で検出された蛍光信号が所定の閾値を超えた時点力 所定 の期間においてそれぞれ蛍光および散乱光を検出する。
[0025] さらに、このフローサイトメータは、複数の励起光のそれぞれが粒子で散乱して生じ た前方散乱光を検出し、前方散乱光信号を出力する前方散乱光検出器と、フローセ ルと前方散乱光検出器との間の出射光路上に配設され、所定の波長帯を有する前 方散乱光を選択的に透過させる前方散乱光バンドパスフィルタと、複数の励起光の それぞれが粒子で散乱して生じた側方散乱光を検出し、側方散乱光信号を出力す る側方散乱光検出器と、フローセルと側方散乱光検出器との間の出射光路上に配設 され、所定の波長帯を有する側方散乱光を選択的に透過させる側方散乱光バンドパ スフィルタとを備える。
[0026] 好適には、複数の光源は、複数の励起光を所定の周期および互いに異なる位相で パルス発振する。
発明の効果
[0027] 本発明の 1つの態様に係るフローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法によれば 、遅延時間を設定することなぐ複数の蛍光色素により標識された細胞粒子を複数の レーザ光源により励起して得られた複数の蛍光を検出することができる。
[0028] また、本発明の別の態様に係るフローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法によ れば、光軸の調整を格段に簡素化することができる。
図面の簡単な説明
[0029] [図 1]本発明に係るフローサイトメータの構成を示す概略図である。
[図 2]図 1の光源が照射する光パルスおよび光電子増倍管が出力する光パルス信号 のタイミングチャートである。
[図 3]図 1のフローサイトメータのブロック図である。
[図 4]図 3に示す光検出器が検出する前方散乱光のパルス信号のタイミングチャート である。
[図 5]図 3に示すデジタル信号処理装置のブロック図である。
[図 6]図 3に示す 1つの光電子増倍管が出力する各光源に対応する光信号要素の時 間的推移を示すタイミングチャートである。
[図 7]従来技術によるフローサイトメータの構成を示す概略図である。
[図 8]図 6のフローサイトメータのブロック図である。
符号の説明
[0030] 1：フローサイトメータ、 2：流体力学的フロー機構、 3：光学的機構、 4：デジタル信号 処理装置（DSP)、 5:細胞粒子、 10:サンプル懸濁液供給部、 11, 13:エアポンプ、 12:シース液供給部、 14:フローチャンノ 、 16:フローセル、 18:懸濁液供給管、 20: サンプル管、 22:シース管、 24:オリフィス、 26:液滴、 28a, 28b:偏向板、 30, 32, 34:光源、 36:導光部材、 37:光ファイノく、 38:ビームエキスパンダ、 39:ハーフミラ 一、 40:集光レンズ、 42:検出する前方散乱光検出装置、 50:側方散乱光 Z蛍光検 出装置、 52:光ファイノく、 54:ロッドレンズ、 62:クロックパルス発生回路、 64:レーザ 駆動回路、 66:同期回路、 68:分離回路、 PD:光検出器、 70:増幅回路 (AMP)、 7 2：デジタル Zアナログ変換回路、 74：面積 Z幅 Z高さ演算回路 (AZWZH演算回 路）、 76:パラメータセレクタ回路、 78:コンペンセーシヨン回路、 80:ログ Zリニア増 幅回路、 82:コンピュータ、 84:セルソータ、 PMT1〜PMT6:光電子増倍管（Photo Multiplier Tube)、 HM1〜HM6 :ハーフミラー（Half Mirror)ゝ BPF1〜： BPF6 :バンド ノ スフィルタ（Band Pass Filter)。
発明を実施するための最良の形態
[0031] 以下、添付図面を参照して本発明に係るフローサイトメータおよびフローサイトメトリ 方法の実施形態を説明する。この説明において、理解を容易にするために方向を表 す用語 (例えば、「X方向」、「Y方向」および「Z方向」など）を適宜用いるが、これは説 明のためのものであって、これらの用語は本発明を限定するものでない。
[0032] 図 1〜図 6を参照しながら、本発明に係るフローサイトメータおよびフローサイトメトリ 方法の実施形態について以下に説明する。図 1に示すフローサイトメータ 1は、概略 、蛍光標識試薬などで染色された細胞粒子をシースフロー内で一列に配列するため の流体力学的フロー機構 2と、各細胞粒子に波長の異なる複数のレーザ光を照射し 、散乱光および蛍光を受光するための光学的機構 3と、光学的機構 3から出力された 散乱光および蛍光に関する電気信号を制御，処理するための信号処理装置 4とを備 える。
[0033] まず、流体力学的フロー機構 2について説明する。
流体力学的フロー機構 2は、図 1に示すように、分析すべき細胞粒子 5を含むサン プル懸濁液を貯蔵 ·供給するためのサンプル懸濁液供給部 10と、シース液を貯蔵 · 供給するためのシース液供給部 12と、フローチャンバ 14と、フローチャンバ 14の下 流に連結されたフローセル 16とを有する。分析すべき細胞粒子 5は、例えば、蛍光 染料や蛍光ラベルモノクロナール抗体などの蛍光標識試薬で蛍光標識されている。 なお本実施形態では、フローセルを採用したフローサイトメータを用いて以下説明 するが、択一的には、詳細図示しないが、本発明は、ジェット'イン'エア方式のフロー サイトメータにも等しく適用される。
[0034] 蛍光標識試薬は、これに限定するものではな 、が、例えば、青色励起光で励起さ れて黄緑色蛍光を発する FITC (Fluoresein)、同様に青色励起光で励起されて黄緑 色の蛍光を発光する PE (R-phycoerythrin)およびそのタンデム蛍光試薬である PE Cy5 (赤色蛍光)， PE— Cy7 (赤外蛍光)、橙色励起光で励起されて赤色の蛍光 を発する APC (Allophycocyanin)およびそのタンデム蛍光試薬である APC— Cy5 ( 赤外蛍光）、紫外励起光で励起されて蛍光発光する Ho (Hoechest 33342) Blue ( 青色蛍光）および Ho— Red (赤色蛍光)などが一般的に用いられている。
[0035] フローチャンバ 14は略円筒形状を有し、その中心軸に沿って懸濁液供給管 18が 配設されて 、る。サンプル懸濁液供給部 10およびシース液供給部 12に貯蔵された サンプル懸濁液およびシース液は、それぞれのエアポンプ 11, 13の圧力により、サ ンプル管 20およびシース管 22を介して懸濁液供給管 18およびフローチャンバ 14内 に供給される。これにより、シース液がサンプル懸濁液を円筒状に包み込む鞘状の シースフロー (層流）が形成される。このとき、サンプル懸濁液供給部 10の圧力をシ ース液供給部 12の圧力より若干低く設定することにより、流体力学的な絞り込みが生 じ、シース液に包まれたサンプル懸濁液の流径が非常に細くなり、サンプル懸濁液に 含まれる細胞粒子 5をフローセル 16内で一列に整列させることができる（1つ 1つの細 胞粒子 5をフローセル 16内で実質的に等間隔に配列することができる）。
[0036] フローセル 16は最下部にオリフィス 24を有し、フローセル 16を通過した細胞粒子 5 を含むシースフローがオリフィス 24力もジェット噴射される。噴射されたシースフロー は、図示しないピエゾ圧電素子などの振動装置力もの振動を加えられると、それぞれ の細胞粒子 5を収容する液滴 26が形成される。
[0037] また、特定の細胞粒子 5を含む液滴 26を分取するとき（セルソータに適用する場合 )、液滴 26が形成されるブレイク'オフ'ポイントの直前で、分取したい細胞粒子 5を含 むシースフローを荷電する荷電部（図示せず)が配設される。さらに、所定電圧 (例え ば、 6000Vの直流電圧）が印加された一対の偏向板 28a, 28b力設けられ、荷電さ れた液滴 26は、これらの偏向板 28a, 28bの間を通過するときに直流電場から力を 受けて偏向し、分取される。
[0038] 次に、光学的機構 3について説明する。
図 1に示す光学的機構 3は、フローセル 16内で整列した細胞粒子 5に異なる波長 の複数のレーザビーム (励起光)を照射する第 1、第 2および第 3の光源 30, 32, 34 を有する。第 1、第 2および第 3の光源 30, 32, 34は、任意の光源であって、本発明 を限定するものではないが、レーザビームなどのコヒーレント光を生成することが好ま しい。一例として、第 1の光源 30は、青色レーザビーム (ピーク波長: 488nm,出力： 20mW)を照射する DPSSレーザ（Diode Pumped Solid State Laser:半導体レーザ励 起固体レーザ)であってもよい。第 2の光源 32は、赤色レーザビーム (ピーク波長： 63 5nm,出力： 20mW)を照射するダイオードレーザで、同様に、第 3の光源 34は、紫 外レーザビーム（ピーク波長： 375nm,出力： 8mW)を照射するダイオードレーザで あってもよい。
[0039] 本発明に係る実施形態によれば、光源 30, 32, 34は変調器（図示せず)を内蔵し 、この変調器は、後述のクロックパルス発生回路 62 (図 5参照）から出力されるクロック パルス信号に基づいて、図 2 (a)〜（c)に示すように、所定の発振周波数 (例えば、 f = 100MHz)で各レーザビームをパルス発振（パルス変調）させることができるこのと き、各光源 30, 32, 34から出力される各レーザビームの出力パルス波形は、互いに 重なり合わないように制御される。すなわち、第 1、第 2および第 3の光源 30, 32, 34 は、同一の周期で異なる第 1、第 2および第 3の位相 δ , δ , δ を有するようにレー
1 2 3
ザビーム (励起光)をパルス発振させることができる。なお、発振周波数を、例えば 10 ΟΜΗζに設定したとき、各レーザビームのパルス幅は 0. 01 μ秒以下となる。
[0040] さらに、光源 30, 32, 34に内蔵される変調器は、任意のものを用いることができ、 例えば、 DPSSレーザ光源 30に関しては、アメリカ合衆国メリーランド州のボルチモ ァ巿にあるプリムローズ株式会社（Brimrose Corporation)から市販されて!、る音響光 学的変調器 (型番 TEM— 85— 10)などが好適に用いられ、赤色および紫外レーザ 光源 32, 34のダイオードレーザに対しては、汎用半導体変調器を用いて、各レーザ ビームをパルス駆動することができる。
なお、モード同期型レーザ光源を用いてレーザパルスを形成すると、レーザビーム のピーク強度を実質的に増大させることができ、検出感度を向上させることができる。
[0041] 第 1、第 2および第 3の光源 30, 32, 34からパルス発振させたレーザビームは、図 1 および図 3に示すように、導光部材 36を用いて同一光路上に導光し、フローセル 16 上の同一の照射位置に照射される。導光部材 36を構成する部品は、例えば、光ファ イノく 37、ビームエキスパンダ 38、ハーフミラー 39、および集光レンズ 40などを含み、 導光部材 36のこれらの構成部品の全体または一部を X、 Yおよび Z方向に移動させ て、光源 30, 32, 34からのレーザビームを正確に同一光路上に導光させることがで きる。
[0042] また光学的機構 3は、図 1および図 3に示すように、好適な実施形態では、青色レー ザビームが細胞粒子 5で散乱して生じた前方散乱光（FSC : Forward Scattering Ligh t)を検出する前方散乱光検出装置 42と、各レーザビームが細胞粒子 5で散乱して生 じた側方散乱光（SSC： Side Scattering Light)および各レーザビームが細胞粒子 5を 励起して生じたさまざまな波長を有する複数の蛍光 (FL： fluorescent light)を検出す る側方散乱光 Z蛍光検出装置 50とを備える。
前方散乱光検出装置 42は、青色レーザビームを選択的に透過させるバンドパスフ ィルタ（図示せず、例えば、 488± 5nmの選択波長）を有し、青色レーザビームが細 胞粒子 5で散乱して生じた前方散乱光を検出するものである。一方、側方散乱光 Z 蛍光検出装置 50は、レーザビームの波長と同じ 3つの波長を有する側方散乱光と、 各光源からのレーザビームの波長とは異なるさまざまな波長を有する蛍光を検出する ものである。
[0043] ここで図 2〜図 6を参照しながら、前方散乱光検出装置 42、側方散乱光 Z蛍光検 出装置 50、および信号処理装置 4についてさらに詳細に説明する。
[0044] 前方散乱光検出装置 42は、集光レンズ 44を介してフローセル 16からの前方散乱 光 (FSC)を検出する光検出器 PDを有し（図 3)、上述のように、青色レーザビームを 選択的に透過させるバンドパスフィルタ（図示せず)を介して、青色レーザビームが細 胞粒子 5で散乱して生じた青色前方散乱光だけを検出する。こうして、前方散乱光検 出装置 42は、青色前方散乱パルス光の強度に応じて電圧が変化する電気的な前方 散乱光パルス信号を信号処理装置 4に出力する。
[0045] このとき、光検出器 PDは、フローセル 16中を Z方向に移動する単一の細胞粒子 5 が青色レーザビームを散乱して生じる前方散乱光を検出するため、光検出器 PD力 出力される前方散乱光パルス信号の強度は、図 4に示すように時間的に増減する。 そして、前方散乱光パルス信号が検出される期間 T、すなわち細胞粒子 5が青色レ 一ザビームにより照射されている期間 Τは、フローセル 16中を移動する細胞粒子 5の 大きさおよびシースフローの流速 (エアーポンプ 11の圧力）に依存する。例えば、ェ ァポンプ 11の圧力が約 30psiで、フローセルの断面積が約 20000 μ m2であるとき、 期間 Tは約 10 秒であることが知られている。したがって、各光源 30, 32, 34力 00 MHzの発振周波数でレーザビームを実質的に間断なくパルス発振するとき、 1つの パルス発振レーザビームの幅 wが 0. 01 秒となり、期間 T内に約 1000パルスのレ 一ザビームが 3つの光源から交互に細胞粒子 5に照射され、青色レーザビームの前 方散乱光パルス信号は約 333パルス検出されることになる。ただし、図 4においては 、図面をわ力りやすくするために、レーザビームの幅 wを十分大きくして図示した。
[0046] 換言すると、前方散乱光パルス信号が検出されている間、例えば、前方散乱光パ ルス信号の出力値 Vが所定の閾値電圧 V を超えている間 (V>V )、細胞粒子 5が
th th
シースセル 16中の照射位置を通過していると判断することができる。したがって、後 述するが、信号処理装置 4は、前方散乱光パルス信号の出力値 Vが所定の閾値電 圧 V を超えた時点から所定期間 Tにおいて、前方散乱光パルス信号、側方散乱光 th
パルス信号および蛍光パルス信号をデータとして取り込む。
[0047] 次に、側方散乱光 Z蛍光検出装置 50について説明する。
図 3において、青色、赤色および紫外レーザビームをフローセル 16内で一列に配 列された細胞粒子 5に照射すると、側方散乱光および異なる波長帯を有する複数の 蛍光は、光ファイバ 52および光をコリメートするためのロッドレンズ 54を介して、側方 散乱光 Z蛍光検出装置 50に入射される。
[0048] 本実施形態において、光源 30, 32, 34は、上述のように、それぞれ青色レーザビ ーム（ピーク波長： 488nm)、赤色レーザビーム（ピーク波長： 635nm)、および紫外 レーザビーム（ピーク波長：375nm)を照射し、細胞粒子 5は、 FITC、 PE、 PE-Cy 5、 PE— Cy7、 APC、 APC— Cy5、 Ho— Blueおよび Ho— Redからなる蛍光標識試 薬を用いて蛍光標識されて 、る。
[0049] 側方散乱光 Z蛍光検出装置 50は、概略、微弱な光を電気的に増幅して検出する 複数の光電子増倍管（Photo Multiplier Tube) PMTl〜PMT6と、ハーフミラー（Half Mirror) HM1〜HM6と、所定の波長帯の光だけを透過するバンドパスフィルタ（Ban d Pass Filter) BPFl〜： BPF6とを有する。
[0050] ロッドレンズ 54を介して入射された側方散乱光 Z蛍光は、ハーフミラー HM1に入 射し、その一部がバンドパスフィルタ BPF1に向力つて反射する。バンドパスフィルタ BPF1は、例えば、第 1の光源 30と実質的に同じ波長帯 (488nm± 5nm)を有する 青色側方散乱光だけを透過し、光電子増倍管 PMT1は、図 2 (d)に示すように、青 色側方散乱光の光パルス信号を信号処理装置 4に出力する。
[0051] ハーフミラー HM1を透過した光は、概略、図 3に示す数多くのハーフミラー HM2 〜HM5で反射、またはこれらを透過して光電子増倍管 PMT2〜PMT6に入射する 。すなわち、光電子増倍管 PMT2〜PMT6のそれぞれは、青色、赤色、および紫外 レーザビームの発振周波数とそれぞれの位相において、波長の異なる複数の蛍光を 組み合わせた複合的な蛍光を検出する。
ただし、細胞粒子 5を同定するためには、各光電子増倍管 PMT2〜PMT6は、波 長の異なる複数の蛍光を検出することが好ましいので、側方散乱光 Z蛍光検出装置 50は、波長選択可能なハーフミラー HM2〜HM6およびバンドパスフィルタ BPF2 〜BPF6を用いて、特定の波長帯を有する蛍光を選択的に検出するように構成され ている。
[0052] 具体的には、図 3に示す側方散乱光 Z蛍光検出装置 50において、ハーフミラー H Mlを透過した光は、ハーフミラー HM2に入射し、ハーフミラー HM2は、波長が 73 Onm未満の波長を有する光を反射し、波長が 730nm以上の光を透過する。ハーフ ミラー HM2を透過した光は、波長が 749nm以上の光だけを透過するバンドパスフィ ルタ BPF2に入射する。したがって、光電子増倍管 PMT2は、図 2(e)に示すように、 第 1、第 2および第 3のレーザが照射される第 1、第 2および第 3の位相 δ , δ , δ
1 2 3 において、 749nm以上の波長を有する蛍光を検出する。
ここで本願にぉ 、て、光電子増倍管 PMT2が検出する一連の光パルス信号を構成 する、第 1、第 2および第 3の位相 δ , δ , δ において検出される光パルス信号の
1 2 3
それぞれを光信号要素 S , S , S と定義する。すなわち、光信号要素 S , S , S
21 22 23 21 22 は、各光源 30, 32, 34により励起された 749nmの波長を有する蛍光に対応し、光
23
電子増倍管 PMT2は、 3つの光信号要素 S , S , S 力 なる一連の光パルス信号
21 22 23
を検出する。
[0053] 図 3に戻って、ハーフミラー HM2で反射した光はハーフミラー HM3に入射し、ハー フミラー HM3は、波長が 600nm未満の波長を反射し、波長が 600nm以上の光を 透過する。ハーフミラー HM3を透過した光は、 680nm± 30nmの波長帯を有する 光だけを透過するバンドパスフィルタ BPF3で分光され、光電子増倍管 PMT3は、図 2 (f)【こ示すよう【こ、第 1、第 2および第 3の位ネ目 δ , δ , δ 【こお!ヽて、 680nm± 30
1 2 3
nmの波長帯を有する蛍光を検出して、光信号要素 S , S , S 力 なる一連の光
31 32 33
パルス信号を出力する。同様に、光信号要素 S , S , S は、各光源 30, 32, 34に
31 32 33
より励起された 680nm± 30nmの波長帯を有する蛍光に対応する。
[0054] 続!、て、ハーフミラー HM3で反射した蛍光はハーフミラー HM4に入射し、ハーフミ ラー HM4は、波長が 550nm未満の波長を透過し、波長が 550nm以上の光を反射 する。ハーフミラー HM4で反射した蛍光は、 580nm± 30nmの波長帯を有する蛍 光だけを透過するバンドパスフィルタ BPF4で分光され、光電子増倍管 PMT4は、図 2 (g)【こ示すよう【こ、第 1、第 2および第 3の位ネ目 δ , δ , δ 【こお!ヽて、 580nm± 30
1 2 3
nmの波長帯を有する蛍光を検出して、光信号要素 S , S , S 力 なる光パルス
41 42 43
信号を出力する。ただし、赤色レーザビームの励起光により、 580nm± 30nmの波 長帯を有する蛍光が生じることはないので、光信号要素 S
42は、蛍光試薬によらない 自家発光の蛍光による信号を示す。
[0055] さらに、ハーフミラー HM4で反射した蛍光はハーフミラー HM5に入射し、ハーフミ ラー HM5は、波長が 505nm未満の波長を透過し、波長が 505nm以上の蛍光を反 射する。ハーフミラー HM5で反射した蛍光は、 530nm± 30nmの波長帯を有する 蛍光だけを透過するバンドパスフィルタ BPF5で分光され、光電子増倍管 PMT5は、 図 2 (h)【こ示すよう【こ、第 1、第 2および第 3の位ネ目 δ , δ , δ 【こお!ヽて、 530nm士
1 2 3
30nmの波長帯を有する蛍光を検出して、光信号要素 S , S , S 力 なる光パル
51 52 53
ス信号を出力する。ただし、光電子増倍管 PMT4と同様、赤色レーザビームの励起 光により、励起光より短い波長を有する蛍光は生じないので、光電子増倍管 PMT5 の光信号要素 S は自家発光の蛍光による信号を示す。
52
[0056] また、ハーフミラー HM5を透過した蛍光は、 424nm±44nmの波長帯を有する蛍 光だけを透過するバンドパスフィルタ BPF6で分光され、光電子増倍管 PMT6は、図 2 (i)【こ示すよう【こ、第 1、第 2および第 3の位ネ目 δ , δ , δ 【こお!ヽて、 424nm±44
1 2 3
nmの波長帯を有する蛍光を検出して、光信号要素 S , S , S 力 なる光パルス 信号を出力する。ただし、光電子増倍管 PMT4および 5と同様、青色および赤色レ 一ザビームの励起光より短 、波長を有する蛍光は生じな 、ので、光電子増倍管 PM T6の光信号要素 S および S は自家発光の蛍光による信号を示す。
61 62
[0057] 一方、信号処理装置 4は、図 5に示すように、クロックパルス発生回路 62と、これに 接続されたレーザ駆動回路 64を有し、上述のように、第 1〜第 3の光源 30, 32, 34 を一定の周波数および異なる位相（ δ , δ , δ )でパルス駆動する。
1 2 3
また、信号処理装置 4は、同期回路 66を有し、これはレーザ駆動回路 64、光電子 増倍管 ΡΜΤ1〜ΡΜΤ6、増幅回路 (AMP) 70、および分離回路 68に接続されてい る。
[0058] 信号処理装置 4は、同期回路 66において、光検出器 PDおよび光電子増倍管 PM T1〜PMT6からの各光パルス信号を第 1〜第 3のレーザ光源 30, 32, 34の位相 δ , δ , δ に同期させ、分離回路 68において、光電子増倍管 ΡΜΤ1〜ΡΜΤ6で検
1 2 3
出された各光パルス信号を表 1に示すような光信号要素 sに分離する。
[表 1]
第 1レーザ 第 2レーザ 第 3レーザ
ΡΜΤ1 S CSSC) °13
A =488±5nm
S21(FL4) S22(FL6) 。23
ΡΜΤ3 S31(FL3) S3Z(FL5) °33
A =680±30nm
PMT4 S41(FL2) S43(FL8)
A =580±30nm
PMT5 S5,(FL1)
A =530±30nm
PMT6 ^61 °62 S63(FL7)
A =424±44nm [0059] このとき、光信号要素 S は、第 1のレーザ光源 30と同じ波長帯（ =488nm± 5n
11
m)を有するので、側方散乱光（SSC)として検出される。
同様に、光信号要素 S は、青色レーザビームで励起されて生じた赤外蛍光（ λ >
21
749nm)の強度を示すものであって、蛍光標識試薬 PE— Cy7で染色された細胞粒 子 5からの赤外蛍光 (FL4)に関する光パルス信号に他ならない。また光信号要素 S
2 は、蛍光標識試薬 APC— Cy7が赤色レーザビームで励起されて生じた赤外蛍光（
2
FL6)の強度を示す。
[0060] さらに、光信号要素 S は、青色レーザビームで励起されて生じた赤色蛍光（ λ = 6
31
80nm± 30nm)の強度を示し、蛍光標識試薬 PE— Cy5で染色された細胞粒子 5か らの赤色蛍光 (FL3)に対応する。同様に、光信号要素 S は、蛍光標識試薬 APCが
32
赤色レーザビームで励起されて生じた赤色蛍光 (FL5)の強度を示す。
[0061] カロえて、光信号要素 S は、青色レーザビームで励起されて生じた黄緑色蛍光（ λ
41
= 580nm± 30nm)の強度を示し、蛍光標識試薬 PEで染色された細胞粒子 5から の黄緑色蛍光 (FL2)に対応する。同様に、光信号要素 S の強度は、蛍光標識試薬
43
Ho - Redが紫外レーザビームで励起されて生じた黄緑色蛍光 (FL8)に相当する。
[0062] さらに、光信号要素 S は、青色レーザビームで励起されて生じた青色蛍光（λ = 5
51
30nm± 30nm)の強度を示し、蛍光標識試薬 FITCから生じる青色蛍光 (FL1)に相 当し、光信号要素 S は、紫外レーザビームで励起されて生じた紫色蛍光（λ =424
63
nm±44nm)の強度を示し、蛍光標識試薬 Ho— Blueから生じる青色蛍光 (FL7)を 検出する
[0063] このように、本実施形態によれば、任意の選択波長を有するハーフミラー HM2〜H M6およびバンドパスフィルタ BPF2〜： BPF6をフローセル 16と光電子増倍管 PMT1 〜PMT6の間に配設することにより、光源の波長および蛍光標識試薬に依存する蛍 光 FL1〜FL8を、各光電子増倍管 PMT1〜PMT6で検出された光パルス信号から 分離された光信号要素として検出することができる。なお、ハーフミラー HM2〜HM 5およびバンドパスフィルタ BPF1〜BPF5に関して、上述した選択波長は一例に過 ぎず、他の適当な波長帯で光を選択した場合であっても本発明を同様に適用するこ とがでさる。 なお、分離回路 68は、上述のように、表 1のすベての光信号要素 Sを検出してもよ いが、側方散乱光（SSC)および蛍光 (FL1〜FL6)に相当する光信号要素 Sのみ を検出するようにロジックを設計してぉ 、てもよ!、。
ところで、光電子増倍管 PMT1〜PMT6が検出する光の強度は、その波長および ハーフミラーやバンドパスフィルタなどの構成、細胞粒子の大きさや性状、染色条件 などに大きく依存する。すなわち、表 1に示す上述の光信号要素 Sは、光源 30, 32
, 34および光電子増倍管 PMT1〜PMT6に応じて、そのスケール (検出値）にばら つきが生じる。そこで、光電子増倍管 PMT1〜PMT6が検出する光信号要素 Sの ばらつきを補正するために、同期回路 66は、光電子増倍管 PMT1〜PMT6のそれ ぞれの光電子増倍電圧 HVを、第 1〜第 3のレーザ光源 30, 32, 34の位相 δ , δ
1 2
, δ に同期させて変化させることができる。例えば、光電子増倍管 ΡΜΤ2の第 1レー
3
ザ 30が照射される位相において、光信号要素 S を増倍させるための光電子増倍電
21
圧 HV に設定する。他の光信号要素 Sに対しても同様に、同期回路 66は、光電子
21 ij
増倍管 PMT1〜PMT6の光電子増倍電圧 HV (表 2参照）を、各光源の位相 δ ,
1 δ , δ に応じてスイッチング制御して、各光信号要素 Sのスケールをより均一化す
2 3 ij
ることがでさる。
[表 2]
Figure imgf000019_0001
択一的には、光電子増倍管 PMT1〜PMT6が検出する光パルス信号を電気的に 増幅する増幅回路 70の増幅電圧 AMPを、同期回路 66を用いて、表 3に示すように スイッチング制御してもよい。こうして、同期して変化する増幅電圧 AMPを用いて、 各光信号要素 Sを電気的に増幅して、より均一なスケールを有する光信号要素 Sを 得るようにしてちょい。
[表 3]
第 1レーザ 第 2レーザ 第 3レーザ
PMT1 Α Ρ, , AMP12 AMP,3
A =488±5nm
PMT2 AMP21 AMP22 AMP23
A >749nm
PMT3 AMP31 AMP32 層 33
A =680±30nm
PMT4 AMP41 AMP42 AMP43
A =580±30nm
PMT5 AMP51 層 52 AMP53
A =530±30nm
PMT6 AMPB1 AMP62 層 63
A =424±44nm
[0066] なお、本実施形態のフローサイトメータ 1は、多色レーザビームが照射された細胞粒 子 5を同定するために散乱光および蛍光を検出するものであるから、信号処理装置 4 は、細胞粒子 5がフローセル 16中を通過し、各レーザビームが照射されている間に 限って光パルス信号 (光信号要素 S)を検出することが好ましい。さもなければ、信号 処理装置 4は、細胞粒子 5とは関連のないノイズ信号に関する膨大な量のデータを処 理しなければならない。
[0067] そこで、本発明の信号処理装置 4は、上述（図 4)のように、例えば、前方散乱光パ ルス信号の出力値 Vを常にモニタし、この出力値 Vが所定の閾値電圧 V を超えてい
th
ることを検出したとき (V>V )、細胞粒子 5がシースセル 16中の照射位置を通過し
th
ていると判断し、前方散乱光パルス信号の出力値 Vが所定の閾値電圧 V を超えた
th
時点から所定期間 τにおいて、前方散乱光パルス信号、側方散乱光パルス信号およ び蛍光パルス信号をデータとして取り込む。すなわち、信号処理装置 4は、前方散乱 光パルス信号の出力値 Vをトリガ信号として、散乱光パルス信号および蛍光パルス信 号の検出を開始する。 [0068] なお、上記（図 4)説明では、散乱光パルス信号および蛍光パルス信号の検出を開 始するトリガ信号を検出するために、前方散乱光パルス信号の出力値 Vをモニタして いたが、側方散乱光パルス信号または任意の少なくとも 1つの蛍光パルス信号を常 時モニタしてもよい。すなわち、側方散乱光パルス信号の出力値 Vが所定の閾値電 圧 V を超えた時点を起点として、前方散乱光および蛍光パルス信号の検出を開始 th
してもよい。択一的には、複数の光電子増倍管 PMT1〜PMT6のうちの少なくとも 1 つの光電子増倍管 PMTをトリガ光電子増倍管 PMTと設定し、トリガ光電子増倍管 P MTで検出された蛍光パルス信号を常時モニタして、その出力値 Vが所定の閾値電 圧 V を超えた時点から所定期間 Tにおいて前方散乱光パルス信号、側方散乱光パ th
ルス信号、および蛍光パルス信号の検出を開始してもよ ヽ。
[0069] こうして信号処理装置 4は、所定期間 Tにおいて、例えば、光電子増倍管 PMT2か ら、図 6 (a)〜（c)に示すように推移する光信号要素 S (FL4) , S (FL6) , S を検
21 22 23 出する。
[0070] 次に、図 5を参照しながら、信号処理装置 4を構成する上記以外の各種回路および その機能について説明する。
信号処理装置 4は、光検出器 PDで検出された前方散乱光パルス信号、および光 電子増倍管 PMTで検出されて、同期信号 66で分離された各光信号要素 Sをデジ タル変換するためのアナログ Zデジタル変換回路 (AZD変換回路） 72を有する。 また、本実施形態の信号処理装置 4は、面積 Z幅 Z高さ演算回路 (AZWZH演 算回路） 74を有し、これにより、光信号要素 Sから直接的に、従来式のアナログ波形 の光パルス信号の面積、幅、高さなどに相当する細胞粒子 5を特徴付けるデータを 迅速に計算することができる。そしてパラメータセレクタ回路 76で処理すべき光信号 要素 S (FSC, SSC, FL1〜FL8)を選択し、コンペンセーシヨン回路 78は、同様に ij
、デジタル式の光信号要素 Sを用いて、異なる波長スペクトルを有する蛍光の間で 生じる蛍光の漏れ込みを補償する (蛍光補正を行う)。そして選択された光信号要素 Sは、ログ Zリニア増幅回路 80により増幅され、コンピュータ 82および Zまたはセル ソータ 84に出力される。
[0071] コンピュータ 82は、各細胞粒子 5に対するデジタルパルス光信号を受けると、さまざ まなアプリケーションを用いて、例えば、細胞数頻度分布（ドットプロットやヒストグラム
)を作成するなどの各種分析 ·評価を行うことができる。また、セルソータ 84は、デジタ ルパルス光信号カゝら細胞粒子 5を同定し、特定の細胞粒子 5を含む液滴を分取する ことができる。
これまで説明してきたように、本実施形態によれば、複数のレーザビームを同一光 路上に導光するので、従来のフローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法のように 、遅延時間を設定することなぐ複数の蛍光色素により標識された細胞粒子からの前 方'側方散乱光および蛍光を検出することができる。さらに、光源カゝらフローセルに至 る光軸の調整を格段に簡素化することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 互いに異なる波長を有する複数の励起光を、所定の周期および互いに異なる位相 で照射する複数の光源と、
前記複数の励起光を同一の入射光路上に導光し、染色された粒子に集光する導 光部材とを備えたことを特徴とするフローサイトメータ。
[2] 前記粒子は、前記入射光路と交差するシースフロー中を流れることを特徴とするフ ローサイトメータ。
[3] 前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子を励起して生じた蛍光を検出し、蛍光信 号を出力する複数の蛍光検出器と、
前記蛍光信号を前記励起光の位相のそれぞれに同期して検出される複数の光信 号要素に分離する同期分離回路とを備えたことを特徴とする請求項 1に記載のフロ 一サイトメータ。
[4] 前記蛍光検出器が光電子増倍管からなり、
前記蛍光検出器の光電子増倍電圧を前記励起光の前記位相のそれぞれに呼応し て変化させることを特徴とする請求項 3に記載のフローサイトメータ。
[5] 前記蛍光信号を電気的に増幅する増幅回路を備え、
前記増幅回路の増幅電圧を前記励起光の前記位相のそれぞれに呼応して変化さ せることを特徴とする請求項 3に記載のフローサイトメータ。
[6] 前記フローセルと前記複数の蛍光検出器のそれぞれとの間の出射光路上に配設さ れ、所定の波長帯を有する前記蛍光を選択的に透過させる複数のバンドパスフィル タとを備えたことを特徴とする請求項 3に記載のフローサイトメータ。
[7] 前記複数の励起光のそれぞれが粒子で散乱して生じた散乱光を検出し、散乱光信 号を出力する散乱光検出器を備え、
前記蛍光検出器のそれぞれは、前記散乱光信号が所定の閾値を超えた時点から 所定の期間において前記蛍光を検出することを特徴とする請求項 3に記載のフロー サイトメータ。
[8] 前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子で散乱して生じた散乱光を検出し、散乱 光信号を出力する散乱光検出器を備え、 前記複数の蛍光検出器は、少なくとも 1つのトリガ蛍光検出器を含み、 前記蛍光検出器および前記散乱光検出器は、前記トリガ蛍光検出器で検出された 前記蛍光信号が所定の閾値を超えた時点から所定の期間においてそれぞれ前記蛍 光および前記散乱光を検出することを特徴とする請求項 3に記載のフローサイトメ一 タ。
[9] 前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子で散乱して生じた前方散乱光を検出し、 前方散乱光信号を出力する前方散乱光検出器と、
前記フローセルと前記前方散乱光検出器との間の出射光路上に配設され、所定の 波長帯を有する前記前方散乱光を選択的に透過させる前方散乱光バンドパスフィル タと、
前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子で散乱して生じた側方散乱光を検出し、 側方散乱光信号を出力する側方散乱光検出器と、
前記フローセルと前記側方散乱光検出器との間の出射光路上に配設され、所定の 波長帯を有する前記側方散乱光を選択的に透過させる側方散乱光バンドパスフィル タとを備えたことを特徴とする請求項 1に記載のフローサイトメータ。
[10] 前記複数の光源は、前記複数の励起光を所定の周期および互いに異なる位相で パルス発振することを特徴とする請求項 1に記載のフローサイトメータ。
[11] 互いに異なる波長を有する複数の励起光を、所定の周期および互いに異なる位相 で照射するステップと、
前記複数の励起光を同一の入射光路上に導光し、染色された粒子に集光するステ ップとを有することを特徴とするフローサイトメトリ方法。
[12] 前記入射光路と交差するシースフロー中に前記粒子を流すステップを有することを 特徴とする請求項 11に記載のフローサイトメトリ方法。
[13] 前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子を励起して生じた蛍光を検出し、蛍光信 号を出力するステップと、
前記蛍光信号を前記励起光の前記位相のそれぞれに同期して検出される複数の 光信号要素に分離するステップをさらに有することを特徴とする請求項 11に記載の フローサイトメトリ方法。
[14] 前記蛍光を検出するステップは、光電子増倍管を用いて行われ、
前記光電子増倍管の光電子増倍電圧を前記励起光の前記位相のそれぞれに呼 応して変化させるステップを有することを特徴とする請求項 13に記載のフローサイトメ トリ方法。
[15] 増幅回路を用いて、前記蛍光信号を電気的に増幅するステップと、
前記増幅回路の増幅電圧を前記励起光の前記位相のそれぞれに呼応して変化さ せるステップとを有することを特徴とする請求項 13に記載のフローサイトメトリ方法。
[16] 前記蛍光を検出するステップは、所定の波長帯を有する前記蛍光を選択的に検出 するステップを有することを特徴とする請求項 13に記載のフローサイトメトリ方法。
[17] 前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子で散乱して生じた散乱光を検出し、散乱 光信号を出力するステップを有し、
蛍光を検出するステップは、前記散乱光信号が所定の閾値を超えた時点から所定 の期間において行われることを特徴とする請求項 13に記載のフローサイトメトリ方法。
[18] 前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子で散乱して生じた散乱光を検出し、散乱 光信号を出力するステップを有し、
前記蛍光を検出するステップは、少なくとも 1つのトリガ蛍光検出器を用いて蛍光を 検出するステップを含み、
前記散乱光信号を出力するステップおよび前記蛍光を検出するステップは、前記ト リガ蛍光検出器で検出された前記蛍光信号が所定の閾値を超えた時点から所定の 期間において行われることを特徴とする請求項 13に記載のフローサイトメトリ方法。
[19] 前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子で散乱して生じた前方散乱光のうち、所 与の波長帯を有する前方散乱光を選択的に検出し、前方散乱光信号を出力するス テツプと、
前記複数の励起光のそれぞれが粒子で散乱して生じた側方散乱光のうち、所与の 波長帯を有する前方散乱光を選択的に検出し、前方散乱光信号を出力するステップ とを有することを特徴とする請求項 11に記載のフローサイトメトリ方法。
[20] 前記励起光を照射するステップは、前記複数の励起光を所定の周期および互いに 異なる位相でパルス発振するステップを有することを特徴とする請求項 11に記載の フローサイトメトリ方法。
PCT/JP2006/315290 2005-08-08 2006-08-02 フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法 WO2007018087A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE112006002091.9T DE112006002091B4 (de) 2005-08-08 2006-08-02 Durchflusszytometer und Durchflusszytometrie
US11/988,386 US7990525B2 (en) 2005-08-08 2006-08-02 Flow cytometer and flow cytometry

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005229536A JP4756948B2 (ja) 2005-08-08 2005-08-08 フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法
JP2005-229536 2005-08-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007018087A1 true WO2007018087A1 (ja) 2007-02-15

Family

ID=37727274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/315290 WO2007018087A1 (ja) 2005-08-08 2006-08-02 フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US7990525B2 (ja)
JP (1) JP4756948B2 (ja)
DE (1) DE112006002091B4 (ja)
WO (1) WO2007018087A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2034291A1 (en) 2007-09-04 2009-03-11 Sony Corporation Light irradiation device, fine particle analyzing apparatus, and light irradiation method
CN102374964A (zh) * 2010-07-20 2012-03-14 索尼公司 微粒检测装置及光照射装置
EP2235501B1 (en) * 2008-01-15 2018-05-23 Malvern Panalytical Limited Light scattering measurements using simultaneous detection
JP2019513236A (ja) * 2016-03-17 2019-05-23 ビーディー バイオサイエンス ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別
CN112147044A (zh) * 2020-09-07 2020-12-29 桂林电子科技大学 用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置
CN112229781A (zh) * 2020-09-07 2021-01-15 桂林电子科技大学 一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置
US20220099553A1 (en) * 2016-03-18 2022-03-31 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. Sample analyzer and sample analysis method thereof
US11698334B2 (en) 2016-09-13 2023-07-11 Becton, Dickinson And Company Flow cytometer with optical equalization

Families Citing this family (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7340957B2 (en) 2004-07-29 2008-03-11 Los Alamos National Security, Llc Ultrasonic analyte concentration and application in flow cytometry
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
WO2007081387A1 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices, methods of use, and kits for performing diagnostics
US20080003142A1 (en) 2006-05-11 2008-01-03 Link Darren R Microfluidic devices
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US7835000B2 (en) 2006-11-03 2010-11-16 Los Alamos National Security, Llc System and method for measuring particles in a sample stream of a flow cytometer or the like
WO2008105855A2 (en) * 2006-11-13 2008-09-04 University Of Wyoming Apparatus and method for measuring the fluorescence of large multi-cellular organisms
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
EP2479552B1 (en) 2007-04-02 2015-09-02 Acoustic Cytometry Systems, Inc. Methods for enhanced analysis of acoustic field focused cells and particles
US7837040B2 (en) * 2007-04-09 2010-11-23 Los Alamos National Security, Llc Acoustic concentration of particles in fluid flow
US8083068B2 (en) 2007-04-09 2011-12-27 Los Alamos National Security, Llc Apparatus for separating particles utilizing engineered acoustic contrast capture particles
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
WO2009063322A2 (en) * 2007-08-15 2009-05-22 Malvern Instruments Ltd Broad-range spectrometer
JP4556975B2 (ja) 2007-09-04 2010-10-06 ソニー株式会社 光照射方法、光照射装置及び微粒子解析装置
JP4525725B2 (ja) 2007-10-18 2010-08-18 ソニー株式会社 光学測定部、光学測定用部材、及びこれらを配設した微小粒子測定装置、並びに微小粒子の光学測定方法
US8263407B2 (en) 2007-10-24 2012-09-11 Los Alamos National Security, Llc Method for non-contact particle manipulation and control of particle spacing along an axis
US8528406B2 (en) 2007-10-24 2013-09-10 Los Alamos National Security, LLP Method for non-contact particle manipulation and control of particle spacing along an axis
JP4389991B2 (ja) 2007-10-26 2009-12-24 ソニー株式会社 微小粒子の光学的測定方法及び光学的測定装置
US8266950B2 (en) 2007-12-19 2012-09-18 Los Alamos National Security, LLP Particle analysis in an acoustic cytometer
JP2009162660A (ja) * 2008-01-08 2009-07-23 Sony Corp 検出方法及び検出装置
JP4572973B2 (ja) 2008-06-16 2010-11-04 ソニー株式会社 マイクロチップ及びマイクロチップにおける送流方法
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
JP5487638B2 (ja) 2009-02-17 2014-05-07 ソニー株式会社 微小粒子分取のための装置及びマイクロチップ
JP2010207133A (ja) 2009-03-10 2010-09-24 Sony Corp 細胞分離方法
DE102009020252B4 (de) * 2009-05-07 2012-01-12 Krohne Optosens Gmbh Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenz eines Mediums
JP5304434B2 (ja) 2009-05-21 2013-10-02 ソニー株式会社 微小粒子測定装置
JP5304456B2 (ja) 2009-06-10 2013-10-02 ソニー株式会社 微小粒子測定装置
JP5493486B2 (ja) 2009-06-16 2014-05-14 ソニー株式会社 物質混合装置と物質混合方法
JP5534214B2 (ja) 2009-10-05 2014-06-25 ベイバイオサイエンス株式会社 フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法
CA2777524C (en) * 2009-10-16 2018-06-12 Canadian Blood Services Dual analyzer system for biological fluid
JP2011095181A (ja) * 2009-10-30 2011-05-12 Sysmex Corp 粒子分析装置
JP2011163787A (ja) 2010-02-05 2011-08-25 Sony Corp 微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
EP2534267B1 (en) 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
CA2767113A1 (en) * 2010-03-25 2011-09-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection system for droplet-based assays
JP5437148B2 (ja) 2010-04-23 2014-03-12 ベイバイオサイエンス株式会社 フローサイトメータおよびセルソータ
CA2797122C (en) * 2010-05-03 2019-02-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Optical combiner for combining multiple laser beams in a flow cytometer
KR101912952B1 (ko) * 2010-05-05 2018-10-29 베크만 쿨터 바이오메디컬, 엘엘씨 진단 기기 및 유동 공정
JP2011237201A (ja) 2010-05-06 2011-11-24 Sony Corp 微小粒子分取装置、マイクロチップ及びマイクロチップモジュール
DE102010023486A1 (de) * 2010-06-11 2011-12-15 B. Braun Avitum Ag Nachweisvorrichtung und -verfahren
US8384045B2 (en) 2010-07-01 2013-02-26 Sony Corporation Minute particle analyzing device and method
WO2012021587A2 (en) * 2010-08-10 2012-02-16 Rait Securities, Llc System and method for electronic trading of financial instruments
US8570500B2 (en) * 2010-08-20 2013-10-29 Stratedigm, Inc. Detector arrangement for a flow cytometry system
JP2012047464A (ja) 2010-08-24 2012-03-08 Sony Corp 微小粒子測定装置及び光軸補正方法
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
GB2484930B (en) * 2010-10-26 2017-04-26 Uh Ventures Ltd An improved low cost apparatus and method for the detection of a fluid-borne particle
JP5567526B2 (ja) * 2010-11-12 2014-08-06 株式会社日立ハイテクノロジーズ 分析装置および分析方法
JP5481402B2 (ja) * 2011-01-17 2014-04-23 株式会社日立ハイテクノロジーズ 自動分析装置
WO2012109600A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP3736281A1 (en) 2011-02-18 2020-11-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
JP5923859B2 (ja) * 2011-03-15 2016-05-25 ソニー株式会社 レーザー照射装置および微小粒子測定装置
EP2510958B2 (en) 2011-04-11 2023-02-15 Fresenius Medical Care Deutschland GmbH Method and apparatus for monitoring a treatment of a patient, preferably for monitoring hemodialysis, hemodiafiltration and/or peritoneal dialysis
US9556470B2 (en) 2011-06-02 2017-01-31 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US8976352B2 (en) * 2011-08-30 2015-03-10 Sony Corporation Microparticle analysis apparatus
JP5772425B2 (ja) * 2011-09-13 2015-09-02 ソニー株式会社 微小粒子測定装置
US9841367B2 (en) 2011-09-16 2017-12-12 The University Of North Carolina At Charlotte Methods and devices for optical sorting of microspheres based on their resonant optical properties
US9242248B2 (en) * 2011-09-16 2016-01-26 The University Of North Carolina At Charlotte Methods and devices for optical sorting of microspheres based on their resonant optical properties
US8582100B1 (en) * 2012-06-19 2013-11-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Remote multisensor optical particle monitor for flowing fluid systems
US8654329B2 (en) * 2012-06-19 2014-02-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Parallel multisensor optical particle sensors for flowing fluid systems
US9140648B2 (en) * 2013-03-12 2015-09-22 Ecolab Usa Inc. Fluorometer with multiple detection channels
JP6121319B2 (ja) 2013-03-29 2017-04-26 シスメックス株式会社 粒子測定装置、照射光学系および照射位置調整方法
US9513206B2 (en) 2013-03-29 2016-12-06 Sysmex Corporation Particle measuring apparatus
US9372143B2 (en) * 2013-05-15 2016-06-21 Captl Llc Scanning image flow cytometer
CN105324802B (zh) * 2013-06-03 2019-05-31 爱克斯崔里斯科技有限公司 颗粒检测系统及相关方法
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
KR20150062675A (ko) * 2013-11-29 2015-06-08 서울바이오시스 주식회사 휴대용 공기 품질 판단 장치
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US9726593B2 (en) 2014-02-28 2017-08-08 Life Technologies Corporation Systems, methods, and apparatuses for optical systems in flow cytometers
JP2017512301A (ja) 2014-02-28 2017-05-18 ライフ テクノロジーズ コーポレーション フローサイトメータにおける光学系のためのシステム、方法、及び装置
JP5646095B1 (ja) * 2014-03-14 2014-12-24 キヤノン株式会社 計測装置
US9575050B2 (en) 2014-04-21 2017-02-21 Becton, Dickinson And Company Slider tape sealing cartridge for adjustably sealing a flow cytometer sample manipulation chamber
JP6350086B2 (ja) * 2014-08-05 2018-07-04 株式会社島津製作所 光学的検出器
JP6435175B2 (ja) * 2014-12-02 2018-12-05 株式会社堀場エステック 分解検出装置、分解検出方法、分解検出装置用プログラム、濃度測定装置、及び、濃度制御装置
JP6821591B2 (ja) 2014-12-10 2021-01-27 サイテック バイオサイエンスィズ インコーポレイテッド 自己トリガフローサイトメーター
US10900885B2 (en) 2014-12-19 2021-01-26 Captl Llc Flow cytometry using hydrodynamically planar flow
WO2016105418A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Fluidigm Canada Inc. Methods and systems for correlating results of optical and mass cytometry
WO2016118333A1 (en) * 2015-01-21 2016-07-28 Stratedigm, Inc. Systems and methods for detecting a particle
CN107209102B (zh) 2015-02-18 2021-03-02 贝克顿·迪金森公司 光学检测系统及其使用方法
JP6475069B2 (ja) 2015-04-23 2019-02-27 アズビル株式会社 粒子検出装置及び粒子の検出方法
US10036698B2 (en) 2015-06-19 2018-07-31 Captl Llc Time-sequential cytometry
JP6596987B2 (ja) * 2015-07-02 2019-10-30 富士電機株式会社 粒子計測装置
DE102015111282A1 (de) * 2015-07-13 2017-01-19 Stiftung Caesar Center Of Advanced European Studies And Research Verfahren zum Beobachten eines chemischen und/oder biologischen Vorgangs
KR101681422B1 (ko) * 2015-07-31 2016-11-30 가톨릭대학교 산학협력단 다수의 레이저를 사용하는 세포 분석 장치
WO2017027736A1 (en) * 2015-08-12 2017-02-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multi-spectral filter profiling and quality control for flow cytometry
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
JP6237806B2 (ja) * 2016-03-16 2017-11-29 ソニー株式会社 微小粒子分取装置
WO2017212718A1 (ja) 2016-06-10 2017-12-14 ソニー株式会社 微小粒子測定装置及び微小粒子測定装置の洗浄方法
US10302568B2 (en) 2016-06-22 2019-05-28 DeNovix, Inc. Cell counter
JP7068292B2 (ja) * 2016-07-15 2022-05-16 アジレント・テクノロジーズ・インク フローサイトメーターのための光学検出システム、フローサイトメーターのシステムおよび使用方法
EP4050322B1 (en) * 2016-08-04 2024-05-29 Malvern Panalytical Limited Method of characterising particles suspended in a fluid dispersant by light diffraction, processor and machine-readable, non-transient storage medium
JP6350626B2 (ja) * 2016-09-29 2018-07-04 ソニー株式会社 データ解析方法
KR101934926B1 (ko) * 2017-01-10 2019-01-03 충남대학교산학협력단 유동 유체 내의 나노입자 거동 예측 방법 및 장치
EP3361232A1 (en) * 2017-02-09 2018-08-15 Koninklijke Philips N.V. Optical particle sensor and sensing method
US10585031B2 (en) 2017-02-27 2020-03-10 Becton, Dickinson And Company Light detection systems and methods for using thereof
EP3382372A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-03 Koninklijke Philips N.V. Optical particle sensor and sensing method
US10648909B2 (en) * 2017-05-25 2020-05-12 Abbott Laboratories Methods and systems for assessing flow cell cleanliness
KR101986903B1 (ko) * 2017-09-29 2019-06-07 포항공과대학교 산학협력단 입자의 광학적 관측 및 분석 장치, 그리고 관측 및 분석 방법
US11668711B2 (en) * 2017-11-13 2023-06-06 Cornell Univeristy Multiplexed diagnostic assay for iron and vitamin A deficiency and methods of use thereof
ES2778148T3 (es) * 2018-01-31 2020-08-07 Sick Engineering Gmbh Aparato de análisis para la determinación de polvo fino
GB201806412D0 (en) * 2018-04-19 2018-06-06 Castrol Ltd Apparatus and method for fluid analysis
JP2019191013A (ja) 2018-04-25 2019-10-31 ソニー株式会社 微小粒子測定装置
WO2020150746A1 (en) * 2019-01-18 2020-07-23 Mission Bio Method, apparatus and system to detect sub-particle flowrate in a closed systems
JP2020143991A (ja) * 2019-03-06 2020-09-10 ソニー株式会社 微小粒子測定装置、微小粒子分取装置、微小粒子測定システム及び微小粒子分取システム
CN109946219A (zh) * 2019-04-12 2019-06-28 广西师范大学 一种流式细胞仪散射光和荧光检测装置及方法
WO2020237222A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Mission Bio, Inc. Method and apparatus for simultaneous targeted sequencing of dna, rna and protein
WO2021003255A1 (en) 2019-07-01 2021-01-07 Mission Bio Method and apparatus to normalize quantitative readouts in single-cell experiments
DE102020000677B4 (de) 2020-02-01 2023-01-12 Hochschule Anhalt Universaldurchflussmessgerät und Verfahren zur Steuerung eines Universaldurchflussmessgeräts
WO2021178889A1 (en) * 2020-03-05 2021-09-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Three-dimensional dosimetry procedures, methods and devices, and optical ct scanner apparatus which utilizes fiber optic taper for collimated images
EP4143536A4 (en) * 2020-04-29 2023-11-01 Becton, Dickinson and Company SYNCHRONOUS MODULATION AND DETECTION METHODS IN A FLOW CYTOMETER AND ASSOCIATED SYSTEMS
US11885743B2 (en) * 2020-07-22 2024-01-30 Agar Corporation, Inc. Fluorescence and scatter and absorption spectroscopic apparatus with a sapphire tube and method for analyzing inline low level hydrocarbon in a flow medium
EP3943918A1 (en) * 2020-07-22 2022-01-26 Universidade do Minho Device for identification and quantification of phytoplankton, methods and uses thereof
US11846578B2 (en) * 2020-09-28 2023-12-19 Lighthouse Worldwide Solutions Apparatus and method for characterization of particles
US20220313806A1 (en) 2021-03-25 2022-10-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
CN114152559A (zh) * 2021-12-13 2022-03-08 常州必达科生物科技有限公司 一种光斑的检测方法及检测装置
EP4306929A1 (en) * 2022-07-11 2024-01-17 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Fluorometer system, fluorescene analysis method, and use thereof
CN116908077B (zh) * 2023-09-08 2023-11-24 赛雷纳（中国）医疗科技有限公司 一种流式细胞仪及其控制方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61173141A (ja) * 1985-01-28 1986-08-04 Canon Inc 粒子解析装置
WO2003021212A1 (en) * 2001-08-28 2003-03-13 Baylor College Of Medicine Pulsed-multiline excitation for color-blind fluorescence detection
JP2003315248A (ja) * 2002-04-24 2003-11-06 Sysmex Corp フローサイトメータ
JP2006275858A (ja) * 2005-03-30 2006-10-12 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 蛍光検出方法、蛍光検出用ビーズの作製方法及び蛍光検出用ビーズ

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5760900A (en) * 1989-03-18 1998-06-02 Canon Kabushiki Kaisha Method and apparatus for optically measuring specimen
EP1146617A3 (en) 2000-03-31 2003-04-23 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. High-powered semiconductor laser array apparatus
US6828567B2 (en) * 2001-01-26 2004-12-07 Biocal Technology, Inc. Optical detection in a multi-channel bio-separation system
US6944322B2 (en) * 2001-03-28 2005-09-13 Visiongate, Inc. Optical tomography of small objects using parallel ray illumination and post-specimen optical magnification
US6870165B2 (en) * 2001-10-19 2005-03-22 Biocal Technology, Inc. Multi-color multiplexed analysis in a bio-separation system
JP3891925B2 (ja) 2002-12-03 2007-03-14 ベイバイオサイエンス株式会社 生物学的粒子の情報を得る装置
US7106442B2 (en) * 2003-04-29 2006-09-12 Silcott David B Multi-spectral optical method and system for detecting and classifying biological and non-biological particles
JP4304120B2 (ja) * 2004-04-30 2009-07-29 ベイバイオサイエンス株式会社 生物学的粒子をソーティングする装置及び方法
JP4304195B2 (ja) * 2006-06-13 2009-07-29 ベイバイオサイエンス株式会社 生物学的粒子をソーティングする装置及び方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61173141A (ja) * 1985-01-28 1986-08-04 Canon Inc 粒子解析装置
WO2003021212A1 (en) * 2001-08-28 2003-03-13 Baylor College Of Medicine Pulsed-multiline excitation for color-blind fluorescence detection
JP2003315248A (ja) * 2002-04-24 2003-11-06 Sysmex Corp フローサイトメータ
JP2006275858A (ja) * 2005-03-30 2006-10-12 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 蛍光検出方法、蛍光検出用ビーズの作製方法及び蛍光検出用ビーズ

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101382499B (zh) * 2007-09-04 2012-10-03 索尼株式会社 光照射装置、微粒分析装置和光照射方法
US7782512B2 (en) 2007-09-04 2010-08-24 Sony Corporation Light irradiation device, fine particle analyzing apparatus, and light irradiation method
EP2034291A1 (en) 2007-09-04 2009-03-11 Sony Corporation Light irradiation device, fine particle analyzing apparatus, and light irradiation method
US10006851B2 (en) 2008-01-15 2018-06-26 Malvern Panalytical Limited Light scattering measurements using simultaneous detection
EP2235501B1 (en) * 2008-01-15 2018-05-23 Malvern Panalytical Limited Light scattering measurements using simultaneous detection
CN102374964B (zh) * 2010-07-20 2015-08-19 索尼公司 微粒检测装置及光照射装置
CN102374964A (zh) * 2010-07-20 2012-03-14 索尼公司 微粒检测装置及光照射装置
JP2019513236A (ja) * 2016-03-17 2019-05-23 ビーディー バイオサイエンス ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別
JP2022095825A (ja) * 2016-03-17 2022-06-28 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別
JP7130562B2 (ja) 2016-03-17 2022-09-05 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別
US20220099553A1 (en) * 2016-03-18 2022-03-31 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. Sample analyzer and sample analysis method thereof
US11709126B2 (en) * 2016-03-18 2023-07-25 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. Sample analyzer and sample analysis method thereof
US11698334B2 (en) 2016-09-13 2023-07-11 Becton, Dickinson And Company Flow cytometer with optical equalization
CN112147044A (zh) * 2020-09-07 2020-12-29 桂林电子科技大学 用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置
CN112229781A (zh) * 2020-09-07 2021-01-15 桂林电子科技大学 一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置

Also Published As

Publication number Publication date
US7990525B2 (en) 2011-08-02
JP4756948B2 (ja) 2011-08-24
DE112006002091T8 (de) 2008-10-09
DE112006002091T5 (de) 2008-07-10
JP2007046947A (ja) 2007-02-22
DE112006002091B4 (de) 2019-02-21
US20090122311A1 (en) 2009-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007018087A1 (ja) フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法
JP4389991B2 (ja) 微小粒子の光学的測定方法及び光学的測定装置
JP4990746B2 (ja) 液体フローに含まれる生物学的粒子を分別する装置ならびにその方法
JP4698766B2 (ja) 蛍光検出装置および蛍光検出方法
US20100032584A1 (en) Tiime gated fluorescent flow cytometer
US20050162648A1 (en) System and method for multiple laser triggering
US8450702B2 (en) Fluorescence detecting method and fluorescence detecting device
US8618510B2 (en) Optically integrated microfluidic cytometers for high throughput screening of photophysical properties of cells or particles
JP2009282049A (ja) 粒子分類システム用光検出器
JP2005315799A (ja) 生物学的粒子をソーティングする装置及び方法
US5185265A (en) Pulse modulation of the excitation light source of flow cytometers
KR20090045845A (ko) 미소 입자의 측정 방법 및 측정용 기판과 측정 장치
US10137479B2 (en) Temporal multiplexed excitation for miniaturized, planar fluorescence activated cell sorting
US11828697B2 (en) Multichannel excitation and emission for miniaturized, planar fluorescence activated cell sorting
CN102272582A (zh) 荧光检测装置及荧光检测方法
JPH0792077A (ja) 粒子解析装置
US20140158913A1 (en) Microparticle analysis apparatus and microparticle analysis method
JPS62165141A (ja) 微小粒子分析装置
US11674877B2 (en) Apparatus and method for cyclic flow cytometry using particularized cell identification
KR100619256B1 (ko) 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 생물세포 분류장치 및 세포 분류방법
JPH04188045A (ja) 検体測定装置
JP2749928B2 (ja) 検体測定方法及び検体測定装置
JP2022107070A (ja) 粒子分取装置、粒子分取方法及びコンピュータプログラム
JPS63231244A (ja) 細胞分析装置
JP6860890B2 (ja) 液体中微粒子分析システムおよび液体中微粒子分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11988386

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1120060020919

Country of ref document: DE

RET De translation (de og part 6b)

Ref document number: 112006002091

Country of ref document: DE

Date of ref document: 20080710

Kind code of ref document: P

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06782159

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1