KR100619256B1

KR100619256B1 - 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 생물세포 분류장치 및 세포 분류방법

Info

Publication number: KR100619256B1
Application number: KR1020040019223A
Authority: KR
Inventors: 김진승
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2004-03-22
Filing date: 2004-03-22
Publication date: 2006-08-31
Also published as: KR20050094097A

Abstract

본 발명은 레이저다이오드를 써서 생물세포를 검출하여 분류하는 형광활성 세포분류 장치에 관한 것으로서, 세포흐름실의 노즐로부터 배출되는 세포들을 유형에 따라 구분하기 위하여, 평행광을 연속적으로 내어 노즐에 위치하는 검출영역을 지나가는 세포의 흐름을 검출하는 세포검출 연속작동 레이저다이오드와, 세포가 검출된 시점에 소정 시간동안 광펄스를 내는 펄스작동 레이저다이오드로 구성된다. 본 발명의 형광활성 세포분류 장치는, 레이저다이오드를 쓰기 때문에, 아르곤 이온 레이저 등을 쓰는 종래의 형광활성 세포분류 장치와 비교할 때 상대적으로 크기가 작고, 가벼우며, 전력소모가 적고, 값이 싸게 구성될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포를 분류하는 방법은 세포검출 연속작동 레이저다이오드에서 나오는 빛을 검출영역에 비추어 세포의 흐름을 검출하고, 검출된 세포에 펄스작동 레이저다이오드에서 나오는 고출력 광펄스를 비추어 그 세포로부터 방출되는 산란광 또는 형광을 검출하며, 그 산란광과 형광으로부터 변환된 산란광신호 또는 형광신호에 따라 상기 세포의 특성을 분석하고 이를 바탕으로 분류한다.

생물세포, 형광활성 세포, FACS, 레이저다이오드, 세포검출 연속작동 레이저다이오드, 펄스작동 레이저다이오드, 세포분류

Description

레이저다이오드를 사용하는 형광활성 생물세포 분류장치 및 세포 분류방법{Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS) Apparatus with Laser Diodes for Characterizing and Sorting Cells and Method For Sorting the Cells Using the Same}

도 1은 아르곤 이온 레이저를 쓰는 종래의 형광활성 세포분류 장치의 구성을 보여준다.

도 2는 도 1의 형광활성 세포분류 장치에서 세포가 지나가는, 흐름실의 노즐을 상세하게 보여준다.

도 3a는 도 1의 형광활성 세포분류 장치의 염색세포 검출신호를 나타낸 그래프이다.

도 3b는 도 1의 형광활성 세포분류 장치의 소비 전력을 나타낸 그래프이다.

도 4는 이 발명에 따른 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치의 구성을 보여준다.

도 5는 도 4의 형광활성 세포분류 장치에서 세포가 지나가는, 세포흐름실의 노즐을 상세하게 보여준다.

도 6은 도 4의 형광활성 세포분류 장치의 중앙처리부의 구성을 상세하게 보여준다.

도 7은 본 발명에 따른 형광활성 세포분류 장치를 써서 형광활성 세포를 분류하는 방법을 나타낸 순서 도이다.

도 8a~c는 본 발명에 따른 형광활성 세포분류 장치를 이용한 형광활성 세포 분류방법을 설명하는 도이다.

도 9a는 도 4의 형광활성 세포분류 장치의 세포검출 신호를 나타낸 그래프이다.

도 9b는 도 4의 형광활성 세포분류 장치의 소비 전력을 나타낸 그래프이다.

* 도면의 주요 부호에 대한 설명 *

1, 2, 4, 21, 22, 24: 광증배관(photomultiplier)

3, 23: 이색 빛가르개(dichroic beam-splitter)

5, 25: 빛가르개(beam-splitter)

6: 아르곤이온 레이저(Argon ion laser system)

7, 29: 집속렌즈(focusing lens)

8, 30: 세포흐름실(flow chamber)

8-1, 30-1: 표본 유체관(sample fluid pipe)

8-2, 30-2: 시스 유체관(sheath fluid pipe)

8-3, 30-3: 노즐(nozzle)

8-4, 8-6, 30-4, 30-6: 유핵세포

8-5, 30-5: 무핵세포

8-7, 30-7: 세포핵

9, 31: 형광 집광렌즈(fluorescent light collecting lens)

10, 32: 산란광 집광렌즈(scattered light collecting lens)

11, 33, 33-1: 광검출기(photodetector)

12, 34-2: 전원회로부

13, 35: 세포분류그릇

13-1, 13-2, 13-3: 내부그릇

26: 펄스작동 레이저다이오드(pulse operated laser diode)

27: 세포검출 연속작동 레이저다이오드(continuously operated cell detection laser diode)

28, 28-1: 반투과거울(half mirror)

34: 중앙처리부

34-1: 제어부

34-3: 세포분류 처리부

이 발명은 형광활성 세포 분류기술에 관한 것으로서, 더 상세하게는 레이저다이오드를 써서 형광활성 세포를 검출하고 분류하는, 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치 및 형광활성 세포 분류방법에 관한 것이다.

광학현미경을 통하여 세포를 관찰한 이래로, 세포를 정량적으로 분석하고 분 류하기 위하여, 세포 염색기술, 광전자기술 및 세포를 미세관을 따라 흐르게 하는 기술들을 조합하여 이루어진 "형광활성 세포분류 장치 (Fluorescence Activated Cell Sorting Apparatus)"가 개발되었다. 곧, 이러한 형광활성 세포분류 장치는 염색된 세포가 소정의 관을 통하여 흐를 수 있게 하는 "세포 흐름 제어계(fluidic system)"와, 세포 흐름 제어 시스템에 제어에 따라 흐르는 세포를 관찰하기 위한 "광학계(optical system)"와, 광학계의 광신호를 전기신호로 바꾸어 처리하는 "전자계(electronic system)"로 이루어진다.

도 1은 종래의 아르곤이온 레이저를 쓰는 형광활성 세포분류 장치를 나타낸 구성도로서, 예를 들어, 파장이 480nm이고 광출력(power) 100mW의 평행광(S1)을 연속적으로 내는 아르곤이온 레이저(6)와, 상기 평행광(S1)을 받아 자신의 초점에 모아 집속된 빛을 만드는 집속렌즈(7)와, 상기 집속렌즈(7)의 초점에 모이는 빛을 세포에 비추어주기 위해, 상기 초점에 노즐을 위치시키고 그 노즐을 통하여 세포들을 내보내는 세포흐름실(8)과, 세포가 상기 초점을 지나면서 집속된 빛을 받아 산란시킨 빛(D1)을 모으는 산란광 집광렌즈(10)와, 상기 산란광 집광렌즈(10)가 모은 산란광을 검출하여 전기신호로 바꾸는 광검출기(11)와, 상기 초점을 지나가는 세포가 집속된 빛을 받아 흡수한 뒤 내는 형광을 모으는 형광 집광렌즈(9)와, 상기 형광 집광렌즈(9)가 모은 형광빛을 받아 일부는 반사하고 일부는 투과시키는 빛가르개(5)와, 상기 빛가르개(5)로부터 반사된 제1반사 형광을 검출하는 제1광증배관(4)과, 상기 빛가르개(5)를 투과한 제1투과 형광을 받아 그 형광의 파장에 따라 선택적으로 일부는 반사하고 일부는 투과시키는 이색 빛가르개(3)와, 상기 이색 빛가르개(3)로부터 반사된 제2반사 형광을 검출하는 제2광증배관(2)과, 상기 이색 빛가르개(3)를 투과한 제2통과 형광을 검출하는 제3광증배관(1)과, 각 요소에 전원을 공급하고 그 각 요소를 제어하는 전원회로부(12)로 구성된다.

여기서, 상기 세포흐름실(8)은, 외부로부터 세포가 섞여있는 표본액(sample fluid)을 받아들이고자 연결된 표본 유체관(8-1)과, 외부로부터 시스액(seath fluid)을 받아들이고자 연결된 시스 유체관(8-2)과, 시스액과 표본액을 받아 세포가 상기 집속렌즈(7)의 초점을 지나가게 하는 노즐(8-3)로 구성된다.

또한, 상기 종래의 아르곤이온 레이저를 쓰는 형광활성 세포분류 장치는 상기 노즐(8-3)로부터 배출되어 광산란 특성에 따라 분류된 세포를 담는 세포분류 그릇(13)이 더 설치된다. 여기서, 상기 그릇(13)은, 도 2에 나타낸 것과 같이, 세포의 특성에 따라 분류된 세포들을 담을 수 있는 여러 개의 내부그릇(13-1, 13-2, 13-3)으로 구성된다.

도 2는 도 1의 형광활성 세포분류 장치에서 세포가 지나가는, 세포흐름실(8)의 노즐(8-3)을 상세하게 나타낸 구성도이다. 도에 보인 것과 같이, 노즐(8-3)은 소정의 지름과 길이를 갖는 구조로서 세포 흐름실의 내부로부터 그릇을 향해 각각의 세포가 하나씩 줄지어서 지나가게 한다. 여기서, 집속렌즈(7)를 지나 집속된 빛(S1)은 노즐(8-3)을 지나기 때문에, 세포가 세포 흐름실의 내부로부터 노즐(8-3)을 따라 진행하여 바깥으로 배출되는 동안에 그 세포는 집속된 빛(S1)을 받는다.

이와 같이 구성된, 아르곤이온 레이저를 쓰는 형광활성 세포분류 장치의 작동 방법을 도와 함께 살펴보면 다음과 같다.

먼저, 모든 구성 요소들이 정렬된 상태에서, 미리 형광염료로 물들이는 등과 같이 처리된, 염색처리된 세포를 포함하는 표본액과, 이 표본액을 둘러싸고 흐르게 될 시스액이 각각 표본 유체관(8-1)과 시스 유체관(8-2)을 따라 세포 흐름실(8)에 들어 온 다음에 노즐(8-3)을 통하여 함께 외부로 배출된다. 표본액은 노즐의 중심축을 따라 흐르고, 시스액은 표본액을 둘러싸고 흐른다. 따라서, 표본액에 둘러싸여 흐르는 세포는 노즐의 중심축에서 벗어나지 않은 상태로 노즐을 따라 흐른다. 표본액과 시스액의 배출 양과 속도는 표본 유체관과 시스 유체관의 내부 압력에 의하여 조절된다.

동시에, 세포들의 크기, 모양, 구조, 조성, 광산란 특성, 형광방출 특성을 분석하고 그 결과에 따라 세포들을 분류하기 위하여, 아르곤이온 레이저(6)는 노즐(803)에 연속적으로 레이저 빛을 비추어 노즐을 지나가는 세포가 레이저 빛을 받을 수 있게 해준다. 그러면, 도 2에 보인 것처럼, 집속된 아르곤이온 레이저 빛을 받은 세포(8-6)의 세포물질(핵)(8-7)은 산란광(D1)을 생성함과 동시에 세포물질(핵)에 염색된 형광염료 때문에 형광(F1)을 방출한다. 산란광(D1)은 산란광 집광렌즈(10)를 거쳐 광검출기(11)에 의하여 검출된다. 동시에 형광(F1)은 형광 집광렌즈(9)에 의하여 모아져서, 형광 집광렌즈(9)로부터 집속된 빛다발의 형태의 집속된 형광이 출력된다.

상기 집속된 형광은 빛가르개(5)와 이색빛가르개(3)에서 각각 반사와 투과를 거쳐 광증배관(4, 2, 1)에서 검출된다. 그러면, 전원회로부(12)에 포함된 제어부(나타내지 않음)는 광증배관(4, 2, 1)에서 검출된 신호들을 처리하여, 그 처리된 결 과에 따라 현재 노즐(8-3)로부터 배출되고 있는 해당 세포가 세포분류그릇(13-1, 13-2, 13-2)가운데 미리 정해진 어느 하나의 내부그릇에 들어가도록 제어한다.

한편, 세포의 종류가 다르거나 핵이 없는 등의 이유로 세포물질(핵)에 형광색소가 붙지 않는 "형광비활성"세포(8-5)는, 레이저 광선을 받더라도, 산란광(D1)은 내지만 형광(F1)은 거의 내지 않기 때문에, 전원회로부(12)의 제어부는 현재 노즐로부터 배출되는 세포가 형광비활성 세포임을 판단하고, 그에 따라 해당 형광비활성 세포만을 모으는 내부그릇(13-2)에 들어가도록 제어한다.

상기와 같이 동작하는, 종래의 형광활성 세포분류 장치가 노즐을 지나가는 세포의 특성을 분석하고 이를 바탕으로 분류할 때, 아르곤이온 레이저로부터 방출되는 레이저 광선에 의하여 검출되는 형광활성 세포의 검출신호와 그 소비전력 사이의 관계를 도면과 함께 설명하면 다음과 같다.

도 3(a)는 도 1의 형광활성 세포분류 장치의 형광활성 세포 검출신호를 나타낸 그래프이고, 도 3(b)는 도 1의 형광활성 세포분류 장치의 소비 전력을 나타낸 그래프이다.

보기를 들어, 도 3(a)에 나타낸 것과 같이, 세포흐름실(8)로부터 세포분류그릇(13)에 분류되는 세포들 중에서 형광활성 세포(8-6, 8-4)가 시점(t1)과 시점(t3)에 노즐(8-3)을 통하여 지나가고, 형광비활성 세포(8-5)가 시점(t2)에 지나간다면, 아르곤이온 레이저는 광출력(P1)이 일정한 레이저 빛을 연속적으로 상기 노즐(8-3)에 쪼여주기 때문에, 도 3(b)에 나타낸 것과 같이, 광검출기(11)는 현재 노즐을 지나가는 형광활성 세포(8-6, 8-4)에 대해서는 시점(t1, t3)에서 형광검출신호(SG1) 를 내고, 형광비활성 세포(8-5)에 대해서는 형광검출신호를 거의 내지 못한다.

그러나, 비록 상기 아르곤이온 레이저를 쓰는 형광활성 세포분류 장치가 세포흐름실로부터 노즐을 통하여 배출되는 세포들을 분류하여 세포그릇에 담을 수 있게 동작하기는 해도, 세포가 노즐을 지나가건 지나가지 않건 언제나 고출력의 레이저 빛을 노즐에 연속적으로 비추어야하기 때문에 그 에너지 이용 효율이 낮은 단점이 있다. 또한, 아르곤이온 레이저와 및 그에 부속되는 주변 기기가 크고, 무거워 이동성이 작으며, 값이 매우 비싸기 때문에, 아르곤이온 레이저를 쓰는 형광활성 세포분류 장치 역시 크고, 무거우며, 큰 공간을 차지하여 이동성이 작고, 값이 비싸며 그에 따라 널리 보급되지 못하는 문제점이 있다.

따라서, 이 발명의 목적은 상기의 문제점을 풀고자, 세포가 노즐을 통해 레이저 빛의 경로를 지나가는 순간에만 그 세포의 특성을 분석하는데 필요한 만큼 광출력이 상대적으로 센 광펄스를 비추어 그 세포에서 나오는 산란광과 형광을 분석하고, 그 분석된 값을 바탕으로 그 세포의 특성에 따라 해당세포들을 분류하는, 평균 광출력이 상대적으로 작은, "레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치와 형광활성 세포 분류방법"을 제공하는 데에 있다.

이를 위하여 이 발명에 따른 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치는 노즐(30-3)을 통하여 세포를 내보내는 세포흐름실(30)과, 상기 노즐(30-3)의 제1위치를 지나는 상기 세포에 광펄스(S2)를 비추는 펄스작동 레이저다이오드(26)와, 상기 제1위치를 기준으로 세포가 상기 제1위치를 통과하기 전에 위치하고, 상 기 제1위치로부터 미리 설정된 거리만큼 떨어진, 상기 노즐(30-3)의 제2위치에 레이저 빛을 연속적으로 비추는 연속평행광(D0)을 내는 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)와, 세포가 상기 연속평행광을 지나갈 때 내는 산란광 또는 형광을 검출하여 검출신호를 생성하는 연속광 검출기(33-1)와, 상기 검출신호를 바탕으로 상기 펄스작동 레이저다이오드의 구동시점을 제어하고, 상기 각 요소에 전원을 공급하고 제어하는 중앙처리부(34)와, 상기 광펄스에 의하여 상기 염색된 세포가 방출하는 산란광 및 형광을 검출하고 그 검출된 신호를 바탕으로, 상기 염색된 세포를 분류하는 세포분류 처리부를 포함하여 실시함으로써 달성된다.

이 발명에 따른 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포 분류방법은 세포검출 연속작동 레이저다이오드에서 연속적으로 나오는 레이저 빛을 세포가 지나가는 노즐에 비추는 단계와, 노즐을 지나가는 세포가 레이저 빛을 지나가면서 내는 산란광 또는 형광을 검출하여 세포가 지나가는 것을 확인하는 단계와, 검출된 신호에 따라 펄스작동 레이저다이오드를 구동하여 광출력이 상대적으로 큰 광펄스를 상기 세포에 비추는 단계와, 상기 광펄스를 받은 세포가 내는 산란광과 형광을 검출하는 단계와, 상기 검출된 산란광과 형광을 바탕으로 상기 세포의 특성을 분석하고 이에 따라 세포를 분류하는 단계를 포함하여 실시함으로써 달성된다.

이 발명에 따른 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치를 도와 함께 상세하게 설명하면 다음과 같다.

도 4는 이 발명에 따른 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치를 나 타낸 구성도로서, 노즐(30-3)을 통하여 세포를 내보내는 세포흐름실(30)과, 상기 노즐(30-3)에 광펄스(S2)를 비추어주는 펄스작동 레이저다이오드(26)와, 상기 광펄스 (S2)를 받아 노즐에 있는 자신의 초점에 집속시키는 집속렌즈(29)와, 상기 초점위치로부터 방출되는 산란광(D2)을 모으는 산란광 집광렌즈(32)와, 상기 산란광 집광렌즈(32)가 모은 산란광을 검출하는 산란광 검출기(33)와, 상기 초점을 지나가는 세포가 방출하는 형광을 모으는 형광 집광렌즈(31)와, 상기 형광 집광렌즈(31)가 모은 빛을 받아 일부는 반사하고 일부는 투과시키는 빛가르개(25)와, 상기 빛가르개(25)로부터 반사된 제1반사 형광을 검출하는 제1광증배관(24)와, 상기 빛가르개(25)를 투과한 제1통과 형광을 받아 빛의 파장에 따라 선택적으로 일부는 반사하고 일부는 투과시키는 이색 빛가르개(23)와, 상기 이색 빛가르개(23)로부터 반사된 제2반사 형광을 검출하는 제2광증배관(22)과, 상기 이색 빛가르개(23)를 투과한 제2통과 형광을 검출하는 제3광증배관(21)과, 상대적으로 광출력이 낮은, 연속평행광(D0)을 내는 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)와, 상기 연속평행광(D0)의 광경로가 상기 초점렌즈(29)를 거쳐서, 상기 초점렌즈의 초점을 기준으로 세포가 상기 초점을 지나가기 전에 위치하는, 노즐(30-3) 내의 제1위치에 쪼여주는 제1반투과거울(28)과, 상기 제1위치를 지난 연속평행광의 광경로를 바꾸는 제2반투과거울(28-1)과, 상기 제2반투과거울(28-1)로부터 반사된 연속평행광을 검출하는 연속광 검출기(33-1)와, 각 요소에 전원을 공급하고 그 각 요소를 제어하는 중앙처리부(34)로 구성된다.

여기서, 상기 세포흐름실(30)은, 외부로부터 세포가 섞여있는 액체를 받아들 이고자 연결한 표본 유체관(30-1)과, 외부로부터 시스액을 받아들이고자 연결한 시스 유체관(30-2)과, 상기 시스액과 세포가 혼합된 액체를 받아 세포가 상기 초점을 지나가게 하는 노즐(30-3)로 구성된다.

또한, 이 발명에 따른 형광활성 세포분류 장치는, 상기 중앙처리부의 제어에 따라, 상기 노즐(30-3)로부터 배출되는 세포의 이동 방향을 조절하는 방향조절부(나타내지 않음)와, 상기 방향조절부의 조절에 따라, 상기 노즐(30-3)로부터 배출되는 세포를 담는 세포분류 그릇(35)을 더 포함한다. 여기서, 상기 세포분류 그릇(35)은, 도 5에 나타낸 것과 같이, 세포의 특성에 따라 분류된 세포들을 담을 수 있는 여러 개의 내부그릇(35-1, 35-2, 35-3)으로 구성된다.

도 5는 도 4의 형광활성 세포분류 장치에서 세포가 지나가는, 세포흐름실의 노즐(30-3)을 상세하게 나타낸 구성도이다.

상기 노즐(30-3)은 소정의 지름과 길이를 갖는 구조로서, 세포흐름실(30)로부터 세포분류 그릇(35)으로 세포가 줄지어서 지나가게 한다. 곧, 상대적으로 가느다란 관 모양의 노즐(30-3)은 형광염료가 붙은 세포물질(핵)(30-7)을 갖는 형광활성 세포(30-4, 30-6) 및 형광염료가 붙지 않은 형광비활성 세포(30-5)를 세포흐름실(30)로부터 세포분류 그릇(35)으로 줄지어 흐르게 한다.

도 6은 도 4의 형광활성 세포분류 장치의 중앙처리부(34)를 상세하게 나타낸 구성도로서, 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)의 동작을 제어하고, 연속광 검출기(33-1)로부터 출력되는 신호에 따라 펄스작동 레이저다이오드(26)의 동작을 제어하는 제어부(34-1)와, 산란광 검출기(33)로부터 나오는 산란광 검출신호와 제1~ 제3광증배관(24, 22, 21)로부터 출력되는 형광 검출신호를 바탕으로 상기 방향조절부(나타내지 않음)를 조절하여, 현재 노즐(30-3)로부터 배출되는 세포를 분류하는 세포분류 처리부(34-3)와, 각 요소에 전원을 공급하는 전원회로부(34-2)를 포함한다.

여기서, 상기 제어부는(34-1)는 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)를 구동하는 세포검출 연속작동 레이저다이오드 구동부(34-1A)와, 펄스작동 레이저다이오드(26)를 구동하는 펄스작동 레이저다이오드 구동부(34-1B)와, 상기 연속광 검출기(33-1)로부터 나오는 연속광 검출신호를 입력하여, 세포가 현재 노즐(30-3)을 지나는 것을 확인하는 세포 검출부(34-1D)와, 상기 세포 검출부(34-1D)로부터 나오는 검출신호를 바탕으로 상기 펄스작동 레이저다이오드(26)의 구동시점을 결정하여 동기신호를 생성하는 동기부(34-1E)와, 상기 세포검출 연속작동 레이저다이오드 구동부(34-1A)를 제어하며 아울러 상기 동기부(34-1E)로부터 나오는 동기신호에 따라, 상기 펄스작동 레이저다이오드 구동부(34-1B)를 통하여 상기 펄스작동 레이저다이오드의 동작을 제어하는 레이저다이오드 제어부(34-1C)를 포함한다.

상기와 같이 구성된, 이 발명에 따른 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치의 동작방법을 도 7과 도 8(a) ~ 도 8(c) 및 도 9와 함께 살펴보면 다음과 같다.

먼저, 모든 장치구성 요소들이 광학적 및 전기적으로 정렬된 상태에서, 미리 적절하게 형광염료 처리되어 세포가 섞인 표본액과 시스액이 각각의 표본 유체관(30-1)과 시스 유체관(30-2)을 따라 세포흐름실(30)에 들어와서 더해져 표본 액과 시스액은 노즐(30-3)을 통하여 세포분류 그릇(35)로 소정의 속도로 배출되도록 설정한다(ST1). 여기서, 상기 표본 유체관(30-1)과 시스 유체관(30-2)을 따라 세포 흐름실(30)로 들어오는 표본액과 시스액의 양과 속도는 표본 유체관(30-1)과 시스 유체관(30-2)의 내부 압력에 의하여 조절된다.

동시에 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)를 동작시켜 연속평행광이 노즐(30-3)을 지나는 세포에게 비춘다 (ST2). 여기서, 노즐(30-3)을 따라 세포흐름실(30)로부터 세포분류 그릇(35) 쪽으로 형광활성 세포(C1), 형광비활성 세포(C2), 형광활성 세포(C3, C4)는, 도 8a에 보인 것처럼 차례대로 흐른다. 그러면, 상기 형광활성 세포(C1)가 제1위치에서 t1의 시점에 연속평행광(D0)을 받고, 상기 시점(t1)으로부터 소정의 시차를 두고, 상기 형광활성 세포(C1)에 이어지는 형광활성 또는 형광비활성 세포(C2, C3, C4)도 차례대로 각각의 시점(t2, t3, t4)에 연속평행광(D0)을 받는다.

따라서, 시점(t1)에 제1위치에서 형광활성 세포(C1)가 연속평행광(D0)을 받으면, 산란광(D0-1)과 약하지만 형광(D0-2)을 방출한다. 이때, 연속광 검출기(33-1)는, 도 9(a)에 나타낸 것과 같이, 산란광(D0-1)을 검출하여 검출신호(SG2)를 세포 검출부(34-1D)에 보낸다(ST3).

그러면, 상기 동기부(34-1E)는 상기 세포 검출부(34-1D)를 통하여 받은 검출신호를 바탕으로, 상기 제1위치, 펄스작동 레이저다이오드에서 나오는 광펄스가 지나가는 초점 및 노즐을 지나가는 염색세포의 속도와 같은 인자들을 써서 상기 펄스작동 레이저다이오드의 동작시점을 결정하여 동기신호를 만들어 레이저다이오드 제 어부(34-1C)에 보낸다.

상기 동기신호를 받은 레이저다이오드 제어부(34-1C)는 펄스작동 레이저다이오드 구동부(34-1B)를 제어한다. 그러면, 상기 펄스작동 레이저다이오드(26)는, 도 8(b)에 보인 것처럼, 상기 펄스작동 레이저다이오드 구동부의 제어에 따라, 상기 형광활성 세포(C1)에 광펄스(S2)를 비추고 그것을 받은 형광활성 세포는 산란광(D2)과 형광(F2)을 내보낸다 (ST4). 곧, 상기 펄스작동 레이저다이오드(26)는, 시점(t1+d)에 비활성 상태로부터 활성 상태가 되어 시간(T) 동안 상기 세포(C1)에 광펄스(S2)를 비춰준다.

그러면, 세포분류 처리부(34-3)는 산란광 검출기(33)와 제1 ~ 제3 광증배관(24, 22, 21)로부터 전송되는 신호들을 받아들여 현재 노즐(30-3)을 지나가는 세포(C1)의 특성을 판단하여 분류신호를 출력한다(ST5).

세포분류 처리부(34-3)로부터 출력되는 분류신호에 따라, 방향조절부는 노즐(30-3)로부터 배출되는 형광활성 세포(C1)가 해당하는 세포분류 그릇(35)에 들어가도록 동작한다 (ST6).

한편, 세포(C1)가 분류되는 동안에, 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)로부터 연속적으로 나오는, 상기 연속평행광을 시점(t2)에 그곳을 지나가는 다른 형광비활성 세포(C2)가 받을 수 있다. 그러면, 상기 세포 검출부(34-1D)는, 시점(t2)에 상기 형광비활성 세포(C2)가 연속평행광의 집속점을 지나면서 산란시킨 빛을 받아 검출하기 때문에, 도 9(a)와 같이, 검출신호(SG2)를 생성한다.

따라서, 상기 동기부(34-1E)는 동기신호를 만든다. 또한 상기 레이저다이오 드 제어부(34-1C)는 펄스작동 레이저다이오드(26)를 구동한다. 따라서, 상기 형광비활성 세포(C2)가 상기 초점을 지나가는 동안에 상기 펄스작동 레이저다이오드는, 도 8(c)에 보인 것처럼, 시점(t2+d)에 광펄스를 낸다. 여기서, 이 세포(C2)는 형광염료가 붙어 있지 않으므로, 광펄스를 받아서 내는 산란광과 형광신호가 형광활성 세포가 내는 것과는 다르다.

그러면, 상기 세포 처리부(34-3)는 산란광 검출기(33)와 형광검출기(21,22,24)로부터 전송되는 신호들을 받아들여 현재 노즐(30-3)을 지나가는 형광비활성 세포(C2)의 특성을 판단하여 세포분류 신호를 출력한다(ST5). 상기 세포분류 처리부(34-3)로부터 출력되는 세포분류 신호에 따라 방향조절부는 노즐(30-3)로부터 배출되는 형광비활성 세포(C2)가 해당하는 세포분류 그릇(35)에 들어가도록 동작한다 (ST6).

상기와 같이, 상기 형광비활성 세포(C2)가 분류되는 동안에, 검출 레이저다이오드(27)로부터 연속적으로 나오는 연속평행광은 시점(t3)에 다른 형광활성 세포(C3)를 비춘다.

상기 형광활성 세포(C3)가 받는 연속평행광은, 상기 형광활성 세포(C1)가 겪은연속평행광과 비슷하게 진행한다. 곧, t3 시점에 형광활성 세포(C3)는 연속평행광을 받아, 도 8(a)과 같이, 산란광(D0-1)과 형광(D0-2)을 생성한다. 그러면, 상기 연속광 검출기(33-1)는, 도 9(a)에 보인 것 처럼, 산란광(D0-1)을 검출하여 검출신호(SG2)를 세포 검출부(34-1D)에 전송한다(ST3).

상기 동기부(34-1E)는 상기 세포 검출부(34-1D)를 통하여 입력한 검출신호를 바탕으로, 상기 제1위치, 펄스작동 레이저다이오드가 지나가는 초점의 위치 및 노즐을 지나가는 형광활성 세포의 속도와 같은 인자들을 이용하여 상기 펄스작동 레이저다이오드의 동작시점을 결정하여 동기신호를 만들어 레이저다이오드 제어부(34-1C)에 보낸다.

상기 동기신호를 받은 레이저다이오드 제어부(34-1C)는 펄스작동 레이저다이오드 구동부(34-1B)를 제어한다. 그러면, 상기 펄스작동 레이저다이오드(26)는, 도 8(b)에 나타낸 것과 비슷하게, 상기 펄스작동 레이저다이오드 구동부의 제어에 따라, 상기 형광활성 세포(C3)에 광펄스(S2)를 비추고 그에 따라 형광활성 세포(C3)는 산란광(D2)과 형광(F2)을 낸다(ST4). 곧, 상기 펄스작동 레이저다이오드(26)는, 시점(t3+d)에 비활성 상태로부터 활성 상태가 되어 시간(T) 동안 상기 형광활성 세포(C3)에 광펄스(S2)를 비춰준다.

그러면, 상기 세포분류 처리부(34-3)는 산란광 검출기(33)와 제1 ~ 제3 광증배관(24, 22, 21)로부터 전송되는 신호들을 받아들여 현재 노즐을 지나가는 형광활성 세포(C3)의 특성을 판단하여 분류신호를 출력한다(ST5).

상기 세포분류 처리부(34-3)로부터 나오는 세포분류 신호에 따라 방향조절부는 노즐(30-3)로부터 배출되는 형광활성 세포(C3)가 해당하는 세포분류 그릇(35)에 들어가도록 동작한다 (ST6).

형광비활성 세포(C4)도 상기 형광비활성 세포(C2)가 분류되는 것과 같은 방식으로, 시점(t4)에 검출되고 그 검출신호를 바탕으로 작동하는 펄스작동 레이저다이오드로부터 시점(t4+d)에 광펄스를 받아 산란광(D2)과 형광(F2)을 내고, 그에 따 라 분류된다.

따라서, 이 발명에 따른 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치는 세포검출 연속작동 레이저다이오드를 써서 노즐을 따라 지나가는 세포의 흐름을 검출하여, 그 세포에 광펄스를 비추어주는 시점을 결정하고 그 시점에 맞추어 펄스작동 레이저다이오드를 구동하여 상기 세포에 광펄스를 비추어 주고, 상기 세포가 그 광펄스는 받아 내는 산란광과 형광을 분석함으로써 해당 세포의 특성을 알아내고, 그에 맞게 분류한다.

이 발명의 실시예에서는 연속검출 레이저다이오드가 내는 연속 평행광이 연속검출 레이저다이오드로부터 노즐의 제1위치를 지나게 하고 그 제1위치로부터 광검출기에 도달하게 하기 위하여 반투과거울을 사용하였지만, 상기 반투과거울을 사용하지 않고 상기 연속검출 레이저다이오드의 연속평행광이 노즐의 제1위치를 지난 다음에 광검출기에 도달하게 꾸며질 수도 있다.

형광활성 세포분류 장치는 각종 세포를 특성에 따라 효율적으로 분류 수집하는장치로서 생명과학 (동물학, 식물학, 미생물학, 농학, 수산학, 임학 등)과 의학연구에서 꼭 필요한 중요한 장치이나, 종래의 형광활성 세포 분류 장치에서 광원으로 써온, 광출력이 높은 아르곤이온 레이저 계통 등의 레이저는 크고 무거우며, 전력소모가 많고, 값이 비싸기 때문에,이를 사용하는 형광활성 세포분류 장치도 크고, 무거우며, 전력소모가 많고, 값이 비싸서 널리 활용되지도 못하였고, 또 장치의 이동이나 설치가 매우 번거로와 쓰기에 불편했다. 또한, 값이 매우 비싸서 널리 보급되지 못하였다.

이와 같은 문제점을 해결한, 이 발명에 따른, 레이저다이오드를 이용한 활성활성 세포분류장치는, 해당 세포가 지나가는 순간을 정확히 포착할 수 있게 연속광을 출력하는 검출 레이저다이오드와 해당 세포에게 미리 정해지 시간만 높은 광펄스를 출력하는 펄스출력 레이저다이오드를 쓰므로, 그 크기가 작고 무게도 가벼우며, 차지하는 공간도 작아 이동성이 크다. 또한, 이 발명에 따른 레이저다이오드를 쓰는 형광활성 세포분류 장치는, 레이저다이오드와 그 구동회로를 간단하게 꾸밀 수 있기 때문에, 그 값이 종래의 아르곤 이온 레이저 등을 쓰는 장치에 비하여 상대적으로 싸다.

Claims

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노즐(30-3)을 통하여 형광염료에 의하여 염색된 세포를 내보내는 세포흐름실(30)과,

상기 노즐(30-3)의 제1위치를 지나는 상기 세포에 광펄스(S2)를 비추는 펄스작동 레이저다이오드(26)와,

상기 제1위치를 기준으로 세포가 상기 제1위치를 통과하기 전에 위치하고, 상기 제1위치로부터 미리 설정된 거리만큼 떨어진, 상기 노즐(30-3)의 제2위치에 연속평행광(D0)을 비추는 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)와,

상기 연속평행광의 경로를 지나가는 세포가 산란시킨 빛 또는 형광을 받아 검출신호를 생성하는 연속광 검출기(33-1)와,

상기 검출신호를 바탕으로 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)의 동작을 제어하고 연속광 검출기(33-1)로부터 나오는 신호에 따라 펄스작동 레이저다이오드(26)의 동작을 제어하는 제어부(34-1)와, 상기 제어부(34-1)의 제어신호에 따라 상기 산란광과 상기 형광을 바탕으로 현재 노즐(30-3)로부터 나오는 상기 세포를 분류하는 세포분류 처리부(34-3)와, 각 요소에 전원을 공급하는 전원회로부(34-2)를 포함하는 중앙처리부(34)와,

상기 세포가 상기 광펄스를 받아 내보내는 산란광 및 형광을 검출하고 그 검출된 신호를 바탕으로 상기 세포를 광학적 특성에 따라 분류하는 세포 분류기를 포함하는 것을 특징으로 하는 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 세포분류 장치.
제2항에 있어서, 상기 제어부(34-1)는

상기 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)를 구동하는 세포검출 연속작동 레이저다이오드 구동부(34-1A)와,

상기 펄스작동 레이저다이오드(26)를 구동하는 펄스작동 레이저다이오드 구동부(34-1B)와,

상기 연속광 검출기(33-1)로부터 나오는 연속광 검출신호를 입력하여, 현재 노즐(30-3)을 지나는 세포를 검출하는 세포 검출부(34-1D)와,

상기 세포 검출부(34-1D)로부터 나오는 검출신호를 바탕으로 상기 펄스작동 레이저다이오드(26)의 구동시점을 결정하여 동기신호를 생성하는 동기부(34-1E)와,

상기 세포 검출부(34-1D)로부터 나오는 검출신호를 입력하고 상기 세포검출 연속작동 레이저다이오드 구동부(34-1A)를 제어하며, 상기 동기부(34-1E)로부터 나오는 동기신호에 따라, 상기 펄스작동 레이저다이오드 구동부(34-1B)를 통하여 상기 펄스작동 레이저다이오드의 동작을 제어하는 레이저다이오드 제어부(34-1C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 세포분류 장치.
제2항에 있어서, 상기 세포분류기는

상기 세포가 상기 광펄스를 받아 보내는 산란광을 검출하여 상기 중앙처리부에 산란광신호를 출력하는 산란광 검출기와,

상기 세포가 상기 광펄스를 받아 보내는 형광을 검출하여 상기 중앙처리부에 형광신호를 출력하는 복수개의 광증배관을 포함하는 것을 특징으로 하는 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 세포분류 장치.
제4항에 있어서, 상기 중앙처리부(34)는

상기 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)의 동작을 제어하고, 연속광 검출기(33-1)로부터 나오는 신호에 따라 펄스작동 레이저다이오드(26)의 동작을 제어하는 제어부(34-1)와,

상기 제어부(34-1)의 제어신호에 따라, 상기 산란광과 상기 형광을 바탕으로, 현재 노즐(30-3)로부터 나오는 상기 세포를 분류하는 세포분류 처리부(34-3)와,

각 요소에 전원을 공급하는 전원회로부(34-2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 세포분류 장치.
제5항에 있어서, 상기 제어부(34-1)는

상기 세포검출 연속작동 레이저다이오드(27)를 구동하는 세포검출 연속작동 레이저다이오드 구동부(34-1A)와,

상기 펄스작동 레이저다이오드(26)를 구동하는 펄스작동 레이저다이오드 구동부(34-1B)와,

상기 연속광 검출기(33-1)로부터 나오는 연속광 검출신호를 입력하여, 현재 노즐(30-3)을 지나는 세포를 검출하는 세포 검출부(34-1D)와,

상기 세포 검출부(34-1D)로부터 나오는 검출신호를 바탕으로 상기 펄스작동 레이저다이오드(26)의 구동시점을 결정하여 동기신호를 생성하는 동기부(34-1E)와,

상기 세포 검출부(34-1D)로부터 나오는 검출신호를 입력하고 상기 세포검출 연속작동 레이저다이오드 구동부(34-1A)를 제어하며, 상기 동기부(34-1E)로부터 나오는 동기신호에 따라, 상기 펄스작동 레이저다이오드 구동부(34-1B)를 통하여 상기 펄스작동 레이저다이오드의 동작을 제어하는 레이저다이오드 제어부(34-1C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 세포분류 장치.
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소정의 속도로 일렬로 줄지어 흐르는 세포에 세포검출 연속작동 레이저다이오드의 연속평행광을 비추는 단계와,

상기 연속평행광을 검출하는 단계와,

상기 연속평행광이 상기 세포에 비추는 시점과 상기 세포가 흐르는 속도 사이의 관계에 의하여 설정되며, 상기 검출된 신호에 따라 상기 세포에 펄스작동 레이저다이오드를 구동하여 광출력이 상대적으로 큰 광펄스를 비추는 단계와,

상기 광펄스를 받은 세포가 내는 산란광과 형광을 검출하는 단계와,

상기 검출된 산란광과 형광을 바탕으로 상기 세포를 분류하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 세포 분류방법.
제8항에 있어서, 상기 광펄스 출력시간을 설정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 레이저다이오드를 사용하는 형광활성 세포 분류방법.