JP2007532874A - フローサイトメーターの多分取監視制御サブシステム - Google Patents
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Abstract
フローサイトメーターの作動を制御する光学的な照明と監視のサブシステムであって、フローサイトメーターがキャリア流体を有し、キャリア流体が、液滴発生器に結合された流路に沿って流れ、液滴発生器が、液滴がキャリア流体からブレークオフする位置を制御し、液滴ソーターが、液滴が複数の液滴の航路に沿って分取されるように働く。このサブシステムは、1以上の液滴の航路の各々に沿った各々の液滴監視位置を、共用レーザーを光源とするような、各々の光線で照明するように働く。各々の液滴監視位置で各々の光線を通過する液滴から発せられる、後方散乱反射に応答して、各々の光線の振幅が増幅される。従って、液滴は、各々の光線の振幅の増幅の結果として、検出可能な蛍光を発する微粒子が存在することを、検出される。
Description
本発明は、一般にフローサイトメーターシステムとそのサブシステムに関し、特に、フローサイトメーターの液滴形成と液滴分取偏向パラメータを下流基準で調整するために、偏向しない液滴流れ及び偏向した液滴流れの多数の分取流路を設置し監視する働きをする、新規な改良されたサブシステムに関する。
特許文献1に、「フローサイトメーターの液滴ブレークオフ位置調整メカニズム」という発明の名称で記載され、本発明の譲受人に譲渡され、その開示が本明細書に併合され、図1にダイヤグラムで示されたようなフローサイトメーターは、一般に医療産業で、診断の補助及び病気の治療のために、患者の体の中の流体中の微粒子(例えば血液細胞)を分析するために使用される。限定しない実施例として、化学療法治療期間の中で、化学療法の前に、このような計器を、患者の骨髄から取り出した一定量の血液から健康な血液細胞(幹細胞)を分取し、捕集するために使用することができる。一旦化学療法治療期間が完了すると、次に、捕集された量のこれらの細胞は、体内移行及び健康な血液細胞の再生を容易にするために、患者に再注入される。
この目的のために、図1に示すフローサイトメーターシステムでは、容器11に収納された遠心分離された血液サンプルの細胞のような、分析される微粒子が、キャリア流体(例えば塩水)12の(加圧された)連続する即ちとぎれない流れに注入される。キャリア流体流れは、流体流れチャンバー14の流体導管13に沿って導かれる。流体流れ導管13は、1以上のレーザー17のような光学照明サブシステムによって発せられる出力光線16により、「上流」位置15で横から照射される。レーザー出力光線16がキャリア流体流れに遮られた後ろ側で、レーザー出力光線16の通路に、光検出器サブシステム20の1以上の光検出器が光学的に配置される。光検出器サブシステムは、細胞からの光の反射、細胞による光の遮断、及び、細胞に付加された蛍光染料抗体からの光の放出、を含む、流体流れ(の中の微粒子又は細胞)の内容物によって変調された光を受光するために配置される。
どの検出器出力信号が、どの照明された細胞を表しているかについて混乱を避けるために、サイトメーターフローチャンバーを通る流体流れ導管13が、レーザーの出力光線16と交差する位置15を通る時に1つの細胞のみが通過するように、微粒子又は細胞を通すように形成され、サイズが決められる。その結果、光検出器サブシステム20からの出力信号は、キャリア流体流れにより輸送される微粒子によって変調されるので、各変調信号は、個々の細胞と結びつけることができる。もし光検出器サブシステム20の出力が、所望の細胞の1以上のパラメータと関連付けられる所定の「分取」基準を満たすならば、その出力は、流体流れチャンバーの出口ポート18の「下流」に位置する静電気液滴ソーターにより、その細胞を含むキャリア流体の液滴23の分取を制御するために使用される。
キャリア流体流れは、流体流れチャンバーに結合された音響(例えば圧電変換器)駆動液滴発生器27によって個々の液滴に変えられる。出口ポート18から離れる流体流れは、相互に連なった液滴流れ22として流れ、次に、チャンバー出口ポートの下流の位置25で、分離した液滴に分かれる(ブレークオフする)。また、細胞がレーザー交差位置15を通過する時間と、それに続いて、特定の細胞を含むキャリア流体流れの最後に付着した部分が、キャリア流体流れから現実に物理的に分離、即ち、航路26に沿って飛行する個別の液滴23としてブレークオフする時間との間に、「分取」遅れがある。
液滴が流れチャンバー出口ポート18の下流を形成する位置25は、液滴発生起動信号の可変パラメータによって調整することができる。液滴が形成される比率は、音響駆動信号の周波数によって支配され、液滴は、液滴発生器27のピエゾ振動の周波数と同期して発生する。限定しない実施例として、液滴発生器27に適用される音響駆動周波数は、20.7 kPa (3 psi)から482.6 kPa(70 psi)のオーダーの流体圧力において、4から100キロヘルツのオーダーとすることができる。
光検出器出力は、普通、デジタル化され、次に細胞種別マップによって、又は、フローサイトメーター制御ワークステーション50の、関連する管理制御プロセッサーにより計算される識別アルゴリズムによって、分析される。この分析に基づき、制御プロセッサーは、液滴ソーター24の荷電偏向制御回路52に制御信号を発信し、液滴を分取し、又は分取を終了する。フローチャンバーの出口ポート18を出る流体流れからブレークオフする、即ち分離する、個々の液滴23を制御分取するために、液滴ソーターは、静電気荷電環31を使用し、静電気荷電環31は連続する液滴の航路26を取り囲む。静電気荷電環は、金属製の円筒を備えることができ、金属製の円筒は液滴の連続の航路26に沿った位置を取り囲むように配置され、液滴の連続の航路26では個々の液滴23が流体流れから分離し、普通、(軸方向の)全長にいくつかの液滴が存在する。静電気荷電環31は、流体チャンバー出口ポート18の下流で、一組の静電気偏向板(極性が互いに反対で、高電圧の)33及び35の上流に、垂直に配置され、静電気偏向板33及び35の間を、荷電した液滴23cが、下方に飛行するときに通過し、1以上の分取流路36に沿って分取され、関連する分取液滴の捕集容器41に入るか、又は、分取されずに航路を通過して、分取終了即ち廃棄の容器43に入る。中心位置は、必ずしも廃棄の容器ではない。測定装置を通過するサンプルを、廃棄しないで捕集する、補集容器として使用される可能性もあるからである。
サイトメーターワークステーション50により実行される細胞分析及び分取ルーチンの制御のもとで、所定の間隔の所定の荷電電圧パルスが、静電気荷電環に選択的に負荷され、分取される細胞を含む液滴に荷電する。選択的に荷電された液滴が2つの相反する極性の高電圧偏向板33及び35の間を通過する間、液滴は反対の極性を有する偏向板に引きつけられる一方、同時に、同一極性に荷電した偏向板により反発される。この、静電気偏向操作は、荷電した液滴を、分取しない液滴航路の軸から外れて分取液滴補集容器41に入る、偏向した航路に沿って誘導する。
以上で分かるように、流体流れ内の、関心のある所定の細胞又は微粒子には、写真検出器サブシステム20が特定の細胞に対して出力信号を発生する時間と、その細胞を含む液滴23が実際に流体流れから個々に分離即ちブレークオフする、分取パルスの時間との間に、「分取」遅れがある。分取荷電パルスを与えた時に流体流れからブレークオフする、最後に付着した液滴のみが偏向板により偏向させられ、その後分取液滴補集容器に集められるので、この分取遅れの正確な時間間隔を知ることは、液滴の正確な分取を行うために重要である。
特許文献1に説明された発明により、フローサイトメーターには、フィードバックに基づく信号処理メカニズムが備えられ、この信号処理メカニズムは、下流の光学検出器サブシステムにより、初めに校正された(液滴分取メカニズムの液滴荷電環内の)空間位置での液滴のブレークオフポイントを維持するように作動し、光学検出器サブシステムは、荷電した液滴の偏向により生じた液滴流れの切れ目を探す。これらの液滴の切れ目が液滴流れ流路の所定の下流位置で検出される時間と、切れ目を生じた偏向した液滴が液滴荷電環で荷電される時間との間の差が、校正用の標準時間間隔と比較される。両者の間の差は、必要に応じて、測定装置を再校正するために、液滴発生器のピエゾ駆動機の調整に使用される。また、流体流れの温度と流体流れの圧力の制御が、様々な差の修正において同様に或はそれ以上に有効であると考えられている。
本発明は、液滴のブレークオフポイントの位置及びブレークオフポイントの下流の位置に据え付けられた補助の光学サブシステムに導入され、分取された液滴流れの組成を監視するために使用される、特許文献1に説明されたサブシステムと類似する。しかし、特許文献1で説明された流れの切れ目の探索に加え、本発明では、各液滴航路の監視位置に隣接して、補助の照明と検出のユニットを配置する。照明と監視のステーションは、液滴上の障害物の影響を最小にするために、液滴のブレークオフポイントに比較的接近して配置される。各照明と監視のステーションの目的は、液滴がステーションの視野を通過する場合に液滴を検出し、一旦液滴が検出された場合には、液滴中に含まれる可能性がある微粒子に検出容易な振幅で蛍光を発するようにさせる高エネルギーレーザー光のパルスで、その液滴を照明することである。
この目的のため、各照明と監視のステーションは、照明と受光レンズのユニットを備え、この照明と受光レンズのユニットの視野は、レンズが設置された流路に隣接する流路に沿って飛行する各液滴を、包囲するような大きさにされる。光ファイバーの3つのグループを1組にしたものを接続する光ファイバー端子ブロックが、各レンズに結合される。3つの光ファイバーの1番目は、連続出力で且つ制御可能なパルスを出力する半導体レーザーのような共有可視光源の出力と、結合される。端子ブロック及び関連するレンズが隣接して配置された航路に沿った液滴と交差する点は、この1番目の光ファイバーを通して、レーザーと協働して、連続的かつ制御可能なように照明される。それぞれの光ファイバー端子ブロックは、接続されたレーザーからの光が液滴の航路を横切って照明するように配置される。
2番目の光ファイバーは、半導体センサーに結合され、半導体センサーは、液滴が、照明と監視のステーションのうちのそれぞれの1つを通過するときに、液滴から散乱される光を検出するために働く。3番目の光ファイバーは、他の半導体センサーに結合され、この半導体センサーは、液滴からのレーザーの後方散乱を除去するために組み込まれたロングパスフィルターを含む。この半導体センサーは、関連する照明と監視のステーションのそばを通過する液滴中に存在する可能性がある微粒子によって発生される、蛍光を検出するために使用される。
照明される液滴中の微粒子によって普通発生される蛍光パルスの振幅は、比較的低く、特に、液滴からの後方散乱光のパルスの振幅と比較した場合、低い。本発明により、この潜在的な、低い振幅を検出する問題は、後方散乱光パルスが所定の閾値に達したことの検出信号に応答して、レーザーにより発生する照明光線の振幅を制御増幅することにより、容易に解決される。このようなことが発生した場合には、照明レーザー光線のエネルギーは、一時的に増加され、又は脈動され、おおむね増幅した振幅で蛍光を発するように、液滴中の蛍光微粒子(もしあれば)を刺激する。液滴中の微粒子によって発光された、おおむね増幅した蛍光の振幅は、半導体蛍光センサーによって容易に検出することができる。蛍光は、散乱光より大きくなる。
特に、本発明の有利な点は、液滴が意図された流路に分取されたことを確認することができることである。即ち、液滴のブレークオフポイントの下流に配置されることは、半導体検出器出力が、どの液滴が微粒子を含むかを示すだけではなく、これらの微粒子の蛍光特性が、意図された航路と適切に関連しているかどうかを示すことも可能にする。この情報は、サイトメーターワークステーションにより実行されるサイトメーターの細胞分析及び分取ルーチンにフィードバックされ、サイトメーターワークステーションは次に、意図された偏向流路に沿った液滴の適切な分取を確実にするために、どのような調整が適切であるかを決定する。
本発明による新規かつ改良された多流路配置の液滴監視サブシステムを詳細に説明する前に、本発明の目的が、第1に、従来のフローサイトメーター測定装置や、関連する信号処理装置、及び付随する監視制御回路の、これらの回路や装置の作動を制御する所定の配置の、何が効果的かという点に置かれていることに気づかなければならない。従って、これら回路や装置の構成、及びこれらが他のサイトメーターシステム装置と接続される方法は、大部分が、容易に理解できるブロックダイヤグラム形式の図面に示されてきたが、それらは、本発明に関連する特定の詳細を示すのみであり、本発明の説明の利益を有する技術の分野における通常の知識を有する者に容易に明らかとなる詳細な開示を不明確にしないようにするだけである。そこで、本発明のブロックダイヤグラムの説明図では、便利な機能別グループに分けてフローサイトメーターシステムの主要な装置を示すことが意図され、それにより本発明をより容易に理解することができるように意図されている。
図2を参照すると、これは、本発明の多流路液滴監視サブシステム、及びそれが、上述した、図1に示すタイプのフローサイトメーターと接続される方法、をダイヤグラムで示したものである。図2の説明図及びそれに続くダイヤグラムで、連続する流体流れが、比較的長い長方形で描かれ、一方、流体チャンバーの出口ポート部で連続する流体流れからブレークオフした個々の液滴が、比較的小さな長方形で描かれている。光学照明及び検出器が配置された画像観察位置は、円で示されている。
図示のように、液滴ブレークオフ光学検知サブシステム50は、フォトダイオード又はカメラのような、一対のブレークオフ光学センサー51と52を備えることができ、液滴ブレークオフポイントに直面して隣接するように配置される。図3の前面図及び図4の側面図に更に示すように、液滴ブレークオフ光学検知サブシステムは、荷電環31と同軸に配置することができる。ブレークオフ光学検知サブシステムに加えて、本発明は、複数の照明と光学監視のステーションを備え、これらは、それぞれ1以上の液滴が荷電板を出て液滴偏向板33及び35に加えられる互いに反対の極性の電圧によって偏向されるときに、液滴が荷電されていれば、その荷電の程度に基づいて通過する航路のそれぞれに沿った所定の位置に、隣接してそれぞれ配置される。
限定のない例を提供する目的で、図2と図3は、5つの航路101、102、103、104、及び105を有するサイトメーターサブシステムを示し、これらはそれぞれ、液滴捕集受容器111、112、113、114、及び115で終了する。これら5つの航路のなかで、最中央の航路103は、分取されない即ち分取を終了する液滴に関連し、一方、航路101及び102は、ソーターの中心軸の左に分取し、航路104及び105は、ソーターの中心軸の右に分取する。以上に示されたように、流路の照明と監視のステーションは、各流路に直面して隣接するように配置される。本発明の例の5つの流路の実施例には、それぞれ航路101、102、103、104、及び105に関連した、円121、122、123、124、及び125で示される、5つの照明と監視のステーションがある。本発明の好ましい実施例により、照明と監視のステーションは、液滴のブレークオフポイントに比較的接近して配置され、液滴上の障害物の影響を最小にする。図2及び図3のダイヤグラム図から分かるように、照明と監視のステーションは、高電圧偏向板により制限された円弧に沿って配置することができる。
各円は、レンズが隣接配置された流路に沿って飛行するそれぞれの液滴を包囲するような大きさの視野を有する、照明と受光レンズのユニットを示す。更に図5に、また、図6にも示すように、光ファイバー端子ブロック130がそれぞれのレンズ120に結合され、端子ブロック130は、一組の3本の光ファイバー131、132、及び133を接続する。これらの光ファイバーの1番目のファイバー131は、関連する光学照明源、例えば半導体レーザー141、の出力に結合される。端子ブロック及び関連するレンズが配置された位置に隣接した航路に沿った液滴と交差する点は、レーザー141と協働した、この1番目の光ファイバー131を通して、連続かつ制御可能なように照明される。それぞれの光ファイバー端子ブロックは、関連するレーザー半導体からの光が液滴航路に交差するように、配置される。
2番目の光ファイバー132は、半導体センサー142に結合され、半導体センサー142は、液滴が、それぞれの照明と監視のステーション121、122、123、124、及び125のうちの1つを通過するときに、液滴から散乱される光を検出するために働く。3番目の光ファイバー133は、他の半導体センサー143に結合され、この半導体センサー143は、液滴からのレーザーの後方散乱を除去するために組み込まれたロングパスフィルターを備える。この半導体センサー143は、照明と監視のステーションを通過する液滴中に存在する可能性がある微粒子によって発生される、蛍光を検出するために使用される。
図7に示すように、照明される液滴中の微粒子によって普通発せられる蛍光パルス152の振幅151は、比較的低く、特に、液滴からの後方散乱光パルス162の振幅161と比較した場合、低い。本発明により、この潜在的な、低い振幅の問題は、後方散乱光パルス162が所定の閾値163に達したことの検出信号に応答して、レーザー141により発生する照明光線の振幅を制御増幅することによって、容易に解決される。このようなことが発生した場合には、照明レーザー光線のエネルギーは、一時的に増加され、又は脈動され、図7に破線165で示すように、おおむね増幅した振幅で蛍光を発するように、液滴の中の蛍光微粒子(もしあれば)を刺激する。液滴中の微粒子によって発光された、おおむね増幅した蛍光の振幅は、今度は、半導体センサー143によって、特にレーザー散乱を除去するために組み込まれたロングパスフィルターを備えた半導体センサー143によって、容易に検出することができる。
通過する液滴からのレーザー光線の後方散乱が、レンズ120の視野の照射領域に入る液滴の最先端部として最初に検出されることに気づくであろう。この現象は、増加したエネルギー出力を有するレーザー半導体のパルス発生のトリガーを直ちに引き、液滴中の蛍光微粒子の位置を容易に知ることができる。
特に、本発明の有利な点は、液滴が意図された流路に分取されたことを確認できる能力である。即ち、液滴のブレークオフポイントの下流に配置されていることは、半導体検出器出力が、どの液滴が微粒子を含むかを示すだけではなく、これらの微粒子の蛍光特性が、意図された航路に適切に結び付けられているかどうかを示すことも可能とする。この情報は、サイトメーターワークステーション50により実行されるサイトメーターの細胞分析及び分取ルーチンにフィードバックされ、意図した偏向流路に沿った液滴の適切な分取を確実にするにはどんな調整が適切であるかを決定する。
我々は、本発明による実施例を示し、説明してきたが、同一の実施例に限らず、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に公知の、様々な変更及び修正をすることができ、従って、我々が、本明細書に示し、記載した詳細な説明に限定することを意図しているのではなく、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に明らかな変更や修正を全て包含することを意図していることが、理解されなければならない。
Claims (12)
- フローサイトメーターの作動を制御する方法であって、
キャリア流体が、液滴発生器に結合された流路に沿って流れ、前記液滴発生器が、液滴が前記キャリア流体からブレークオフする位置を制御し、液滴ソーターが、選択された液滴が1以上の液滴の航路に沿って分取されるように働き、前記方法が、
(a)前記1以上の液滴の航路の各々に沿った各々の液滴監視位置を、各々の光線で照明する工程と、
(b)前記各々の液滴監視位置で前記各々の光線を通過する液滴から発せられる後方散乱反射に応答して、前記各々の光線の振幅を増幅させる工程と、
(c)前記各々の光線の振幅の前記増幅の結果として、検出可能な蛍光を発する微粒子の存在する前記液滴を検出する工程とを備える、
方法。 - 更に、前記液滴から工程(c)が蛍光を検出する程度に従い、少なくとも1つの前記液滴発生器及び前記液滴ソーターを制御する工程(d)を備える、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)が、前記各々の液滴監視位置をレーザー光線で照明する工程を備え、前記レーザー光線が、光ファイバー及び焦点を合わせるように結合されたレンズにより、前記各々の液滴監視位置に導かれる、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)が、前記後方散乱反射用の光学検出器に導く光ファイバーを通して、前記後方散乱反射を導く工程を備える、請求項3に記載の方法。
- 工程(c)が、結合された光学蛍光検出器に導く光ファイバーを通して、前記蛍光を導く工程を備える、請求項4に記載の方法。
- 前記光学蛍光検出器が、後方散乱光の通路を除外する作用をするように組み込まれたロングパスフィルターを含む、請求項5に記載の方法。
- フローサイトメーターの作動を制御する配置であって、
キャリア流体が、液滴発生器に結合された流路に沿って流れ、前記液滴発生器が、液滴が前記キャリア流体からブレークオフする位置を制御し、液滴ソーターが、液滴が複数の液滴の航路に沿って分取されるように働き、前記配置が、
前記液滴の航路に隣接するようにそれぞれ配置された、複数の液滴監視位置と、
光ファイバー及び焦点を合わせるように結合されたレンズにより、各々の液滴監視位置に結合された、複数のレーザー光線出力と、
前記液滴監視位置に光ファイバーによってそれぞれ結合された、複数の後方散乱検出器と、
前記液滴監視位置に光ファイバーによってそれぞれ結合された、複数の蛍光検出器とを備える、
配置。 - 前記レーザーのうちのそれぞれ1つが、各々の液滴監視位置で各々のレーザー光線を通過する液滴からの後方散乱反射を検出する、関連する後方散乱検出器に応答して発光される、レーザー光線のエネルギーを増加するように働く、請求項7に記載の配置。
- 前記液滴発生器及び前記液滴ソーターのうちの少なくとも1つの作動が、蛍光検出器が液滴からの蛍光を検出する検出の程度に従って制御される、請求項8に記載の配置。
- それぞれの光学蛍光検出器が、後方散乱光の通路を除外する作用をするように組み込まれたロングパスフィルターを含む、請求項5に記載の配置。
- フローサイトメーターの作動を制御する光学的な照明と監視の装置であって、
前記フローサイトメーターがキャリア流体を有し、
前記キャリア流体が、液滴発生器に結合された流路に沿って流れ、前記液滴発生器が、液滴が前記キャリア流体からブレークオフする位置を制御し、液滴ソーターが、液滴が複数の液滴の航路に沿って分取されるように働き、前記装置が、
前記液滴の航路に隣接するようにそれぞれ配置された、複数の液滴監視位置と、
光ファイバー及び焦点を合わせるように結合されたレンズにより、各々の液滴監視位置に結合された、複数のレーザー光線出力と、
前記液滴監視位置に光ファイバーによってそれぞれ結合された、複数の後方散乱検出器とを備え、
それぞれのレーザーが、各々の液滴監視位置で各々のレーザー光線を通過する液滴からの後方散乱反射を検出する、関連する後方散乱検出器に応答して発光される、レーザー光線のエネルギーを増加するように働き、
更に、前記液滴監視位置に光ファイバーによってそれぞれ結合された、複数の蛍光検出器を備え、
それぞれの蛍光検出器が、前記レーザーのうちの関連する1のレーザーによって発光されるレーザー光線のエネルギーの前記増加の結果増幅された振幅の、蛍光パルスを検出するために働き、
前記液滴発生器及び前記液滴ソーターのうちの少なくとも1つの作動が、蛍光検出器が液滴からの増幅された振幅の蛍光を検出する検出の程度に従って制御される、
装置。 - それぞれの光学蛍光検出器が、後方散乱光の通路を除外する作用をするように組み込まれたロングパスフィルターを含む、請求項11に記載の装置。
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