JP4990746B2 - 液体フローに含まれる生物学的粒子を分別する装置ならびにその方法 - Google Patents
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Description
なお、特許文献1に記載された内容は、参考にここに一体のものとして統合される。
まず流体フロー機構10について、図1、図3および図4を参照して以下説明する。
流体フロー機構10は、概略、シースフローを形成するための円筒状のフローチャンバ12と、蛍光染料や蛍光ラベルモノクロナール抗体などの蛍光標識試薬で蛍光標識された細胞粒子を含むサンプル懸濁液を収容するためのサンプル容器14と、シース液を収容するためのシース容器16とを備え、フローチャンバ12の中心軸に沿って配設されたサンプル管15にサンプル懸濁液が供給され、フローチャンバ12の周縁部に接続されたシース管17を介してフローチャンバ12内にシース液が供給されるように構成されている。
次に、図1および図5を参照して光学的機構40について以下説明する。
光学的機構40は、フローセル30内を整列して通過する細胞粒子に異なる波長を有する複数の励起光を順次照射する第1、第2および第3の光源41,42,43と、第1の光源41からの光が細胞粒子で散乱して生じた前方散乱光を検出する前方散乱光検出装置45と、第1、第2および第3の側方散乱光/蛍光検出装置51,52,53とを備える。
v0=d/t0 (1)
次に、図1および図6を参照してソータ機構60について以下説明する。
ソータ機構60は、図1に示すように、所定の電圧差を有する一対の偏向板62と、固定撮像部64と、コントローラ(制御部)66とを備え、コントローラ66は、偏向板62、固定撮像部64、および側方散乱光/蛍光検出装置51,52,53(光検出器SSC1,SSC2および光電子増倍管FL1〜FL8)に接続されている。
固定撮像部64は、位置P0からブレイク・オフ・ポイントBPまでの距離Lが一定となるように、フローセル30に対して固定された位置に配置されるように構成されるが、固定撮像部64を流体フロー機構10に組み立てた後の組み立て誤差等に起因して、必ずしも高精度に位置決めできないことがある。そこで、固定撮像部64を流体フロー機構10に組み立てた後、実際にサンプル懸濁液に含まれる細胞粒子を分別する前に、位置P0から撮像領域70の画像位置P1までの距離LB0を以下のように正確に測定して必要がある。
v0j=k・v0f, k=Sf/Sj(>1) (2)
ここでフローセル30の断面積SfおよびジェットフローFJの断面積Sjは、たとえば約20000μm2および約3850μm2である。
T0=Lf/v0f+Lj/v0j=(k・Lf+Lj)/v0j (3)
v0j=λ/τ (4)
T0/τ=(k・Lf+Lj)/λ (5)
式(5)の左辺(T0/τ)は、細胞粒子が位置P0からブレイク・オフ・ポイントBPまでの距離Lを移動する遅延時間T0を、点滅光源の発光周期τで割ったものであり、位置P0からブレイク・オフ・ポイントBPまでの間に形成され得るシースフローFSおよびジェットフローFJの極大点(または極小点)の個数に対応するものである。ここで、この左辺(T0/τ)をドロップ・ディレイDD0と定義する。
DD0=T0/τ=(k・Lf+Lj)/λ=(LB+LB0)/λ (6)
また、式(5)を変形して次式を得る。
Lj=λ・T0/τ−kLf (7)
サンプル懸濁液に含まれる細胞粒子は、図2の細胞粒子B1,B2,B3のようにフローセル30の中心から逸脱した経路を移動するとき、標準ビーズの移動速度v0より遅い移動速度v1を有し、とりわけフローセル30内を移動するときには速度v1fを有し、ジェットフローFJを移動するときには速度v1jを有する。このとき、式(2)および式(3)と同様、次式が得られる。
v1j=k・v1f, k=Sj/Sf(>1) (8)
T1=Lf/v1f+Lj/v1j=(k・Lf+Lj)/v1j (9)
T1/τ=(k・Lf+Lj)/λ (10)
同様に、ドロップ・ディレイDD1を次のように定義する。
DD1=T1/τ (11)
v0f=d/t0 (12)
同様に、細胞粒子が移動速度v1fで第1の光検出器SSC1および第2の光検出器SSC2の検出位置の間の距離dを時間t1で移動したとき移動速度vfは次式で与えられる。
v1f=d/t1 (13)
したがって、式(12)および式(13)から、次式が得られる。
v1f=(t0/t1)・v0f (14)
同様に、式(2)および式(8)から次式が得られる。
v1j=(t0/t1)・v0j
=(t0/t1)・λ/τ (v0j=λ/τ 式(4)) (15)
これを式(9)に代入して次式を得る。
T1=(k・Lf+Lj)/(t0/t1)・τ/λ (16)
よってドロップ・ディレイDD1(=T1/τ)は次式で求めることができる。
DD1=(k・Lf+Lj)/(t0/t1)/λ
=DD0/(t0/t1) (17)
(DD0=T0/τ=(k・Lf+Lj)/λ 式(6))
PB=v1j/T0/λ=(t0/t1)・λ/τ・T0
=(t0/t1)・DD0 (18)
したがって、細胞粒子Bが標準ビーズAに対して遅延している距離ΔDは、ドロップディレイDD0を用いて次式で表される。
ΔD=(t0/t1)DD0−DD0=(t0/t1−1)・DD0 (19)
このとき、細胞粒子Bは標準ビーズAより遅いので(t0<t1)、ΔDは負の値となる。たとえば、DD0=30で、t0/t1=0.95のとき、細胞粒子Bは、DD0の1.5倍の距離だけ遅れることになる。同様にして、標準ビーズAの遅延時間T0を含む任意の時間においてすべての細胞粒子の位置を、ドロップディレイDD0を用いて特定することができる。こうして、各細胞粒子の位置をモニタして、目的細胞粒子Tが液滴フローDF1の所定の適正位置に存在すると判断したとき、所定期間(変調周期λ)荷電電極36を用いて目的細胞粒子Tを確実に荷電することができる。
Claims (18)
- 液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置であって、
個々の生物学的粒子は前記液体フローにおいて異なる移動速度を有し、
第1の位置で液体フローに光を照射する第1の光源と、
第1の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第1の受光器と、
第1の位置の液体フロー下流側にある第2の位置で第2の光を液体フローに照射する第2の光源と、
第2の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第2の受光器と、
前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記生物学的粒子のそれぞれが第1の位置から第2の位置まで移動するために要した移動時間を計測するとともに、前記生物学的粒子のそれぞれが第1の位置から、液体フローから液滴が分離するブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を該移動時間に基づいて求める制御部と、
第1の受光器が前記生物学的粒子からの光を検出した後、前記生物学的粒子のそれぞれについて求められた前記遅延時間が経過したとき、ブレイク・オフ・ポイントにある前記生物学的粒子に電荷を与える荷電部とを備えることを特徴とする装置。 - 前記制御部は、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも1つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、該生物学的粒子の識別情報を収集し、該識別情報に応じた極性を有する電荷を該生物学的粒子に与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項2に記載の装置。
- 前記制御部は、異なる前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも1つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項3に記載の装置。
- 前記制御部は、同一の前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも1つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項3に記載の装置。
- 前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度が所定の閾値より遅いとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記液体フローおよび前記ブレイク・オフ・ポイントを含む撮像領域の画像を撮像する固定撮像部をさらに備え、
前記制御部は、前記固定撮像部で撮像された画像に基づいて、第1の位置から前記ブレイク・オフ・ポイントまでのフロー距離、および前記液体フローから分離して形成された隣接する液滴間の液滴間隔を求めるとともに、該フロー距離、該液滴間隔および前記移動時間に基づいて、該生物学的粒子が第1の位置からブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を求めることを特徴とする請求項1に記載の装置。 - 第1および第2の光源で光を照射された前記生物学的粒子から検出された光は、該生物学的粒子からの側方散乱光または前方散乱光であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記生物学的粒子に照射する第1および第2の光は互いに波長の異なるレーザ光であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 液体フローの中心から逸脱して流れる生物学的粒子は、液体フローの中心を流れる生物学的粒子に比して、より遅い移動速度を有し、より長い遅延時間を有することを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する方法であって、
個々の生物学的粒子は前記液体フローにおいて異なる移動速度を有し、
第1の位置で前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出するステップと、
第2の位置で前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出するステップと、
第1および第2の位置で検出された前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記生物学的粒子のそれぞれが第1の位置から第2の位置まで移動するために要した移動時間を計測するとともに、前記生物学的粒子のそれぞれが第1の位置から、液体フローから液滴が分離するブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を該移動時間に基づいて求めるステップと、
第1の受光器が前記生物学的粒子からの光を検出した後、前記生物学的粒子のそれぞれについて求められた前記遅延時間が経過したとき、ブレイク・オフ・ポイントにある前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与えるステップとを有することを特徴とする方法。 - 電荷を与えるステップは、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも1つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるステップを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 電荷を与えるステップは、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、該生物学的粒子の識別情報を収集し、該識別情報に応じた極性を有する電荷を該生物学的粒子に与えるステップを含むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 電荷を与えるステップは、異なる前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも1つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えないステップを含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 電荷を与えるステップは、同一の前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも1つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えるステップを含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 電荷を与えるステップは、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度が所定の閾値より遅いとき、該生物学的粒子に電荷を与えないないステップを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記液体フローおよびブレイク・オフ・ポイントを含む撮像領域の画像を撮像するステップと、
前記画像に基づいて、第1の位置からブレイク・オフ・ポイントまでのフロー距離、および前記液体フローから分離して形成された隣接する液滴間の液滴間隔を求めるとともに、該フロー距離、該液滴間隔および前記移動時間に基づいて、該生物学的粒子が第1の位置からブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を求めるステップとを有することを特徴とする請求項11に記載の方法。 - 液体フローの中心から逸脱して流れる生物学的粒子は、液体フローの中心を流れる生物学的粒子に比して、より遅い移動速度を有し、より長い遅延時間を有することを特徴とする請求項11に記載の方法。
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