JP5534214B2

JP5534214B2 - フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法

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Publication number: JP5534214B2
Application number: JP2010220445A
Authority: JP
Inventors: 昌彦神田; 茂明加藤; 沙理藤山; 恵泉川; 俊洋近西
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; University of Tokyo NUC; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; University of Tokyo NUC; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2009-10-05
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2030-09-30
Also published as: US8767212B2; JP2011099848A; US20110176127A1

Description

本発明は、フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法に関する。

バイオテクノロジの急速な発展に伴い、医学や生物学を含むさまざま分野で細胞などを自動的に分析・分別するフローサイトメータおよびセルソータの需要がますます増大しつつある。フローサイトメータは、生体（血液など）から採取された細胞粒子を蛍光色素などで染色し、数多くの細胞粒子をシースフロー内で一列に配列し、細胞粒子のそれぞれにレーザビームを照射して、細胞粒子から生じる側方散乱光と蛍光色素に依存するさまざまな多色蛍光を測定することにより、細胞を同定するものである。また、同定するために収集された散乱光と蛍光に関する情報は、通常、電気的信号に変換され、サンプルから採取された大量の細胞粒子を統計的に評価することにより、生体の病変などの状態が診断される。さらにセルソータは、散乱光と蛍光に関する電気的信号を用いて、シースフローから分離される各細胞粒子を含む液滴を帯電させ、この液滴が落下する間に特定の電場を液滴に印加することにより、特定の細胞粒子を選択的に収集（分別）するものである。

典型的なフローサイトメータが、たとえば本願と同一の譲受人に譲渡された特許文献１および２に記載されており、これらの記載内容はここに参考に一体のものとして統合される。

これまでのフローサイトメータおよびセルソータは、上述のように、血液などから採取された比較的に寸法の大きい細胞粒子等を同定または分別することが主流であった。ところが昨今、ヒトゲノム研究に代表されるような遺伝子解析研究が進み、遺伝子を含むさまざまなタンパク質の解析研究が盛んに行われるようになり、細胞粒子等のみならずより微小なタンパク質複合体を蛍光標識して精度よく同定および分別する技術の確立に対する要請が近年ますます増大している。

特許第３８９１９２５号公報特許第４３０４１２０号公報

しかしながら、従来のフローサイトメータおよびセルソータによれば、より微小なタンパク質複合体を蛍光標識して精度よく同定および分別するには解決すべき課題があった。すなわち図１１（ａ）に示すような比較的に寸法の大きい細胞粒子（Ｄ_１＝０．５μｍ〜数百μｍ）の周囲には半径の二乗に比例する表面積に数多くの蛍光標識された蛍光色素（抗体）が付着するのに対し、図１１（ｂ）に示すようなタンパク質複合体（Ｄ_２＝〜１０^２ｎｍ）には蛍光色素があまり多く付着しないので、蛍光標識されたタンパク質複合体から生じる蛍光の強度は、細胞粒子等の巨大粒子から生じるものより実質的に小さくなってしまう。たとえばタンパク質複合体の半径（Ｄ_２）が細胞粒子（Ｄ_１）の１／１０倍（＝Ｄ_２／Ｄ_１）であれば、タンパク質複合体からの蛍光の強度は、半径の二乗に比例して細胞粒子からの蛍光の強度の１／１００倍となり、精度よく同定および分別するために必要な蛍光強度が得られなかった。このため、従来のフローサイトメータおよびセルソータでは、より微小なタンパク質複合体を蛍光標識して精度よく同定および分別することは困難であった。

そこで本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その１つの態様によれば、以下のフローサイトメータを提供することを目的とする。すなわち、そのフローサイトメータは、染色された生物学的粒子を含むシースフローを形成するフローセルと、フローセルに第１の光を照射する第１の光源と、第１の光源よりシースフロー下流側においてフローセルに第２の光を照射する第２の光源と、第１の光による生物学的粒子からの散乱光または蛍光を受光して電気的信号に変換する第１の受光部と、第２の光による生物学的粒子からの蛍光を受光して電気的信号に変換する、シースフローに沿って配列された複数の第２の受光部と、第１の受光部が散乱光または蛍光を受光した時から所定の期間において、複数の第２の受光部から出力された電気的信号を電気的に加算することにより、第２の光により生物学的粒子を励起したときに生じる蛍光の電気的信号を増大させる信号処理部とを備えたことを特徴とするものである。

第２の光源は、複数の第２の受光部が対向するフローセルの受光領域全体にわたって実質的に均一な強度で第２の光を照射することが好ましい。また第２の光源は、複数の第２の受光部のそれぞれが対向するフローセルの各受光領域に、同一波長の第２の光を照射する複数の光源からなるものであってもよい。さらに第２の受光部は、シースフローに沿った第１の方向、および第１の方向と直交する第２の方向に格子状に配列されるものであってもよい。そしてフローサイトメータは、複数の第２の受光部のそれぞれに対向して配置され、第２の光による生物学的粒子からの蛍光を集光するための複数のマイクロレンズを有することがなお好ましい。

本発明の別の態様によれば、フローサイトメトリ方法が提供され、これは、染色された生物学的粒子を含むシースフローを形成するステップと、フローセルに第１の光を照射するステップと、第１の光源よりシースフロー下流側においてフローセルに第２の光を照射するステップと、第１の光による生物学的粒子からの散乱光または蛍光を受光して電気的信号に変換するステップと、第２の光による生物学的粒子からの蛍光を複数の受光領域において受光して電気的信号に変換するステップと、第１の光による生物学的粒子からの散乱光または蛍光を受光した時から所定の期間において、複数の第２の受光部から出力された電気的信号を電気的に加算することにより、第２の光により生物学的粒子を励起したときに生じる蛍光の電気的信号を増大させるステップとを有することを特徴とするものである。

このフローサイトメトリ方法においても同様に、第２の光は、複数の受光領域全体にわたって実質的に均一な強度で照射されることが好ましく、択一的には、第２の光は、同一波長を有し、複数の第２の受光部のそれぞれが対向するフローセルの各受光領域に照射される。

複数の第２の受光部から出力された電気的信号を電気的に加算することにより、第２の光により生物学的粒子を励起したときに生じる蛍光の電気的信号を増大させ、タンパク質複合体などの微小な生物学的粒子であっても検出精度を格段に改善することができる。
また複数の第２の受光部が対向するフローセルの受光領域全体にわたって実質的に均一な強度で第２の光を照射することにより、微小な生物学的粒子の励起時間を長くして、得られる蛍光強度を増大させることができる。

本発明に係る実施形態１によるフローサイトメータ（セルソータ）の概略的構成を示す模式図である。図１に示す流体フロー機構のフローチャンバ、フローセル、およびジェットフローを示す詳細拡大図である。図１に示す光学的機構の各構成部品を示す概略図である。図２に示すフローセルに照射される入射レーザビームと、入射レーザビームが微小細胞粒子に照射されて生じた側方散乱光および蛍光を受光する受光部の概略的構成を示すフローセルの概略断面図である。（ａ）は入射レーザビームの照射方向とは直交する平面で切断したときのフローセルの拡大断面図であり、（ｂ）はフローセルの受光領域全体において照射される入射レーザビームが均一な強度を有することを示す。（ａ）はフローセルの各受光領域に対向してそれぞれ１つの第２の受光部が配置され、（ｂ）は水平方向にも複数の第２の受光部が（アレイ状に）配置されたフローセルの拡大断面図である。（ａ）は第１の受光部から出力された電気的信号を示すタイミングチャートであり、図７（ｂ）〜（ｄ）は複数の第２の受光部のそれぞれから出力された電気的信号を示すタイミングチャートである。フローセル内のシースフロー、およびジェットフロー（およびジェットフローからブレイク・オフ・ポイントで分離する液滴を含む）を示す概略図である。実施形態２による光学的機構を示す図４と同様の概略図である。（ａ）は図５（ａ）と同様のフローセルの拡大断面図であり、（ｂ）は図５（ｂ）と同様に、フローセルの各受光領域において照射される入射レーザビームが均一な強度を有することを示す。（ａ）は比較的に大きい細胞粒子の周囲に数多くの蛍光色素が付着した状態を示し、（ｂ）は微小なタンパク質複合体の周囲には蛍光色素があまり多く付着しない様子を示す概念図である。（ａ），（ｂ），（ｃ）はそれぞれ、比較例１、比較例２、および比較例３に係るフローサイトメータの第２の光源からの近紫外レーザビームの照射面を示す概略図である。比較例１に係るフローサイトメータの信号処理部が検出したフォトンカウントと頻度を、標識ビーズおよび非標識ビーズを含むサンプル懸濁液のそれぞれについてプロットしたグラフである。比較例２に係るフローサイトメータの信号処理部が検出したフォトンカウントと頻度を、標識ビーズおよび非標識ビーズを含むサンプル懸濁液のそれぞれについてプロットしたグラフである。標識ビーズを含むサンプル懸濁液について、比較例１の信号処理部が検出したフォトンカウントと頻度を、非標識ビーズの最大閾値で分類して、ポジティブ率を求めた図１２と同様のグラフである。標識ビーズを含むサンプル懸濁液について、比較例２の信号処理部が検出したフォトンカウントと頻度を、非標識ビーズの最大閾値で分類して、ポジティブ率を求めた図１３と同様のグラフである。比較例３に係るフローサイトメータの信号処理部が検出したフォトンカウントと頻度を、標識ビーズおよび非標識ビーズを含むサンプル懸濁液のそれぞれについてプロットしたグラフである。

以下、添付図面を参照して本発明に係るフローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法の実施の形態を説明する。各実施の形態の説明において、理解を容易にするために方向を表す用語（例えば、「上方」、「下方」、「上流側」および「下流側」など）を適宜用いるが、これは説明のためのものであって、これらの用語は本発明を限定するものでない。

実施形態１

図１〜図８を参照しながら、本発明に係るフローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法の実施形態１について説明する。
図１に示すフローサイトメータ１は、概略、赤血球などの一般的な細胞粒子より微小なタンパク質複合体（たとえば直径が１０^２ｎｍ未満のもの）等の微小細胞粒子Ｐを蛍光色素などで染色されたものを、フローセル３０内で一列に配列するための流体フロー機構１０と、各微小細胞粒子Ｐに少なくとも２種類のレーザ光を照射し、散乱光および蛍光を受光するための光学的機構４０と、光学的機構４０から出力された散乱光および蛍光に関する電気信号を処理するためのデジタル信号処理装置（信号処理部）６０とを備える。
また、このフローサイトメータ１は、微小細胞粒子Ｐから生じた散乱光および蛍光に関する電気信号をデジタル信号処理装置６０により解析して微小細胞粒子Ｐを同定し、微小細胞粒子Ｐの種別に応じた極性を有する電荷を所定のタイミングで微小細胞粒子Ｐに与え、その電荷に基づいて微小細胞粒子Ｐを分別するためのソータ機構８０を設けることにより、セルソータとして構成することができる。
以下、流体フロー機構１０、光学的機構４０、デジタル信号処理装置６０、およびソータ機構８０について詳細に説明する。

［１．流体フロー機構］
図１および図２を参照すると、流体フロー機構１０は、概略、シースフローを形成するための円筒状のフローチャンバ１２と、蛍光染料や蛍光ラベルモノクロナール抗体などの蛍光標識試薬で蛍光標識された微小細胞粒子Ｐを含むサンプル懸濁液を収容するためのサンプル容器１４と、シース液を収容するためのシース容器１６とを備え、フローチャンバ１２の中心軸に沿って配設されたサンプル管１５にサンプル懸濁液が供給され、フローチャンバ１２の周縁部に接続されたシース管１７を介してフローチャンバ１２内にシース液が供給されるように構成されている。

また流体フロー機構１０は、サンプル容器１４内の気圧を制御する圧力コントローラ１８と、圧力コントローラ１８に圧縮空気を供給するためのエアポンプ２６と、シース容器１６と流体連通する大量のシース液を貯蔵するためのプレナム容器２４と、プレナム容器２４に圧縮空気を供給するための別のエアポンプ２７とを備える。好適には、圧力コントローラ１８は、シース容器１６内の圧力をモニタして、サンプル容器１４内の圧力がシース容器より所定の圧力だけ大きくなるようにサンプル容器１４内の圧力を調整する。

さらに、とりわけ図２に示すように、フローチャンバ１２の下端部には、水晶、ガラス、溶融シリカまたは透明プラスティックなどの透明部材を用いて漏斗状に形成された流路ブロック２８が配設され、その下方に断面積の小さいフローセル３０が構成されている。流路ブロック２８の上方周辺部には、周波数可変（たとえばｆ＝６０ｋＨｚ）のピエゾ圧電素子等を用いた振動器３２が配設され、流路ブロック２８の下方中央部にはオリフィス３４と、シースフローに接触し、これより分離して形成される液滴Ｄ（微小細胞粒子Ｐを含む）に所望の極性を有する電荷を与えるための荷電電極（荷電部）３６とが設けられている。

こうして構成された流体フロー機構１０において、エアポンプ２６，２７が作動すると、サンプル容器１４およびシース容器１６にそれぞれ収容されたサンプル懸濁液およびシース液がフローチャンバ１２内に供給され、シース液がサンプル懸濁液を円筒状に包み込むシースフロー（層流）が形成される。そして振動器３２により所定の周波数で流路ブロック２８に振動が与えられると、図２に示すように、フローセル３０を通過したシースフローが流路ブロック２８のオリフィス３４からジェットフローとして噴出され、ジェットフローの水平方向断面が鉛直方向に沿って振動器３２の周波数に同期して変調し（くびれが生じ）、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにおいてジェットフローから液滴Ｄが分離する。

詳細後述するが、分別すべき所望の微小細胞粒子Ｐがブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達する直前と推定されるタイミングで、微小細胞粒子Ｐの識別情報に応じた極性を有する電圧を荷電電極３６に印加することにより、識別された微小細胞粒子Ｐを含む液滴Ｄを荷電することができる。そして荷電電極３６の下方には、図１に示すソータ機構８０の構成部品として、所定の電圧差を有する一対の偏向板８２が配設され、落下する液滴Ｄが微小細胞粒子Ｐの識別情報に応じて分別され、所定のコレクションチューブ８４に収容される。なお、分別すべき微小細胞粒子Ｐの識別情報の収集方法については、たとえば前掲の特許文献２に記載された手法を用いることができる。

［２．光学的機構］
図１を参照すると、光学的機構４０は、概略、フローセル３０内を整列して通過する微小細胞粒子Ｐに第１および第２の光を順次照射する第１および第２の光源４２，４４と、第１の光源４２からの光が微小細胞粒子Ｐで散乱して生じた側方散乱光を検出する側方散乱光検出装置（第１の受光部）５２と、第１の光源４２からの光により励起された微小細胞粒子Ｐから生じる蛍光を検出する複数の（図４では３つの）蛍光検出装置（第２の受光部）５４とを有する。
なお、図４においては、第１の光源４２と第１の受光部５２、および第２の光源４４と第２の受光部５４はそれぞれ、直線上に配列されているように図示されているが、第１および第２の光源４２，５２の入射レーザビームの光軸と、第１および第２の受光部５２，５４への出射レーザビームの光軸とが所定の角度（１８０度でなく、好適には、たとえば９０度）をなすように光学的機構４０（第１および第２の光源４２，４４ならびに第１および第２の受光部５２，５４）を配置することが好ましい。これにより、第１および第２の受光部５２，５４は、第１および第２の光源４２，５２からの照射光を直接的に受光することを回避して、光エネルギ強度がより小さい側方散乱光または蛍光を精度よく受光することができる。

図３は、光学的機構４０の具体的構成を示す概略図である。図３において、第１および第２の光源４２，４４はともにレーザビームなどのコヒーレント光源である。第１の光源４２は、好適には、青色レーザビーム（ピーク波長：４８８ｎｍ，出力：２０ｍＷ）を照射するＤＰＳＳレーザ（Diode Pumped Solid State Laser：半導体レーザ励起固体レーザ）である。第２の光源４４は、たとえば近紫外レーザビーム（ピーク波長：３５５ｎｍ，出力：１Ｗ）を照射するモード同期レーザであってもよい。

図３において、第１の光源４２から出力された青色レーザビームは、ビームエキスパンダ４３ａによりビーム整形され、フローセル３０の上方（上流側）に照射される。一方、第２の光源４４から出力された近紫外レーザビームは、通常、ガウス分布強度を有するが、光減衰器４６、ビームエキスパンダ４３ｂ、円筒面レンズ４７、マスク４８、および球面レンズ４９ａ〜４９ｃを用いて、比較的に強度変化の小さい一部分のレーザビームを切り出して拡張することにより、実質的に均一な光強度を有するトップハット状ビームを整形することができる。
実質的に均一な光強度を有するビームを整形するものである限り、当業者ならば自明である他の任意の光学素子を用いることができる。たとえば、不均一なレーザビームを均一な強度を有するビームを変換するビームホモジナイザや、回折型マイクロレンズアレイ、回折型ビーム整形光学素子、回折型線状集光レンズなどの回折型光学素子を用いてもよい。

図４は、第１および第２の光源４２，４４からのレーザビームが照射される方向に平行な平面で切断したときのフローセル３０の拡大断面図であり、図５（ａ）はレーザビームの照射される方向とは直交する平面で切断したときのフローセル３０の拡大断面図である。第１の光源４２から出力された青色レーザビームは、図示しないが、照射領域の中心位置にピークをもつガウス分布強度を有するものであるのに対し、第２の光源４４からの近紫外レーザビームは、上述のように、図５（ｂ）に示すフローセル３０のほぼ矩形の受光領域全体５５ａ〜５５ｃにおいて（２次元的に）均一な強度を有するように（トップハット状に）ビーム整形される。

図４において、第１の受光部５２は一般的なフォトダイオードを有し、第１の光源４２からの青色レーザビームを選択的に透過させるバンドパスフィルタ（図示せず）を介して、青色レーザビームが微小細胞粒子Ｐで散乱して生じた青色側方散乱光（ＦＳＣ）だけを検出する。
一方、複数の第２の受光部５４ａ〜５４ｃのそれぞれは、第１の受光部５２よりシースフローの下流側（図中のフローセル３０の下方）において、フローセル３０の受光領域５５ａ〜５５ｃに対向して配置される。また第２の受光部５４ａ〜５４ｃのそれぞれは、光電子増倍管やフォトンカウンタなど（たとえば日本の静岡県浜松市にある浜松ホトニクス株式会社から市販されている型番H7421-50のフォトンカウンタ）からなり、赤色光（６１０ｎｍ〜）を選択的に透過させるバンドパスフィルタ（図示せず）を介して、近紫外レーザビームが微小細胞粒子Ｐを励起して生じる赤色蛍光を検出する。すなわち第２の受光部５４ａ〜５４ｃは、同一の波長を有する励起光により励起された微小細胞粒子Ｐから生じる赤色蛍光を検出する。

ここで、本発明において、第２の光源４４から出力された近紫外レーザビームをトップハット状にビーム整形した理由について説明する。
微小細胞粒子Ｐを蛍光標識する蛍光色素は、一般に、励起光からの励起エネルギを受けて基底状態より高いエネルギ準位にある励起状態に遷移した電子が元の基底状態に戻る際に励起状態と基底状態のエネルギ準位差（バンドギャップ）に相当するエネルギを放出して蛍光を発する。
そして単一の蛍光色素から生じる蛍光強度（Ｉ）は、励起光源の励起エネルギ（Ｐ）の他、励起時間（τ_１）、ビーム断面積（Ｓ）、蛍光色素の蛍光寿命（τ_０）、シースフローの屈折率（ｎ）、系全体の効率（η）をパラメータとして次式で表されることが知られている。

ここで、ｃは真空中の光速であり、Ｂはアインシュタインの誘導放出係数を示す。

上式より、蛍光強度（Ｉ）は、実験的には、励起光源の励起エネルギ（Ｐ）の増大とともにある程度までは増大するが、その後飽和する（一定となる）のに対し、蛍光強度（Ｉ）は、励起時間（τ_１）に比例して単調増加することが分かる。したがって、タンパク質複合体などの微小細胞粒子Ｐに付着する数少ない蛍光色素からの蛍光強度を増大させるためには、励起時間（τ_１）を長く、すなわち微小細胞粒子Ｐに励起光を照射している時間間隔を長くすることが有効である。

そこで本発明は、第２の光源４４から出力された近紫外レーザビームをトップハット状にビーム整形して、微小細胞粒子Ｐがフローセル３０の受光領域５５を移動する間においては、ほぼ一定の強度を有する近紫外レーザビームで微小細胞粒子Ｐを継続的かつ効率的に励起することにより、励起時間（τ_１）を長くして、蛍光強度を増大させようとするものである。

このとき第２の受光部５４ａ〜５４ｃは、図６（ａ）に示すフローセル３０の受光領域５５ａ〜５５ｃに対向して、すなわちフローセル３０内でシースフローが流れる方向に沿って一列に配置される。しかし微小細胞粒子Ｐは、フローセル３０の中心軸に沿って移動するとは限らず、流路ブロック２８に接近して（中心から左右方向にずれて）移動することがあるので、こうした中心軸から逸脱して移動する微小細胞粒子Ｐから生じる蛍光をより広い範囲の受光領域５５ａ〜５５ｃで受光するために、シースフローが流れる方向とは直交する方向（水平方向）にも２個以上（図６（ｂ）では３つの）フォトンカウンタ（第２の受光部）５４ａ〜５４ｃを配置することが好ましい。このようにフォトンカウンタ５４ａ〜５４ｃを格子状のアレイとして構成することにより、微小細胞粒子Ｐがフローセル３０の受光領域５５を移動する間に生じる蛍光をより多く受光することができる。
なお、同様に図示のように、第２の受光部５４ａ〜５４ｃのみならず、第１の受光部５２も水平方向に複数個配置してもよい。

換言すると、一般に、レーザ光により励起された蛍光色素からの蛍光は全方位に放射するが、これまでのフローサイトメータでは、蛍光を固定されたただ１つの受光部で検出するため、全方位に放射される蛍光を集光することは困難である。しかしながら、本発明によれば、少なくともフローセル３０における微小細胞粒子Ｐの移動方向に沿って、複数の第２の受光部５４を配置することにより、微小細胞粒子Ｐから生じる蛍光をより多く集光することができる。また本発明によれば、上述のように、微小細胞粒子Ｐの移動方向とは直交する水平方向にも複数の第２の受光部５４を配置することにより、全方位に放射される蛍光をできるだけ多く集光して、微小細胞粒子Ｐの検出精度を大幅に改善することができる。

［３．デジタル信号処理装置］
図１を参照すると、デジタル信号処理装置（信号処理部）６０は、微小細胞粒子Ｐに青色レーザビームを照射して得られた側方散乱光を検出する側方散乱光検出装置（第１の受光部）５２と、トップハット状の近紫外レーザビームを照射して得られた赤色蛍光を検出する複数の蛍光検出装置（第２の受光部）５４とに電気的に接続されている。

図７（ａ）は第１の受光部５２のフォトダイオードから出力された電気的信号を示し、図７（ｂ）〜図７（ｄ）は複数の第２の受光部５４ａ〜５４ｃのフォトンカウンタから出力された電気的信号を示すタイミングチャートである。
フローセル３０内の微小細胞粒子Ｐは、通常、一定の速度で下流方向に移動するので、信号処理部６０は、たとえば第１の受光部５２のフォトダイオードからの電気的信号がピークとなる時点を検出し（図７（ａ））、これを起算点として、それぞれの第２の受光部５４ａ〜５４ｃフォトンカウンタが対向する受光領域５５ａ〜５５ｃを微小細胞粒子Ｐが通過するタイムウィンドウ（時間帯）を予測することができる。すなわち信号処理部６０は、第１の受光部５２の電気的信号がピークとなる時刻ｔ_０を起算点として、微小細胞粒子Ｐが受光領域５５ａ〜５５ｃを通過する時間帯を定義する時刻ｔ_１〜ｔ_４を設定することができる（図７（ｂ）〜図７（ｄ））。

したがって信号処理部６０は、時間帯ｔ_１〜ｔ_２、時間帯ｔ_２〜ｔ_３、時間帯ｔ_３〜ｔ_４において第２の受光部５４ａ〜５４ｃのフォトンカウンタで検出された電気的信号を図示しないバッファメモリに一時記憶した後、時刻ｔ_４経過後、電気的に加算することにより、特定の微小細胞粒子Ｐに対する赤色蛍光の電気的信号を増大させ、もって微小細胞粒子Ｐの検出精度を格段に向上させることができる。

なお、図４に示す光学的機構４０は３つの第２の受光部５４ａ〜５４ｃを有するものとして図示したが、第２の受光部５４ａ〜５４ｃの個数はこれに限定されるものではなく、たとえば光軸の中心間距離を０．２５ｍｍとする１０以上のフォトンカウンタ５４をシースフロー（フローセル３０）に沿って配列してもよい。

なお、複数の微小細胞粒子Ｐがフローセル３０を連続して通過するため、特定の微小細胞粒子Ｐ_１の後に別の微小細胞粒子Ｐ_２がフローセル３０内を続いて流れるが、本発明に係る信号処理部６０は、上述のように、各微小細胞粒子Ｐ_１，Ｐ_２に対する適当な時間帯を区切って互いに独立して電気的信号を処理するため、複数の微小細胞粒子Ｐに対する蛍光信号が干渉し合う（クロストークする）ことなく高い検出精度を担保することができる。

また、フローセル３０の受光領域５５ａ〜５５ｃを通過する微小細胞粒子Ｐからの蛍光を第２の受光部５４ａ〜５４ｃのそれぞれを用いてより選択的に受光できるように、図示しないが、各受光領域５５ａ〜５５ｃと、対応する第２の受光部５４ａ〜５４ｃのそれぞれとの間にマイクロレンズを設けることが好ましい。こうして、第２の光源４４からのトップハット状の励起強度を有するレーザビームにより連続的に励起される微小細胞粒子Ｐからの蛍光をより確実に、かつ、より選択的に受光することができる。

さらに、上記実施形態では、第１の光源４２から出力された青色レーザビームは、照射領域の中心位置にピークをもつガウス分布強度を有するものとして説明したが、第２の光源４４からの近紫外レーザビームと同様、均一な強度を有するようにビーム整形した後にフローセル３０に照射するように構成してもよい。このとき、第１の光源４２から出力された青色レーザビームを受光するために複数の第１の受光部５２を設けることにより、微小細胞粒子Ｐが受光領域５５ａ〜５５ｃを通過する時間帯を定義する時刻ｔ_１〜ｔ_４をより正確に設定することができる。

加えて、第２の光源４４のレーザビームとは異なる波長を有するレーザビームを照射する第３の光源またはそれ以上の光源（図示せず）を設けて、微小細胞粒子Ｐから生じる異なる波長の蛍光を検出することにより、微小細胞粒子Ｐを同定するために必要なより多くの情報を収集することができる。このとき、第３の光源から出力されるレーザビームも同様に、照射領域の中心位置にピークをもつガウス分布強度を有し、複数の第３の受光部（図示せず）を配置することが好ましい。

［４．ソータ機構］
なお、本発明に係るフローサイトメータ１は、ソータ機構８０を追加的に設けることによりセルソータとして構成することができる。以下、図１、図７および図８を参照してソータ機構８０について以下説明する。

ソータ機構８０は、概略、図１において、一対の偏向板８２と、ＣＣＤカメラなどの固定撮像部８６と、これらに電気的に接続された制御回路部（図示せず）とを有し、制御回路部はデジタル信号処理装置６０に内蔵されたものであってもよい。すなわちデジタル信号処理装置６０は、偏向板８２および固定撮像部８６に加え、図示しないが、第１および第２の受光部５４ａ〜５４ｃ、液滴Ｄを帯電させる荷電電極３６、ならびにジェットフローから液滴Ｄを分離させる振動器３２にも接続されている。

図８は、フローセル３０内のシースフローＦ_Ｓと、フローセル３０のオリフィス３４から噴出されるジェットフローＦ_Ｊ（およびジェットフローＦ_Ｊからブレイク・オフ・ポイントＢＰで分離する液滴Ｄを含む）とを簡略的に図示したものである。上述のように、流路ブロック２８に取り付けられた振動器３２が所定の周波数（たとえばｆ＝６０ｋＨｚ）で振動すると、図８に示すようにジェットフローＦ_Ｊの水平方向断面が鉛直下方に沿って振動器３２の周波数ｆに同期して変調する（くびれが生じる）。このときのジェットフローＦ_Ｊの変調周期（隣接する極大点または極小点の間の距離および隣接する液滴Ｄの間の距離）λは一定となる。

固定撮像部８６は、点滅光源（図示せず）を有し、フローセル３０に対して固定された位置に配置され、ジェットフローＦ_Ｊの下流側から下流方向に所定距離隔てた画像位置ＩＰ_１を上端とし、下流側にある画像位置ＩＰ_２を下端とする撮像領域（破線で示す）９０におけるジェットフローＦ_Ｊおよび液滴Ｄの画像を撮像するように設計されている。また点滅光源は、撮像領域９０にあるジェットフローＦ_Ｊと液滴Ｄを、振動器３２の周波数ｆと同一の周波数で点滅照明するように構成されている。したがって、固定撮像部８６は、定常状態にあるジェットフローＦ_Ｊおよび液滴Ｄを振動器３２の周波数ｆで撮像するため、図８のように静止したように見える画像を得ることができる。

このとき、固定撮像部８６はフローセル３０に対して固定されているので、図８において、第１の受光部５２が微小細胞粒子Ｐからの側方散乱光を検出した位置ＩＰ_０から、画像位置ＩＰ_１までの距離Ｌ_Ｂ０は一定である。固定撮像部８６を用いてジェットフローＦ_Ｊの変調周期λを常時モニタし、画像処理技術により位置ＩＰ_０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの正確な距離Ｌ（＝Ｌ_Ｂ０＋Ｌ_Ｂ）をリアルタイムで算出し、これに応じて荷電電極３６がブレイク・オフ・ポイントＢＰで微小細胞粒子Ｐに電荷を与える遅延時間を補正する。こうして得られた遅延時間が経過した時に、目的とする微小細胞粒子Ｐを含むジェットフローＦ_Ｊに、微小細胞粒子Ｐの識別情報に応じた極性を有する電荷を与えることにより、目的とする微小細胞粒子Ｐを含む液滴Ｄを所望する方向にあるコレクションチューブ８４に効率よく分別することができる。

このように、本発明に係るフローサイトメータ１をセルソータに採用したとき、対象となる細胞粒子が極めて微小なものであっても、複数の第２の受光部５４ａ〜５４ｃにより検出された蛍光信号を加算することにより蛍光信号を増大させ、微小細胞粒子Ｐに関するより正確な情報に基づいたより精緻な分別を実現することができる。

実施形態２

図９および図１０を参照しながら、本発明に係る実施の形態２によるフローサイトメータ１について以下に説明する。実施形態２に係るフローサイトメータ１は、第２の光源４４を複数設け、それぞれから出力されるレーザビームが各受光領域５５において均一な強度を有する点を除いて、実施の形態１のフローサイトメータ１と同様の構成を有するので、その他の構成部品に関連する詳細な説明を省略する。なお図中、同一構成部品については同一の符号を用いて示す。

上記説明したように、実施形態１に係る光学的機構４０は、単一の第２の光源４４からのレーザビームを、ストリップ状の幅広の受光領域５５に均一強度で照射するようにビーム整形するものであるが、数多くの構成部品を有し、精緻なアセンブリ精度が求められるため、生産コストを引き上げる場合がある。また実施形態１によれば、単一の第２の光源４４からのレーザビームを広範な領域に照射し、かつ第２の受光部５４ａ〜５４ｃにより有効に蛍光を受光できない領域においても照射するので、光エネルギの損失が大きく、各受光領域５５で必要な光強度を実現するためには単一の第２の光源の出力エネルギを増大させる必要がある。このとき、高出力のレーザ光源は、一般に、低出力のものに比して高価となり、一定強度の出力を得るための制御が複雑になる傾向がある。そこで本発明に係る実施形態２は、より簡便で、安価で、制御しやすい光学的機構４０を提案するものである。

図９および図１０（ａ），（ｂ）は、実施形態１の図４および図５（ａ），（ｂ）と同様のフローセル３０の拡大断面図である。実施形態２において、第１の光源４２から出力された青色レーザビームがガウス分布強度を有するのに対し、第２の光源４４のそれぞれから出力された近紫外レーザビームは、同一の発光波長を有するが、フローセル３０のほぼ矩形の各受光領域５５ａ〜５５ｃにおいて均一な強度を有するようにビーム整形される。

また図９において、第１の光源４２と第１の受光部５２、および第２の光源４４ａ〜４４ｃと第２の受光部５４ａ〜５４ｃはそれぞれ、直線上に配列されているように図示されているが、図４について上述したように、第１および第２の光源４２，５２の入射レーザビームの光軸と、第１および第２の受光部５２，５４への出射レーザビームの光軸とが所定の角度（１８０度でなく、好適には、たとえば９０度）をなすように光学的機構４０を配置することが好ましい。こうして、第１および第２の受光部５２，５４は、第１および第２の光源４２，５２からの入射レーザビームを直接的に受光することを回避して、光エネルギ強度がより小さい側方散乱光および蛍光を精度よく受光することができる。

このように構成された実施形態２に係るフローサイトメータ１によれば、実施形態１と同様、信号処理部６０が第２の受光部５４ａ〜５４ｃの各フォトンカウンタで検出された電気的信号をバッファメモリに一時記憶した後、電気的に加算することにより、特定の微小細胞粒子Ｐに対する赤色蛍光の電気的信号を増大させて（積算して）、微小細胞粒子Ｐの検出精度を格段に向上させることができる。また、このフローサイトメータ１を採用したセルソータは極めて微小な細胞粒子をより精緻に分別することができる。

なお、実施形態２に係る光学的機構４０は、図１０（ａ）に示すようにフローセル３０の各受光領域５５を互いに分離または隔離することにより、あるいは各受光領域５５を連続的なものとして、各受光領域５５ａ〜５５ｃと対応する第２の受光部５４ａ〜５４ｃのそれぞれとの間にマイクロレンズを配置することにより、複数の微小細胞粒子Ｐによる蛍光信号が干渉し合う（クロストークする）ことを防止するように構成してもよい。

また実施形態２においても実施形態１（図６（ｂ））と同様、第２の受光部（フォトンカウンタ）５４を格子状のアレイとして水平方向にも並べて構成することにより、微小細胞粒子Ｐが中心から逸脱してフローセル３０内を移動する場合であっても、受光領域５５の移動期間中に生じる蛍光を受光可能な蛍光強度を増大させることができる。

さらに、実施形態２に係る光学的機構４０においては、各受光領域５５ａ〜５５ｃにおいて均一な強度を有するようにビーム整形されたが、より安価な構成を実現するために、第２の光源４４のそれぞれから出力された近紫外レーザビームも、第１の光源４２から出力された青色レーザビームと同様、ガウス分布強度を有していてもよい。ただし、第２の光源４４のそれぞれから出力された近紫外レーザビームの発光波長は同一でなければならない。

さらに実施形態１および２の中間的な形態として、光学的機構４０は、単一の第２の光源４４から出力された近紫外レーザビームを、互いに分離した各受光領域５５（図１０（ａ））に照射するようにビーム整形するものであってもよい。

本発明に係る上記実施形態のフローサイトメータ１を用いて、サンプル懸濁液中に含まれる所望の微小細胞粒子Ｐを検出または同定するときの検出精度が改善されることについて、従来技術によるフローサイトメータと対比しながら以下説明する。
具体的には、本発明および従来技術にそれぞれ対応する比較例１および２に係るフローサイトメータを用いて、蛍光標識された標準ビーズ（以下、「標識ビーズ（Target）」ともいう。）を含むサンプル懸濁液に励起光を照射して検出された標識ビーズに固有の蛍光の強度と、その蛍光を発する標識ビーズの個数とを測定する実験を行った。
同様に、比較例１および２に係るフローサイトメータを用いて、蛍光標識されない標準ビーズを（以下、「非標識ビーズ（Blank）」ともいう。）を含むサンプル懸濁液に励起光を照射して検出された所定波長の蛍光の強度と、その蛍光を発する非標識ビーズの個数とを測定した。

この実施例で用いられた標識ビーズ（Target）は、直径１７０μｍのポリスチレン製の球からなる黄色蛍光の標準ビーズ（Y170）をストレプトアビジン標識色素（Qdot 705（登録商標））などの標識色素で蛍光標識されたものであり、非標識ビーズ（Blank）は、同一の標準ビーズを標識色素で蛍光標識されていないものである。

なお、この実施例で用いられた比較例１および２に係るフローサイトメータは、上記実施形態に係るフローサイトメータと基本的には同一の構成を有する。ただし比較例１および２に係る光学的機構４０は、以下説明する点において上記実施形態１とは異なるように構成されている。

上記実施形態に係るフローサイトメータの第２の光源４４は、近紫外レーザビーム（ピーク波長：３５５ｎｍ，出力：１Ｗ）を発するものであって、照射面全体において実質的に均一な光強度を有するトップハット状ビームを形成するものである。
これに対し、比較例１（本発明に対応）に係るフローサイトメータの第２の光源４４は、同様の近紫外レーザビームを発するものであるが、図１２（ａ）に示すように、鉛直方向に流れるフローセル３０（シースフロー）に対して垂直方向に長く延びた長楕円状の照射面（１５μｍ×３０μｍ）を有し、ガウス分布の光強度を有するものである。
一方、比較例２（従来技術に対応）に係るフローサイトメータの第２の光源４４は、同様に近紫外レーザであるが、図１２（ｂ）に示すように水平方向に長く延びた照射面（３０μｍ×１５μｍ）を有し、比較例１と同様のガウス分布の光強度を有するものである。
すなわち比較例１のフローセル３０に流れる標準ビーズは、図１２（ａ）の照射面の長径軸（３０μｍ）を縦断し、比較例２に係るフローセル３０に流れる標準ビーズは、図１２（ｂ）の照射面の短径軸（１５μｍ）を横断するので、前者は後者に比してほぼ２倍長い励起時間（上記［数１］のτ_１）において励起光が照射される。

このとき比較例１および２に係るフローサイトメータにおいて、フォトンカウンタなどの第２の受光部５４ａ〜５４ｃは、近紫外レーザビームが標準ビーズを励起して生じる黄色蛍光を受けて、黄色蛍光の強度に比例する光子カウント数（蛍光強度）に相当する電気的信号を信号処理部６０に出力し、信号処理部６０は、図７に示すように、標準ビーズが受光領域を通過する所定のタイムウィンドウにおける電気的信号を電気的に加算する。
このように、比較例１のフローサイトメータは、比較例２に比してほぼ２倍長い励起時間（τ_１）において標準ビーズを励起した際の蛍光を検出するので、複数の第２の受光部５４を有する本発明に係るフローサイトメータに対応し、比較例２のフローサイトメータは、より短い励起時間で標準ビーズを励起した際の蛍光を検出するので、従来技術に係るフローサイトメータに近似するものと位置付けることができる。

上述の標識ビーズ（Target）および非標識ビーズ（Blank）を含むサンプル懸濁液をそれぞれ別々に、比較例１に係るフローサイトメータのサンプル容器１４内に収容した後、上記実施形態と同様に、エアポンプ２６，２７を作動させて、サンプル懸濁液およびシース液をフローチャンバ１２内に供給し、シースフロー（層流）を形成した。さらに振動器３２により所定の周波数で流路ブロック２８に振動を与えて、流路ブロック２８のオリフィス３４から噴出するジェットフローを形成し、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにおいてジェットフローから液滴Ｄが分離するように制御した。

標識ビーズ（Target）を含むサンプル懸濁液について、第２の受光部を用いて、標識ビーズ（Target）に固有の波長を有する蛍光を検出し、具体的にはフォトンカウンタで検出されたフォトンカウント（光量子数、光強度に相当）を検出した。さらに信号処理部６０を用いて、サンプル懸濁液全体に対して所定のフォトンカウントが検出された頻度（サンプル懸濁液に含まれる標識ビーズ（Target）の個数に相当）を測定した。

同様に、非標識ビーズ（Blank）を含むサンプル懸濁液について、第２の受光部を用いて同一の波長を有する蛍光を検出し、信号処理部６０を用いてフォトンカウントと頻度を測定した。

図１３は、比較例１（本発明に対応）に係るフローサイトメータの信号処理部６０が検出したフォトンカウント（強度）と頻度（標準ビーズの個数）を、標識ビーズ（Target、ドット（・）で表示）および非標識ビーズ（Blank、クロス（×）で表示）を含むサンプル懸濁液のそれぞれについて同一のグラフにプロットしたものである。
同様に、図１４は比較例２（従来技術に対応）に係るフローサイトメータの信号処理部６０が検出したフォトンカウント（強度）と頻度（標準ビーズの個数）を、標識ビーズ（Target、・）および非標識ビーズ（Blank、×）を含むサンプル懸濁液のそれぞれについて同一のグラフにプロットしたものである。

図１３および図１４から明らかなように、非標識ビーズ（Blank）からの所定波長を有する（黄色）蛍光のフォトンカウント（強度）は、比較例１および２においてともに全体的に小さく、非標識ビーズの全体数に対する平均のフォトンカウント（平均強度）は、比較例１では１．４５であり、比較例２では１．７２であり、両者は実質的に同じであった。非標識ビーズ（Blank）が蛍光標識されていない標準ビーズであり、検出された蛍光は非標識ビーズとは無関係の背景ノイズによるものと考えられるので、この検出結果は妥当なものであると考えられる。

一方、標識ビーズ（Target）からの所定波長を有する蛍光の平均フォトンカウント（平均強度）は、比較例１では１１．８８であり、比較例２では９．４５であった。この結果は、比較例１（本発明に対応）に係るフローサイトメータで検出できる蛍光の平均強度を比較例２（従来技術に対応）に比して２５％以上増大できることを意味するものである。したがって、標識ビーズ（Target）からの蛍光の平均強度を増大させることができるので、より確実に係る標識ビーズを同定して、検出精度を実質的に改善することができる。

ここでフローサイトメータによる標準ビーズの検出精度を定量的に規定するために、ポジティブ率ＰＲ（以下、「ポジ率」ともいう。）を次のように定義する。
非標識ビーズ（Blank）とは無関係の背景ノイズに起因する蛍光検出の強度は、上述のように全体的に小さく、所定の最大閾値（たとえば９．００）を設定することができる。このとき、標識ビーズ（Target）を含むサンプル懸濁液について、比較例１（本発明に対応）の信号処理部６０が検出したフォトンカウント（強度）および頻度（個数）をプロットした各ポイントを、図１５および図１６に示すようになだらかな曲線で結び、この曲線とｘ軸で囲まれた領域のうち上記最大閾値より大きい領域の面積をＳ_１、および小さい領域の面積をＳ_２とする。そしてポジティブ率ＰＲを次式で定義する。
ＰＲ（％）＝Ｓ_１／（Ｓ_１＋Ｓ_２）

最大閾値より大きいフォトンカウント（強度）を有する蛍光が信号処理部６０により検出されたとき、その蛍光は背景ノイズではなく、確実に標識ビーズ（Target）からのものであると判断することができる。すなわちソータ機構８０を用いて、最大閾値より大きい蛍光強度を有する標識ビーズ（Target）だけを選択的に分別することにより、極めて高い純度で標準ビーズまたは微小細胞粒子Ｐを分取することができる。換言すると、ポジティブ率ＰＲを改善することにより、セルソータが分取する微小細胞粒子Ｐの収量を増大させることができる。

この実施例において、ポジティブ率ＰＲは比較例１では６８．２％であり、比較例２では３９．７％であった。したがって、比較例１（本発明に対応）に係るセルソータによる微小細胞粒子Ｐを分取するとき、比較例２（従来技術に対応）に比して、所望する標識ビーズ（Target）の収量を約１．７倍以上に増大することができる。

さらに比較例３に係るフローサイトメータを用いて、検出精度をさらに改善する手法について説明する。
比較例３に係るフローサイトメータは、図１２（ｃ）に示すように比較例１と同様のものであるが、エアポンプ２６，２７がサンプル容器１４およびシース容器１６に加える圧力を小さくすることにより、フローセル３０内に流れるシースフロー（標準ビーズ）の速度を遅くしたものである。比較例１および２のシースフローの流速がｖ_１（２．２６ｍ／ｓ）であったところ、比較例３のシースフローの流速がｖ_２（１．５５ｍ／ｓ）となるようにエアポンプ２６，２７の圧力を制御した。すなわち比較例３は、流速を遅くして長時間励起を行う基礎実験である。こうして標識ビーズ（Target）からの所定波長を有する蛍光の平均フォトンカウント（平均強度）を１３．１１まで増大させることにより（比較例１では１１．８８）、より確実に係る標識ビーズを同定することができるので、検出精度を実質的に改善することができる。

１：フローサイトメータ、１０：流体フロー機構、１２：フローチャンバ、１４：サンプル容器、１５：サンプル管、１６：シース容器、１７：シース管、１８：圧力コントローラ、２４：プレナム容器、２６，２７：エアポンプ、２８：流路ブロック、３０：フローセル、３２：振動器、３４：オリフィス、３６：荷電電極（荷電部）、４０：光学的機構、４２：第１の光源、４４：第２の光源、４３：ビームエキスパンダ、４６：光減衰器、４７：円筒面レンズ、４８：マスク、４９：球面集光レンズ、５２：側方散乱光検出装置（第１の受光部）、５４：蛍光検出装置（第２の受光部）、５５：受光領域、６０：デジタル信号処理装置（信号処理部）、８０：ソータ機構、８２：偏向板、８４：コレクションチューブ、８６：固定撮像部、Ｐ：微小細胞粒子、Ｄ：液滴、ＢＰ：ブレイク・オフ・ポイント。

Claims

染色された生物学的粒子を含むシースフローを形成するフローセルと、
フローセルに第１の光を照射する第１の光源と、
第１の光源よりシースフロー下流側においてフローセルに第２の光を照射する第２の光源と、
第１の光による生物学的粒子からの散乱光または蛍光を受光して電気的信号に変換する第１の受光部と、
第２の光による生物学的粒子からの蛍光を受光して電気的信号に変換する、シースフローに沿って配列された複数の第２の受光部と、
第１の受光部が散乱光または蛍光を受光した時から所定の期間において、複数の第２の受光部から出力された電気的信号を電気的に加算することにより、第２の光により生物学的粒子を励起したときに生じる蛍光の電気的信号を増大させる信号処理部とを備え、
第２の光源は、複数の第２の受光部が対向するフローセルの受光領域全体にわたってシースフローに沿って実質的に均一な強度で第２の光を照射することを特徴とするフローサイトメータ。
第２の光源は、複数の第２の受光部のそれぞれが対向するフローセルの各受光領域に、同一波長の第２の光を照射する複数の光源からなることを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
第２の受光部は、シースフローに沿った第１の方向、および第１の方向と直交する第２の方向に格子状に配列されることを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
複数の第２の受光部のそれぞれに対向して配置され、第２の光による生物学的粒子からの蛍光を集光するための複数のマイクロレンズを有することを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
請求項１〜４のいずれか１に記載のフローサイトメータを備えたことを特徴とするセルソータ。
染色された生物学的粒子を含むシースフローを形成するステップと、
フローセルに第１の光を照射するステップと、
第１の光源よりシースフロー下流側においてフローセルに第２の光を照射するステップと、
第１の光による生物学的粒子からの散乱光または蛍光を受光して電気的信号に変換するステップと、
第２の光による生物学的粒子からの蛍光を複数の受光領域において受光して電気的信号に変換するステップと、
第１の光による生物学的粒子からの散乱光または蛍光を受光した時から所定の期間において、複数の第２の受光部から出力された電気的信号を電気的に加算することにより、第２の光により生物学的粒子を励起したときに生じる蛍光の電気的信号を増大させるステップとを有し、
第２の光は、複数の受光領域全体にわたってシースフローに沿って実質的に均一な強度で照射されることを特徴とするフローサイトメトリ方法。
第２の光は、同一波長を有し、複数の第２の受光部のそれぞれが対向するフローセルの各受光領域に照射されることを特徴とする請求項６に記載のフローサイトメトリ方法。
染色された生物学的粒子は、蛍光色素で蛍光標識された１００ｎｍ未満の径を有することを特徴とする請求項６または７に記載のフローサイトメトリ方法。