JP2016114356A - 蛍光検出装置、及び蛍光検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体分子の数を高感度、かつ検量線不要で定量的に評価することのできる蛍光検出装置、及び蛍光検出方法を提供すること。【解決手段】励起光の波長より狭い幅のナノスリットを有する遮光膜に対し、ナノスリットの長手方向と平行な直線偏光の光を励起光として照射し、ナノスリットの長手方向と交差しかつ断面の幅及び高さのいずれもがナノスリットの短手方向の幅以下であるナノ流路との交差点において、ナノスリットを通過した励起光によって被検出体が蛍光を発する。この蛍光の量に応じて信号を出力し、信号と閾値を比較して、ナノスリットとナノ流路の交差点を移動した被検出体の数を計測する。【選択図】図１

Description

本発明は、試料溶液中に存在するＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、又は蛋白質等の生体分子を蛍光法により、高感度に検出・計測する蛍光検出装置、及び蛍光検出方法に関する。

バイオ分野ではＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質等の生体分子を高感度、かつ容易に検出・計測する必要性があり、その方法としては蛍光法と呼ばれる方法が広く一般的に用いられている。蛍光法は、検出対象の分子もしくはそれと特異的に結合・反応する分子を蛍光体で標識し、外部から励起光を照射することで生じた蛍光発光を検出し、検出対象分子の生体特異反応の過程を観察したり、定量化等を行ったりする方法であり、非常に重要な技術である。例えば、各種ＲＮＡはウィルスそのもの、または病原体や遺伝子の活動に関連している生体分子であり、病気の確定診断や早期発見の研究に用いられているが、このＲＮＡの検出を行うためのＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法やマイクロアレイ法といった方法にも蛍光法が用いられている。

またバイオ分野では、ＰＣＲ法と呼ばれるＤＮＡ増幅方法もよく用いられる。ＰＣＲ法はＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる酵素の反応を利用し、ＤＮＡの中から所望の領域のみ選択的に増幅することの出来る方法である。上記ＲＴ−ＰＣＲ法やマイクロアレイ法においても使用されており、生体試料のＲＮＡ量が極めて微量で蛍光の検出が不可能な量であっても、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡを増幅させることで、蛍光の検出を可能としている。

このように蛍光法、ＰＣＲ法は非常に有用な一方で、ＰＣＲ法には複雑なプライマー設計、試薬の増加、厳密な温度管理、増幅バイアス等の課題も存在する。特に使い捨てに適した微細なマイクロチップ構造の検出器、所謂μＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を想定した場合、その限られた空間のために、その課題は顕著となる。

ここで、従来の高感度蛍光検出方法について説明する。一分子からの生体分子の活動を動的にリアルタイムに観察することを目的に、超高感度な蛍光観察装置が既に実用化されている。これは全反射照明蛍光顕微鏡と呼ばれ、従来の落射照明型顕微鏡での励起光入射とは異なり、高屈折率材料（例えば石英）から低屈折率材料（例えば水溶液）へ臨界角以上で入射した際に全反射によって生ずるエバネッセント光を励起光に用いるところが特徴的である。エバネッセント光は全反射する界面からの距離に応じて指数関数的に減衰するため、全反射照明蛍光顕微鏡は、落射照明型顕微鏡と比較し、励起光照射体積を大幅に低減することができ、結果として、水のラマン散乱をはじめとした様々な背景光を飛躍的に低減し、検出感度を大幅に向上することが可能となっている。

その励起光照射体積を減少させ背景光を低減するという考え方は、例えば特許文献１や非特許文献１で更に検討が重ねられている。特許文献１では、全反射エバネッセント光による励起光よりも、更に励起光照射体積を低減可能なナノ開口によるエバネッセント光を利用して、蛍光検出の感度を上げている。これは、径が２００ｎｍ程度と励起光の波長よりも狭いナノ開口を有する薄膜に励起光を照射し、漏れ出てくるエバネッセント光を利用したものである。ナノ開口エバネッセント光の照射体積はナノ開口の大きさにより制御可能であるため、全反射エバネッセント光の照射体積よりも、更に大幅に小さくすることが可能となっている。

また、非特許文献２では、ナノ開口によるエバネッセント光を利用した照明方式を用い、ナノ開口内底面部に固定化したＤＮＡポリメラーゼへの蛍光体標識ｄＣＴＰの取込み計測に応用している。

更には、表面プラズモン共鳴による電場増強効果を利用し、蛍光強度の向上を図った特許文献２や、励起光を斜めに入射し、かつナノ開口を有する膜と基板との間に低屈折率膜を設けることにより高効率励起光照射を実現した特許文献３が提案されている。

特開２００４−１６３１２２号公報 特開２０１３−００２９８６号公報 国際公開第２０１１／００２０１０号 国際公開第２０１２／１６５４００号

Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００８， Ｖｏｌ．８０， ｐｐ．６０１８−６０２２ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００３， Ｖｏｌ．２９９， ｐｐ．６８２−６８６

しかしながら、上記従来技術においては、被検出体の絶対数または濃度を定量的に直接評価することはできないという課題があった。これらを評価しようとする場合、蛍光強度または蛍光計測数と被検出体の絶対数または濃度の関係を予め明らかにする検量線を評価しておく必要があった。検量線の評価は非常に手間がかかる上、評価時は被検出体のみの溶液で評価するため、被検出体以外も存在する実際の生体試料においては被検出体以外の物質からの相互作用が発生し、正しい検量線を得られないという課題も生じた。

本発明は、上記従来の課題を解決するもので、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質等の生体分子の個体数を高感度に検出し、かつ検量線不要で定量的に評価することのできる蛍光検出装置、及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。

上記従来の課題を解決するため蛍光検出装置は、励起光の照射により蛍光を発する被検出体の個体数を計測するための蛍光検出装置であって、前記励起光を出射する励起光光源と、長手方向と短手方向とを有し前記短手方向の幅が前記励起光の波長より狭いナノスリットを有する遮光膜と、前記遮光膜上で前記光源と反対側に位置し、前記ナノスリットの前記長手方向と交差し、かつ断面の幅及び高さのいずれもが前記ナノスリットの幅以下であるナノ流路と、前記被検出体を前記ナノ流路内で移動させる被検出体移動部と、前記ナノスリットと前記ナノ流路との交差点で前記ナノスリットを介して前記ナノ流路に照射された前記励起光で励起された前記被検出体が発する蛍光の量に応じ、信号を出力する蛍光検出部と、前記蛍光検出部からの前記信号と閾値を比較し、前記ナノスリットと前記ナノ流路の交差点を移動した前記被検出体の個体数を計測する被検出体数計測部と、を有し、前記励起光は、前記ナノスリットの長手方向と平行な直線偏光の光である。

上記により、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質等の生体分子の個体数を高感度、高信頼性、高スループット、かつ安価に計測することが可能な蛍光体検出装置、及び蛍光体検出方法を実現できる。

実施の形態１における蛍光検出装置の概略図 実施の形態１における光強度分布シミュレーション（平行）図 実施の形態１における光強度分布シミュレーション（垂直）図 実施の形態１における蛍光検出方法の工程図 実施の形態２におけるマイクロチップの概略図

（本発明の一態様に至った経緯）
例えば、蛍光法により生体分子の挙動を一分子レベルから高感度に観察するためには、励起光照射体積を減少させ、背景光を低減する必要性が生じる。

上記特許文献１では、微少開口から漏れ出てくるエバネッセント場を利用して、励起光照射領域を低減し、蛍光検出の感度を上げている。しかしながら、微小開口近傍のみの蛍光性生体分子が観測されるため、蛍光性生体分子の観測確率が不定となり、検出感度の低下や検出時間の増大を招いてしまう。即ち、被検出体の定量的な評価には検量線が必要となり、生体分子の個体数を高感度に検出することができない。

また、蛍光性生体分子を含む水溶液は、微少開口膜とカバーガラスの間に保持されただけであり、微少開口の領域内部には複数の生体分子が存在する。即ち、背景光を低減することができない。

その上、上記特許文献２及び特許文献３では、微少開口近傍に被検出体と特異的に反応する反応物質を予め固定化しておく必要があるため、装置コストが上昇するだけでなく、再利用が難しくなる。

さらに、特許文献４では、ラマン散乱光を用いて励起光照射体積を減少させ、ナノポアを用いて背景光を低減させている。しかしながら、ナノポアと電場増強のための突起構造を数ｎｍレベルで位置合わせをする必要があり、またその突起構造自体も数ｎｍの加工精度が要求され、作製が非常に困難でかつ高コストになってしまう。即ち、生体分子の個体数を高感度、高信頼性、高スループット、かつ安価に計測することができない。

以上の検討を踏まえて、本発明者は、以下の本発明の一態様を想到するに至った。

即ち、本発明の一態様に係る蛍光検出装置は、励起光の照射により蛍光を発する被検出体の数を計測するための蛍光検出装置であって、前記励起光を出射する励起光光源と、長手方向と短手方向とを有し前記短手方向の幅が前記励起光の波長より狭いナノスリットを有する遮光膜と、前記遮光膜上で前記光源と反対側に位置し、前記ナノスリットの前記長手方向と交差し、かつ断面の幅及び高さのいずれもが前記ナノスリットの幅以下であるナノ流路と、前記被検出体を前記ナノ流路内で移動させる被検出体移動部と、前記ナノスリットと前記ナノ流路との交差点で前記ナノスリットを介して前記ナノ流路に照射された前記励起光で励起された前記被検出体が発する蛍光の量に応じ、信号を出力する蛍光検出部と、前記蛍光検出部からの前記信号と閾値を比較し、前記ナノスリットと前記ナノ流路の交差点を移動した前記被検出体の個体数を計測する被検出体数計測部と、を有し、前記励起光は、前記ナノスリットの長手方向と平行な直線偏光の光である。

これにより、試料の濃縮やＰＣＲ法という複雑な工程を経ることなしに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質等の生体分子の個体数を高感度に検出し、かつ検量線不要で定量的に評価することができる。即ち、直線偏光を利用することで、効果的に励起光がナノスリット近傍に局在することができ、ナノ流路との交差点において被検出体の蛍光を検出し、個体数を計測することができる。また、ナノ開口近傍に被検出体と特異的に反応する反応物質を予め固定化しておく必要がないため、装置を低コスト化できるだけでなく、再利用できるため、μＴＡＳのような使い捨てに適した微細なマイクロチップ構造の検出器にも適用することができる。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、以下に述べる実施の形態は、本発明の好適な実施の形態であるから技術的に好ましい種々の限定が付与されているが、本発明の適用の範囲は、以下の説明において特に本発明を限定する旨の記載が無い限り、これらの態様に限られるものではない。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における蛍光検出装置の概略図である。蛍光検出装置は、大きく分けて励起光光源１０１、マイクロチップ１０３、蛍光検出部１１０、被検出体数計測部１１１、被検出体移動部１１２から構成されている。更にマイクロチップ１０３は、基板Ａ１０４ａ、基板Ｂ１０４ｂ、遮光膜１０５、遮光膜１０５内のナノスリット１０６、ナノ流路１０７から構成されており、被検出体１０８はナノ流路１０７内を移動する構成となっている。ただし、マイクロチップ１０３の構成要素はこれに限定されない。例えば、被検出体移動部１１２を含んだ構成となっていてもよいし、基板Ｂ１０４ｂとナノ流路１０７だけで構成されていてもよい。また、基板Ｂ１０４ｂ、遮光膜１０５、ナノスリット１０６、ナノ流路１０７で構成されていてもよい。

検出目的の生体分子はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、マイクロリボ核酸）とした。ｍｉＲＮＡとは細胞内に存在する長さ１８から２５塩基程のＲＮＡであり、特定のｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を認識し、ポリＡ鎖の分解と翻訳の抑制を引き起こし、癌の発症や記憶の形成などの生命現象に関与していると考えられる生体分子である。ただし、ｍｉＲＮＡ単体では蛍光発光しないため、被検出体１０８となりえない。そのため、本態様においては、目的ｍｉＲＮＡと人工核酸との二本鎖を被検出体１０８として用いた。この人工核酸は目的ｍｉＲＮＡを認識し、二本鎖として結合する他、二本鎖状態の時のみ蛍光発光するものである。これらの人工核酸は、例えば、ＷＯ２００８−１１１４８５号公報で示される人工核酸が適当である。

励起光光源１０１は波長５１４ｎｍのＡｒイオンレーザー光源を使用した。ただし、光源は蛍光に合わせて波長選択すればよく、ＬＥＤ光源等の帯域の広い光源であってもよいし、複数の波長を発する光源であってもよい。更には蛍光の励起が可能なのであれば白色光源でも構わない。ただし、励起光の光源は直線偏光が望ましい。直線偏光でない場合、波長板や偏光フィルタにより直線偏光にすることが望ましい。

また、励起光１０２は必ずしも連続光である必要はなく、パルス変調されていてもよい。被検出体１０８へ照射する励起光１０２を短時間とすることで、蛍光の退色を抑制することが可能となる。

励起光光源１０１より出射した励起光１０２はガラス製の基板Ａ１０４ａを介し、ナノスリット１０６に照射される。このとき、ナノスリット１０６は長手方向と短手方向とを有し、ナノスリット１０６の短手方向の幅は励起光１０２の波長より狭いため、励起光１０２は遮光膜１０５を完全に通過することなくナノスリット１０６近傍にて、局所的に存在する。

なお、基板Ａ１０４ａの材料は励起光１０２に対して、基板Ｂ１０４ｂの材料は蛍光１０９に対して透明な材料であればよく、例えば、前記ガラスの他、石英等の無機材料やポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の透明樹脂でもよい。しかしながら、本態様はこの材料に限定されない。また、基板Ａ１０４ａは無くともよいし、基板Ａ１０４ａと基板Ｂ１０４ｂの材料は同じである必要もない。

遮光膜１０５の材料はアルミニウムとしたが、励起光１０２に対して不透明であればよく、励起光１０２を十分遮光することができる材料であればよい。金属は消衰係数が高いため、遮光性が高く、必要な膜厚を薄くすることが可能でることから、遮光膜１０５の材料としては金属が望ましい。アルミニウムの他には、例えば、金、銀、クロム、白金、ゲルマニウム、タングステン等の金属があるが、本態様はこれらの材料に限定されるものではなく、また複数種の金属からなる合金であってもよい。

遮光膜１０５の厚みは６０ｎｍとした。薄すぎると励起光１０２を十分遮光出来ないため、ナノスリット１０６とナノ流路１０７の交差点以外でも被検出体１０８が蛍光を発しノイズとなってしまうし、厚すぎるとナノスリット１０６近傍で局在する励起光１０２がナノ流路１０７に届かなくなってしまう。遮光膜１０５の材料によっても異なるが、遮光膜１０５の厚みは２０ｎｍから２００ｎｍ程度が望ましい。しかしながら、本態様はこれに限定されない。

ナノスリット１０６の短手方向の幅は２００ｎｍとしたが、特にこれに限定されるものではなく、ナノスリット１０６の短手方向の幅は励起光１０２の最短波長より短ければよい。よって、励起光の最短波長は、例えば、３５０ｎｍから７５０ｎｍが望ましい。これにより、可視光域の蛍光を効率よく検出することができる。ここで、ナノスリット１０６の短手方向の幅が励起光１０２の最短波長に近すぎると複数の被検出体１０８に同時にナノスリット１０６近傍で局在する励起光１０２が照射されてしまう可能性が高くなり、逆に狭すぎるとナノスリット１０６近傍で局在する励起光１０２でナノ流路１０７を覆うことができず、被検出体１０８の蛍光発光ができなくなる可能性が高くなる。ナノスリット１０６の短手方向の幅は被検出体１０８、ナノ流路１０７に合わせて調整することができる。また、ナノスリット１０６の長手方向の幅は特に限定はない。

励起光１０２の遮光膜１０５への入射は、必ずしも垂直入射である必要はないし、平行光である必要もない。装置の構成により、適当な入射とすることが可能である。

ナノスリット１０６はガラスで充填しているが、本態様はこれに限定されず、励起光１０２に対して透明な他の材料で充填していてもよく、例えば、石英等の無機材料やポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の透明樹脂でもよい。これにより、遮光膜１０５とナノスリット１０６の表面の凹凸を抑制し、平滑性を向上させることができ、ナノ流路１０７内の被検出体１０８の移動を妨げることなく、スムーズに蛍光を検出することができる。

ナノスリット１０６の断面形状は四角形であるが、本態様はこれに限定されない。角が丸まった形状でも構わないし、円を含めた楕円形状でも、台形形状であっても構わない。

次に、ナノスリット１０６近傍で局在する励起光１０２はナノ流路１０７を覆い、ナノ流路１０７内を移動する被検出体１０８に照射される。ナノ流路１０７は幅、高さ共に１００ｎｍとした。ここでナノ流路１０７の幅とは遮光膜１０５に対して垂直でナノスリット１０６と平行な面でナノ流路１０７の断面図を得た際、遮光膜１０５と平行な方向の最大長さであり、ナノ流路１０７の高さとは前記断面図において、遮光膜１０５と垂直な方向の最大長さである。

なお、ナノ流路１０７の幅、高さは両方がナノスリット１０６の短手方向の幅よりも狭く、かつ被検出体１０８が十分通過することのできる幅、高さであれば、本態様では特に限定はされない。ただし、ナノスリット１０６近傍で局在する励起光１０２はナノスリット１０６から離れるに従い指数関数的に減少するため、ナノ流路１０７の高さは可能な限り小さい方が望ましく、３０ｎｍから１５０ｎｍが望ましい。

ナノ流路１０７の前記断面形状は四角形であるが、本態様においては特に限定されない。角の丸まった形状でも構わないし、円を含めた楕円形状でも、台形形状であっても構わない。

遮光膜１０５に垂直な方向からマイクロチップ１０３を見たとき、ナノスリット１０６とナノ流路１０７は単に交差していればよく、必ずしも直角に交差している必要はない。

遮光膜１０５とナノ流路１０７は必ずしも直接接する必要はなく、間に薄膜があってもよい。これによって、遮光膜１０５の腐食防止が可能となる。ただし、膜厚が厚すぎるとナノスリット１０６近傍で局在する励起光１０２が減衰してしまい、ナノ流路１０７まで届かなくなってしまう。

ナノ流路１０７の内面は被検出体１０８が意図せず付着しないように表面コート処理、例えば、疎水処理や親水処理をしていても良い。

被検出体１０８は励起光１０２が照射されると波長約５４０ｎｍの蛍光１０９を発する。蛍光１０９は蛍光検出部１１０によって検出され、蛍光検出部１１０は蛍光強度に応じた信号を出力する。

本態様においては、蛍光検出部１１０は、蛍光１０９を集光する対物レンズ１１０ａと、励起光１０２を遮光し、蛍光１０９を通過させる機能を有する光学フィルタ１１０ｂと、像を結像する結像レンズ１１０ｃと蛍光強度を評価するディテクタ１１０ｄから成り立っている。

以上の本実施の形態１の構成において、ＦＤＴＤ法（Ｐｏｙｎｔｉｎｇ、富士通株式会社製）を用い、直線偏光の励起光の光強度分布に関して、シミュレートを行った。図２、図３に結果を示す。図２、図３はそれぞれ、図１のナノ流路１０７の中心を通り、ナノ流路１０７に沿った線で切った断面図である。ここで、図１と同じ構成要素については同じ符号を用い、説明を省略する。図２は励起光１０２をナノスリット１０６の長手方向と平行な直線偏光とした場合、図３は励起光１０２をナノスリット１０６の長手方向と垂直な直線偏光とした場合のシミュレーション図である。曲線は光強度が同一の等高線図を示している。

２つの図から分かるように、励起光１０２は遮光膜１０５で遮られ、ナノ流路１０７にはナノスリット１０６近傍で局在する励起光１０２で照射されている。このことはつまり、励起光照射体積を少なくすることが出来ているということであり、その結果、Ｓ／Ｎよく蛍光１０９を検出することが可能となっている。

なお、ナノ流路１０７における励起光１０２の光強度は、図２の励起光１０２の偏光方向がナノスリット１０６の長手方向と平行である方が、図３の垂直な直線偏光よりも強い。即ち、本態様においては、直線偏光の励起光１０２の偏光はナノスリット１０６の長手方向と平行にすることが望ましい。これにより、励起光１０２にて最も効率良くナノ流路１０７を覆うことが可能となる。即ち、励起光のパワーを最小にすることができる。

本態様において検出する被検出体１０８は、励起光１０２を受けて蛍光発光する。しかしながら、ナノ流路１０７を通過できる被検出体１０８は分子が小さい。上述の通り、望ましいナノ流路１０７の高さは３０ｎｍから１５０ｎｍであるため、これより小さな分子に限られる。小さな分子に対して広範囲に励起光１０２を当てても、微弱な蛍光しか得られないためＳ／Ｎよく検出することができず、被検出体１０８の個体数を計測することができない。また、励起光１０２が弱い場合は十分な蛍光を確保できず、検出には不十分である。図２に示すように、励起光１０２の偏光方向をナノスリット１０６の長手方向と平行にすることによって、ナノスリット１０６を通過した励起光１０２は微小領域を効果的に照射できることを見出した。これにより、ナノ流路１０７を通過する被検出体１０８の個体数の計測に成功するに至った。

以上のように、単に光を当てるのではなく、直線偏光を利用してスリットを通過させることによって、最小の励起光パワーで蛍光を検出することができ、小さな分子の被検出体１０８を効率よく計測することができる。

なお、本態様において、遮光膜１０５の膜厚は非常に薄いため、励起光１０２が遮光膜１０５を僅かながら透過する場合がある。そのため、本態様においては光学フィルタ１１０ｂを使用して、励起光１０２を完全に遮光しているが、本態様において、光学フィルタ１１０ｂは必須ではない。光学フィルタ１１０ｂは使用しなくともよいし、分光技術で代替してもよい。また、光学系もこれに限定されない。蛍光検出部１１０は、被検出体１０８より発せられた蛍光１０９を強度に応じて出力出来れば、その構成は問わない。

図４に、本態様における蛍光検出方法のブロック図の一例を示す。ナノ流路１０７内を移動し、ナノスリット１０６とナノ流路１０７との交差点で被検出体１０８が発する蛍光１０９は、蛍光検出部１１０で検出され、蛍光の量に応じた信号を検出信号として出力する。被検出体数計測部１１１は、蛍光検出部１１０からの信号出力と閾値を比較（閾値比較１１１ａ）し、被検出体の個体数を計測（被検出体数計測１１１ｂ）して出力部１１３に出力する。以上のようにして、検出目的のｍｉＲＮＡと人工核酸の二本鎖から成る被検出体１０８の個体数を計測する。このとき、検出目的外のｍｉＲＮＡや結合していない余分な人工核酸は蛍光を発することがないため、検出目的のｍｉＲＮＡのみが計測可能である。

なお、本態様においては、Ｓ／Ｎの関係上、閾値は１つ、つまり被検出体１０８の有無のみを検出することが最も好ましいが、可能であるならば閾値を複数とし、複数の被検出体１０８を同時に検出、計測しても構わない。

また、被検出体１０８を計測している際、被検出体１０８は被検出体移動部１１２によって、ナノ流路１０７内を移動する。本態様においては、被検出体移動部１１２としてはポンプ技術を用いたが、電気泳動等の技術を用いても構わない。本態様では特に移動部は限定されない。

本態様は、複数種の被検出体１０８を同時に検出、計測可能である。この場合、被検出体１０８であるｍｉＲＮＡと人工核酸の二本鎖は、種類毎に異なる色の蛍光を発することができる。また、励起光光源１０１もそれに合わせた波長を有する光源とし、光学フィルタ１１０ｂをプリズムまたはグレーティング素子で置き換え、ディテクタ１１０ｄをライン型のイメージセンサとすることで、各色、つまり各種の被検出体１０８の個体数をそれぞれ同時に計測することが可能となる。その他の方法としては、分光せずにカラーイメージセンサで色情報も同時に評価することで計測を可能とする方法や、励起光光源１０１を波長可変とし、時間毎に異なる波長の励起光１０２を出射することで計測を可能とする方法がある。ただし後者の方法の場合は被検出体１０８がナノスリット１０６上を通過する時間内に、被検出体１０８に対応する全ての波長の励起光１０２を照射しなければならない注意点がある。しかしながら、本態様はこれらの方法に限定されず、異なる構成の蛍光検出部１１０であってもよい。

なお、本態様においては、マイクロチップ１０３は容易に交換可能である。マイクロチップ１０３は既存の製造技術、例えばＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）作製技術や半導体作製技術を用い、大量生産することが可能であるため、非常に安価に製造することができる。

マイクロチップ１０３の製造方法としては、例えば、基板Ａ１０４ａ上にナノスリット１０６を有する遮光膜１０５を形成した後、ナノ流路１０７を形成し、基板Ｂ１０４ｂで覆うことができる。また、基板Ａ１０４ａ上にナノスリット１０６を有する遮光膜１０５を形成した基板Ａ１０４ａと、ナノ流路１０７を形成した基板Ｂ１０４ｂを貼り合わせて形成することもできる。

特に本態様においては、ナノスリット１０６とナノ流路１０７が交差する構造であるため作製時に厳密な位置合わせ工程が不要であることから、低コストでの製造を実現することができる。

また、マイクロチップ１０３内で生体分子の固定化は行わないため、再利用も容易に可能である。

（実施の形態２）
図５は、本発明の実施の形態２におけるマイクロチップ５０１である。マイクロチップ５０１内の構成要素は実施の形態１におけるマイクロチップ１０３内と同じである。異なる点はナノ流路（５０２Ａ〜５０２Ｄ）とナノスリット（５０３ａ〜５０３ｄ）が複数（４本ずつ）ある点である。また蛍光検出部等の装置の他の要素についても、実施の形態１と基本的に同じである。そのため、マイクロチップ５０１以外の要素については図を省略し、図１を元に説明する。

なお、本態様においては、ナノ流路５０２とナノスリット５０３の本数、配置の形状は特に限定されない。例えば、ナノ流路５０２が放射状に配置され、ナノスリット５０３が円弧状となっていても、本態様は適用可能である。

また、本態様においては、ナノスリット５０３は全てのナノ流路５０２と交差している必要はない。１本のナノ流路５０２のみと交差するナノスリット５０３があってもよい。

ただし、複数あるナノ流路５０２とナノスリット５０３の交差点間の距離は全て蛍光検出部１１０の光学分解能以上の距離とする点である。このようにすることで、個々の交差点で発する蛍光１０９を精度良く計測することが可能となる。

また、本態様においては、蛍光検出部１１０のディテクタ１１０ｄは２次元イメージセンサで構成されている。このようにすることで、個々の交差点で発する蛍光１０９をそれぞれ同時に検出可能となる。

実施の形態２は、実施の形態１と比較し、２つの点で優れる。１つめは、ナノ流路５０２が複数存在するため、計測のスループットが向上する点である。例えば、ナノ流路５０２の間隔を０．８μｍ、蛍光検出部１１０の視野を２．０ｍｍ径、分解能０．５μｍとし、視野の８割で蛍光検出が可能であるとすると、２０００本のナノ流路を一度に蛍光検出可能となる。これはつまり、スループットが２０００倍になることを意味する。

２つめは、同一ナノ流路２０２において複数のナノスリット５０３があるため、検出の精度を向上させることができる点である。精度を向上させる手法については、いくつか考えられる。例えば、個々の交差点で計測した被検出体１０８の個体数の平均を真の被検出体１０８の個体数としたり、個々の交差点での蛍光検出部１１０の出力を合計し、閾値で除算することで、被検出体１０８の個体数としたりすることも出来る。本態様はこれら方法に限定されない。

本発明にかかる蛍光検出装置は、微小な蛍光体の個体数を高感度、高信頼性、高スループット、かつ安価に計測する蛍光検出装置として有用である。また、蛍光体と特定ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質等の生体分子を関連づけることで、サンプル内の特定の生体分子数を計測するバイオ分野、医療分野への用途にも応用可能である。

１０１ 励起光光源
１０２ 励起光
１０３，５０１ マイクロチップ
１０４ａ 基板Ａ
１０４ｂ 基板Ｂ
１０５ 遮光膜
１０６，５０３，５０３ａ〜５０３ｄ ナノスリット
１０７，５０２，５０２ａ〜５０２ｄ ナノ流路
１０８ 被検出体
１０９ 蛍光
１１０ 蛍光検出部
１１０ａ 対物レンズ
１１０ｂ 光学フィルタ
１１０ｃ 結像レンズ
１１０ｄ ディテクタ
１１１ 被検出体数計測部
１１１ａ 閾値比較
１１１ｂ 被検出体数計測
１１２ 被検出体移動部
１１３ 出力部

Claims (9)

1. 励起光の照射により蛍光を発する被検出体の個体数を計測するための蛍光検出装置であって、
   前記励起光を出射する励起光光源と、
   長手方向と短手方向とを有し前記短手方向の幅が前記励起光の波長より狭いナノスリットを有する遮光膜と、
   前記遮光膜上で前記光源と反対側に位置し、前記ナノスリットの前記長手方向と交差し、かつ断面の幅及び高さのいずれもが前記ナノスリットの前記短手方向の幅以下であるナノ流路と、
   前記被検出体を前記ナノ流路内で移動させる被検出体移動部と、
   前記ナノスリットと前記ナノ流路との交差点で前記ナノスリットを介して前記ナノ流路に照射された前記励起光で励起された前記被検出体が発する蛍光の量に応じ、信号を出力する蛍光検出部と、
   前記蛍光検出部からの前記信号と閾値を比較し、前記ナノスリットと前記ナノ流路の交差点を移動した前記被検出体の個体数を計測する被検出体数計測部と、を有し、
   前記励起光は、前記ナノスリットの長手方向と平行な直線偏光の光である、
   蛍光検出装置。
2. 前記遮光膜は、前記励起光に対して不透明な膜である、
   請求項１記載の蛍光検出装置。
3. 前記遮光膜は金属である、
   請求項１記載の蛍光検出装置。
4. 前記励起光の波長は、３５０ｎｍから７５０ｎｍである、
   請求項１記載の蛍光検出装置。
5. 前記ナノ流路の断面の幅及び高さは、各々３０ｎｍから１５０ｎｍである、
   請求項１記載の蛍光検出装置。
6. 前記ナノスリットは、前記励起光に対して透明な材料で充填されている、
   請求項１記載の蛍光検出装置。
7. 前記ナノスリットと前記ナノ流路の前記交差点が複数あり、
   前記交差点間の距離は、前記蛍光検出部の分解能以上であり、
   前記蛍光検出部は前記複数の交差点から前記蛍光を同時に検出する、
   請求項１から請求項６のいずれか一に記載の蛍光検出装置。
8. 前記被検出体は異なる波長の蛍光を発する複数種からなり、
   前記励起光光源は前記複数種のそれぞれの前記被検出体に適した複数の励起光を出射し、
   前記蛍光検出部は複数種のそれぞれの前記被検出体が発する蛍光の量と波長に応じた信号を出力し、
   前記被検出体数計測部は前記蛍光検出部からの前記信号を元に、前記ナノスリットと前記ナノ流路の交差点を移動したそれぞれの前記被検出体の個体数を計測する、
   請求項１から請求項７のいずれか一に記載の蛍光検出装置。
9. 励起光を出射する励起光光源と、長手方向と短手方向とを有し前記短手方向の幅が前記励起光の波長より狭いナノスリットを有する遮光膜と、
   前記遮光膜上で前記光源と反対側に位置し前記ナノスリットの前記長手方向と交差しかつ断面の幅及び高さのいずれもが前記ナノスリットの前記短手方向の幅以下であるナノ流路と、を有する蛍光検出装置を用いた蛍光検出方法であって、
   前記被検出体を前記ナノ流路内で移動させ、
   前記ナノスリットと前記ナノ流路との交差点で前記ナノスリットを介して前記ナノ流路に照射された励起光で励起された前記被検出体が発する蛍光の量に応じた信号を出力し、
   前記蛍光検出部からの前記信号と閾値を比較し、前記ナノスリットと前記ナノ流路の交差点を移動した前記被検出体の個体数を計測し、
   前記励起光は、前記ナノスリットの長手方向と平行な直線偏光の光である、
   蛍光検出方法。

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