WO2011043202A1 - 表面プラズモン増強蛍光測定装置 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS; Surface fieldmonenhanced Fluorescence Spectroscopy).
- SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
- SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
- Such a surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus 10 has a basic structure as shown in FIG. 11 and has a chip structure in which a metal thin film 102 is provided on the surface of a dielectric member 106 and a reaction layer 104 is provided on the surface. 108 is provided.
- the chip structure 108 includes a light source 112 that is incident on the dielectric member 106 and irradiates the excitation light b1 toward the metal thin film 102 on the dielectric member 106 side.
- the light receiving means 116 for receiving the metal thin film reflected light b2 reflected at is provided.
- a light detection means 120 for receiving the fluorescence b3 emitted from the fluorescent substance labeled with the analyte captured by the reaction layer 104 is provided.
- the condensing member 122 for condensing the fluorescence b3 efficiently and the light contained other than the fluorescence b3 are removed, and only the necessary fluorescence is selected.
- a filter 124 is provided.
- a primary antibody that specifically binds to an antigen contained in an analyte such as DNA to be detected is immobilized in advance on the surface of the metal thin film 102.
- An analyte and a secondary antibody that specifically binds to the analyte are sequentially fed to the reaction layer 104 in contact with the metal thin film 102, and the secondary antibody is captured by the reaction layer 104.
- the secondary antibody captured together with the analyte is labeled with a fluorescent substance.
- the trapped reaction layer 104 is irradiated with the excitation light b1 from the light source 112 into the dielectric member 106, and this excitation light b1 is incident on the metal thin film 102 at a specific angle (resonance angle) ⁇ 1. In this way, a dense wave (surface plasmon) is generated. In addition, when a close-packed wave (surface plasmon) is generated on the metal thin film 102, the excitation light b1 and the electronic vibration in the metal thin film 102 are coupled, resulting in a phenomenon that the light amount of the metal thin film reflected light b2 is reduced.
- the light receiving means 116 and the light source 112 are paired and rotated around the irradiation region of the metal thin film 102, and the incident angle to the metal thin film 102 can be changed.
- the incident angle is changed and a point where the signal of the metal thin film reflected light b2 received by the light receiving means 116 is changed (the amount of light is reduced) is found, a resonance angle ⁇ 1 at which a dense wave (surface plasmon) is generated is obtained. Can do.
- the signal of the metal thin film reflected light b2 received by the light receiving means 116 at that time changes (the amount of light decreases). Therefore, a dense wave (surface plasmon) is generated.
- the incident angle at which the amount of light is minimized or an angle near the incident angle can be obtained as the resonance angle ⁇ 1.
- the surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus 10 is a high-sensitivity measuring sensor that enables observation of minute molecular activities, particularly between biomolecules.
- the resonance angle scanning step of obtaining the resonance angle ⁇ 1 by changing the incident angle of the excitation light to the metal thin film 102 it is desirable that the irradiation range of the excitation light is inside the reaction region of the reaction layer 104.
- the detection step of detecting the analyte by irradiation with excitation light in order to capture the signal from the label with high sensitivity, it is desired to irradiate the entire reaction region, and both must be compatible. Was difficult.
- the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to perform both resonance angle scanning and detection of a labeled substance with high accuracy.
- a surface plasmon-enhanced fluorescence measuring device that is detected by a light detection means, A beam shape changing unit for changing the beam shape of the excitation light; A surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus comprising: control means for controlling the beam shape changing unit.
- the control means controls the beam shape changing unit to change the beam shape of the excitation light, thereby expanding and reducing the irradiation area of the excitation light to the metal thin film, 2.
- the surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus according to 1 above, wherein the irradiation region in the detection step for detecting the fluorescent substance is wider than the irradiation region in the resonance angle scanning step for detecting the resonance angle.
- the irradiation area at the time of the resonance angle scanning process is a partial area in the area of the reaction layer, and the irradiation area at the time of the detection process is an area that covers the reaction layer.
- Surface plasmon enhanced fluorescence measurement device is a partial area in the area of the reaction layer, and the irradiation area at the time of the detection process is an area that covers the reaction layer.
- the reaction layer has a flow path through which a reagent solution containing a sample solution and a fluorescent material is sent
- the control means is configured such that an irradiation area of the excitation light irradiated for detecting a liquid-feeding state in a liquid-feeding process in which a sample liquid and a reagent liquid are fed to the reaction layer is more than an irradiation area at the time of the detection process.
- the surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus according to 2 or 3, wherein the surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus is controlled so as to be wide.
- the control means controls the beam shape changing unit,
- the irradiation area at the time of the resonance angle scanning step is a part of the area of the reaction layer,
- the irradiation region at the time of the detection step is substantially matched with the region of the reaction layer,
- the irradiation area at the time of the liquid feeding process in which the sample liquid and the reagent liquid are fed to the reaction layer is an area that spans the inside and outside of the area of the reaction layer.
- the excitation light irradiation region on the metal thin film is controlled to be constant by changing the beam shape of the excitation light by the beam shape changing unit in accordance with the change of the incident angle. 6.
- the surface plasmon enhanced fluorescence measurement apparatus according to any one of 1 to 5 above.
- both the resonance angle scan and the detection of the target substance can be accurately performed.
- FIG. 2A is a cross-sectional view around the microchip 14, and FIG. 2B is a top view of a part thereof.
- FIG. 3 is a schematic diagram showing a beam shape changing unit 130a using a diaphragm mechanism. It is a schematic diagram which shows the beam shape change part 130b using a beam expander. It is a schematic diagram which shows the beam shape change part 130c using a zoom lens. It is a figure which shows the control flow performed by the control means.
- FIG. 7A is a schematic diagram showing the positional relationship between the excitation light b13 and the reaction layer 104 in the resonance angle scanning process, and FIG.
- FIG. 7B shows the cross-sectional shape of the excitation light b12 after the beam shape change in the process. It is a schematic diagram shown.
- FIG. 8A is a schematic diagram showing a positional relationship between the excitation light b13 and the reaction layer 104 in the detection process for detecting the analyte
- FIG. 8B is an excitation light b12 after the beam shape change in the same process. It is a schematic diagram which shows the cross-sectional shape.
- FIG. 9A and FIG. 9B are modifications of FIG. 8A and FIG. 8B, respectively.
- FIG. 10C shows a modification using a dielectric member 106 having a semicircular cross section.
- 10 (a) and 10 (b) are diagrams corresponding to FIGS. 7 (a) and 7 (b), respectively. It is the schematic of the conventional surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus.
- FIG. 1 and 2 are schematic views of a surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus according to an embodiment.
- Surface plasmon-enhanced fluorescence measurement device accurately detects the fluorescence generated by the excited fluorescent material by irradiating a metal thin film with excitation light to generate a rough wave (surface plasmon), and it is extremely accurate even if the detection sensitivity is increased. It is possible to detect fluorescence.
- the surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus 10 of the present invention includes a metal thin film 102, a reaction layer 104 formed on one side surface of the metal thin film 102, and a dielectric member formed on the other side surface. 106, and a chip structure 108 having the same.
- the chip structure 108 includes a light source 112 that is incident on the dielectric member 106 and irradiates the excitation light b1 toward the metal thin film 102 on the dielectric member 106 side.
- the light receiving means 116 for receiving the metal thin film reflected light b2 reflected on the light is provided.
- the excitation light b1 emitted from the light source 112 is preferably a laser beam, and a gas laser or a solid-state laser having a wavelength of 200 to 1000 nm and a semiconductor laser having a wavelength of 385 to 800 nm are preferable.
- the beam shape of the excitation light b ⁇ b> 1 irradiated from the light source is changed by the beam shape changing unit 130.
- excitation light b 11 and excitation light b 12 respectively, which pass through the inside of the dielectric member 106 and pass through the metal thin film.
- the excitation light applied to 102 is referred to as excitation light b13.
- excitation light b1 An irradiation range of the excitation light b13 on the metal thin film 102 is referred to as an irradiation region b131 (see FIG. 7 and the like).
- the configuration of the beam shape changing unit 130 will be described later.
- a light detection means 120 for receiving the fluorescence b3 generated in the reaction layer 104 is provided.
- the light detecting means 120 it is preferable to use an ultrasensitive photomultiplier tube or a CCD image sensor capable of multipoint measurement.
- the control unit 13 includes a CPU and a memory, and controls each device such as the light source 112, the beam shape changing unit 130, the light receiving unit 116, and the light detecting unit 120 by executing a program stored in the memory. .
- a light collecting member 122 for efficiently collecting light, and transmission of light having a wavelength different from the fluorescence b3 in the light.
- a filter 124 formed so as to selectively transmit the fluorescence b3.
- any condensing system may be used as long as it aims at efficiently condensing the fluorescent signal on the light detecting means 120.
- a simple condensing system a commercially available objective lens used in a microscope or the like may be used. The magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
- the filter 124 an optical filter, a cut filter, or the like can be used.
- the optical filter include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens.
- the cut filter includes external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), and plasmon scattering light (excitation light originated from plasmon A filter that removes various types of noise light such as scattered light generated by the influence of structures or deposits on the surface of the excitation sensor) and autofluorescence of the enzyme fluorescent substrate, such as an interference filter and a color filter.
- a SAM film Self-Assembled Monolayer: conjugated with a primary antibody on the surface of the metal thin film 102 in contact with the reaction layer 104 is used. (Also referred to as “self-assembled monolayer”) or a polymer material film.
- the primary antibody is bound to one surface of the SAM film or the polymer material film, and the other surface of the SAM film or the polymer material film is directly or indirectly fixed to the surface of the metal thin film 102.
- SAM film examples include a film formed of a substituted aliphatic thiol such as HOOC— (CH 2 ) 11 —SH, and examples of the polymer material include polyethylene glycol and MPC polymer. This may be prepared at the time of use, or a substrate on which these are bonded in advance may be used. Alternatively, a polymer having a reactive group for the primary antibody (or a functional group that can be converted into a reactive group) may be directly immobilized on the substrate, and the primary antibody may be immobilized thereon. When an antibody or a polymer is bound using various reactive groups, an amidation condensation reaction through succinimidylation, an addition reaction through maleimidation, or the like is common.
- a substituted aliphatic thiol such as HOOC— (CH 2 ) 11 —SH
- the polymer material examples include polyethylene glycol and MPC polymer. This may be prepared at the time of use, or a substrate on which these are bonded in advance may be used. Alternatively,
- a solution containing the analyte antigen as the target substance (hereinafter also referred to as a specimen liquid) and a reagent liquid containing the secondary antibody are fed to the reaction layer 104 thus configured.
- the antigen can be captured by the immobilized primary antibody.
- the captured antigen is labeled by the action of a reagent solution containing a secondary antibody labeled with a fluorescent substance.
- the primary antibody may be allowed to act after the antigen and the secondary antibody have been reacted in advance.
- the excitation light b1 is irradiated to the dielectric member 106 from the light source 112 to the reaction layer 104 where the analyte is captured, and the excitation light b1
- a specific incident angle (resonance angle ⁇ 1) with respect to the thin film 102
- a dense wave surface plasmon
- the fluorescent material generated in the reaction layer 104 on the metal thin film 102 is efficiently excited, thereby increasing the amount of fluorescent b3 emitted from the fluorescent material and condensing this fluorescent b3.
- the light detection means 120 By receiving light by the light detection means 120 through the member 122 and the filter 124, an extremely small amount and / or extremely low concentration of the analyte can be detected.
- the material of the metal thin film 102 of the chip structure 108 is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably made of gold. It consists of a metal alloy.
- Such a metal is suitable for the metal thin film 102 because the electric field enhancement due to close-packed waves (surface plasmons) increases.
- examples of the method for forming the metal thin film 102 include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like.
- the sputtering method and the vapor deposition method are preferable because the thin film formation conditions can be easily adjusted.
- the thickness of the metal thin film 102 ranges from gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm. It is preferable to be within.
- the thickness of the metal thin film 102 is within the above range, close-packed waves (surface plasmons) are easily generated, which is preferable. Moreover, as long as the metal thin film 102 has such a thickness, the size (length ⁇ width) is not particularly limited.
- FIG. 2A is a cross-sectional view of the chip structure 108
- FIG. 2B is a top view of a part thereof.
- the reaction layer 104 is provided on the surface layer of the metal thin film 102 on the lower layer side in the channel 143 provided in the quartz substrate 142. It is provided in the path of the quartz substrate 142.
- the quartz substrate 142 is supported by a fixture 141.
- a reagent solution containing a secondary antibody labeled with a fluorescent substance and a sample solution containing an analyte are sent to the channel 143 by a pump (not shown).
- Samples include blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, stool, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.).
- the analyte contained in the sample is, for example, nucleic acid (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid), etc., or nucleoside, nucleotide And modified molecules thereof), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules and complexes thereof.
- it may be a carcinoembryonic antigen such as AFP ( ⁇ -fetoprotein), a tumor marker, a signaling substance, a hormone, or the like, and is not particularly limited.
- the fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a substance that emits fluorescence b3 by being irradiated with predetermined excitation light b1 or excited by using the electric field effect.
- the fluorescence b3 as used in this specification includes various light emission, such as phosphorescence.
- a prism having an angle of 60 degrees made of a high refractive index material can be used.
- various optically transparent inorganic substances, natural polymers, and synthetic polymers can be used. From the viewpoint of chemical stability, production stability, and optical transparency, silicon dioxide (SiO 2 ). , Titanium dioxide (TiO 2 ), polycarbonate (PC), cycloolefin polymer (COP), optical polyester (OKP: manufactured by Osaka Gas Chemical Co., Ltd.), and the like can be used.
- such a surface plasmon enhanced fluorescence measurement apparatus 10 adjusts the optimum angle (resonance angle ⁇ 1) of surface plasmon resonance by the excitation light b1 irradiated from the light source 112 to the metal thin film 102, so that an angle variable unit (not shown). Z).
- the angle variable unit (not shown) is controlled by the control unit 13, and in the “resonance angle scanning process”, the light receiving unit 116 and the light source are used to determine the total reflection attenuation (ATR) condition by the servo motor of the angle variable unit. Synchronize with 112 and rotate around the irradiation area, and the angle can be changed in the range of 45 to 85 °.
- the resolution is preferably 0.01 ° or more.
- Beam shape change part] 3 to 5 are schematic views showing an embodiment of the beam shape changing unit 130.
- the beam shape changing units 130 a, 130 b, and 130 c (the collective name for these are the beam shape changing unit 130) are controlled by the control means 13.
- FIG. 3 is a schematic diagram showing a beam shape changing unit 130a using a diaphragm mechanism.
- the gear 131g meshes with a rack gear 107L formed on the throttle member drive rack 107.
- the gear 131g is pivotally supported by a boss formed on a frame (not shown).
- the gear 131g meshes with a gear portion 135g formed on the outer periphery of the aperture opening / closing ring 135.
- a shaft support hole 132 is formed in the diaphragm blade 131 and is pivotally supported by a boss formed in the diaphragm blade support ring 136 so as to be rotatable.
- a pin 133 is implanted in the diaphragm blade 131 and is inserted into a groove part 134 formed in the diaphragm opening / closing ring 135.
- FIG. 4 is a schematic diagram showing a beam shape changing unit 130b using a beam expander.
- the beam shape changing unit 130b that functions as a beam expander includes a first lens LS1 and a second lens LS2 in which a positive lens and a negative lens are cemented.
- the beam shape changing unit 130b shown in the figure moves the beam diameter of the excitation light b11 emitted from the light source 112 by moving at least one of the first lens and the second lens in the optical axis direction by a lens moving unit (not shown). It is possible to vary.
- FIG. 5 is a schematic diagram showing a beam shape changing unit 130c using a zoom lens.
- the beam shape changing unit 130c functioning as a zoom lens includes a first lens LS3 and a second lens LS4 having a shorter focal length than the first lens LS3, and has a predetermined value according to the ratio of the focal lengths of the two lenses.
- the beam diameter can be changed by the reduction ratio or the enlargement ratio.
- One lens is composed of a plurality of lens groups, a mechanism for moving one lens in the lens group in the optical axis direction is provided, and the enlargement / reduction ratio can be changed by changing the focal length of the lens group. It is good also as a structure.
- FIGS. 3 to 5 a combination of the configurations of FIGS. 3 to 5 may be used as the beam shape changing unit 130. 4 and 5, a spherical lens is used, but a vertical and horizontal enlargement / reduction ratio may be made different by applying a cylindrical lens.
- the structure of the beam shape change part shown in FIGS. 3-5 is an example, and is not limited to these. Any structure that can change the cross-sectional area, beam diameter, and other beam shapes may be used.
- FIG. 6 is a diagram showing a control flow executed by the control means 13.
- step S11 of FIG. 6 the beam shape changing unit 130 changes the shape of the excitation light b1 so as to have a preset beam shape.
- step S12 the resonance angle scanning process is executed with the beam shape changed in step S11.
- the beam shape set in step S11 is a beam shape optimized for the resonance angle scanning process, and will be described below with reference to FIG.
- FIG. 7A is a schematic diagram showing the positional relationship between the irradiation region b131 of the excitation light b13 on the metal thin film 102 and the reaction layer 104 in the resonance angle scanning step
- FIG. 7B shows the beam shape in the same step.
- It is a schematic diagram which shows the cross-sectional shape of excitation light b12 after a change.
- the resonance angle scanning process performed in step S12 is performed by synchronizing the light receiving means 116 and the light source 112, and swinging the incident angle on the metal thin film 102 to generate an incident angle (light receiving means 116, The position of the light source 112) is obtained.
- the resonance angle ⁇ 1 varies depending on the chemical state of the surface of the metal thin film 102.
- the beam shape of the excitation light b12 is preliminarily adjusted by the beam shape changing unit 130 so that the irradiation region b131 of the excitation light b13 is within the region of the reaction layer 104 within the change range of the incident angle in the resonance angle scanning process. We are trying to optimize. This will be described below.
- the dielectric member 106 has a 60-degree prism shape with one side of 25 mm.
- the size of the reaction layer 104 is 1.0 mm (Y direction) ⁇ 3.0 mm (X direction).
- the excitation light b1 is laser light having a wavelength of 633 nm, and the scan range of the incident angle of the excitation light b1 on the metal thin film 102 in the resonance angle scanning step is 79 ° ⁇ 3 °.
- the incident angle means an incident angle when there is no refraction due to incidence on the dielectric member 106.
- the incident angle of the excitation light b13 after bending of the optical path on the surface of the dielectric member 106 at an incident angle of 79 ⁇ 3 degrees is 70.48 to 74.32 degrees in calculation.
- the irradiation areas b131 of the excitation light b13 at the upper and lower limits of the scan range of the incident angle of 82 degrees and 76 degrees and the intermediate 79 degrees are indicated by x1, x3, and x2, respectively.
- the size and irradiation position of the irradiation region b131 of the excitation light b13 on the surface of the metal thin film 102 change with the change of the incident angle.
- the excitation light b12 in order for the irradiation region b131 of the excitation light b13 to be within the region (1.0 mm ⁇ 3.0 mm) of the reaction layer 104 in the scan range of the incident angle, the excitation light b12 is a circle having a diameter of ⁇ 0.3 mm. Can be calculated in advance.
- the control unit 13 controls the beam shape changing unit 130 to change the shape so as to obtain such a shape.
- the size of the irradiation region b131 on the surface of the metal thin film 102 of the excitation light b13 is 1.61 mm (X direction diameter) at x1 (82 degrees) and x3 (76 degrees). 0.918 mm (diameter in the X direction).
- the size and irradiation position of the irradiation region b131 of the excitation light b13 on the surface of the metal thin film change corresponding to the change in the incident angle of the excitation light.
- the beam shape of the excitation light b12 is changed by the beam shape changing unit 130 in accordance with the change of the incident angle so as to cancel out the change in the size of the above, so that It is possible to control so that the size of the irradiation region b131 of the excitation light b13 is constant.
- the excitation light is adjusted in accordance with the change of the incident angle so that the diameter in the x direction is constant 0.90 mm.
- the beam shape of b12 is changed.
- the reagent solution containing the specimen solution and the fluorescently labeled secondary antibody is fed to the reaction layer 104. Since the primary antibody is immobilized on the metal thin film 102 in contact with the reaction layer 104 as described above, it is included in the sample liquid that reacts specifically with the primary antibody by feeding the sample liquid and the reagent liquid. The antigen is captured, and the secondary antibody that specifically reacts with the antigen is captured.
- step S21 of FIG. 6 the beam shape changing unit 130 changes the shape of the excitation light b1 so as to have a preset beam shape.
- step S22 liquid feeding management is performed during the liquid feeding process using the beam shape changed in step S21.
- the liquid feeding management is to detect (observe) a liquid feeding state as to whether the sample liquid and the reagent liquid are normally fed. In the liquid feeding management, for example, it is detected whether the liquid is fed normally or whether bubbles are generated in the flow path.
- a beam shape is set so that the irradiation region in the liquid feeding management covers at least the entire reaction layer 104 or extends inside and outside the reaction layer 104. Therefore, the beam shape is set so that the irradiation area in the liquid feeding management (step S22) is wider than the irradiation area (on the surface of the metal thin film 102) in the detection step (step S32) described later (step S32). S21). By doing so, it is possible to manage the liquid feeding state not only in the reaction layer 104 but also in the surrounding flow path 143.
- the excitation light b1 need not be incident at the resonance angle ⁇ 1.
- the dye fading due to applying strong energy to the fluorescent substance other than at the time of detection causes a decrease in sensitivity and quantification accuracy, it is reflected rather than detecting (observing) with an electric field enhanced by surface plasmon. It is preferable to detect with light or scattered light. Also, the intensity or wavelength of the excitation light b1 may be changed.
- step S31 of FIG. 6 the beam shape changing unit 130 changes the shape of the excitation light b1 so as to have a preset beam shape.
- step S32 a detection process is executed with the beam shape changed in step S31.
- the beam shape set in step S31 is a beam shape optimized for the detection step, and will be described below with reference to FIG.
- FIG. 8A is a schematic diagram showing the positional relationship between the irradiation region b131 of the excitation light b13 on the metal thin film 102 and the reaction layer 104 in the detection step of detecting the analyte
- FIG. 8B is the same step. It is a schematic diagram which shows the cross-sectional shape of the excitation light b12 after the beam shape change in.
- the excitation light b13 is irradiated over as wide an area of the reaction layer 104 as possible. It is preferable.
- the beam shape changing unit 130 is controlled by the control means 13 so that the irradiation area in the detection process becomes wider than the irradiation area in the resonance angle scanning process.
- a part of the reaction layer 104 is irradiated in the resonance angle scanning step, and the excitation light b13 is detected during the detection step at the incident angle (resonance angle) to the metal thin film 102 determined in the resonance angle scanning step.
- the shape of the excitation light b ⁇ b> 12 is determined so that the irradiation region b ⁇ b> 131 due to is substantially the entire region of the reaction layer 104 or substantially the same region.
- the beam shape changing unit 130 makes the cross-sectional shape of the excitation light b12 a circle having a diameter of ⁇ 1.0 mm.
- the irradiation region b131 of the excitation light b13 irradiates most of the reaction layer 104 as shown in FIG.
- the position of the irradiation region varies depending on the value of the incident angle (resonance angle) determined in the resonance angle scanning step, but a beam that irradiates most of the reaction layer 104 even at the upper and lower limits of the scan range of the incident angle. It has a shape.
- the tip structure 108 can be moved in the Z-axis direction by the position adjusting mechanism 14 shown in FIG.
- the resonance angle can be adjusted by adjusting the Z-axis direction in accordance with the resonance angle ⁇ 1 by the position adjusting mechanism 14. It is desirable that the center of the irradiation region of the excitation light incident at ⁇ 1 coincides with the center of the reaction layer 104.
- control means 13 controls the beam shape changing unit 130 to appropriately change the beam shape of the excitation light, so that both the resonance angle scan and the detection of the target substance can be accurately performed. It becomes possible.
- FIG. 9 is a modification of FIG.
- the beam shape changing unit 130 is an aperture mechanism as shown in FIG. 3, and can shape the beam shape into a rectangle.
- the beam shape changing unit 130 changes the sectional shape of the excitation light b12 to a 1.0 mm square.
- the reaction layer 104 reaction region
- the beam shape approximates that shape, thereby exciting light during the detection process.
- the irradiation region b131 of b13 can easily cover the entire reaction layer 104, and can capture signals from a wider range of fluorescent materials than in FIG.
- FIG. 10 shows an embodiment using a dielectric member 106 having a semicircular cross section as a modification.
- the irradiation position on the metal thin film 102 of the excitation light b13 can be fixed regardless of the incident angle, as will be described below.
- the beam shape is set in consideration of both the change in the irradiation position of the excitation light b13 and the change in the size of the irradiation region due to the change in the incident angle. In the illustrated embodiment, only the change in size in the irradiated area need be considered.
- the beam shape changed by the beam shape changing unit 130 is about ⁇ 0.8 mm in which the length in the X direction is expanded as compared with FIG. 7B (incident on the dielectric member 106). Position) circle.
- the excitation light b12 needs to be divergent light so that incident light (excitation light b13) inside the dielectric member 106 becomes parallel light.
- the tip is positioned at the position calculated from the incident angle and the size / refractive index of the dielectric by the position adjusting mechanism 14 in the resonance angle scanning process. If the structure 108 is interlocked, the irradiation region moving according to the incident angle can be maintained at the center of the reaction field (reaction layer 104), and the beam shape can be controlled considering only the area change of the excitation light irradiation region due to the incident angle. Is possible.
- the metal is applied.
- the position and size of the center of the irradiation region b131 of the excitation light b13 on the thin film 102 can be controlled to be constant.
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Abstract
励起光のビーム形状を変更するビーム形状変更部130及びこれを制御する制御手段13を備えることにより、共鳴角スキャンと、標的物質の検出を共に精度よく行うことが可能となる。
Description
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS;Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy)の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置に関する。
従来より、表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS)の原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出が行われている。表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS)は、光源より照射したレーザ光(励起光)が金属薄膜表面で全反射減衰(ATR;attenuated total reflectance)する条件において、金属薄膜表面に粗密波(表面プラズモン)を発生させることによって、光源より照射したレーザ光(励起光)が有するフォトンを金属薄膜近傍に局在化させることができ、これにより金属薄膜近傍の蛍光物質を効率良く励起させることによって、極微量および/または極低濃度のアナライトを検出する方法である。
近年、このような表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS)の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置の開発が進められており、例えば特許文献1や特許文献2などにその技術開示がなされている。
このような表面プラズモン増強蛍光測定装置10は、図11に示したように基本的な構造において、誘電体部材106の表面に金属薄膜102、更にその表面に反応層104が設けられたチップ構造体108を備えている。
そして、チップ構造体108の誘電体部材106側には、誘電体部材106内に入射され、金属薄膜102に向かって励起光b1を照射する光源112を備え、さらに光源112から照射され金属薄膜102で反射した金属薄膜反射光b2を受光する受光手段116が備えられている。
一方、チップ構造体108の反応層104側には、反応層104で捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光b3を受光する光検出手段120が設けられている。
なお、反応層104と光検出手段120との間には、蛍光b3を効率よく集光するための集光部材122と、蛍光b3以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光のみを選択するフィルタ124が設けられている。
そして、表面プラズモン増強蛍光測定装置10の使用においては、あらかじめ金属薄膜102の表面上には検出対象のDNA等のアナライトに含まれる抗原に特異的に結合する1次抗体があらかじめ固定されている。金属薄膜102に接する反応層104に、アナライト及び当該アナライトに特異的に結合する2次抗体を順に送液して、2次抗体を反応層104で捕捉させる。アナライトとともに捕捉される2次抗体は蛍光物質で標識されている。
捕捉された反応層104に光源112より誘電体部材106内に励起光b1を照射し、この励起光b1が特定の角度(共鳴角)θ1で金属薄膜102に入射することで、金属薄膜102上に粗密波(表面プラズモン)を生ずるようになっている。なお、金属薄膜102上に粗密波(表面プラズモン)が生ずる際には、励起光b1と金属薄膜102中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光b2の光量減少という現象が生ずる。
受光手段116及び光源112とは対となって金属薄膜102の照射領域を中心として回動し、金属薄膜102への入射角度を変更することができる。入射角度を変化させ、その際の受光手段116で受光される金属薄膜反射光b2のシグナルが変化(光量が減少)する地点を見つければ、粗密波(表面プラズモン)が生ずる共鳴角θ1を得ることができる。
入射角度を変化するに対応して、その際の受光手段116で受光される金属薄膜反射光b2のシグナルが変化(光量が減少)する、当該光量の減少に対応するように金属薄膜近傍で局所的に粗密波(表面プラズモン)が生ずることとなる。この際の光量が最少となる入射角度あるいは、当該入射角度付近の角度を共鳴角θ1として得ることができる。
そして、この粗密波(表面プラズモン)を生ずる現象により、金属薄膜102上の反応層104の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光b3の光量が増大することとなる。
この増大した蛍光b3を、集光部材122およびフィルタ124を介して光検出手段120で受光することで、極微量および/または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。
このように、表面プラズモン増強蛍光測定装置10は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察可能とする高感度計測センサである。
金属薄膜102への励起光の入射角を振って共鳴角θ1を求める共鳴角スキャン工程においては励起光の照射範囲は反応層104の反応領域の内側であることが望まれる。一方で、励起光の照射によりアナライトの検出を行う検出工程の際には、標識からの信号を感度よく捉えるためには、反応領域の全域を照射することが望まれ、これらを両立することは難しかった。
本願発明は上記問題に鑑み、共鳴角スキャンと、標識物質の検出を共に精度よく行うことを目的とする。
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
1.金属薄膜の一方側に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜の他方側に形成された反応層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
前記励起光のビーム形状を変更するビーム形状変更部と、
前記ビーム形状変更部を制御する制御手段と、を有することを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。
前記励起光のビーム形状を変更するビーム形状変更部と、
前記ビーム形状変更部を制御する制御手段と、を有することを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。
2.前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御して前記励起光のビーム形状を変更することにより前記励起光の前記金属薄膜に対する照射領域の拡大縮小を行い、
共鳴角を検出する共鳴角スキャン工程時の照射領域よりも、蛍光物質を検出する検出工程時の照射領域が広いことを特徴とする前記1に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
共鳴角を検出する共鳴角スキャン工程時の照射領域よりも、蛍光物質を検出する検出工程時の照射領域が広いことを特徴とする前記1に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
3.前記共鳴角スキャン工程時の照射領域は前記反応層の領域内の一部の領域であり、前記検出工程時の照射領域は前記反応層を覆う領域であることを特徴とする前記2に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
4.前記反応層に検体液及び蛍光物資が含まれる試薬液を送液される流路を有し、
前記制御手段は、前記反応層に検体液及び試薬液が送液される送液工程において送液状態の検出を行うために照射する前記励起光の照射領域が、前記検出工程時の照射領域よりも広くなるように制御することを特徴とする前記2又は3に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
前記制御手段は、前記反応層に検体液及び試薬液が送液される送液工程において送液状態の検出を行うために照射する前記励起光の照射領域が、前記検出工程時の照射領域よりも広くなるように制御することを特徴とする前記2又は3に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
5.前記反応層に検体液及び蛍光物資が含まれる試薬液を送液される流路を有し、
前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御することにより、
前記共鳴角スキャン工程時の照射領域を前記反応層の領域の一部とし、
前記検出工程時の照射領域を前記反応層の領域と略一致させ、
前記反応層に検体液及び試薬液が送液される送液工程時の照射領域を前記反応層の領域の内部及び外部にまたがる領域にする、
ことを特徴とする前記2に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御することにより、
前記共鳴角スキャン工程時の照射領域を前記反応層の領域の一部とし、
前記検出工程時の照射領域を前記反応層の領域と略一致させ、
前記反応層に検体液及び試薬液が送液される送液工程時の照射領域を前記反応層の領域の内部及び外部にまたがる領域にする、
ことを特徴とする前記2に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
6.前記金属薄膜上における前記励起光の照射領域の、前記励起光の前記金属薄膜への入射角度の変更に対応する変化を相殺するように、
前記入射角度の変更に合わせて前記ビーム形状変更部により前記励起光のビーム形状を変更させることにより、前記金属薄膜上の前記励起光の照射領域を一定とするように制御することを特徴とする前記1から5の何れか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
前記入射角度の変更に合わせて前記ビーム形状変更部により前記励起光のビーム形状を変更させることにより、前記金属薄膜上の前記励起光の照射領域を一定とするように制御することを特徴とする前記1から5の何れか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
本願発明によれば、励起光のビーム形状を変更するビーム形状変更部及びこれを制御する制御手段とを備えることにより、共鳴角スキャンと、標的物質の検出を共に精度よく行うことが可能となる。
以下、本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
図1、図2は、実施形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を金属薄膜に照射して粗密波(表面プラズモン)を生じさせて励起された蛍光物質が生ずる蛍光を正確に検出し、検出感度を上げても超高精度に蛍光検出を行うことを可能とするものである。
[表面プラズモン増強蛍光測定装置10、及び検体検出方法]
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置10は、図1に示したように、まず金属薄膜102と、金属薄膜102の一方側面に形成された反応層104と、他方側面に形成された誘電体部材106と、を有するチップ構造体108を備えている。
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置10は、図1に示したように、まず金属薄膜102と、金属薄膜102の一方側面に形成された反応層104と、他方側面に形成された誘電体部材106と、を有するチップ構造体108を備えている。
そして、チップ構造体108の誘電体部材106側には、誘電体部材106内に入射され、金属薄膜102に向かって励起光b1を照射する光源112を備え、さらに光源112から照射され金属薄膜102に反射した金属薄膜反射光b2を受光する受光手段116を備えている。
ここで光源112から照射される励起光b1としてはレーザ光が好ましく、波長200~1000nmのガスレーザまたは固体レーザ、波長385~800nmの半導体レーザが好適である。また、光源から照射された励起光b1は、そのビーム形状をビーム形状変更部130により形状変更される。なお、以下においてはビーム形状変更部130により形状変更される前と後の励起光を区別する場合にはそれぞれ励起光b11、励起光b12と称し、誘電体部材106の内部を透過して金属薄膜102に照射する励起光を励起光b13と称す。更にこれらを総称する場合には励起光b1という。また励起光b13の金属薄膜102上の照射範囲を照射領域b131(図7等参照)と称す。ビーム形状変更部130の構成については後述する。
一方、チップ構造体108の反応層104側には、反応層104で生じた蛍光b3を受光する光検出手段120が設けられている。
光検出手段120としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なCCDイメージセンサを用いることが好ましい。
制御手段13は、CPUやメモリを備えており、メモリに記憶されているプログラムを実行することにより、光源112、ビーム形状変更部130、受光手段116、光検出手段120等の各装置を制御する。
なお、チップ構造体108の反応層104と光検出手段120との間には、光を効率よく集光するための集光部材122と、光の内で蛍光b3とは異なる波長の光の透過を低減して蛍光b3を選択的に透過するように形成されたフィルタ124が設けられている。
集光部材122としては、光検出手段120に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、10~100倍が好ましい。
一方、フィルタ124としては、光学フィルタ、カットフィルタなどを用いることができる。光学フィルタとしては、減光(ND)フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。さらにカットフィルタとしては、外光(装置外の照明光)、励起光(励起光の透過成分)、迷光(各所での励起光の散乱成分)、プラズモンの散乱光(励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光)、酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
そして、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置10を用いたアナライト検出方法では、反応層104に接する側の金属薄膜102表面上には1次抗体を結合させたSAM膜(Self-Assembled Monolayer:「自己組織化単分子膜」ともいう)あるいは高分子材料膜が設けられている。1次抗体はSAM膜あるいは高分子材料膜の一方の面に結合されており、SAM膜あるいは高分子材料膜の他方の面は、直接若しくは間接に金属薄膜102表面に固定されている。SAM膜としては例えばHOOC-(CH2)11-SHなどの置換脂肪族チオールで形成された膜、高分子材料としては例えばポリエチレングリコール(polyethylene glycol)やMPCポリマー等が挙げられる。これは使用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。また、1次抗体に対する反応性基(または反応性基に変換可能な官能基)を備えたポリマーを直接基板上に固定化し、その上に1次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。
「送液工程」では、このようにして構成した反応層104に標的物質としてのアナライトの抗原を含む溶液(以下、検体液ともいう)と、二次抗体を含む試薬液の送液を行う。固定化した一次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対しさらに蛍光物質で標識した二次抗体を含む試薬液を作用させることで捕捉された抗原を標識している。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから一次抗体を作用させてもよい。
蛍光物質で標識されたアナライトの検出を行う「検出工程」においては、アナライトが捕捉された反応層104に光源112より誘電体部材106に励起光b1を照射し、この励起光b1が金属薄膜102に対して特定の入射角度(共鳴角θ1)で金属薄膜102に入射することで、金属薄膜102上に粗密波(表面プラズモン)を生ずるようになる。
なお、金属薄膜102上に粗密波(表面プラズモン)が生ずる際には、励起光b1と金属薄膜102中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光b2のシグナルが変化(光量が減少)することとなるため、受光手段116で受光される金属薄膜反射光b2のシグナルが変化(光量が減少)して最少となる地点を見つければ良い。
そして、この粗密波(表面プラズモン)により、金属薄膜102上の反応層104で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光b3の光量が増大し、この蛍光b3を集光部材122およびフィルタ124を介して光検出手段120で受光することで、極微量および/または極低濃度のアナライトを検出することができる。
なお、チップ構造体108の金属薄膜102の材質としては、好ましくは金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。
このような金属は、粗密波(表面プラズモン)による電場増強が大きくなることから金属薄膜102に好適である。
また、金属薄膜102の形成方法としては、例えばスパッタリング法、蒸着法(抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など)、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法、蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
さらに金属薄膜102の厚さとしては、金:5~500nm、銀:5~500nm、アルミニウム:5~500nm、銅:5~500nm、白金:5~500nm、およびそれらの合金:5~500nmの範囲内であることが好ましい。
電場増強効果の観点からは、金:20~70nm、銀:20~70nm、アルミニウム:10~50nm、銅:20~70nm、白金:20~70nm、およびそれらの合金:10~70nmの範囲内であることがより好ましい。
金属薄膜102の厚さが上記範囲内であれば、粗密波(表面プラズモン)が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜102であれば、大きさ(縦×横)は特に限定されないものである。
図2(a)は、チップ構造体108の断面図であり、図2(b)はその一部の上面図である。反応層104はこれらの図に示すように石英基板142に設けられた流路143の経路中の下層側であって金属薄膜102の表層に設けられている。石英基板142の経路中に設けられている。石英基板142は固定具141により支持されている。流路143には蛍光物質が標識された二次抗体等が含まれる試薬液や、アナライトが含まれる検体液が不図示のポンプにより送液される。
検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液(髄液、腹水、胸水等)などが挙げられる。検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、AFP(αフェトプロテイン)等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
さらに蛍光物質としては、所定の励起光b1を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光b3を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光b3とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
また、誘電体部材106としては、高屈折率材料の角度60度等のプリズムを用いることができる。高屈折率の材料としては光学的に透明な各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素(SiO2)、二酸化チタン(TiO2)、ポリカーボネート(PC)、シクロオレフィンポリマー(COP)、光学用ポリエステル(OKP:大阪ガスケミカル(株)製)等を用いることができる。
さらに、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置10は、光源112から金属薄膜102に照射される励起光b1による表面プラズモン共鳴の最適角(共鳴角θ1)を調整するため、角度可変部(図示せず)を有している。
ここで、角度可変部(図示せず)は制御手段13により制御され、「共鳴角スキャン工程」においては角度可変部のサーボモータで全反射減衰(ATR)条件を求めるために受光手段116と光源112とを同期して、照射領域を中心として回動し、45~85°の範囲で角度変更を可能としている。また分解能は0.01°以上であることが好ましい。
[ビーム形状変更部]
図3から図5は、ビーム形状変更部130の実施例を示す模式図である。本願においてビーム形状の変更とは、ビーム形状の整形、変更のみならず、ビーム径の拡大、縮小を含む概念である。ビーム形状変更部130a、130b、130c(これらを総称したものがビーム形状変更部130である)は制御手段13により制御される。
図3から図5は、ビーム形状変更部130の実施例を示す模式図である。本願においてビーム形状の変更とは、ビーム形状の整形、変更のみならず、ビーム径の拡大、縮小を含む概念である。ビーム形状変更部130a、130b、130c(これらを総称したものがビーム形状変更部130である)は制御手段13により制御される。
図3は、絞り機構を用いたビーム形状変更部130aを示した模式図である。同図において、歯車131gは絞り部材駆動ラック107に形成されたラック歯車107Lと歯合している。歯車131gは、不図示の枠体に形成されたボスに軸支されている。歯車131gは、絞り開閉リング135の外周に形成された歯車部135gと歯合している。絞り羽131には軸支穴132が形成され、絞り羽根支持リング136に形成されたボスで軸支され回動可能に支持されている。また、絞り羽根131にはピン133が植設され、絞り開閉リング135に形成された溝部134に挿入されている。このような構成にして、絞り部材駆動ラック107の図示矢印方向の移動により、歯車131gを介して絞り開閉リング135が回転し、複数の絞り羽根131が軸支穴132を中心に回動し絞り動作をおこなう、虹彩絞りとしている。ビーム形状変更部130aにより、光源112から照射された励起光b11の形状を絞ることが可能である。なお、同図に示す例では、光軸を中心として円形に絞る構成としているが、4枚あるいは2枚の絞り羽131により光軸を中心として矩形に絞る構成としてもよい。
図4は、ビームエキスパンダーを用いたビーム形状変更部130bを示す模式図である。図4において、ビームエキスパンダーとして機能するビーム形状変更部130bは、第1レンズLS1と、正レンズと負レンズとを接合した第2レンズLS2とから構成されている。同図に示すビーム形状変更部130bは不図示のレンズ移動手段により第1レンズ及び第2レンズの少なくとも一方を光軸方向に移動することによって、光源112から照射された励起光b11のビーム径を可変することが可能である。
図5は、ズームレンズを用いたビーム形状変更部130cを示す模式図である。図5において、ズームレンズとして機能するビーム形状変更部130cは、第1レンズLS3と第1レンズLS3よりも焦点距離の短い第2レンズLS4とからなり、2つのレンズの焦点距離の比により所定の縮小率あるいは拡大率でビーム径の変更を行うことができる。なお、一方のレンズを複数のレンズ群より構成し、レンズ群中の一つのレンズを光軸方向に可動させる機構を設けて、レンズ群の焦点距離を変更することにより拡大縮小率を変更可能な構成としてもよい。
なお図3から図5の構成を組み合わせたものをビーム形状変更部130としてもよい。また図4、図5においては球面レンズを用いているが、シリドンドリンカルレンズを適用することにより、縦横の拡大縮小比率を異ならせるようにしてもよい。また、図3から図5に示したビーム形状変更部の構成は一例であり、これらに限定されない。断面積、ビーム径その他のビーム形状を変更できる構成であればよい。
[ビーム形状の制御フロー]
図6から図8に基づいてビーム形状変更の制御について説明する。図6は制御手段13により実行される制御フローを示す図である。
図6から図8に基づいてビーム形状変更の制御について説明する。図6は制御手段13により実行される制御フローを示す図である。
[共鳴角スキャン工程におけるビーム形状]
図6のステップS11では、ビーム形状変更部130により、予め設定されているビーム形状となるよう励起光b1に対して形状変更を行う。ステップS12ではステップS11で変更したビーム形状により、共鳴角スキャン工程を実行する。ここで、ステップS11で設定されたビーム形状は共鳴角スキャン工程に最適化したビーム形状であり、以下、図7に基づいて説明する。
図6のステップS11では、ビーム形状変更部130により、予め設定されているビーム形状となるよう励起光b1に対して形状変更を行う。ステップS12ではステップS11で変更したビーム形状により、共鳴角スキャン工程を実行する。ここで、ステップS11で設定されたビーム形状は共鳴角スキャン工程に最適化したビーム形状であり、以下、図7に基づいて説明する。
図7(a)は共鳴角スキャン工程における励起光b13の金属薄膜102上での照射領域b131と反応層104との位置関係を示す模式図であり、図7(b)は同工程におけるビーム形状変更後の励起光b12の断面形状を示す模式図である。ステップS12で実施する共鳴角スキャン工程は前述のとおり、受光手段116と光源112とを同期させて、金属薄膜102への入射角度を振って、全反射減衰の発生する入射角度(受光手段116、光源112の位置)を求めるものである。
共鳴角θ1は金属薄膜102の表面の化学的な状態により変化するものである。共鳴角スキャン工程において精度良く共鳴角θ1を求めるためには、金属薄膜102の表面に一次抗体が固定化されている反応層104の領域内に対して励起光b13を照射する必要がある。励起光b13の金属薄膜102上の照射領域b131の一部あるいは全部が反応層104の外側を照射した場合には、正確に共鳴角θ1を求めることができないからである。本実施形態においては、共鳴角スキャン工程の入射角度の変更範囲で励起光b13の照射領域b131が反応層104の領域内部に収まるように、予めビーム形状変更部130により励起光b12のビーム形状の適正化を図っている。以下説明する。
本実施形態においては、(1)誘電体部材106の屈折率はn=1.515であり、その表面上に金属薄膜102が形成されている。また誘電体部材106は、1辺が25mmの60度プリズム形状である。反応層104のサイズは1.0mm(Y方向)×3.0mm(X方向)である。(2)励起光b1は波長633nmのレーザ光であり、共鳴角スキャン工程における励起光b1の金属薄膜102への入射角度のスキャン範囲は79度±3度である。ここでいう入射角度は、誘電体部材106への入射による屈折がなかった場合の入射角度を意味する。以下単に入射角度という場合には当該入射角度を示す。なお入射角度79±3度での誘電体部材106表面での光路の屈曲した後の励起光b13の金属薄膜102への入射角度は、計算上で70.48~74.32度となる。
図7(a)においては、入射角度のスキャン範囲上下限の82度、76度とその中間の79度における励起光b13の照射領域b131をそれぞれx1、x3、x2で示している。図7(a)に示すように入射角度の変更に伴い、金属薄膜102表面での励起光b13の照射領域b131の大きさや照射位置が変化することになる。
本実施形態においては、入射角度のスキャン範囲において励起光b13の照射領域b131が反応層104の領域内部(1.0mm×3.0mm)に収まるためには、励起光b12はφ0.3mmの円形が適正であるというのが予め算出できる。ステップS11ではこのような形状となるように、制御手段13ではビーム形状変更部130により形状変更を行うように制御している。ちなみにφ0.3mmの励起光b12に対して、励起光b13の金属薄膜102表面での照射領域b131の大きさはx1(82度)で1.161mm(X方向直径)、x3(76度)で0.918mm(X方向直径)となる。
[他の実施形態]
また、前述のように励起光の入射角度の変更に対応して、金属薄膜表面での励起光b13の照射領域b131の大きさ及び照射位置が変化する。他の実施形態においては、このうちの大きさの変化を相殺するように当該入射角度の変更に合わせてビーム形状変更部130により励起光b12のビーム形状を変更させることにより、金属薄膜102上の励起光b13の照射領域b131の大きさを一定とするように制御することが可能である。例えば、x1(82度)からx3(76度)の範囲で照射角度を変更させた場合であってもx方向直径は一定の0.90mmとなるように、入射角度の変更に合わせて励起光b12のビーム形状を変更する。
また、前述のように励起光の入射角度の変更に対応して、金属薄膜表面での励起光b13の照射領域b131の大きさ及び照射位置が変化する。他の実施形態においては、このうちの大きさの変化を相殺するように当該入射角度の変更に合わせてビーム形状変更部130により励起光b12のビーム形状を変更させることにより、金属薄膜102上の励起光b13の照射領域b131の大きさを一定とするように制御することが可能である。例えば、x1(82度)からx3(76度)の範囲で照射角度を変更させた場合であってもx方向直径は一定の0.90mmとなるように、入射角度の変更に合わせて励起光b12のビーム形状を変更する。
このようにすることにより、常に同じ面積を照射することにより、照射面積の大小による蛍光b3の光量への影響を避けることができる。
[送液工程におけるビーム形状]
送液工程においては、前述のように反応層104に検体液と蛍光標識されている二次抗体を含む試薬液の送液を行う。前述のとおり反応層104に接している金属薄膜102には、一次抗体が固定化されているので、検体液と試薬液を送液することにより一次抗体に特異的に反応する検体液に含まれる抗原が捕捉され、されに当該抗原に特異的に反応する二次抗体が捕捉されることになる。
送液工程においては、前述のように反応層104に検体液と蛍光標識されている二次抗体を含む試薬液の送液を行う。前述のとおり反応層104に接している金属薄膜102には、一次抗体が固定化されているので、検体液と試薬液を送液することにより一次抗体に特異的に反応する検体液に含まれる抗原が捕捉され、されに当該抗原に特異的に反応する二次抗体が捕捉されることになる。
図6のステップS21では、ビーム形状変更部130により、予め設定されているビーム形状となるよう励起光b1に対して形状変更を行う。ステップS22ではステップS21で変更したビーム形状により、送液工程時における送液管理を行う。送液管理とは、検体液と試薬液が正常に送液されているかの送液状態を検出(観察)するものである。送液管理では、例えば液体が正常に送液されているかあるいは、気泡が流路中に発生していないかを検出する。
送液管理においては、反応層104のみならず、その周辺の流路143も観察する必要がある。送液管理における照射領域は少なくとも反応層104の全域を覆うあるいは反応層104の内部及び外部にまたがるようなビーム形状の設定がなされている。そのため後述の検出工程(ステップS32)の(金属薄膜102表面における)照射領域よりも、当該送液管理(ステップS22)における照射領域の方が広くなるようにビーム形状の設定がなされている(ステップS21)。このようにすることにより、反応層104のみならずその周辺の流路143での液体の送液状態を管理することができる。
なお、送液管理時においては、必ずしも金属薄膜102表面における表面プラズモンにより発生する蛍光b3により検出する必要はなく、金属薄膜102表面における反射光や散乱光を受光手段116により検出するようにしてもよい。その場合は、励起光b1を共鳴角θ1で入射する必要はない。また検出時以外で蛍光物質に強いエネルギーを与えることによる色素の褪色が感度および定量精度の低下を引き起こすという問題が懸念されるので、表面プラズモンにより増強された電場で検出(観察)するよりも反射光や散乱光で検出する方が好ましい。また、励起光b1の強度あるいは波長を変更するようにしてもよい。
[検出工程におけるビーム形状]
図6のステップS31では、ビーム形状変更部130により、予め設定されているビーム形状となるよう励起光b1に対して形状変更を行う。ステップS32ではステップS31で変更したビーム形状により、検出工程を実行する。ここで、ステップS31で設定されたビーム形状は検出工程に最適化したビーム形状であり、以下、図8に基づいて説明する。
図6のステップS31では、ビーム形状変更部130により、予め設定されているビーム形状となるよう励起光b1に対して形状変更を行う。ステップS32ではステップS31で変更したビーム形状により、検出工程を実行する。ここで、ステップS31で設定されたビーム形状は検出工程に最適化したビーム形状であり、以下、図8に基づいて説明する。
図8(a)はアナライトの検出を行う検出工程における励起光b13の金属薄膜102上の照射領域b131と反応層104との位置関係を示す模式図であり、図8(b)は同工程におけるビーム形状変更後の励起光b12の断面形状を示す模式図である。
前述のように共鳴角スキャン工程においては、励起光b13が反応層104の外側を照射しないようにそのサイズを絞る必要があった。一方で、検出工程においては、反応層104の全域に渡って捕捉されたアナライトに標識した蛍光物質の検出を行うためには、励起光b13は反応層104のなるべく広い領域に渡って照射することが好ましい。
本実施形態においては、共鳴角スキャン工程時の照射領域よりも検出工程時の照射領域が広くなるように制御手段13によりビーム形状変更部130の制御を行っている。具体的には、共鳴角スキャン工程では反応層104の一部の領域を照射するようにし、当該共鳴角スキャン工程で決定した金属薄膜102への入射角度(共鳴角)において検出工程時に励起光b13による照射領域b131が、反応層104の概ね全域あるいは略一致する領域となるように、励起光b12の形状を決定している。図8(b)においてはビーム形状変更部130により励起光b12の断面形状をφ1.0mmの円形にしている。このような形状とすることにより、図8(a)に示すように励起光b13の照射領域b131は、反応層104の大部分を照射していることがわかる。なお、共鳴角スキャン工程で決定した入射角度(共鳴角)の値により照射領域の位置が異なることになるが、入射角度のスキャン範囲の上下限でも反応層104の大部分を照射するようなビーム形状としている。また、図1に示した位置調整機構14によりチップ構造体108をZ軸方向に移動可能な構成とし、位置調整機構14で共鳴角θ1に応じたZ軸方向の調整をすることで、共鳴角θ1で入射した励起光の照射領域の中心と反応層104の中心を一致させることが望ましい。
本実施形態によれば、ビーム形状変更部130を制御手段13が制御して励起光のビーム形状の変更を適切に行うことにより、共鳴角スキャンと、標的物質の検出を共に精度よく行うことが可能となる。
[変形例]
図9は、図8の変形例である。図9に示す実施形態においては、ビーム形状変更部130は図3に示したような絞り機構であって、且つ、ビーム形状を矩形に整形することができるものである。図9(b)に示す例においてはビーム形状変更部130により励起光b12の断面形状を1.0mm角の正方形にしている。このようにすることにより、図9(a)に示すように反応層104(反応領域)が矩形形状である場合には、その形状に近似したビーム形状とすることにより、検出工程時の励起光b13の照射領域b131は反応層104の全域を容易に覆うことができ、図8よりも更に広範囲の蛍光物質からの信号を余すことなく捉えることが可能となる。
図9は、図8の変形例である。図9に示す実施形態においては、ビーム形状変更部130は図3に示したような絞り機構であって、且つ、ビーム形状を矩形に整形することができるものである。図9(b)に示す例においてはビーム形状変更部130により励起光b12の断面形状を1.0mm角の正方形にしている。このようにすることにより、図9(a)に示すように反応層104(反応領域)が矩形形状である場合には、その形状に近似したビーム形状とすることにより、検出工程時の励起光b13の照射領域b131は反応層104の全域を容易に覆うことができ、図8よりも更に広範囲の蛍光物質からの信号を余すことなく捉えることが可能となる。
[その他の実施形態]
図10は変形例として断面が半円形の誘電体部材106を用いた実施形態である。図10に示す実施形態においては、以下説明するように、入射角度によらず励起光b13の金属薄膜102上の照射位置を固定化することができる。
図10は変形例として断面が半円形の誘電体部材106を用いた実施形態である。図10に示す実施形態においては、以下説明するように、入射角度によらず励起光b13の金属薄膜102上の照射位置を固定化することができる。
図10(c)に示すように半円形の誘電体部材106を用いた場合には、共鳴角スキャン工程において光源112、受光手段116を移動させて入射角度を変更させた場合であっても励起光b1を誘電体部材106の半円の中心に向けて照射するようにすることにより、誘電体部材106表面で励起光b1は常に法線方向から照射することになる。このような構成とすることにより誘電体部材106表面での光路の屈曲が生じないので、図10(a)に示すように入射角度を変更することにより照射領域b131がx1~x3のように変化しても反応層104における励起光b13の照射領域b131の中心は常に一定となる。
図7(a)においては、入射角度の変更による、励起光b13の照射位置の変化と照射領域における大きさの変化の双方を考慮して、ビーム形状の設定を行っていたが、図10に示す実施形態においては、照射領域における大きさの変化のみを考慮すればよい。その結果、ビーム形状変更部130により変更するビーム形状は図10(b)に示すように図7(b)に比較してX方向の長さを拡大したφ0.8mm程度(誘電体部材106入射位置)の円形に設定することができる。但し半円形の誘電体部材106を用いた場合には、誘電体部材106内部の入射光(励起光b13)が平行光になるように、励起光b12は発散光とする必要がある。
また、図1に示すような三角形状の誘電体部材106を用いた実施形態においても、共鳴角スキャン工程において位置調整機構14により入射角と誘電体のサイズ・屈折率から計算される位置にチップ構造体108を連動させれば、入射角により移動する照射領域を反応場(反応層104)中心に維持することができ、入射角による励起光照射領域の面積変化のみを考慮したビーム形状に制御することが可能である。
更に、その他の実施形態と、前述の他の実施形態のように励起光の入射角度の変更に合わせてビーム形状変更部130により励起光b12のビーム形状を変更させる構成を適用することにより、金属薄膜102上の励起光b13の照射領域b131の中心の位置及び大きさを一定とするように制御することが可能である。
10 増強蛍光測定装置
13 制御手段
14 位置調整機構
130、130a、130b、130c ビーム形状変更部
b1、b11、b12、b13 励起光
b131 照射領域
b2 金属薄膜反射光
b3 蛍光
102 金属薄膜
104 反応層
106 誘電体部材
108 チップ構造体
13 制御手段
14 位置調整機構
130、130a、130b、130c ビーム形状変更部
b1、b11、b12、b13 励起光
b131 照射領域
b2 金属薄膜反射光
b3 蛍光
102 金属薄膜
104 反応層
106 誘電体部材
108 チップ構造体
Claims (6)
- 金属薄膜の一方側に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜の他方側に形成された反応層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
前記励起光のビーム形状を変更するビーム形状変更部と、
前記ビーム形状変更部を制御する制御手段と、を有することを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。 - 前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御して前記励起光のビーム形状を変更することにより前記励起光の前記金属薄膜に対する照射領域の拡大縮小を行い、
共鳴角を検出する共鳴角スキャン工程時の照射領域よりも、蛍光物質を検出する検出工程時の照射領域が広いことを特徴とする請求項1に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。 - 前記共鳴角スキャン工程時の照射領域は前記反応層の領域内の一部の領域であり、前記検出工程時の照射領域は前記反応層を覆う領域であることを特徴とする請求項2に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
- 前記反応層に検体液及び蛍光物資が含まれる試薬液を送液される流路を有し、
前記制御手段は、前記反応層に検体液及び試薬液が送液される送液工程において送液状態の検出を行うために照射する前記励起光の照射領域が、前記検出工程時の照射領域よりも広くなるように制御することを特徴とする請求項2又は3に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。 - 前記反応層に検体液及び蛍光物資が含まれる試薬液を送液される流路を有し、
前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御することにより、
前記共鳴角スキャン工程時の照射領域を前記反応層の領域の一部とし、
前記検出工程時の照射領域を前記反応層の領域と略一致させ、
前記反応層に検体液及び試薬液が送液される送液工程時の照射領域を前記反応層の領域の内部及び外部にまたがる領域にする、
ことを特徴とする請求項2に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。 - 前記金属薄膜上における前記励起光の照射領域の、前記励起光の前記金属薄膜への入射角度の変更に対応する変化を相殺するように、
前記入射角度の変更に合わせて前記ビーム形状変更部により前記励起光のビーム形状を変更させることにより、前記金属薄膜上の前記励起光の照射領域を一定とするように制御することを特徴とする請求項1から5の何れか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
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