JP2004156911A - 表面プラズモン蛍光顕微鏡、および表面プラズモンにより励起された蛍光を測定する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、表面プラズモンにより増強された蛍光を受光するように受光部品を構成することにより、強い蛍光強度で視認できる表面プラズモン蛍光顕微鏡、および表面プラズモンにより励起された蛍光を測定する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、一方の表面に試料を密着させることができる金属薄膜と、金属薄膜の他方の表面に密着し、試料よりも高い屈折率を有する高屈折率媒体と、励起光を照射する光源とを備え、励起光により励起された第１の表面プラズモンが、試料を蛍光発光させ、この蛍光により励起された第２の表面プラズモンが、試料に依存する蛍光放射角度においてピーク強度を有するように蛍光を増強し、第２のプラズモンにより増強された蛍光を受光する受光部品をさらに備える。
【選択図】図４

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面プラズモンにより励起された蛍光を測定するシステムおよびその方法に関し、とりわけ表面プラズモン蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の表面プラズモン顕微鏡によれば、クレッチマン配置を用いて表面プラズモンを励起し、イメージセンサで受光した反射光から表面プラズモン共鳴角を検出し、こうして得られた表面プラズモン共鳴角より、試料の屈折率を理論的に計算して求めている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
また、表面プラズモン共鳴角と蛍光を同時に検出して、被検体の特性を高精度に検出する従来の装置によれば、被検体の蛍光は、金属薄膜を含む平面に対して法線方向に配置された受光手段（集光レンズおよび光ファイバ）を用いて検出している（例えば、特許文献２参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特許第２６０９９５３号公報（図１）
【特許文献２】
特開２０００−６２２５５号公報（図１ないし図３）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
試料に含まれる試料分子は、一般に、所定の波長λ_１を有するレーザ光などのコヒーレント励起光が照射されると、試料分子に固有のより長い波長λ_２（λ_１＞λ_２）を有する蛍光を等方的に発光する。しかしながら、こうした蛍光の光強度は、照射される励起光に比して非常に小さいために、励起光から蛍光を高い精度で弁別して検出することは非常に困難であると考えられてきた。
【０００６】
ところが、本発明者の鋭意研究の結果、詳細後述するように、励起光により励起された第１の表面プラズモンが試料を蛍光発光させ、この蛍光により第２のプラズモンが励起され、さらに第２のプラズモンが試料に依存する蛍光放射角度においてピーク強度を有するように蛍光を増強できることを突き止めた。
【０００７】
しかるに、本発明は、第２の表面プラズモンにより増強された蛍光を受光するように、ＣＣＤエリアセンサなどの受光部品を構成することにより、強い蛍光強度で視認できる表面プラズモン蛍光顕微鏡、および表面プラズモンにより励起された蛍光を測定する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、蛍光のピーク強度を与える蛍光放射角度を精度よく測定することにより、試料の屈折率を正確に測定できる表面プラズモン蛍光顕微鏡、および測定方法を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、ピーク強度を有する蛍光をスペクトル分析することにより、試料分子を特定できる表面プラズモン蛍光顕微鏡、およびその方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また本発明によれば、赤外域光の超短パルスレーザから照射される少なくとも２つのフォトンを用いて、紫外域における蛍光を励起することにより、ＤＮＡや蛋白質を効率よく蛍光励起することができる。
【００１１】
さらに本発明によれば、マイクロレンズアレイを用いて、複数のスポットにおける蛍光を同時に測定することにより、試料を走査させることなく、迅速に蛍光を測定することができる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の本発明によれば、一方の表面に試料を密着させることができる金属薄膜と、金属薄膜の他方の表面に密着し、試料よりも高い屈折率を有する高屈折率媒体と、励起光を照射する光源とを備え、励起光により励起された第１の表面プラズモンが、試料を蛍光発光させ、この蛍光により励起された第２の表面プラズモンが、試料に依存する蛍光放射角度においてピーク強度を有するように蛍光を増強し、第２のプラズモンにより増強された蛍光を受光する受光部品をさらに備えたことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡を提供することができる。
【００１３】
請求項２に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、励起光を金属薄膜上の焦点に集光させる光学部品をさらに備える。
【００１４】
請求項３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、光学部品と受光部品の間の光路上に配置され、励起光が金属薄膜で反射された反射光を遮光する着脱可能な反射光カットフィルタをさらに備える。
【００１５】
請求項４に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、受光部品は、２次元マトリックスセンサであって、反射光カットフィルタが反射光を遮光するとき、２次元マトリックスセンサのセンサ座標と、各センサ座標において受光した蛍光の強度とを関連付けて記憶する第１のメモリ部品を備える。
【００１６】
請求項５に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、すべてのセンサ座標における蛍光の強度を積算して、積算蛍光強度を求めるための蛍光強度演算部と、励起光の焦点を金属薄膜上において走査させるために、高屈折率媒体に固定された試料ステージと、試料ステージのステージ座標と、各ステージ座標の積算蛍光強度とを関連付けて記憶する第２のメモリ部品とをさらに備える。
【００１７】
請求項６に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡によれば、ピーク強度を有する蛍光が、センサ座標において、蛍光放射角度に依存する輝環半径を有する円周上に結像するように、光学部品を構成し、この輝環半径から、試料の屈折率を計算する屈折率演算部をさらに有する。
【００１８】
請求項７に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、受光部品は、２次元マトリックスセンサであって、反射光カットフィルタが反射光を遮光しないとき、２次元マトリックスセンサのセンサ座標と、各センサ座標において受光した反射光の強度とを関連付けて記憶する第１のメモリ部品をさらに備える。
【００１９】
請求項８に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、極小強度を有する反射光が、センサ座標において、反射角度に依存する暗環半径を有する円周上に結像するように、光学部品を構成し、この暗環半径から、試料の屈折率を計算する屈折率演算部をさらに有する。
【００２０】
請求項９に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、第１または第２のメモリ部品に記憶された情報を元に、２次元画像を表示する画像表示部を有する。
【００２１】
請求項１０に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、ピーク強度を有する蛍光のスペクトル分布を測定するスペクトルアナライザをさらに有する。
【００２２】
請求項１１に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、標本に対する標本スペクトル分布と、試料に対する測定スペクトル分布を比較して、試料を特定する試料同定部を有する。
【００２３】
請求項１２に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、励起光源は、近赤外域の波長を有する励起光を照射する超短パルスレーザである。
【００２４】
請求項１３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、励起光を構成する少なくとも２つのフォトンの光エネルギを同時に試料に吸収させて、励起光よりも短波長の蛍光を励起する。
【００２５】
請求項１４に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、励起光の波長が約６００ｎｍないし約１０００ｎｍである。
【００２６】
請求項１５に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、光学部品は、複数の微小凸レンズを有するマイクロレンズアレイを含む。
【００２７】
請求項１６に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、光源と光学部品の間の光路上に配置され、励起光を光学部品へ、光学部品からの光を受光部品へ案内するハーフミラーまたはダイクロイックミラーをさらに備える。
【００２８】
請求項１７に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、光源と光学部品の間の光路の外側に配置され、光学部品からの光を受光部品へ案内するミラーをさらに有する。
【００２９】
請求項１８に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、励起光はコヒーレント光である。
【００３０】
請求項１９に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、金属薄膜は、銀薄膜と金薄膜の積層体であって、金薄膜上に試料を密着させ、銀薄膜上に高屈折率媒体を密着させる。
【００３１】
請求項２０に記載の本発明によれば、表面プラズモンにより励起された蛍光を測定する方法であって、一方の表面に試料を密着させることができる金属薄膜と、金属薄膜の他方の表面に密着し、試料よりも高い屈折率を有する高屈折率媒体とを含むターゲットを準備するステップと、励起光をターゲットに照射するステップと、励起光により励起された第１の表面プラズモンにより、試料を蛍光発光させるステップと、この蛍光により励起された第２のプラズモンにより、試料に依存する蛍光放射角度においてピーク強度を有するように蛍光を増強させるステップと、第２のプラズモンにより増強された蛍光を受光するステップとを有することを特徴とする測定方法を提供することができる。
【００３２】
請求項２１に記載の測定方法は、励起光を金属薄膜上の焦点に集光させるステップを有する。
【００３３】
請求項２２に記載の測定方法は、反射光を遮光して、蛍光だけを受光するステップを有する。
【００３４】
請求項２３に記載の測定方法において、蛍光を受光するステップは、２次元マトリックスセンサを用いて受光し、２次元マトリックスセンサのセンサ座標と、各センサ座標において受光した蛍光の強度とを関連付けて第１のメモリ部品に記憶するステップをさらに有する。
【００３５】
請求項２４に記載の測定方法は、すべてのセンサ座標における蛍光の強度を積算して、積算蛍光強度を得るステップと、励起光の焦点を金属薄膜上において走査させるステップと、試料ステージのステージ座標と、各ステージ座標の積算蛍光強度とを関連付けて第２のメモリ部品に記憶するステップとをさらに有する。
【００３６】
請求項２５に記載の測定方法は、第１または第２のメモリ部品に記憶された情報を元に、２次元画像を表示するステップを有する。
【００３７】
請求項２６に記載の測定方法は、ピーク強度を有する蛍光を、センサ座標において、蛍光放射角度に依存する輝環半径を有する円周上に結像させるステップと、この輝環半径から、試料の屈折率を計算するステップとをさらに有する。
【００３８】
請求項２７に記載の測定方法は、輝環が楕円である場合、その輝環が楕円形状を有するとき、その扁平方向から試料分子の配向方向を計算するステップをさらに有する。
【００３９】
請求項２８に記載の測定方法は、ピーク強度を有する蛍光のスペクトル分布を測定するステップをさらに有する。
【００４０】
請求項２９に記載の測定方法は、標本に対する標本スペクトル分布と、試料に対する測定スペクトル分布を比較して、試料を特定するステップを有する。
【００４１】
請求項３０に記載の測定方法において、励起光は、近赤外域の波長を有する超短パルスレーザ光である。
【００４２】
請求項３１に記載の測定方法は、励起光よりも短波長の蛍光が励起されるように、励起光を構成する少なくとも２つのフォトンの光エネルギを同時に試料に吸収させるステップを有する。
【００４３】
請求項３２に記載の測定方法において、励起光の波長が約６００ｎｍないし約１０００ｎｍである。
【００４４】
請求項３３に記載の測定方法は、励起光を金属薄膜上の複数の焦点に集光させるステップを有する。
【００４５】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して本発明に係る表面プラズモン蛍光顕微鏡の実施形態を説明する。以下の実施形態の説明において、理解を容易にするために方向を表す用語（例えば、「上側」、「右側」または「左側」など）を適宜用いるが、これは説明のためのものであって、これらの用語は本発明を限定するものでない。
【００４６】
実施形態１．
図１ないし図３を参照しながら、本発明に係る表面プラズモン蛍光顕微鏡の実施形態１について以下詳細に説明する。図１において、実施形態１の表面プラズモン蛍光顕微鏡１は、概略、波長λ_１を有するコヒーレント光（以下、単に「励起光」という。）を照射するＨｅ−Ｎｅレーザなどの励起光源１０と、励起光が照射されるターゲット２０と、ターゲット２０を平行移動させるためのＸ−Ｙステージ３０（「試料ステージ」ともいう。）と、ターゲット２０からの光を受光する受光部品４０と、パーソナルコンピュータ５０（以下、単に「ＰＣ」という。）を備える。受光部品４０は、光電子増倍管や、光強度を電気信号に変換できる任意の半導体素子を用いて構成することができるが、好適には、ある程度の領域に亙って受光できるＣＣＤエリアセンサが用いられる。
【００４７】
ＰＣ５０は、試料ステージ３０および受光部品４０と無線または有線にて通信し、試料ステージ３０を平行移動させるパルスモータ（図示せず）を駆動するとともに、受光部品４０が受光した光の強度を電気信号として受信し、この光強度を試料ステージ３０の各ステージ座標に関連付けるように記憶して、付属のモニタに画像表示することができる。
【００４８】
実施形態１のターゲット２０は、表面プラズモンを励起するためのクレッチマン配置を有する。すなわち、このターゲット２０は、高い屈折率（例えば約１．７４）を有する高屈折率プリズム２２、これに蒸着された金属薄膜２４（膜厚ｄ_ｍは、例えば、約５０ｎｍ）、および金属薄膜２４に密着させた誘電体材料である試料２６からなる３層構造体を有する。なお、試料２６の厚みが有限の場合は、空気を含めた４層構造となる。
【００４９】
図１において、励起光源１０から照射された励起光は、通常、高屈折率プリズム２２を介して金属薄膜２４に入射した後、同じ反射角度でプリズム側に反射する。励起光は、図１の紙面に平行な方向に振動するｐ偏光成分と、垂直な方向に振動するｓ偏光成分を有する。金属薄膜２４で反射する光を、以下、単に「反射光」という。励起光源１０および受光部品４０は、手動またはＰＣ５０による自動制御にて、励起光が照射された金属薄膜２４表面上の点を中心とする円周上を走査させることができる。
【００５０】
励起光が全反射するように金属薄膜２４に入射した場合に、金属薄膜２４付近で生じる現象を微視的に見ると、図１に示すように、金属薄膜２４の微小近傍において（ｄ_ｓｐは波長程度の距離で、例えば、約１μｍ）、いわゆるエバネッセント波（近接場）が形成される。エバネッセント波は、金属薄膜２４から遠ざかる方向には指数関数的に減衰し、空間中を伝播しないが、金属薄膜２４に平行な方向には伝播し、その波数は真空中における光波の波数よりも大きい。
【００５１】
一方、励起光のｐ偏光により、金属薄膜２４内の自由電子が縦振動し、縦波として金属薄膜２４を伝播する。この縦波の波数は、真空中（空気中）を伝播する光波よりも大きい。そして、エバネッセント波の波数が自由電子の縦波の波数と一致するように入射角θ_ｓｐが設定されたとき、自由電子がエバネッセント場と共鳴して、表面プラズモンが励起される。そして入射角θ_ｓｐを有するｐ偏光の光エネルギの多くが金属薄膜２４に吸収されて、表面プラズモンを形成するため、同じ角度θ_ｓｐで反射する反射光だけが暗くなる（その強度が実質的に減衰する）。このように反射光の強度が減衰して極小となり、表面プラズモンが形成されるときの角度θ_ｓｐを共鳴角といい、この状態を表面プラズモン共鳴状態という。こうして表面プラズモン共鳴状態にあるエバネッセント場は、図２に示すように、金属薄膜２４と試料２６の間の界面において、励起光の数百倍の強度をもつ極めて強い特異的な（不連続な）電磁場を有し、試料２６の厚み方向に向かうに従って指数関数的に減衰し、波長程度の近傍領域ｄ_ｓｐにおいては、上記界面の電磁場の１／ｅ倍の電磁場を有する。この現象を表面プラズモンの電場増強作用といい、ｄ_ｓｐを「浸み出し長」または「浸入長」という。このように、表面プラズモン共鳴状態にあるエバネッセント場とは、金属薄膜２４と試料２６の界面にまとわりついた局在的で、格段に増強された電磁場である。
【００５２】
ところで、ＤＮＡや蛋白質などの試料２６内には、一般に、数ナノメートルの大きさを有する極めて微小な試料分子２７が含まれており、この試料分子２７は、上述の表面プラズモン共鳴状態にあるエバネッセント場に存在するとき（近傍領域ｄ_ｓｐ内に存在するとき）、格段に増強された励起光の数百倍の電磁場を受けて強く蛍光励起される。このように、非常に強力な電磁場で蛍光励起されるため、試料分子２７は、必ずしも蛍光特性の強い分子（以下、「蛍光分子」という。）である必要はなく、あるいは本来試料中に存在しない蛍光分子を注入して、試料分子２７を染色しなくてもよい。すなわち、本発明の表面プラズモンによる強い電磁場を用いて、試料２６内に含まれる任意の試料分子２７を蛍光発光させることができ、蛍光分子による染色に起因する試料の測定精度の低下を防止することができる。
【００５３】
こうして励起された蛍光は、上述のように、極めて微小な試料分子２７を発光中心とする点発光であるので、大きな空間周波数（波数）を有し、比較的に広範な波数を含む。このとき、波数が２π／λ_２（λ_２：空間中を伝播するときの蛍光波長）である蛍光だけが空間中を伝播できるが、それより大きい波数を有する多くの蛍光は、空間中を伝播することができず、上述の励起光により形成されたエバネッセント場とは異なる別の（第２の）エバネッセント場を形成する。この第２のエバネッセント場は、同様に、試料分子２７の近傍に局在し、試料分子２７から離れるに従って指数関数的に減衰する電場強度分布を有する。そして、金属薄膜２４の自由電子の縦波の波数と、第２のエバネッセント場の波数が一致するとき、第２のエバネッセント場と金属薄膜２４の自由電子が共鳴し、上述の表面プラズモンとは異なる第２の表面プラズモンが励起される。このとき、第２の表面プラズモンの電場増強作用により、第２の表面プラズモンの波数と一致する波数を有するｐ偏光成分の蛍光だけが著しく増強される。
【００５４】
その結果、第２の表面プラズモンにより増強されたｐ偏光成分の蛍光は、高屈折率プリズム２２を介して、所定の蛍光放射角度θ_ｆｌで放射される。したがって、この現象を巨視的に見ると、ターゲット２０から放射される蛍光は、蛍光放射角度θ_ｆｌにおいてピーク強度を有するように放射される。このように第２の表面プラズモンにより増強された蛍光のピーク強度は、表面プラズモンにより増強されることなく等方的に放射される蛍光の光強度に比して、数十ないし数百倍強い。
【００５５】
励起光を用いて第１の表面プラズモンを形成するとき、励起光の光エネルギが第１の表面プラズモンに内在されるエネルギに変換されるために、反射角度θ_ｓｐで反射する反射光の強度が極小となるプロセスに対して、励起された蛍光を用いて第２の表面プラズモンを形成するとき、第２の表面プラズモンに内在されるエネルギが光エネルギに変換されるために、蛍光放射角度θ_ｆｌで放射される蛍光がピーク値を有するように増強されるプロセスは、互いに表裏一体のプロセスであるといえる。
【００５６】
蛍光放射角度θ_ｆｌで放射する蛍光が増強されるプロセスを検証するための実験を以下のように行った。励起光源１０としてアルゴンレーザ（波長λ_１＝約５１４．５ｎｍ）、金属薄膜２４として銀薄膜（膜厚ｄ_ｍ＝約５０ｎｍ）、試料２６としてローダミン６Ｇ水溶液を用い、高屈折率プリズム（屈折率ｎ＝約１．７３）を入射角θ_ｓｐ（＝約５６．９°）で銀薄膜２４に照射して、上述の第１および第２のプラズモンを励起した。このとき、励起光が照射された銀薄膜２４の表面上の点を中心とする円周上に受光部品４０を走査させて、試料分子２７からの蛍光強度の角度依存性をプロットした。このとき、反射光カットフィルタ４２をターゲット２０と受光部品４０の間に挿入して、反射光を遮光し、受光部品４０は、蛍光だけを受光するように構成した。こうして図３（ａ）に示すグラフを得、蛍光放射角度θ_ｆｌ（＝約５５．９°）でピーク強度を有する蛍光が確認された。さらに、反射光カットフィルタ４２と受光部品４０の間に偏光板（図示せず）を配置して、ピーク強度を有する蛍光のｐ偏光成分およびｓ偏光成分の角度依存性をプロットとしたところ、それぞれ図３（ｂ）および（ｃ）を得た。これらのグラフから明らかなように、蛍光のｐ偏光成分はピーク強度を有する一方、蛍光のｓ偏光成分はピーク強度を有さない。これは、表面プラズモンによってｐ偏光の蛍光だけが増強されたことを裏付けている。
【００５７】
本発明に係る実施形態１の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、受光部品４０は、上述の蛍光放射角度θ_ｆｌで放射されるピーク強度を有する蛍光を検出できるような位置に配置される。
【００５８】
ＰＣ５０は、Ｘ−Ｙステージ３０のステップモータを駆動して、Ｘ−Ｙステージ３０を移動させ、蛍光のピーク強度の電気信号と、これを受信したときのステージ座標とを関連付けてメモリ部品（図示せず）に記憶し、これらの情報を元に、各ステージ座標における蛍光強度をモニタ表示する。こうして、表面プラズモンにより増強された蛍光を利用して、試料２６の顕微鏡画像を得ることができる。なお、Ｘ−Ｙステージ３０の移動量を小さくするほど、拡大率の大きい蛍光画像を得ることができる。
【００５９】
以上のように、本発明に係る実施形態１の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、受光部品４０が、第２の表面プラズモンにより増強された蛍光を検出できるような位置（蛍光放射角度θ_ｆｌ）に配置されるので、表面プラズモンにより励起されない蛍光に比べて数十ないし数百倍強い蛍光を検出でき、高精度の蛍光顕微鏡画像を実現することができる。
【００６０】
なお、反射光カットフィルタ４２は、取り外しできる（着脱可能である）ように構成してもよい。すなわち、反射光カットフィルタ４２を取り外したとき、受光部品４０は、反射光を含むターゲット２０から放射されるすべての光を受光し、取り付けたとき、反射光だけを遮光して蛍光だけを受光する。反射光カットフィルタ４２は、反射光とほぼ同じ波長帯域を有する光だけを遮光する光バンドパスフィルタであってもよいが、当業者ならば容易に理解されるような他の遮光フィルタであってもよい。
【００６１】
本発明に係る実施形態１の表面プラズモン蛍光顕微鏡は、反射光が遮光されないとき、反射光の極小強度を受光部品４０により検出して、表面プラズモン共鳴状態における共鳴角θ_ｓｐを検出することができる。同様に、表面プラズモンの波数は、金属薄膜２４の屈折率および膜厚と、試料２６の屈折率に依存して変化するので、励起光の波長λ_１、金属薄膜２４の屈折率および膜厚が既知であるとき、試料２６の屈折率をＰＣ５０により算出することが可能となる。
【００６２】
実施形態２．
図４ないし図８を参照しながら、本発明に係る表面プラズモン蛍光顕微鏡の実施形態２について以下詳細に説明する。図４において、実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡２は、概略、励起光を照射するＨｅ−Ｎｅレーザなどの励起光源１０と、励起光を拡大するビーム・エクスパンダ１２と、拡大された励起光を集光させる対物レンズ６０（開口率は、例えば１．３）と、励起光が照射されるターゲット２０と、ターゲット２０を平行移動させる試料ステージ３０と、ターゲット２０からの光を受光するＣＣＤエリアセンサなどの受光部品４０とを備える。
【００６３】
また、この表面プラズモン蛍光顕微鏡２は、励起光源１０からの励起光を透過し、ターゲット２０からの光を反射するハーフミラー７０と、受光部品４０上に結像させる集光レンズ７２とを有する。さらに任意であるが、ビーム・エクスパンダ１２とハーフミラー７０の間の光路上に、拡大された励起光をターゲット２０へ案内するためのミラー７４を設けてもよい。この表面プラズモン蛍光顕微鏡２は、実施形態１と同様、任意の無線または有線技術を用いて、試料ステージ３０および受光部品４０と通信できるＰＣ５０を有する。
【００６４】
実施形態２のターゲット２０は、図４において、試料ステージ３０に固定されたカバーガラス２３と、その上側表面に密着または蒸着された金属薄膜２４と、金属薄膜２４の上側表面に密着させた試料２６とを有する。また、カバーガラス２３と対物レンズ６０の間において、高い屈折率（例えば、約１．５）を有するマッチングオイル６２が配置されている。なお、金属薄膜は、例えば、約５０ｎｍの膜厚を有する銀薄膜または金薄膜であってもよいが、好適には、銀薄膜（例えば、約４４ｎｍ厚）と金薄膜（例えば、約５ｎｍ厚）の積層体であり、銀薄膜側にカバーガラス２３、金薄膜側に試料２６が密着している。
【００６５】
このように構成された表面プラズモン蛍光顕微鏡２において、励起光源１０から照射された励起光は、ビーム・エクスパンダ１２により拡大され、ミラー７４で反射し、ハーフミラー７０を透過して、対物レンズ６０へ入射する。対物レンズ６０に入射した励起光は、金属薄膜２４上に焦点を結ぶように集光される。したがって、励起光は、入射角が０°からθに至るあらゆる角度で、金属薄膜２４上の焦点に照射される。実施形態１と同様、励起光のｐ偏光により金属薄膜２４内の自由電子が縦振動し、この縦波振動の波数がエバネッセント波の波数と一致するような共鳴角θ_ｓｐを有するｐ偏光成分の励起光が金属薄膜２４に吸収されて、第１の表面プラズモンが形成されるとき、同じ角度θ_ｓｐで反射する反射光だけが暗くなる。その結果、ターゲット２０から反射された反射光をＣＣＤエリアセンサ４０上に結像させると、図５（ａ）に示すように、（細かくハッチングを付した）真っ暗な背景において、円形の明るい領域の内側に暗いリング状の領域を有する像４４（これを「暗環」という。）を得る。ただし、図５（ａ）のように、暗環４４の暗いリング状の領域を完全に連続的にするためには、四分の一波長板（図示せず）を光路上に配置して、励起光を直線偏光から円偏光またはランダム偏光にしておく必要がある。また受光部品４０は、その各センサ座標における光強度を電気信号に変換して、ＰＣ５０へ送信する。
【００６６】
ＰＣ５０は、各センサ座標とその反射光強度を関連付けて、図６のブロック図で示す第１メモリ８０に記憶する。共鳴角θ_ｓｐは、図５（ａ）に示す暗環４４の半径Ｒ_１（以下、「暗環半径」という。）と対応しているので、屈折率演算部８１は、センサ座標上の暗環４４の暗環半径Ｒ_１を計算して共鳴角θ_ｓｐを求め、さらに試料の屈折率を求めることができる。こうして得られた各センサ座標とその反射光強度に関する情報、または共鳴角θ_ｓｐと試料の屈折率に関する情報が、表示制御部８２を介して、ディスプレイ装置などのＰＣ表示部８３に画像表示される。
【００６７】
実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡２は、実施形態１と同様、ハーフミラー７０と集光レンズ７２の間に着脱可能に配置された反射光カットフィルタ４２を有する。反射光カットフィルタ４２を挿入した状態で反射光を遮光したとき、受光部品４０はターゲット２０からの蛍光だけを検出する。このとき、受光部品４０のセンサ座標上に、図５（ｂ）に示すように、（同様に細かくハッチングを付した）真っ暗な背景において、（粗くハッチングを付した）円形の薄暗い領域の内側にリング状の明るい領域４６（これを「輝環」という。）が結像される。この輝環４６の半径Ｒ_２（以下、「輝環半径」という。）は、著しく増強された蛍光が放射される蛍光放射角度θ_ｆｌに依存する。なお、実施形態２においては、反射光を遮光して、蛍光だけを受光部品４０へ案内するために、反射光カットフィルタ４２とハーフミラー７０を用いたが、択一的には、反射光の波長を含む波長域の光を透過し、蛍光の波長を含む波長域の光を反射するダイクロイックミラーを用いてもよい。
【００６８】
ＰＣ５０は、同様に、各センサ座標とその蛍光強度を関連付けて、図６のブロック図で示す第１メモリ８０に記憶し、屈折率演算部８１により、センサ座標上の輝環４６の輝環半径Ｒ_２を計算して、蛍光放射角度θ_ｆｌを求め、さらに試料の屈折率を求めることができる。こうして得られた各センサ座標とその蛍光強度に関する情報、または蛍光放射角度θ_ｆｌと試料の屈折率に関する情報が、表示制御部８２を介してＰＣ表示部８３に画像表示される。以上のように、本発明の表面プラズモン蛍光顕微鏡によれば、共鳴角θ_ｓｐおよび蛍光放射角度θ_ｆｌの両方から試料の屈折率を求めることができるので、より精度の高い屈折率測定が可能となる。
【００６９】
さらにＰＣ５０は、図６に示す蛍光強度演算部８４において、適当なソフトウェアプログラムを用いて、第１メモリ８０に格納された蛍光強度をすべてのセンサ座標において積算する（足し合わせる）ことにより、励起光が照射される金属薄膜２４上の焦点における積算蛍光強度を求める。次に、ＰＣ５０は、ステージ駆動部８６を用いて、試料ステージを微小変位させ、励起光が照射される金属薄膜２４上の焦点を移動させて、同様に、蛍光強度演算部８４を用いて、移動させた焦点における積算蛍光強度を求める。これを反復して行い、試料ステージ３０上の各ステージ座標における積算蛍光強度を走査する。
【００７０】
ＰＣ５０は、各ステージ座標とその積算蛍光強度を関連付けて、図６に示す第２メモリ８５に記憶するとともに、表示制御部８２を介してＰＣ表示部８３に画像表示する。各ステージ座標を細分化することにより、拡大率の大きい蛍光画像を得ることができる。
【００７１】
このように、本発明に係る実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡において、受光部品４０が、第２の表面プラズモンにより増強された蛍光を検出できるので、表面プラズモンにより励起されない蛍光に比べて数十ないし数百倍強い蛍光を検出し、精度の高い蛍光画像を得ることができる。
【００７２】
ところで、多くの分子は、一般に、非対称性の構造を有するので、光の照射方向により屈折率が異なり、つまり光学的な異方性を有する。液体や固体中に分散した分子はランダムに動き回るため、巨視的には等方性を有する物質のように振舞うが、結晶状態や液晶状態もしくは特異的な吸着作用などにより一定方向に整列・配向された分子は、分子本来が有する異方性を顕著に現す。このように異方性分子を一定方向に配向した試料２６について、本発明の表面プラズモン蛍光顕微鏡を用いて画像形成すると、光の照射方向により、屈折率が変わるので、金属薄膜２４上に生じる表面プラズモンの波数が変化し、ひいては第１の表面プラズモンを励起する励起光の共鳴角θ_ｓｐおよび第２の表面プラズモンにより増強放射される蛍光の蛍光放射角度θ_ｆｌが変化する。したがって、実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡２において、励起光は対物レンズ６０を介して光軸の周りの３６０度方向から入射されるが、試料２６が異方性を有するとき、受光部品４０のセンサ座標上に結像される暗環４４および輝環４６は、真円ではなく、楕円形状を有する。換言すると、暗環４４および輝環４６が楕円として検出されたとき、扁平率および扁平方向を計測し、これらの情報から試料分子２７の配向方向および異方性の度合いを検出することができる。
【００７３】
（変形例）
図７に示す実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡の変形例２’において、ＣＣＤエリアセンサ４０と置換可能なスペクトルアナライザ４８を設けてもよい。すなわち、増強された蛍光を検出した後に、ピーク強度を与えるセンサ座標上に、受光部品４０の代わりにスペクトルアナライザ４８（もしくはスペクトルアナライザ４８に接続された光ファイバ）を配置する。表面プラズモンにより増強された蛍光は、一般に、レーザ光よりも比較的に幅広で、試料分子２７に依存するスペクトル分布を有することが知られている。
【００７４】
ＰＣ５０は、図６に示すアナライザ駆動部８９によりスペクトルアナライザ４８を駆動して、検出すべき試料分子２７に関して、例えば、図８（ａ）に示すようなスペクトル分布を得る。一方ＰＣ５０は、検出する可能性のある既知の試料分子２７に関するスペクトル分布を事前にサンプリングして、例えば、図８（ｂ）および（ｃ）に示すような標準スペクトル分布を標準スペクトルメモリ８８に記憶している。したがって、この変形例によるＰＣ５０は、試料同定部８７において、検出すべき試料分子２７のスペクトル分布と、標準スペクトルメモリ８８に格納された標準スペクトル分布を比較することにより、試料分子２７を特定することができる。具体的には、検出された試料分子２７は、図８（ｃ）の標本スペクトル分布と類似するスペクトル分布を有するとき、試料分子２７は標本Ｂであると同定できる。
【００７５】
このように、この変形例に係る表面プラズモン蛍光顕微鏡２’によれば、増強された蛍光のスペクトル分布を検出することにより、試料２６内の試料分子２７を精度よく特定することができる。
【００７６】
実施形態３．
本発明に係る表面プラズモン蛍光顕微鏡の実施形態３について以下詳細に説明する。実施形態３の表面プラズモン蛍光顕微鏡３は、励起光源として近赤外域発光の超短パルスレーザを用いること以外、実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡２と同様の構造を有するので、重複する部分に関する詳細な説明を省略する。
【００７７】
表面プラズモン蛍光顕微鏡３の近赤外域発光の超短パルスレーザは、約６００ｎｍないし約１０００ｎｍの波長を有するレーザ光を、フェムト秒（１０^−１５秒）オーダの極めて短い時間に照射するパルスレーザである。
【００７８】
試料分子２７を蛍光励起するとき、通常、照射された１つのフォトン（励起光）の光エネルギ（Ｅ＝ｈν：ｈはプランク定数、νは振動数）を用いて蛍光励起するが、紫色の蛍光を励起するためには、同様に紫色の（あるいはそれより短い波長の）励起光が必要となる。ところが、紫外域などの短波長光を金属薄膜２４に照射した場合、金属中の自由電子が短波長光の波数と一致するように振動できないため（追従できないため）、表面プラズモンが形成されない。したがって、表面プラズモンを効率よく励起するためには、近赤外域の長波長光を利用することが望ましい。このように、蛍光励起するためのエネルギを１つのフォトンの光エネルギで供給する手法を一光子蛍光励起法という。
【００７９】
これに対し、複数のフォトンを同時に試料分子２７に照射することにより、複数のフォトンエネルギを用いて、１つのフォトンエネルギで励起される蛍光波長より短波長の蛍光を励起する多光子蛍光励起法が考案されている。具体的には、８００ｎｍの波長を有する２つのフォトンを同時に試料分子２７に照射して、フォトン２つ分の光エネルギ（Ｅ＝２×ｈ×８００^−１）を用いて、４００ｎｍの紫外域の蛍光（Ｅ＝１×ｈ×４００^−１）を励起する。
【００８０】
ＤＮＡや蛋白質に含まれる試料分子２７は、紫外域において、より高効率で蛍光励起されることが知られている。したがって、実施形態３の表面プラズモン蛍光顕微鏡３によれば、多光子蛍光励起法を採用し、表面プラズモンの形成を阻害することなく、紫外域の蛍光を効率よく励起することができる。こうして、この表面プラズモン蛍光顕微鏡３は、さらに高強度の蛍光を検出して、より鮮明な蛍光画像を得ることができる。
【００８１】
実施形態４．
図９および図１０を参照しながら、本発明に係る表面プラズモン蛍光顕微鏡の実施形態４について以下詳細に説明する。図９において、実施形態４の表面プラズモン蛍光顕微鏡４は、対物レンズ６０の代わりにマイクロレンズアレイ６４を用いた点以外、実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡２と同様の構成を有するので、重複する部分に関する詳細な説明を省略する。
【００８２】
図９に示すように、実施形態４の表面プラズモン蛍光顕微鏡４のマイクロレンズアレイ６４は、複数のマイクロレンズ６６を有し、各マイクロレンズ６６が励起光を金属薄膜２４上の異なる焦点に集光するように配置されている。図９においては、３つのマイクロレンズ６６を図示したが、これに限定されることなく、任意のマイクロレンズ６６を設けてもよい。一例として、５行×５列のマトリックス状に配置された２５個のマイクロレンズ６６を有するマイクロレンズアレイ６４の平面図を図１０に示す。
【００８３】
図１０に示すマイクロレンズアレイ６４を用いることにより、試料ステージ３０を移動（走査）させることなく、２５ポイントのステージ座標における蛍光を同時に検出することができる。したがって、実施形態４の表面プラズモン蛍光顕微鏡４によれば、蛍光を検出して、試料全体の蛍光画像を得るのに必要な時間を実質的に低減することができる。
【００８４】
実施形態５．
図１１を参照しながら、本発明に係る表面プラズモン蛍光顕微鏡の実施形態５について以下詳細に説明する。実施形態５の表面プラズモン蛍光顕微鏡５は、ハーフミラーを用いることなく、図１０に示すように、励起光源１０からの励起光が対物レンズ６０の左側半分の領域に入射されるようにミラー７６を配置し、かつ対物レンズ６０の右側半分の領域から出射される光が受光部品４０へ案内されるように別のミラー７８を配置する点以外、実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡２と同様の構成を有するので、重複する部分に関する詳細な説明を省略する。
【００８５】
上述のように、図１１に示す実施形態５の表面プラズモン蛍光顕微鏡５において、励起光は、対物レンズ６０の左側半分の領域にのみ入射され、反射光および蛍光は、対物レンズ６０の右側半分の領域からのみ出射される。このとき、集光レンズ７２からの蛍光を受光部品へ案内するミラーは、励起光を遮光しないように、励起光源１０と対物レンズ６０の間の光路の外側に配置されている。このようにハーフミラー７０を用いないので、励起光がハーフミラー７０で反射されることなく、反射光および蛍光がハーフミラー７０を透過することもないので、より強い励起光をターゲット２０に照射し、受光部品４０は、より強い反射光および蛍光を受光することができる。また、受光部品４０に結像する暗環４４および輝環４６は、完全な一円形状ではなく、半円形状を有するが、受光面積を小さくできるので、システム全体を小型化できる。こうして、表面プラズモン蛍光顕微鏡の実施形態５によれば、より高強度の蛍光を受光して、より高精度の蛍光画像を形成することができる。
【００８６】
【発明の効果】
本発明の表面プラズモン蛍光顕微鏡によれば、受光部品は、第２の表面プラズモンにより増強され、蛍光放射角度で放射されるピーク強度を有する蛍光を検出するように構成されているので、表面プラズモンにより励起されない蛍光に比べて数十ないし数百倍強い蛍光を検出して、精度の高い蛍光画像を得ることができる。
【００８７】
また、共鳴角および蛍光放射角度の両方から試料の屈折率を求めることができるので、より精度の高い屈折率測定が可能となる。
【００８８】
表面プラズモンにより励起された強い励起光のスペクトル分布を測定することにより、試料に含まれる試料分子を精度よく特定することができる。
【００８９】
さらに、多光子蛍光励起法を採用し、表面プラズモンの形成を阻害することなく、紫外域の蛍光を効率よく励起することができる。こうして、さらに高強度の紫外域の蛍光を検出して、より鮮明な蛍光画像を得ることができる。
【００９０】
また、マイクロレンズアレイを用いることにより、試料ステージ移動させることなく、複数のステージ座標における蛍光を同時に検出できるので、試料全体の蛍光画像を得るのに必要な時間を実質的に低減することができる。
【００９１】
ハーフミラーを用いないので、励起光がハーフミラーで反射されることなく、反射光および蛍光がハーフミラーを透過することなく、より強い励起光をターゲットに照射し、受光部品はより強い反射光および蛍光を受光することができる。こうして、より高精度の蛍光画像を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係る実施形態１の表面プラズモン蛍光顕微鏡の構成を示す概略図である。
【図２】図２は、表面プラズモンが共鳴状態にあるときのエバネッセント場の電磁波強度を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）は、表面プラズモンにより増強された蛍光の放射角度依存性を示すグラフであり、図３（ｂ）および図３（ｃ）は、それぞれ、この蛍光のｐ偏光およびｓ偏光の放射角度依存性を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明に係る実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡の構成を示す概略図である。
【図５】図５（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、センサ座標上に結像されたリング状の暗い領域と明るい領域を示す。
【図６】図６は、実施形態２の表面プラズモン蛍光顕微鏡のブロック図である。
【図７】図７は、実施形態２の変形例による表面プラズモン蛍光顕微鏡の構成を示す概略図である。
【図８】図８（ａ）は、試料に対する測定スペクトル分布を示し、図８（ｂ）および（ｃ）は、検出する可能性のある標本に対する標本スペクトル分布を示す。
【図９】図９は、実施形態４の表面プラズモン蛍光顕微鏡の構成を示す概略図である。
【図１０】図１０は、５行×５列のマトリックス状に配置されたマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイの平面図である。
【図１１】図１１は、実施形態５の表面プラズモン蛍光顕微鏡の構成を示す概略図である。
【符号の説明】
１，２，３，４，５…表面プラズモン蛍光顕微鏡、１０…励起光源、１２…ビーム・エクスパンダ、２０…ターゲット、２２…高屈折率プリズム、２３…カバーガラス、２４…金属薄膜、２６…試料、２７…試料分子、３０…Ｘ−Ｙステージ、４０…受光部品、４２…反射光カットフィルタ、４４…暗環、４６輝環、４８…スペクトルアナライザ、５０…パーソナルコンピュータ、６０…対物レンズ、６２…マッチングオイル、６４…マイクロレンズアレイ、６６…マイクロレンズ、７０…ハーフミラー、７２…集光レンズ、７４…ミラー、８０…第１メモリ、８１…屈折率演算部、８２…表示制御部、８３…ＰＣ表示部、８４…蛍光強度演算部、８５…第２メモリ、８６…ステージ駆動部、８７…試料同定部、８８…標準スペクトルメモリ、８９…アナライザ駆動部。

Claims (33)

1. 表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   一方の表面に試料を密着させることができる金属薄膜と、
   金属薄膜の他方の表面に密着し、試料よりも高い屈折率を有する高屈折率媒体と、
   励起光を照射する光源とを備え、
   励起光により励起された第１の表面プラズモンが、試料を蛍光発光させ、
   この蛍光により励起された第２の表面プラズモンが、試料に依存する蛍光放射角度においてピーク強度を有するように蛍光を増強し、
   第２のプラズモンにより増強された蛍光を受光する受光部品をさらに備えたことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
2. 請求項１に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   励起光を金属薄膜上の焦点に集光させる光学部品をさらに備えたことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
3. 請求項１または２に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   光学部品と受光部品の間の光路上に配置され、励起光が金属薄膜で反射された反射光を遮光する着脱可能な反射光カットフィルタをさらに備えたことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
4. 請求項３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   受光部品は、２次元マトリックスセンサであって、
   反射光カットフィルタが反射光を遮光するとき、２次元マトリックスセンサのセンサ座標と、各センサ座標において受光した蛍光の強度とを関連付けて記憶する第１のメモリ部品を備えたことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
5. 請求項４に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   すべてのセンサ座標における蛍光の強度を積算して、積算蛍光強度を求めるための蛍光強度演算部と、
   励起光の焦点を金属薄膜上において走査させるために、高屈折率媒体に固定された試料ステージと、
   試料ステージのステージ座標と、各ステージ座標の積算蛍光強度とを関連付けて記憶する第２のメモリ部品とをさらに備えたことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
6. 請求項３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   ピーク強度を有する蛍光が、センサ座標において、蛍光放射角度に依存する輝環半径を有する円周上に結像するように、光学部品を構成し、
   この輝環半径から、試料の屈折率を計算する屈折率演算部をさらに有することを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
7. 請求項３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   受光部品は、２次元マトリックスセンサであって、
   反射光カットフィルタが反射光を遮光しないとき、２次元マトリックスセンサのセンサ座標と、各センサ座標において受光した反射光の強度とを関連付けて記憶する第１のメモリ部品をさらに備えたことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
8. 請求項７に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   極小強度を有する反射光が、センサ座標において、反射角度に依存する暗環半径を有する円周上に結像するように、光学部品を構成し、
   この暗環半径から、試料の屈折率を計算する屈折率演算部をさらに有することを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
9. 請求項４、５または７に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
   第１または第２のメモリ部品に記憶された情報を元に、２次元画像を表示する画像表示部を有することを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
10. 請求項１ないし３のいずれか一に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    ピーク強度を有する蛍光のスペクトル分布を測定するスペクトルアナライザをさらに有することを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
11. 請求項１０に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    標本に対する標本スペクトル分布と、試料に対する測定スペクトル分布を比較して、試料を特定する試料同定部を有することを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
12. 請求項１ないし３のいずれか一に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    励起光源は、近赤外域の波長を有する励起光を照射する超短パルスレーザであることを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
13. 請求項１ないし３のいずれか一に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    励起光を構成する少なくとも２つのフォトンの光エネルギを同時に試料に吸収させて、励起光よりも短波長の蛍光を励起することを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
14. 請求項１２または１３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    励起光の波長が約６００ｎｍないし約１０００ｎｍであることを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
15. 請求項２または３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    光学部品は、複数の微小凸レンズを有するマイクロレンズアレイを含むことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
16. 請求項２または３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    光源と光学部品の間の光路上に配置され、励起光を光学部品へ、光学部品からの光を受光部品へ案内するハーフミラーまたはダイクロイックミラーをさらに備えたことを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
17. 請求項２または３に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    光源と光学部品の間の光路の外側に配置され、光学部品からの光を受光部品へ案内するミラーをさらに有することを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
18. 請求項１ないし３のいずれか一に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    励起光はコヒーレント光であることを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
19. 請求項１ないし３のいずれか一に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    金属薄膜は、銀薄膜と金薄膜の積層体であって、
    金薄膜上に試料を密着させ、銀薄膜上に高屈折率媒体を密着させることを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
20. 表面プラズモンにより励起された蛍光を測定する方法であって、
    一方の表面に試料を密着させることができる金属薄膜と、金属薄膜の他方の表面に密着し、試料よりも高い屈折率を有する高屈折率媒体とを含むターゲットを準備するステップと、
    励起光をターゲットに照射するステップと、
    励起光により励起された第１の表面プラズモンにより、試料を蛍光発光させるステップと、
    この蛍光により励起された第２のプラズモンにより、試料に依存する蛍光放射角度においてピーク強度を有するように蛍光を増強させるステップと、
    第２のプラズモンにより増強された蛍光を受光するステップとを有することを特徴とする測定方法。
21. 請求項２０に記載の測定方法であって、
    励起光を金属薄膜上の焦点に集光させるステップを有することを特徴とする測定方法。
22. 請求項２０または２１に記載の測定方法であって、
    反射光を遮光して、蛍光だけを受光するステップを有することを特徴とする測定方法。
23. 請求項２２に記載の測定方法であって、
    蛍光を受光するステップは、２次元マトリックスセンサを用いて受光し、
    ２次元マトリックスセンサのセンサ座標と、各センサ座標において受光した蛍光の強度とを関連付けて第１のメモリ部品に記憶するステップをさらに有することを特徴とする測定方法。
24. 請求項２３に記載の測定方法であって、
    すべてのセンサ座標における蛍光の強度を積算して、積算蛍光強度を得るステップと、
    励起光の焦点を金属薄膜上において走査させるステップと、
    試料ステージのステージ座標と、各ステージ座標の積算蛍光強度とを関連付けて第２のメモリ部品に記憶するステップとをさらに有することを特徴とする測定方法。
25. 請求項２３または２４に記載の測定方法であって、
    第１または第２のメモリ部品に記憶された情報を元に、２次元画像を表示するステップを有することを特徴とする測定方法。
26. 請求項２１または２２に記載の測定方法であって、
    ピーク強度を有する蛍光を、センサ座標において、蛍光放射角度に依存する輝環半径を有する円周上に結像させるステップと、
    この輝環半径から、試料の屈折率を計算するステップとをさらに有することを特徴とする測定方法。
27. 請求項２６に記載の測定方法であって、
    輝環が楕円形状を有するとき、その扁平方向から試料分子の配向方向を計算するステップをさらに有することを特徴とする測定方法。
28. 請求項２０ないし２２のいずれか一に記載の測定方法であって、
    ピーク強度を有する蛍光のスペクトル分布を測定するステップをさらに有することを特徴とする測定方法。
29. 請求項２８に記載の測定方法であって、
    標本に対する標本スペクトル分布と、試料に対する測定スペクトル分布を比較して、試料を特定するステップを有することを特徴とする測定方法。
30. 請求項２０ないし２２のいずれか一に記載の測定方法であって、
    励起光は、近赤外域の波長を有する超短パルスレーザ光であることを特徴とする測定方法。
31. 請求項２０ないし２２のいずれか一に記載の測定方法であって、
    励起光よりも短波長の蛍光が励起されるように、励起光を構成する少なくとも２つのフォトンの光エネルギを同時に試料に吸収させるステップを有することを特徴とする測定方法。
32. 請求項３０または３１に記載の測定方法であって、
    励起光の波長が約６００ｎｍないし約１０００ｎｍであることを特徴とする表面プラズモン蛍光顕微鏡。
33. 請求項２０ないし２２のいずれか一に記載の表面プラズモン蛍光顕微鏡であって、
    励起光を金属薄膜上の複数の焦点に集光させるステップを有することを特徴とする測定方法。

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