JP4016938B2 - 光学顕微鏡測定装置 - Google Patents
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Description
全反射熱レンズ法を微小領域の顕微測定に応用すると高感度な測定が可能であるとともに、蛍光処理が不要であることから、生体膜中に存在するレセプターや酵素などの反応メカニズムの解析手段など基礎研究分野への有用性が大きく、新たな測定技術として新市場を形成することが期待されている。
また、この紙面に対して垂直方向(この方向をy方向とする)に動かしても、同様に相対位置は変化せず、また焦点は界面上にある。
そのため、プリズム3と試料7とをx、y方向に走査し、全反射熱レンズ法による信号強度分布を測定することで、界面近傍の試料7の像(顕微像)が得られる(非特許文献1、2参照)。
下坂琢哉他、日本分析化学会年会要旨集(2001年11月23日),p258 T. Shimosaka, et al., Analyst, 2003, 128, 562-565. T. Shimosaka, et al., Analytical Chemistry, 2000, 72, 3532-3538.
しかしながら、試料の測定点を光学顕微鏡で観察できるようにするためには、光学顕微鏡の対物レンズを、プローブ光が通過する位置に置かなければならない。また、台形プリズムが置かれた位置に対物レンズを置かなければならない。
したがって、以下のようないくつかの課題を有していた。
また、試料界面(表面)像を得るために、励起光の焦点を試料界面に合わせる必要があるが、励起光焦点が試料界面に来ていることを確認することが困難であった。
これにより励起光は対物レンズを通過した後、大きく屈折して試料界面に斜め入射することとなり、試料界面で全反射するようになる。一方、プローブ光は対物レンズの中央部分を通過した後、光軸に平行にまっすぐ進むようになる。
なおプローブ光の焦点は必ずしも界面上にある必要はなく、むしろ調整時にわずかに界面からずれている方が熱レンズによる屈折の影響を受けて後述するプローブ光検出器における信号を強くすることができるので、超長焦点距離の非コリメート光にして対物レンズのピントが合った状態のときに焦点位置が界面からわずかにずれるようにしてもよい。
そして、光学顕微鏡による目視下で励起光とプローブ光とが測定しようとする試料位置(測定点)にくるように試料を移動し、測定点、励起光、プローブ光が正確に重なるようにする。
そのため、測定点を中心として界面近傍に温度分布が形成され、この温度分布により屈折率分布が発生し、測定点(焦点)近傍に他の領域よりも屈折率が小さい屈折率勾配(熱レンズ)が形成される。
この通過光量の変化を検出器により検出することにより、測定位置の屈折率の変化を検出することができ、例えば屈折率の変化に基づいて測定点近傍に存在する試料量を求めることができる。
これによれば、走査手段により対物レンズに対する試料の位置を相対的に変化させながら測定を繰り返すことにより、試料の屈折率分布を反映する二次元像を得ることができる。
さらに、ピント合わせを行ったときに励起光とプローブ光との光路が試料界面で一致しているかを確認することが容易になり、また、一致していない場合でもそれぞれの光を確認しながら調整できるので作業が容易になる。
これによれば、測定点から励起光やプローブ光の光路が外れているような場合であっても、光学顕微鏡目視下において、光軸調整部を調整することにより、励起光光路やプローブ光光路を微調整することができる。
この光学顕微鏡測定装置は、主に、光学顕微鏡本体16と、試料透過光を検出する検出器19と、励起光光源20と、プローブ光光源21と、励起光光源20からの励起光Eの光軸を調整するミラー22と、プローブ光光源21からのプローブ光Pの光軸を調整するミラー23と、顕微鏡下で励起光、プローブ光を調整する際に光量を落として調整しやすくしたり、信号が飽和したときに信号強度を調整したりする場合に使用される光量調整器24(例えば直線偏光板)とから構成される。
nosinΘo=ngsinΘg=nssinΘs (1)
の関係が成り立つ。
ここで、全反射するためには、
sinΘs=(no/ns)sinΘo>1 (2)
を満たさなければならない。 ここでsinΘo<1であるので、no>nsでなければならない。
なお、オイルの屈折率として現実的な値は1.5程度であるが、オイル・カバーガラス間で全反射しないようにオイルの屈折率>カバーガラスの屈折率の関係を満たすかぎりは屈折率は1.5以上でよい。
対物レンズ12の周縁部分を通過した励起光Eの光路は、図2に示すように大きく屈折し、その結果、屈折した励起光が試料30面に対して浅い角度で斜めに入射し、全反射するようにしてある。
上述したように、スライドガラス31とカバーガラス33とにより挟まれ、さらに周囲をオイル32、34により覆った試料30が、XYステージ上にセットされる。
12:対物レンズ
15:XYステージ
16:光学顕微鏡測定装置
17:ハーフミラー
18:ポート
19:検出器
20:励起光光源
21:プローブ光光源
22、23:ミラー(光路調整部)
24:光量調整器
30:試料
35:アパーチャ
E:励起光
P:プローブ光
Claims (6)
- 対物レンズを用いて測定点を光学的に観察する光学顕微鏡本体と、
励起光を照射する光源と、
励起光を対物レンズの光軸に平行に入射させるとともに対物レンズの周縁部分を通過させて励起光を屈折させ測定点に対して斜めに入射させることにより励起光が試料界面で全反射するようにした励起光入射光学系と、
プローブ光を照射する光源と、
プローブ光を対物レンズの光軸に平行に入射させるとともに対物レンズの中央部分を通過させてプローブ光を測定点に垂直入射させることによりプローブ光が測定点を通過するようにしたプローブ光入射光学系と、
試料を通過したプローブ光を検出する検出器とを備え、
励起光によって生じる測定点近傍の屈折率の変化を、試料を通過するプローブ光により検出することを特徴とする光学顕微鏡測定装置。 - 励起光入射光学系は励起光をコリメートな光にして対物レンズに入射するとともに、プローブ光入射光学系はプローブ光を非コリメートな光にして対物レンズに入射するようにして、対物レンズを通過した励起光の焦点位置とプローブ光の焦点位置とが異なるようにすることを特徴とする請求項1に記載の光学顕微鏡測定装置。
- 測定点を二次元的に走査する走査手段をさらに備えたことを特徴とする請求項1記載の光学顕微鏡測定装置。
- 励起光とプローブ光とは、波長が異なるレーザー光を用いることを特徴とする請求項1に記載の光学顕微鏡測定装置。
- 対物レンズには励起光に対して色収差が生じないレンズが用いられることを特徴とする請求項1記載の光学顕微鏡測定装置。
- 少なくとも励起光入射光学系またはプローブ光入射光学系のいずれかに入射光の光軸を調整する光軸調整部をさらに備えたことを特徴とする請求項1記載の光学顕微鏡測定装置。
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