JP5432186B2 - 蛍光検出装置 - Google Patents
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Description
例えば非特許文献1では、蛍光1分子観察において、エバネッセント場を生成するために、プリズム平面とサンプル基板を平行かつ向かい合わせに配置し、その間を両者の屈折率を整合させるマッチング液で満たす構成が用いられている。
るための条件は、
θp>sin−1(naq/np) (数1)
α≦θpのとき、sin(θi−α)=npsin(θp−α) (数2)
α>θpのとき、sin(α-θi)=npsin(α−θp) (数3)
である。
また、全反射した励起光をプリズム部外へ射出させるための、プリズム部出射面32の角度βの条件は、
β>θp−sin-1(1/np) (数4)
本実施例では、1つのプリズム部18に対し、X軸方向にサンプル領域21を複数設けたため、励起光のプリズム部入射面31への入射角は実質的に90度となるようにした。図4に示すように、入射角が入射面31に対して垂直から大きくずれた場合、励起光が入射面31で屈折するので、隣のサンプル領域21に観察視野を移動させた時、照射領域41が観察視野から外れてしまう可能性があるためである。
垂直入射の場合、α=θp=θiなので、(数1)よりα>sin-1(naq/np)となるように入射面の角度を調整した。プリズム部出射面32とサンプル基板8の成す角に関しては、照射無駄を起こさず、より密にサンプル領域21を配置するため、
β≒90°−θp (数5)
とすることが望ましい。
(プリズム幅lp)≒(サンプル領域間隔)≒(励起光照射領域)≧(観察視野)
を満たすようにすることで、サンプル領域を無駄なく配置することができる。本実施例では、対物レンズ9の倍率として60倍、結像レンズ13の点距離85mm、イメージセンサ14として、画素サイズが6.45μm角、1344×1024画素のCCDカメラを用いているため、観察視野は233μm×306μmとなる。そこで、集光レンズ7の焦点距離と位置を調整し、サンプル基板上での励起光照射領域を300μm×840μm(Y軸×X軸)とし、プリズム幅lp=1000μm、サンプル領域間隔を1000μmとなるように、プリズム部18およびサンプル領域21を作成した。プリズムのY軸方向の長さを10mmとして、プリズム部1つに対して複数のサンプル領域がカバーできるようにしたが、300μmにして、1サンプル領域視野のみをカバーするような形状でもかまわない。サンプル領域21は230μm×300μm(Y軸×X軸)内に1μm間隔で金属構造物73を配置して作成した。
本実施例の構成によると、スキャンによる照射領域のずれを防ぎ、プリズム部を小さくすることによる材料費低減の効果がある。
回折格子部の格子周期dは、θpを回折角として
θp =sin-1(nλ/d) (数6)
かつ、npを回折格子部の屈折率とした(数1)を満たすように作成した。ここで、nは0次以外の回折次数(0以外の整数)、λは励起光の波長である。励起にはどの回折次数を用いても良いが、一般的に一次の回折効率が良いことからn=+1として回折格子部を設計した。とくに本実施例では、ブレーズド回折格子を用いて、θpがブレーズド角となるようにしたが、ホログラフィック回折格子やラミナー回折格子などを用いてもかまわない。入射した励起光は、サンプル溶液23とサンプル基板8の界面で全反射し、その後、回折格子部130aまたは130bより出射することができる。
ここで、Dbは励起光のビーム径、bは回折方向(本実施例ではx軸方向)の視野サイズである。
2a、2b、2c:シャッター
3a、3b、3c:励起フィルター
4a、4b、4c:λ/4板
5a、5b:ダイクロイックミラー、5c:ミラー
6、6a、6b、6c、 120a、120b、120c:ミラー
7、7a、7b、7c、:集光レンズ
8:サンプル基板
9:対物レンズ
10:対物レンズ駆動部
11a、11b:発光フィルター
12:分散プリズム
14:イメージセンサ
15:制御部
17:サンプルステージ
18、18a:プリズム部
19a:流入路、19b:流出路
21:サンプル領域
22:接着層
23:サンプル溶液
31:プリズム部入射面
32:プリズム部出射面
41:照射領域
61:流路
62:送液ユニット
63:溶液保管ユニット
64a:サンプルリザーバ、64b:バッファーリザーバ、64c:反応液リザーバ
65:廃液タンク
71t、71a、71c、71g:蛍光修飾された塩基
72:二本鎖複合体
73:金属構造物
81:保護基
101:サンプル支持部材
102:サンプル駆動部
130a、130b、130c:回折格子部
Claims (1)
- 光源と、
複数の生体試料が外面に配置される第1の平面と、前記光源からの光が入射され、前記第1の平面の内面で全反射された光が出射され、前記複数の生体試料が配置された領域それぞれに対応して、所定の方向に所定の周期で配置された複数のプリズムが外面に形成された第2の平面とを有する基板と、
前記全反射により前記第1の平面の外面で生じたエバネッセント場で励起される前記生体試料から発せられる光を検出する、前記基板に対して前記第1の平面の外面側に配置された検出器と、
前記基板を、前記複数の生体試料のうち第1の生体試料を測定した後に第2の生体試料を測定するように、前記複数のプリズムの配置の前記所定の周期だけ移動させる駆動部とを有し、
前記複数のプリズムの各プリズムは、該プリズムに入射する前記光源からの光が隣接するプリズムから離間するように、入射面内において互いに連接して配置されており、
前記基板において前記光源からの光が入射する領域は、前記所定の方向に前記所定の周期で複数配置されること
を特徴とする蛍光検出装置。
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