JP5258457B2 - 光分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、光分析装置に関し、例えば、生体高分子に光を照射して光分析する光分析装置に関するものである。

従来から、基板の表面に配置された物体に対して励起光を照射して物体の形状を観察する方法が提案されている。例えば、特許文献１には、励起光源から出力された励起光を透明な基板に照射し、その内部で励起光を全反射させることにより、基板表面にエバネセント波を生成し、基板上の試料によるエバネセント波の散乱光を検出する装置が記載されている。ただし、特許文献１に記載の装置では散乱光を分光していない。

また、例えば、特許文献２には、エバネセント波で励起された試料成分からの蛍光及び散乱光を分光する装置が記載されている。ただし、特許文献２に記載の装置では試料成分が流路境界面に固定されていない。

一方、基板表面に複数の生体分子を固定し、特許文献１と同様に基板表面の一定範囲にエバネセント波を生成し、そのエバネセント波によって励起された生体分子の発光を画像化する装置がある。生体分子の発光には、散乱光と蛍光が有るが、生体分子の散乱光は極めて弱いので、一般に蛍光を観測する。最初は基板上に非蛍光性の生体分子を固定し、蛍光性の分子を含む反応液を基板上に流入させ、生体分子固定位置からの蛍光を観測する。これにより、生体分子と反応液中の分子との結合反応を観察することができる。例えば、始めに基板に非修飾一本鎖のＤＮＡを固定し、塩基種ごとに異なる蛍光体で修飾された蛍光修飾塩基を含む反応液を導入し、一本鎖ＤＮＡに対して相補な塩基を結合させながら、分子固定位置からの蛍光を分光すれば、固定されたＤＮＡの配列を解読することが可能である。

特開平９−２５７８１３号公報 特開２００５−７００３１号公報 Funatsu et al., Nature Vol. 374, 555-559 (1995).

基板表面上に固定された生体分子の蛍光を画像化することにより生体分子を分析する装置においては、一般に基板上のスポットごとに異なる種類の生体分子を固定し、各スポットからの蛍光を画像化によって分離して検出する。できる限り短時間で多数種の生体分子を分析し、また、消費される試薬量を低減するには、スポットは光学的に分解可能な範囲でできる限り基板上に高密度に生体分子を固定化するのが好ましい。また、１スポットあたりの試薬消費量を低減するためには、１スポット内に固定化する生体分子数は少ないほど好都合であり、１分子が理想的である。非特許文献１に記載されているように、蛍光検出法は１分子をも検出する感度を有しているけれども、少数分子からの蛍光を分光検出して良好なＳ／Ｎを得るには、損失の少ない分光イメージング法が好ましい。したがって、プリズムや回折格子などの分散素子による分散分光イメージング法、もしくはダイクロイックミラーで分光して複数のイメージセンサで画像を取得する方法（ダイクロ／マルチセンサ分光イメージング法）が好ましい。

しかしながら、分散分光イメージング法では、蛍光の波長の変化が、蛍光像におけるスポット像位置の変化に変換されるので、異なる発光波長を有する複数種の蛍光体のどれかが光ったがどれだかはわからないような場合、どのスポットからの蛍光であるのか蛍光像中のスポット位置から判定できない。その結果として蛍光体の種類も判定できない。

一方、ダイクロ／マルチセンサ分光イメージング法では、理想的には、同一スポットからの発光は、各センサで得られた複数の画像中で蛍光体の種類によらず同位置になる。しかしながら現実には、結像倍率の差、光学調整の不完全さ、色収差、イメージセンサ間個体差、等の理由により、同一スポットからの蛍光の像がセンサごとに微妙にずれざるを得ない。また、少数分子からの蛍光検出のＳ／Ｎが必ずしも十分に高くないことから、スポット像中心位置が時間的に変動する場合もある。スポットが光学的分解能ぎりぎりの高い密度で実装されている結果、ダイクロ／マルチセンサ分光イメージング法においても、スポット像が基板上のどのスポット由来であるかの判定を誤る可能性がある。

このように、高感度な分光イメージング法では、蛍光像中のスポットを試料基板上のスポットに高い精度で帰属させるのが困難であった。

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、スポット像から試料上のスポットの帰属(対応関係)及び発光した蛍光体種の判定を高精度に行うことのできる分光イメージング法に基づく光分析を提供するものである。

上記課題を解決するために、本発明では、基板表面上に金属の構造物を設けるとともに、生体分子固定位置からの生体分子以外の物質から放射された発光のうち、励起光よりも長波長の成分を検出して、光分析に用いるようにしている。ここで、構造物は、金、クロム、銀、アルミなどの金属の微粒子（励起光の波長以下の大きさをなす金属構造物）、微細な突起、あるいは微小開口を有する薄膜である。微粒子もしくは微細な突起の場合は、生体分子を金属構造物上に固定し、構造物の光ルミネセンスを検出する。微小開口を有する金属薄膜の場合は、生体分子は開口中に固定し、生体分子周囲の試料液のラマン散乱光と生体分子近傍の金属構造物の光ルミネセンスを検出する。

即ち、本発明による光分析装置は、生体分子が各々固定された複数の構造物を備える実質的に透明な基板と、基板に励起光を照射する少なくとも１つの光源と、構造物から放出された光を分光する分光部と、分光部による分光された光を検出するセンサ部と、センサ部によって検出された光を処理する処理部と、を備える。処理部は、典型的にはセンサ部によって得られた画像を処理する。また、センサ部は、分光結果に基づいて励起光よりも長い波長の光を検出し、処理部は、励起光よりも長波長の光の有無に基づいて、構造物の位置情報を生成する。励起光は、基板からエバネセント波を生じさせるように、基板に照射することができる。

なお、センサは、エバネセント波によって励起された構造物からの発光の、励起光よりも長い波長を有する部分と励起光と同一波長を有する部分との両方を検出してもよい。この場合、処理部は、励起光と同一波長の光の有無に基づいて、構造物の位置情報を生成する。

また、分光部は、分散素子や複数のダイクロイックミラーで構成する。ダイクロイックミラーで分光部が構成される場合は、センサ部は、複数のイメージセンサで構成される。

さらに、処理部は、生体分子が発光していない時に検出された第１の画像と、生体分子が発光した時に検出された第２の画像との差分を計算する。そして、この差分と第１の画像とを比較することにより発光した前記生体分子の種類を判別する。

また、センサは、構造物から放出された光に生体分子から放出された光が重ねあわされた状態の光を検出する。そして、処理部は、重ねあわされた状態の光を背景光として用いて位置情報を生成するようにしてもよい。また、処理部は、重ねあわされた状態の光の中で周囲より明るい部分の相対位置に基づいて、生体分子の種類を判別する。

さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。

本発明の分光イメージング法に基づく光分析によれば、スポット像から試料上のスポットの帰属(対応関係)及び発光した蛍光体種の判定を高精度に行うことができるようになる。

本発明は、透明材質の基板の表面上にエバネセント波を生成し、基板表面上に供給された液体試料中の蛍光標識された生体分子をエバネセント波で励起し、その結果生体分子から放射された蛍光を検出することにより、生体分子を定性的に検出あるいは定量する分析技術に関する。

本発明の実施形態によれば、生体分子からの蛍光が数分以内で退色するのに対し、金属構造物からの光ルミネセンスや液体のラマン散乱は退色しないので、長時間露光によって高いＳ／Ｎを得ることができ、その結果、生体分子からの蛍光を同目的で利用した場合に比べ、高精度のスポット位置基準、波長基準を得ることができる。

以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。

＜第１の実施形態＞
（１）光分析装置の構成
図１は、本発明の第１の実施形態による光分析装置１００の概略構成を示す図である。図１において、励起光源１から射出された励起光は励起フィルタ２でスペクトル純度を高めたのち、プリズム３に入射し、さらに基板４に入射する。プリズム３と基板４の間はマッチングオイルで満たされており、これらの界面では全反射が起こらないようにしてある。基板４に入射した励起光はその上面で全反射し、基板の表面にエバネセント波を生成する。反応液５が基板４の表面とカバーグラス６の間に満たされている。

エバネセント波によって励起された基板表面からの発光は、対物レンズ７で集光されて、平行化された後、発光フィルタ８によって、発光のうち励起光と同一の波長を持つ成分（弾性散乱光）が除去される。その後に分散素子９で波長ごとに異なる方向へ分散させ、結像レンズ１０でイメージセンサ１１の光電面上に結像させる。イメージセンサ１１で得られた画像は、演算装置２０によって後述の図５に示す処理が実行された後に記憶装置（ＨＤＤ）１９に記録される。本実施形態では励起光源１として波長５３２ｎｍのＮｄ−ＹＡＧの第二高調波レーザを使用したが、アルゴンイオンレーザ、ヘリウムネオンレーザ、半導体レーザ等を用いても良い。発光フィルタ８としては、レーザの波長＋α（例えば５ｎｍ）以上の光を透過させるフィルタを用いることができ、Ｎｄ−ＹＡＧレーザを用いた本実施形態では波長５４０ｎｍ以上を透過させるロングパスフィルタを用いている。ただし、検出する波長範囲を透過させるバンドパスフィルタ、励起光波長のみを遮断するノッチフィルタを用いることができるのはもちろんである。また、本実施形態では分散素子としてプリズムを使用しているが、回折格子でももちろんかまわない。

（２）基板周辺における生体分子の様子
図２は光分析装置１００の基板４の周辺における拡大図であり、図２Ａは上面図、図２Ｂは一点鎖線Ｃにおける断面図である。基板４の上には、生体分子１３が固定された複数の微粒子１２が固定されている。微粒子の固定は、例えば界面活性剤を基板表面にコーティングし、その上に金粒子をばら撒くことにより実現される。ここでは微粒子として直径５０ｎｍの金微粒子を用いたが、銀でも銅でもアルミでもクロムでも、励起光の波長以下の直径を有する任意の金属微粒子で良く、形状も必ずしも球と限らず、直方体、円錐、円柱、その他いびつな形状でも良い。また、図２では基板を低コストで製造するため金微粒子をランダムに分散させているが、格子上に配置してもよい。

本実施形態において、微粒子１２に固定された生体分子１３は一本鎖ＤＮＡであり、反応液には蛍光修飾された塩基１４ａ、１４ｇ、１４ｃ、１４ｔと伸長反応を起こすための酵素が含まれている。例えば、１４ａは緑で発光する色素で修飾されたアデニン、１４ｇはオレンジ色で発光する色素で修飾されたグアニン、１４ｃは赤色で発光する色素で修飾されたシトシン、１４ｔは赤外で発光する色素で修飾されたチミンである。ＤＮＡ一本鎖に塩基が取り込まれて相補鎖が伸長するごとに、伸長した塩基に対応した発光が基板上のエバネセント場で励起され、金微粒子から放射される。本実施例では単一の一本鎖ＤＮＡを微粒子１２に固定したが、もちろん複数分子でも良く、２本鎖でもかまわない。

（３）基板の分散像
図３は、伸長反応開始前の基板の分散像を示す図である。図４は、伸長反応後の基板の分散像を示す図である。

図３に示されるように、金粒子は波長５００〜７００ｎｍのブロード（波長のレンジが広い）な光ルミネセンスを放射するため、横方向に細長くのびた金微粒子のスポットが得られている。

図４の左側の列は一つの金微粒子スポットの拡大図、右側の列はスポット横方向の輝度プロファイルのグラフである。図４において、（Ｎ）は金微粒子のみのとき、（Ａ）はアデニンが結合したとき、（Ｇ）はグアニンが結合した時、（Ｃ）はシトシンが結合したとき、（Ｔ）はチミンが結合した時、にそれぞれ対応する。なお、本実施形態の構成では、同一点から放射された光は長波長ほど左にフォーカスされる。金微粒子自身の発光は常時存在するので、塩基が結合すると、修飾した蛍光体の発光が重ねあわせて観測され、発光波長に対応した部分が金微粒子だけの時に比べて明るくなる。この結果、明るくなったことから塩基が結合したことがわかり、また、明るくなった部分の金微粒子スポットに対する相対位置によって蛍光体の種類、すなわち塩基種を判定することが可能となる。

（４）塩基種判定処理
続いて、塩基種判定処理の詳細について説明する。図５は、塩基種判定処理の詳細なアルゴリズムを示したフローチャートである。なお、図５に対応するプログラムが図示しないメモリに格納されており、塩基種判定処理を実行する際に、演算装置２０によって当該プログラムが実行される。よって、図５における各ステップの処理主体は特に断らない限り演算装置２０である。また、図５中、Ｔｈ１及びＴｈ２はそれぞれ、予め設定された、構造物の発光を判定する閾値、及び生体分子の発光を判定する閾値である。

ステップＳ５０１において、オペレータによって基板４とカバーグラス６の間に蛍光修飾塩基及び酵素を含まない溶液（バッファ）が注入される。そして、発光の画像を取得する準備が整えられると、オペレータによって演算装置２０に対して観測開始の指示が入力される。この状態では金微粒子のみの発光が観測される。構造物にはあらかじめＤＮＡが一本鎖固定されており、これと相補な配列を一部に含む他の一本鎖が部分的にハイブリして２本鎖を形成している。

ステップＳ５０２では、金粒子のみの発光像が例えば２０フレーム分取得されて、時間軸でその取得画像が平均化される。金の発光は退色しないので、このように多数のフレーム（すなわち長時間測定で得られたフレーム）を平均化することにより、発光が弱い場合においても良好なＳ／Ｎを得ることができようになる。

ステップＳ５０３では、横方向にＮピクセル（Ｎ＞２）以上連続して輝度値がＴｈ１以上である領域を金の発光スポットとして平均化した画像から抽出する。本実施形態では金の発光波長（５５０〜７００ｎｍ）が６ピクセルに分散されるようプリズムの頂角が設定されているので、Ｎ＞５とした。ここで抽出された領域の個数をｎとし、ｉ番目の領域をＡ_i、輝度配列をＢ_iとあらわす。

続いて、ステップＳ５０４において、オペレータによって、蛍光修飾塩基、酵素を含む反応溶液（反応バッファ）５が注入される。注入が終了すると、オペレータによって測定開始の指示が演算装置２０に入力される。

ステップＳ５０５では、この後の測定ループステップＳ５０６乃至Ｓ５０９で用いられる変数が初期化される。ここから、金微粒子に固定されたＤＮＡへの塩基の結合反応及び修飾蛍光体の発光が開始するとともに、測定終了までＳ５０６乃至Ｓ５０９が繰り返される。

ステップＳ５０５で初期化された変数は次のように用いられる。フレーム開始番号ｊは測定ループ開始以降に連続的に取得された画像の累積フレーム数である。また、変数ｋ_iは、ｉ番目のスポットＡ_iに塩基が結合して蛍光体の発光が開始したフレーム番号を記憶する変数である。変数ｌ_iは、同スポットに結合した塩基から蛍光体が除去されて蛍光体の発光が終了したフレーム番号を記憶する変数である。変数ｍ_i（ｉ＝１〜Ｎ）は、スポットＡ_iへの蛍光体の結合・除去が繰り返された回数を記憶する変数である。さらに、ｍ_iは、スポットＡ_iに対して読み取られた塩基数である。また、各スポットに対して読み取られた塩基配列を記憶するためのＮ個の配列Ｘ_iを確保する。以上においてｉ＝１〜Ｎである。

ステップＳ５０６では、新しいフレームｊが取得されるたびに、ｎ個の領域に対してステップＳ５０７の処理が実行される。以下では、ｉ番目の領域に関する処理として説明する。まず領域Ａ_iの新しいフレームにおける輝度配列Ｓ_iと既に記録済みの金だけの発光に対する輝度配列Ｂ_iとの差が所定の閾値Ｔｈ２を越えた場合にはｉ番目スポットに蛍光体、即ち何らかの塩基が結合していると判断され（ステップＳ５０７１）、処理はステップＳ５０７２に移行する。ステップＳ５０７２では、ｋ_i≧０か否か判断される。ｋ_i＜０ならば前のフレームの段階では結合していなかったということなので、新たな結合が起こったと判断されて結合開始フレーム番号ｋ_i＝ｊとされる（ステップＳ５０７３）。ステップＳ５０７２でｋ_i≧０と判断された場合にはｊ−１以前のフレームで既に結合した蛍光体が光り続けているだけなのでｋ_iは変更せず、ｉ＝ｉ＋１として次のスポットに対する処理に進む（ステップＳ５０７７）。

一方、ステップＳ５０７１で、Ｓ_iとＢ_iとの差がＴｈ２以下である場合、蛍光体は結合していないと判断されて、処理はステップＳ５０７４に移行する。ステップＳ５０７４では、ｋ_i≧０か否か判断される。ｋ_i＜０ならば前フレームからすでに蛍光体は結合していなかったということなので、ｉ＝ｉ＋１として次の領域に対する処理に進む（ステップＳ５０７７）。ｋ_i≧０ならば、結合していた蛍光体が除去されたと判断され、ステップＳ５０７５において、ｋ_iからｊの間に取得されたフレームに対するＳ_i平均値とＢ_iとの差（これが蛍光体の発光スペクトルとなる）が計算され、この配列の重心となるindex、及びＢ_iの重心indexとの差ｄが求められる。このｄが蛍光体発光スペクトルの中心波長を表す。本実施形態で用いた蛍光体特性に基づき、−３≦ｄ＜−１ならアデニンを修飾した蛍光体、−１≦ｄ＜１ならばグアニンを修飾した蛍光体、１≦ｄ＜２．５ならばシトシンを修飾した蛍光体、２．５≦ｄ＜４ならばチミンを修飾した蛍光体と判定される（ステップＳ５０７５）。そして、ステップＳ５０７６において、ｍ_i＝ｍ_i＋１とし、Ｘ［ｍ_i］に対応した塩基が記憶装置１９に記憶される。

本実施例では、用いた蛍光修飾塩基は修飾蛍光体を結合させたヌクレオチド３リン酸であり、塩基がＤＮＡ１３の近傍に接近して伸長反応が開始し、反応が完了するまでの間のみ蛍光体がＤＮＡ近傍に存在する。伸長反応が完了するとリン酸とともに蛍光体が塩基から切断され、ブラウン運動によってすみやかにＤＮＡ１３の近傍から除去される。蛍光体を伸長反応後に除去する方法としては、この他に３’ＯＨを蛍光修飾したヌクレオチド３リン酸を伸長させ、伸長反応後に紫外レーザによる光化学反応で蛍光体を切断することも可能である。この方法によると蛍光体除去のタイミングを制御できるという利点がある。また、ヌクレオチド３リン酸の塩基本体部分を蛍光体で修飾し、同様に紫外レーザによる光化学反応で蛍光体部を切断したり、また、次の塩基が取り込まれるまでに退色させるということも可能である。

以上のステップをフレームごとにすべてのスポットに対して行い、すべてのスポットに対してｍ_i≧３０となるまで繰り返す（ステップＳ５０８及びＳ５０９）。このことにより、すべてのスポットに対して３０塩基以上の配列が読み取られる。

なお、本実施形態では、メッセンジャーＲＮＡの発現解析をターゲットアプリケーションとしており、３０塩基解読できれば十分であるためｍ_i≧３０を測定終了条件とした。より長い解読塩基長が必要なアプリケーション、例えばドラフト配列未定のゲノムの解読等の場合には測定終了条件をより大きい数値、例えばｍ_i≧１００あるいはｍ_i≧４００などとすれば良い。

なお、本実施例では構造物にＤＮＡ分子を固定して単一分子ＤＮＡのシーケンシングを行ったが、酵素分子が固定されていても同様のことがもちろん可能である。

（５）以上のように、第１の実施形態によれば、分散分光イメージング法に基づくシステムにおいて、生体分子を固定化した構造物からの光ルミネセンスを検出することにより、分散分光イメージング方式では困難であった発光した蛍光体の種別判定が高精度に行えるようになり、結果として高精度な塩基配列決定が可能となる。

＜第２の実施形態＞
第２の実施形態による光分析装置としては、第１の実施形態による光分析装置１００と同一の構成を適用することができる。よって、装置構成についての説明は省略する。また、塩基種判定も第１の実施形態と同様な処理を適用できる。

図６は、第２の実施形態における基板４周辺の拡大図である。図６Ａは基板上面図、図６Ｂは図６Ａの一点鎖線Ｃにおける断面図である。

本実施形態では、生体分子を固定する構造物を、半導体プロセスを利用して格子状に配置している。また、ここでは製造プロセスとしてＥＢ（電子線）描画を用いたが、ドライエッチング、ウェットエッチングを用いても良い。

このようにすることにより、構造物（例えば、金粒子）を基板４上に高密度に集積でき、一遍に処理できる個数を増加させることができるので、その結果、塩基配列決定の処理速度が向上する。

＜第３の実施形態＞
第３の実施形態による光分析装置としては、第１の実施形態による光分析装置１００と同一の構成を適用することができる。よって、装置構成についての説明は省略する。また、塩基種判定も第１の実施形態と同様な処理を適用できる。

図７は、第３の実施形態における基板４周辺の拡大図である。図７Ａは基板上面図、図７Ｂは図７Ａの一点鎖線Ｃにおける断面図である。

本実施形態では、生体分子を固定する構造物として金属薄膜に設けた微小開口を用いた。また、アルミ薄膜に直径１００ｎｍの開口を、ＥＢ描画によって横方向に２．３ミクロンピッチ、縦方向に１ミクロンピッチで設けたが、金、クロムなど任意の金属の薄膜を好適に用いることができ、開口の直径は励起光（例えば、上述のＮｄ−ＹＡＧレーザを用いた場合、５３２ｎｍ）の波長以下の任意の値とすることができる。なお、製造プロセスもＥＢ描画に限られず、ドライエッチング、ウェットエッチングを用いても良い。

このようにすることにより、エバネセント波が生成される領域が開口近傍に限定されると同時に、エバネセント波によって励起される反応液のラマン散乱が開口近傍でしか発生しない（発光している領域の大きさが小さい）。よって、基板４上における背景光が低く抑えられ、その結果、蛍光体からの発光検出のＳ／Ｎが向上する。

＜第４の実施形態＞
図８は、本発明の第４の実施形態による光分析装置２００の概略構成を示す図である。光分析装置２００の基本構成は第１の実施形態のそれとほぼ同一であるが、バンドパスフィルタ１５がステージ１６によって光路から出し入れ可能なようになっている。このバンドパスフィルタ１５は、構造物（例えば金粒子）自体の発光にばらつきがあるため、それをある範囲（バンドパスフィルタの通過域）に抑えるために用いられるものである。

バンドパスフィルタ１５は測定開始時には光路上に挿入されており、この状態で数フレーム画像（構造物のみの画像）を取得した後に、光路上からステージ１６によって取り去られる。つまり、反応させるときにはフィルタ１５は抜き取られた状態となっている。

このようにすることにより、構造物の発光スペクトルのばらつきに左右されず、高精度な波長基準が得られるという効果がある。

なお、第１乃至第３の実施形態で用いた基板と、本実施形態の光分析装置２００との組み合わせを用いても、蛍光測定は可能である。また、塩基種判定は第１の実施形態と同様な処理を適用できる。

＜第５の実施形態＞
図９は、本発明の第５の実施形態による光分析装置３００の概略構成を示す図である。光分析装置３００は、異なる波長の光を出力する複数の励起光源１−１と１−２を備えており、それ以外の構成は、第１の実施形態のそれと同一である。

このようにすることにより、より沢山の種類の蛍光体を高感度に検出できる。励起効率は蛍光体の種類によって異なるため、１種類の波長の励起光源のみではより多くの種類の蛍光体を検出するのに限界がある場合があるからである。

なお、第１乃至第３の実施形態で用いた基板と、本実施形態の光分析装置３００との組み合わせを用いても、蛍光測定は可能である。また、塩基種判定は第１の実施形態と同様な処理を適用できる。

＜第６の実施形態＞
図１０は、本発明の第６の実施形態による光分析装置４００の概略構成を示す図である。光分析装置４００は、少なくとも１つの励起光源（１−１及び／又は１−２）から発光フィルタ８の構成までは第５の実施形態と同一の構成を備えるが、分光する手段として分散素子９を用いるのではなく、複数のダイクロイックミラーを用いている。つまり、図１０に示したように、フィルタ８を透過した光は第１のダイクロイックミラー１８−１（波長６００ｎｍ以上の光を透過、それより短い光を反射）で反射光と透過光に分けられた後に、反射光、透過光いずれも結像レンズ１０−１及び１０−２を透過する。反射光はさらに第２のダイクロイックミラー１８−２（波長５７０ｎｍ以上の光を透過、それより短い光を反射）で反射光と透過光に分けられ、反射光は第１のイメージセンサ１１−１で検出され、透過光は第２のイメージセンサ１１−２で検出される。

一方、第１のダイクロイックミラーの透過光は、さらに第３のダイクロイックミラー１８−３（波長６８０ｎｍ以上の光を透過、それより短い光を反射）で反射光と透過光に分けられる。この反射光は、第３のイメージセンサ１１−３で検出され、透過光は第４のイメージセンサ１１−４で検出される。

また、本実施形態における基板４は、第１乃至第３の実施形態で用いた基板と同様のものを使用することができる。

図１１は、４つのイメージセンサ１１−１乃至１１−４で同時に得られた画像の例を示している。構造物の発光スペクトルは前述の通りブロードなので、全ての画像において同一構造物由来の発光スポットを得ることができる。構造物が無いと、１つの画像中だけで明るいスポットが得られ、他の画像では明るいスポットが得られないので、同一生体分子からの発光を同定するのが困難である。しかし、図１１に示したように構造物からの発光によって蛍光体が結合したときの発光スポットが生成される位置が予め判る。よって、同一生体分子からの発光を高精度に同定することが可能となり、その結果として、高精度の塩基配列決定が可能となる。

以上のように、本実施形態では、分散素子により光を分散させていないので、画像中のスポットが横長（図３参照）に広がらない。よって、スポットの重なりを生じることなく、基板上に生体分子を高密度に集積できるようになる。また、図１１（１）乃至１１（４）を用いて位置合わせをすることも可能である。なお、塩基種判定は第１の実施形態と同様な処理を適用できる。

＜第７の実施形態＞
図１２は、本発明の第７の実施形態による光分析装置５００の概略構成を示す図である。光分析装置５００では、基板４からの弾性散乱光を、フィルタ８で遮断せず、ダイクロイックミラー１８で反射して、第２の結像レンズ１０−２で第２のイメージセンサ１１−２に結像している。それ以外の構成は、第１の実施形態の光分析装置１００と同一である。

このようにすることにより、第１のイメージセンサ１１−１で得られる構造物の分散像が重なりあって構造物毎に分離できなくなってしまっても、第２のイメージセンサ１１−２での像を基に蛍光体の種類を判別可能となる。つまり、第２のイメージセンサ１１−２によって、例えば図１１に示される１枚の構造物（例えば、金粒子）のみの画像が得られるので、構造物の位置を確定できる。よって、第１のイメージセンサ１１−１から得られる画像において、構造物の画像中のスポットが図３のように横長となり、隣り合う像同士が重なっても第２のイメージセンサ１１−２からの画像により構造物の像同士を峻別することができる。

従って、基板４上に生体分子１３を第１の実施形態の場合よりも高密度に集積できるという効果がある。しかも、弾性散乱光は強度が強いので、第２のイメージセンサとしては高感度な冷却ＣＣＤを用いる必要が無く、安価な非冷却ＣＣＤ、ＣＭＯＳセンサ等が使用でき、第１の実施形態と比較して本質的なコスト上昇が生じない。なお、塩基種判定は第１の実施形態と同様な処理を適用できる。

＜第８の実施形態＞
第８の実施形態による光分析装置としては、第１の実施形態による光分析装置１００と同一の構成を適用されるが、フィルタ８の弾性散乱光遮断性能を低くし、イメージセンサ１１に構造物の光ルミネセンスの分散像と弾性散乱光の像を重ねて結像する。例えば、第８の実施形態では、第１の実施形態で２枚用いる光の透過率１／１０００のフィルタを１枚にしたり、光の透過率１０^-4〜１０^-5のフィルタを用いたりする。

図１３は、第８の実施形態における基板４の拡大図を示している。本実施形態では、構造物を縦横ともに１μｍピッチで集積してある。

このように、基板４上では、縦横ともに１μｍピッチで構造物を集積しているため、構造物からの長波長成分の分散像は隣同士とつながってしまい、連続した背景光としてしかとらえられなくなる。

しかし、弾性散乱光を一部透過させるため、図１４に示すように、つながった分散像の上にシャープな構造物の弾性散乱光像が結ばれる。この結果、分散像が重なり合ってしまっても弾性散乱光像を元に蛍光体種の識別が可能となり、第７の実施形態と同一の効果を得ることができる。しかもイメージセンサは１個で良く、フィルタ８の遮断性能が低くて良いので、よりＳ/Ｎの高い蛍光像が得られると同時にコストダウンができる。なお、塩基種判定は第１の実施形態と同様な処理を適用できる。

＜第９の実施形態＞
第９の実施形態による光分析装置としては、第５の実施形態による光分析装置３００と同一の構成を適用されるが、光源１−２の波長がフィルタ８の透過域にあり、構造物１２による光源１−２が出力する光の散乱光を検出することが特徴である。具体的には、光源１−２は波長５９４ｎｍのＨｅＮｅレーザとした。その他にも、波長６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザ、任意の半導体レーザが好適に使用できる。フィルタ８の透過帯域を５２０ｎｍ以上に変更し、光源１−１を波長４８８または５１４．５ｎｍのアルゴンイオンレーザに変更すれば、光源１−２として、第一の実施例の光源1として用いた波長５３２ｎｍのレーザを用いることも可能である。また、光源１−２のパワーは光源１−１よりはるかに小さくてもかまわないため、フィルタ８の透過域の波長を有する発光ダイオードを好適に用いることが可能である。本実施例では散乱光が実質的に単色なのでより高精度な波長基準になるという固有の効果がある。また、光源１−２のパワーは小さくてよいので、光源を２台に増やしたことによるコスト上昇は実質的に発生しない。

伸長反応を利用したＤＮＡシーケンサ、全反射蛍光方式のＤＮＡマイクロアレイリーダーなどに利用できる。

本発明の第１の実施形態による光分析装置の概略構成示す図である。 第１の実施形態における基板周辺の拡大図である。 第１の実施形態で得られる構造物の分散像を示す図である。 伸長反応時に得られる分散像の拡大図である。 塩基配列決定処理を説明するためのフローチャートである。 第２の実施形態における基板周辺の拡大図である。 第３の実施形態における基板周辺の拡大図である。 本発明の第４の実施形態による光分析装置の概略構成を示す図である。 本発明の第５の実施形態による光分析装置の概略構成を示す図である。 本発明の第６の実施形態による光分析装置の概略構成を示す図である。 第５の実施形態で得られる構造物の分光像を示す図である。 本発明の第７の実施形態による光分析装置の概略構成を示す図である。 第８の実施形態における基板周辺の拡大図である。 第８の実施形態における基板の分散像を示す図である。

符号の説明

１，１−１，１−２：励起光源、２：励起フィルタ、３：プリズム、４：基板、５：反応液、６：カバーグラス、７：対物レンズ、８：発光フィルタ、９：分散素子、１０，１０−１，１０−２：結像レンズ、１１，１１−1〜１１−４：イメージセンサ、１２：構造物、１３：生体分子、１４ａ：アデニン、１４ｇ：グアニン、１４ｃ：シトシン、１４ｔ：チミン、１５：バンドパスフィルタ、１６：ステージ、１８，１８−1〜１８−３：ダイクロイックミラー、１９：記憶装置、２０：演算装置

Claims (20)

1. 生体分子が各々固定された複数の金属構造物を備える実質的に透明な基板と、
   前記基板に励起光を照射する少なくとも１つの光源と、
   前記金属構造物から放出された光を分光する分光部と、
   前記分光部による分光された光を検出するセンサ部と、
   前記センサ部によって検出された光を処理する処理部と、を備え、
   前記金属構造物は前記励起光の波長以下の大きさであり、
   前記センサ部は、前記分光結果に基づいて前記励起光よりも長い波長の光を検出し、
   前記処理部は、前記金属構造物から放出された前記励起光よりも長波長の光ルミネッセンスの有無に基づいて、前記金属構造物の位置情報を生成することを特徴とする光分析装置。
2. 前記光源は、前記基板からエバネセント波を生じさせるように、前記基板に励起光を照射することを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
3. 前記基板に前記励起光よりも長波長の光を照射する第二の光源を備えることを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
4. 前記センサ部は、前記分光された光に基づいて、前記基板上に固定された前記複数の金属構造物の画像を一括して検出することを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
5. 前記金属構造物は、金属微粒子であることを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
6. 前記基板が金属薄膜を有し、
   前記金属構造物が、前記基板上の金属薄膜中に形成された、直径が前記励起光の波長以下の開口であることを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
7. 前記分光部は、分散素子で構成されることを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
8. 前記分光部は、複数のダイクロイックミラーで構成され、
   前記センサ部は、複数のイメージセンサで構成されることを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
9. 前記処理部は、前記生体分子が発光していない時に検出された第１の画像と、前記生体分子が発光した時に検出された第２の画像との差分を計算し、この差分と前記第１の画像とを比較することにより発光した前記生体分子の種類を判別することを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
10. 前記センサは、前記金属構造物から放出された光に前記生体分子から放出された光が重ねあわされた状態の光を検出し、
    前記処理部は、前記重ねあわされた状態の光を用いて前記位置情報を生成することを特徴とする請求項１に記載の光分析装置。
11. 前記処理部は、前記重ねあわされた状態の光の中で周囲より明るい部分の相対位置に基づいて、前記生体分子の種類を判別することを特徴とする請求項１０に記載の光分析装置。
12. 生体分子が各々固定された複数の金属構造物を備える実質的に透明な基板と、
    前記基板からエバネセント波を生じさせるように、前記基板に励起光を照射する少なくとも１つの光源と、
    前記金属構造物から放出された光を分光する分光部と、
    前記分光部による分光された光を検出するセンサと、
    前記センサによって検出された光を処理する処理部と、を備え、
    前記金属構造物は前記励起光の波長以下の大きさであり、
    前記センサは、前記エバネセント波によって励起された前記金属構造物からの発光の、前記励起光よりも長い波長を有する部分と前記励起光と同一波長を有する部分との両方を検出し、
    前記処理部は、前記励起光と同一波長の前記金属構造物による散乱光の有無に基づいて、前記金属構造物の位置情報を生成することを特徴とする光分析装置。
13. 前記センサ部は、前記分光された光に基づいて、前記基板上に固定された前記複数の金属構造物の画像を一括して検出することを特徴とする請求項１２に記載の光分析装置。
14. 前記金属構造物は、金属微粒子であることを特徴とする請求項１２に記載の光分析装置。
15. 前記基板が金属薄膜を有し、
    前記金属構造物が、前記基板上の金属薄膜中に形成された、直径が前記励起光の波長以下の開口であることを特徴とする請求項１２に記載の光分析装置。
16. 前記分光部は、分散素子で構成されることを特徴とする請求項１２に記載の光分析装置。
17. 前記分光部は、複数のダイクロイックミラーで構成され、
    前記センサ部は、複数のイメージセンサで構成されることを特徴とする請求項１２に記載の光分析装置。
18. 前記処理部は、前記生体分子が発光していない時に検出された第１の画像と、前記生体分子が発光した時に検出された第２の画像との差分を計算し、この差分と前記第１の画像とを比較することにより発光した前記生体分子の種類を判別することを特徴とする請求項１２に記載の光分析装置。
19. 前記センサは、前記金属構造物から放出された光に前記生体分子から放出された光が重ねあわされた状態の光を検出し、
    前記処理部は、前記重ねあわされた状態の光を用いて前記位置情報を生成することを特徴とする請求項１２に記載の光分析装置。
20. 前記処理部は、前記重ねあわされた状態の光の中で周囲より明るい部分の相対位置に基づいて、前記生体分子の種類を判別することを特徴とする請求項１９に記載の光分析装置。
    

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