KR102450912B1 - 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경 및 이를 이용한 바이오마커 식별방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 형광분석을 통하여 바이오마커의 종류를 용이하게 식별할 수 있는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경 및 이를 이용한 바이오마커 식별방법에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명은 시료에서 발산되는 형광을 분석하는 형광 현미경에 있어서, 상기 형광 현미경의 검출부에는 검출부로 입사되는 형광 스펙트럼의 일부를 차단하는 식별필터가 설치되어 있는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경을 제공한다.
Description
본 발명은 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경 및 이를 이용한 바이오마커 식별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 형광분석을 통하여 바이오마커의 종류를 용이하게 식별할 수 있는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경 및 이를 이용한 바이오마커 식별방법에 관한 것이다.
형광 현미경은 형광(fluorescence)을 이용하여 이미징하는 광학현미경으로, 시료에 존재하는 형광물질이 흡수하는 특정 파장을 비추었을 때, 형광물질이 흡수한 빛이 형광 형태로 나오는 긴 파장의 빛을 감지하여 이미징을 할 수 있다.
파장 특이적 필터를 이용해 비추어 주는 빛보다 훨씬 약한 방출하는 빛을 감지하게 된다. 형광 현미경은 제논, 수은, LED, 레이저를 이용하는 광원과 여기광 필터(excitation filter), 다이크로익 미러(dichroic mirror) 그리고 방출광 필터(emission filter)로 이루어진다. 광원으로부터 나온 빛이 여기광 필터를 통해 형광물질이 흡수할 수 있는 파장만이 지나가게 되고, 다이크로익 미러를 통해 시료를 비추게 된다. 시료에 있던 형광물질이 이 특정 파장의 빛을 흡수하고, 형광의 형태로 긴 파장의 빛을 방출하는데, 이렇게 방출된 빛은 다이크로익 미러에 반사되지 않고 검출기로 검출되게 된다. 다색상 형광 현미경의 경우 각색에 해당하는 여기광 필터와 다이크로익 미러를 장착하여 시료에 존재하는 다양한 색의 형광물질을 이미징 할 수 있다(도 2 참조).
이러한 형광 현미경은 세포내 소기관 및 단백질 등을 이미징 할 때 사용되며 공초점 현미경(confocal microscope)과, 전반사형광 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)등이 있다.
종래의 형광 현미경에서는 제1 광필터(12)를 통하여, 백색광 중에서 플레이트 위에 놓인 시료에 부착된 형광체의 흡수 파장과 일치하는 단색광을 선별하고, 선별된 흡수 파장의 단색 광의 경로를 다이크로익 미러(23)을 통해 조정하여 대물렌즈(objective lens, 22)를 통해 시료에 조사하고, 제2 광필터를 통하여 대물렌즈 및 다이크로익 미러를 통과한 시료의 형광체에 의해 발생한 광에서 시료의 형광체의 발색 파장과 일치하는 광을 선별하여 검출부로 제공한다. 한편 검출부는 튜브렌즈(tube lens) 또는 CCD, CMOS와 같은 카메라(31, 32, 33)로 구현되며 시료에 부착된 형광체의 발색 파장을 검출하여 보임으로써 시료의 형상 또는 시료가 발산하는 형광을 관찰할 수 있도록 한다(도 2참조).
하지만, 종래의 형광 현미경은 시료에 조사되는 광(光)에 따라 단일한 형광영상을 얻는 구조로 되어 있으므로, 다종의 시료를 구분하기 위해서는 다종의 형광염료를 사용하여야 하며, 또한 각 형광염료의 여기(excitation)에 필요한 다양한 파장의 광원과 카메라가 필요하다는 단점을 가지고 있다(도 3 참조).
특히 이러한 시료간의 확실한 구분을 위해서는 각 형광체가 발광하는 형광스펙트럼이 겹치지 않는 것이 바람직하므로, 한번에 2~5종의 형광체를 사용할 수 있어 구분할 수 있는 시료의 종류가 줄어들며, 상기 형광체와 동일한 수량의 광원을 필요로 함에 따라 장치의 크기가 커지고, 비싸지며, 검출 시간이 늘어나는 문제점을 가지고 있다(도 3 참조).
이를 개선하기 위하여 상기 시료에서 발산되는 형광을 프리즘을 이용하여 분광하되, 원 형광의 발산지점과 프리즘으로 분광된 형광의 상대적인 위치를 분석하여 각 형광을 분리할 수 있는 기술이 개발되고 있다(도 4 참조). 이 기술의 경우 상대적인 위치를 분석하여 형광의 종류를 분석하고 있으므로, 흡광 스펙트럼과 발광 스펙트럼이 겹치는 여러 종의 형광체를 사용할 수 있어 다종의 시료의 분석이 가능하며, 또한 광원부의 숫자를 크게 줄일 수 있다. 하지만 이 기술은 원위치의 확인이 필수적이므로, 원위치 확인용 검출부와 프리즘으로 분광된 형광의 검출부를 각각 설치하여야 함은 물론이며, 발산되는 형광을 두 개의 경로를 따라 분리하여야 하므로 검출 영역 및 감도가 떨어진다는 단점을 가지고 있다(도 4 참조).
따라서 형광을 이용한 시료 분석시 검출 영역 및 감도의 변화폭을 최소화 하면서도 다종의 시료를 동시에 분석할 수 있는 형광 현미경의 제작을 필요로 하고 있다.
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 형광분석을 통하여 바이오마커의 종류를 용이하게 식별할 수 있는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경 및 이를 이용한 바이오마커 식별방법을 제공하고자 한다.
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 시료에서 발산되는 형광을 분석하는 형광 현미경에 있어서, 상기 형광 현미경의 검출부에는 검출부로 입사되는 형광 스펙트럼의 일부를 차단하는 식별필터가 설치되어 있는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 식별필터는, 상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크(peak)를 가지는 형광 스펙트럼의 일부; 및 상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부를 차단하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식별필터는, 상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장(peak wavelength) 이하의 파장; 및 상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이상의 파장을 차단하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 시료에서 발산되는 형광은 2~100개의 발광피크를 가지며, 각각의 피크를 가지는 발광 스펙트럼의 일부 또는 전부가 오버랩되어 있는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 시료에 포함된 형광체는 하나 이상의 여기광으로 동시에 발광되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 시료는 2~100종의 형광체를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 시료는, 기판 상에 부착된 포획프로브; 상기 포획프로브와 결합된 바이오마커; 및 상기 바이오마커와 결합되며, 형광체를 포함하는 검출프로브를 포함하며, 상기 기판의 표면에는 2~100종의 검출프로브가 배열되어 있을 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출프로브는 1종 이상의 형광체가 부착되어 있으며, 상기 검출프로브와 결합된 바이오마커는 1종 이상의 발광피크를 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 검출부는 상기 시료에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 식별필터는 상기 분광수단의 전면부에 설치될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 분광수단에 의하여 분광된 형광은 일측 또는 양측이 잘린 타원형으로 관찰될 수 있다.
본 발명은 또한 형광체가 부착된 시료를 준비하는 단계; 상기 시료를 형광 현미경의 대물부에 위치시키는 단계; 상기 시료에 광원을 이용하여 여기광을 공급하는 단계; 상기 여기광에 의하여 발산된 형광 스펙트럼의 일부를 식별필터를 이용하여 차단하는 단계; 상기 식별필터를 통과한 형광을 분광시키는 단계; 및 상기 분광된 형광을 이용하여 시료의 종류를 판별하는 단계를 포함하는 바이오마커 식별방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 시료의 종류를 판별하는 단계는, 분광된 형광의 차단되는 지점을 인식하는 단계; 상기 차단되는 지점으로부터 상기 분광된 형광의 상대적인 위치 및 길이를 식별하는 단계; 및 상기 형광의 상대적인 위치 및 길이를 이용하여 시료의 종류를 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 형광체가 부착된 시료는 상이한 형광체가 각각 부착된 2~100종 바이오마커일 수 있다.
본 발명에 의한 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경은 발광 스펙트럼의 차이를 이용하여 바이오마커의 종류를 구분할 수 있으므로, 다수 바이오마커의 빠르고 정확한 식별에 널리 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 형광의 일부를 차단하여 형광의 종류를 식별할 수 있으므로 기존의 발광 스펙트럼 파장의 차이를 이용한 분석방법에 비하여 검출 영역 및 감도가 향상된 형광 현미경을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 형광 스펙트럼 파장의 일부를 차단한 다음, 차단된 형광을 분광하여 그 형태를 식별하고 있으므로, 발광 스펙트럼의 피크가 유사한 형광을 사용하는 경우에도 식별할 수 있다. 따라서 여기광의 숫자를 줄일 수 있으며, 다종의 형광체를 동시에 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 바이오마커의 식별이 가능한 형광현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 기존의 형광현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 기존의 형광현미경에 사용되는 형광체의 흡광 스펙트럼과 발광 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다.
도 4는 기존의 분광수단을 이용한 형광현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 기존의 분광수단을 이용한 형광현미경으로 관찰된 시료를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광체의 발광 스펙트럼 및 식별필터를 통과한 발광 스펙트럼의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 다수개의 형광체를 사용한 경우 식별필터에 의한 발광 스펙트럼의 관찰된 모습을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 다른 종류의 식별필터를 사용한 경우 발광 스펙트럼의 관찰된 모습을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광체의 흡광 스펙트럼과 발광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 시료를 준비하는 단계를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 시료의 형광을 관찰한 것으로 (a)는 분광되기 이전, (b)는 식별필터를 통과시키고 분광된 이후를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광체의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광체의 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 의한 식별 필터 및 분광수단을 사용하지 않은 형광을 관찰한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 의한 분광수단만을 사용한 다음, 형광을 관찰한 것이다.
도 16는 본 발명의 일 실시예에 의한 분광수단 및 식별필터를 사용한 다음, 형광을 관찰한 것이다.
도 17는 본 발명의 일 실시예에 의한 분광수단 및 식별필터를 사용한 다음, 각 형광의 스펙트럼 분포를 나타낸 것이다.
도 2는 기존의 형광현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 기존의 형광현미경에 사용되는 형광체의 흡광 스펙트럼과 발광 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다.
도 4는 기존의 분광수단을 이용한 형광현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 기존의 분광수단을 이용한 형광현미경으로 관찰된 시료를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광체의 발광 스펙트럼 및 식별필터를 통과한 발광 스펙트럼의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 다수개의 형광체를 사용한 경우 식별필터에 의한 발광 스펙트럼의 관찰된 모습을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 다른 종류의 식별필터를 사용한 경우 발광 스펙트럼의 관찰된 모습을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광체의 흡광 스펙트럼과 발광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 시료를 준비하는 단계를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 시료의 형광을 관찰한 것으로 (a)는 분광되기 이전, (b)는 식별필터를 통과시키고 분광된 이후를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광체의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광체의 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 의한 식별 필터 및 분광수단을 사용하지 않은 형광을 관찰한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 의한 분광수단만을 사용한 다음, 형광을 관찰한 것이다.
도 16는 본 발명의 일 실시예에 의한 분광수단 및 식별필터를 사용한 다음, 형광을 관찰한 것이다.
도 17는 본 발명의 일 실시예에 의한 분광수단 및 식별필터를 사용한 다음, 각 형광의 스펙트럼 분포를 나타낸 것이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
본 발명은 시료에서 발산되는 형광을 분석하는 형광 현미경에 있어서, 상기 형광 현미경의 검출부에는 검출부로 입사되는 형광 스펙트럼의 일부를 차단하는 식별필터가 설치되어 있는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경에 관한 것이다.
본 발명에 사용되는 형광현미경은 시료에서 발생되는 형광을 관찰할 수 있는 현미경으로 크게 대물부(100), 광원부(200) 및 검출부(300)로 구성될 수 있다.
상기 대물부(100)는 시료(110)가 안착되어 관찰이 용이하도록 고정되는 부분으로, 시료(110)를 고정하기 위한 고정 수단을 포함하고 있으며 시료(110)에 여기광을 공급함과 동시에 시료(110)에서 발광되는 형광을 수집/확대하기 위한 대물렌즈(120)가 설치될 수 있다. 또한 다이크로익 미러(130)가 설치되어 상기 광원부(200)에서 공급되는 여기광을 반사하여 상기 시료방향으로 공급함과 동시에 시료(110)에서 발생되는 형광을 투과하여 상기 검출부로 전달할 수 있다(도 1 참조).
상기 다이크로익(Dichroic mirror) 미러(130)는 특정 파장대역의 빛을 반사하고 나머지 파장대역의 빛은 투과시키는 거울의 일종으로 본 발명의 경우 상기 여기광을 반사하면서도 상기 형광을 투과시키는 다이크로익 미러를 이용하여 상기 여기광의 입사와 상기 형광의 투과를 동시에 수행할 수 있다.
상기 광원부(200)는 상기 시료의 형광체를 여기시키기 위한 여기광을 발생시키는 부분으로, 상기 시료에 필요한 여기광만을 공급하기 위하여 여기광 필터(220)가 설치될 수 있다. 상기 여기광 필터(220)는 상기 광원부의 광원(210)에서 공급되는 빛 중 상기 시료에 부착되어 있는 형광체를 여기 시킬 수 있는 파장의 빛만을 투과시키는 필터일 수 있다. 또한 상기 여기광 필터(220)는 다양한 파장의 여기광을 형성할 수 있도록 교체식으로 부착되는 것이 바람직하다.
상기 광원(210)은 상기 여기광의 파장을 포함할 수 있는 빛이라면 제한없이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 연색성이 높은 백색 발광소자가 사용될 수 있다. 상기 고연색 백색 발광소자는 가시광 전역에 걸쳐 매끄러운 발광 스펙트럼이 분포되어 있으며, 또한 여기광으로 많이 사용되는 자외선 영역까지 이러한 스펙트럼이 이어지도록 발광되고 있어 태양광과 유사한 발광 패턴을 가지고 있다. 이 고연색 발광소자의 경우 다양한 발광체와 형광체를 혼합하여 발광을 수행하고 있으므로 상기 여기광 필터(220)를 이용하여 원하는 스펙트럼의 여기광을 형성할 수 있다. 특히 기존에 사용되는 광원의 경우 좁은 영역의 스펙트럼을 가지는 빛 만을 공급하고 있어 광원에서 공급되는 스펙트럼 외의 여기광이 필요한 경우 광원 자체를 교환하여야 하지만, 상기와 같이 고연색성 백색 발광소자를 사용하는 경우 광원의 교체 없이 상기 여기광 필터(220)를 교환하는 것만으로도 원하는 여기광을 형성할 수 있다.
또한 상기 백색발광소자 이외에도 단색광을 발산하는 레이저를 광원으로 사용될 수 있으며, 이 경우 상기 레이저가 발산하는 단색광은 상기 형광체를 동시에 여기시킬 수 있는 것이 바람직하다. 상기 레이저의 경우 상기 발광소자를 사용한 광원에 비하여 높은 광도를 가질 수 있으며, 스펙트럼 대역이 좁은 단색광을 발산할 수 있다. 따라서 상기 형광체를 더욱 밝게 여기시킬 수 있으므로, 상기 형광체들이 동일한 여기광을 사용할 수 있는 경우라면 이러한 레이저 광원을 사용할 수 있다. 다만 상기 형광체를 여기시키기 위하여 넓은 스펙트럼이 필요한 경우에는 상기 고연색의 백색 발광소자를 사용하는 것이 바람직하므로 각 실험의 조건에 따라 적절한 광원을 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 검출부(300)는 상기 시료에서 발생되는 형광을 관찰하기 위하여 설치되는 부분으로 튜브렌즈(tube lens, 330)를 포함하고 있어 상기 형광의 관찰을 용이하게 할 수 있다.
기존에 사용되는 형광현미경(도 2 참조)의 경우 단순히 형광의 피크파장을 측정하여 형광의 종류를 판별하고 있으므로, 상기 피크파장이 유사한 형광을 사용하는 경우 형광의 종류 나아가 상기 형광체가 부착된 시료의 종류를 판정하지 못하는 단점을 가지고 있다. 또한 형광체가 발생시키는 형광을 검출하기 위하여 각 색상에 따른 다수개의 카메라(도 2의 31, 32, 33)를 사용해야 하므로 장치의 크기 및 비용이 증가하는 문제점을 가지고 있다. 아울러 상기와 같이 피크파장이 구분되는 형광체의 경우 흡광 스펙트럼 역시 상이하게 되므로(도 3참조) 다종의 여기광을 사용해야 한다는 문제점을 가지고 있다.
이를 개선하기 위하여 상기 시료에서 발생되는 형광을 분광시킨 다음, 원래위치와 분광된 빛의 위치차이를 이용하여 형광을 식별하는 기술이 사용되고 있다(도 4 참조). 이 기술은 형광의 색상이 아닌 위치 차이를 이용하여 검출하므로 하나의 검출기를 사용할 수 있으며, 각 형광 스펙트럼 사이의 오버랩이 심한 경우에도 사용될 수 있다. 도 5에 나타난 바와 같이 이 기술은 2개의 상을 조합해서 발광점의 확인(path 1) 및 분광을 확인(path 2)하며, 이러한 발광점과 분광의 상대적인 위치 차이를 이용하여 시료의 종류를 식별하고 있다. 하지만, 형광의 발광점을 파악하기 위한 경로(path 1)와 분광을 위한 경로(path 2)의 두 가지로 형광을 나눠서 관찰해야 하므로 검출 영역이 좁아짐과 동시에 감도가 떨어진다는 문제점을 가지고 있다.
따라서 본 발명의 경우 빛의 경로를 나누지 않고 형광의 종류를 판정하기 위하여 상기 검출부에 형광 스펙트럼의 일부를 차단하는 식별필터를 설치하여 형광의 종류를 식별할 수 있다.
상기 시료(110)에 부착되어 있는 형광체는 상기 광원부(200)에서 공급되는 여기광으로 인하여 형광을 발산하게 되며, 상기 형광은 상기 다이크로익 미러(130)를 통과하여 상기 검출부(300)로 공급된다. 또한 상기 검출부(300)의 내부에는 분광수단(320)이 설치되어 있으며, 상기 분광수단(320)을 통과한 형광은 파장 차이에 의하여 분광되어 타원형으로 관찰될 수 있다(도 6의 좌측 그림 참조).
본 발명의 경우 이러한 형광을 식별필터(310)를 이용하여 일부 파장을 차단하고 있으므로, 상기 타원형의 일측 또는 양측이 절단된 형태로 관찰될 수 있다(도 6의 우측 그림 참조). 즉 상기 타원형으로 분광된 형광을 차단된 지점으로부터 상대적인 위치 및 길이를 파악하는 것으로 상기 형광의 종류를 식별할 수 있다.
상기 시료(110)에서 발산되는 형광은 그 종류에 따라 상이한 스펙트럼을 가질 수 있다. 따라서 일정한 파장을 차단하는 식별필터를 통과시키는 경우 상기 형광을 분광하였을 때 타원형의 일부가 절단되어 있는 형상으로 관찰될 수 있으며(도 6의 우측 그림), 이러한 절단의 위치는 상기 형광의 스펙트럼 분포 및 식별필터의 차단 파장과의 상대적인 조합에 의하여 결정될 수 있다(도 7, 도 8 참조).
예를 들어 470nm~670nm의 스펙트럼 분포를 가지며, 530nm의 발광피크를 가지는 적색 형광의 경우 500nm이하의 파장을 차단하는 식별필터를 통과하게 되면 좌측 일부가 절단된 타원형의 형광을 관찰할 수 있다(짧은 파장의 빛이 좌측으로 가도록 분광). 또한 600nm이상의 파장을 차단하는 식별필터를 사용하는 경우 상기 타원의 우측이 잘려있는 형상으로 관찰될 수 있다. 즉 적절한 식별필터를 사용하는 경우 상기 형광의 종류에 따라 다른 차단부를 가지는 타원이 관측될 수 있으며, 이는 상기 식별필터를 적절히 선택하여 사용하는 것만으로도 상기 형광의 식별이 가능한 것을 의미한다.
또한 상기 형광의 스펙트럼 피크가 근접하여 있는 경우에는 상기 잘려있는 부분으로부터 남아있는 타원형 형광의 상대적인 형상 차이에 의하여 두 가지 형광을 식별할 수 있으며, 이는 발광피크가 근접하는 다수개의 형광체를 동시에 사용하는 경우에도 이를 식별할 수 있음을 의미한다(도 7 참조).
또한 상기와 같은 식별을 용이하게 할 수 있도록 상기 식별필터(310)는, 상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부; 상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부 중 적어도 하나 이상을 차단할 수 있다.
일반적으로 발광 스팩트럼의 경우 발광 피크대역에서 가장 밝은 형광이 관찰되기 때문에 상기와 같은 차단은 상기 발광 스팩트럼의 피크대역을 제외한 일부를 가리는 것이 바람직하다. 하지만 상기 발광 피크 대역을 포함하는 부분을 차단하는 경우에도 남아 있는 부분으로 인하여 형광이 관찰될 수 있으므로, 상기와 같이 형광 스팩트럼의 일부를 가릴 수 있는 식별필터를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기와 같은 식별을 용이하게 할 수 있도록 상기 식별필터(310)는, 상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이하의 파장; 및 상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이상의 파장을 차단할 수 있다. 이때 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼 및 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼은 피크 파장 이하 또는 이상의 파장이 제거되어 관찰되며, 나머지 형광의 경우 상기 두 형광의 사이에 피크 파장이 위치하게 된다(도 7 참조). 따라서 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼 및 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼은 일종의 기준점으로 작용할 수 있으며, 이를 기준으로 하여 타원의 형상 및 차단부와의 상대적인 위치차이를 측정하여 상기 형광을 식별할 수 있다.
또한 이 경우 상기 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광은 바람직하게는 가장 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광일 수 있으며, 상기 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광은 바람직하게는 가장 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광인 것이 바람직하다. 가장 짧은 발광피크 또는 가장 긴 발광피크를 가지는 형광의 피크 파장 이하 또는 이상의 파장을 차단하는 것으로 상기와 같은 식별필터의 효과를 최대화 할 수 있다.
상기 시료에서 발산되는 형광은 2~100개의 발광피크를 가지며, 각각의 피크를 가지는 발광 스펙트럼의 일부 또는 전부가 오버랩되어 발산될 수 있다. 상기와 같이 본 발명의 경우 다수개의 형광을 식별할 수 있으며, 상기 식별필터에 의하여 일측 또는 양측이 잘린 타원 형태로 관찰되는 것이 바람직하다. 따라서 상기 형광을 발광 스펙트럼의 일부 또는 전부가 오버랩되어 있는 것이 바람직(도 7 참조)하며, 이 경우 상기 식별필터에 일부가 차단되어 식별이 가능할 수 있다. 아울러 상기와 같이 발광스펙트럼이 오버랩되는 경우 일반적으로는 여기광 역시 오버랩되므로(도 9참조) 상기 광원부에서 하나의 여기광을 사용하는 경우에도 모든 형광체를 여기시킬 수 있다. 이를 통하여 본 발명의 경우 하나의 광원을 사용할 수 있을 뿐만 아니라 하나의 파장을 가지는 여기광으로 시료 전체의 형광체를 발광시킬 수 있으며, 이를 상기 식별필터를 이용하여 식별할 수 있으므로, 기존의 형광분석방법이 비하여 편의성을 크게 개선시킬 수 있다.
또한 보다 많은 형광을 동시에 식별할 경우 하나의 여기광으로 모든 형광체를 발광시킬 수는 없으므로 다수 개의 여기광을 사용할 수도 있다. 위에서 살펴본 바와 같이 하나의 여기광으로 상기 형광체를 모두 여기시키는 것이 가장 바람직하지만, 다수개의 검출이 필요한 경우 형광체의 양이 많아질 수 밖에 없으며, 이 경우 하나의 여기광으로는 모두 여기시키지 못할 수 있다. 따라서 이 경우에는 다수개의 여기광을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 각 형광에 따라 흡수파장의 피크가 상이하므로 하나의 여기광을 사용하여 모든 형광을 여기시킬 수 있는 경우에도 다수개의 여기광을 동시에 또는 순차적으로 공급하여 최적의 이미지를 얻도록 할 수도 있다.
또한 본 발명은 위에서 살펴본 바와 같이 발광 피크가 유사한 형광체를 사용하는 경우에도 이를 식별할 수 있음에 따라, 2~100개의 발광피크를 가지는 형광체를 동시에 식별할 수 있다. 따라서 본 발명의 경우 다종의 시료를 동시에 식별할 수 있다.
상기 시료는, 기판 상에 부착된 포획프로브; 상기 포획프로브와 결합된 바이오마커; 및 상기 바이오마커와 결합되며, 형광체를 포함하는 검출프로브를 포함하며, 상기 기판의 표면에는 2~100종의 검출프로브가 배열되어 있을 수 있다.
상기 시료의 경우 일반적인 형광분석에 사용되는 시료를 사용할 수 있으며, 특히 기존에 사용되는 바이오마커의 면역학적 분석방법에 사용될 수 있다(도 10 참조).
이를 상세히 살펴보면, 기판은 각 지점에 따라 상이한 포획프로브가 부착되어 있으며, 상기 포획프로브는 각각 특정한 바이오마커와 항원-프로브결합을 수행할 수 있다. 이때 상기 기판의 위로 상기 바이오마커를 포함하는 체액이 공급되면, 상기 바이오마커는 상기 특정 지점에 부착되어 있는 포획프로브에 결합되어 상기 기판의 표면에 부착될 수 있다.
또한 상기 검출프로브는 1종 이상의 형광체가 부착되어 있으며, 상기 검출프로브와 결합된 바이오마커는 1종 이상의 발광피크를 가질 수 있다.
상기와 같이 바이오마커의 부착이 완료된 이후, 각 바이오마커에 특이적으로 결합될 수 있는 검출프로브를 공급하여 상기 바이오마커에 부착할 수 있다. 이때 상기 검출프로브는 하나의 형광체가 부착되어 하나의 발광피크를 가지는 형광을 발산할 수도 있으며, 2종 이상의 형광체가 부착되어 2종 이상의 발광피크를 가지는 형광을 발산할 수도 있다. 또한 상기 검출프로브와 다른 종류의 검출프로브의 경우 상기 검출프로브와 동일하거나 상이한 형광체를 포함하는 것으로 다수의 검출프로브를 동시에 구분하거나 각각의 검출프로브를 독립적으로 구분할 수 있다.
즉 각 검출프로브에 따라 상이한 형광체 또는 2종 이상의 형광체 조합이 부착되어 있으며, 따라서 상기 검출프로브가 부착된 바이오마커는 특정 발광피크 또는 두 개 이상의 발광피크를 가지는 형광을 발산할 수 있다.
따라서 상기 바이오마커가 존재하는 경우 상기 기판의 특정지점은 상기 바이오마커에 결합되어 있는 검출프로브에 의하여 형광을 발생시킬 수 있으며, 이러한 형광을 본 발명에서 형태적으로 분석하여 형광의 종류를 식별하는 것이 가능하다.
상기 검출부(300)는 상기 시료에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단(320)을 포함할 수 있다. 상기 검출부(300)로 공급되는 형광은 상기 시료(110)에 부착되어 있는 형광체를 통하여 발산되는 것이기 때문에 단순한 원형의 형광을 가질 수 있다. 본 발명의 경우 이러한 형광을 분석하기 위하여 이를 스펙트럼 파장에 따라 분광하는 것이 바람직하므로 상기 검출부에는 상기 형광을 분광시킬 수 있는 분광수단(320)이 설치될 수 있다.
이때 상기 분광수단(320)은 상기 형광을 분광시킬 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 프리즘(prism) 또는 회절격자(diffraction grating)를 포함하는 분광기를 사용할 수 있다.
상기 식별필터(310)는 상기 분광수단(320)의 전면부에 또는 후면부에 설치될 수 있다. 상기 분광수단(320)을 통과하는 형광의 경우 위에서 살펴본 바와 같이 타원형을 가지도록 분광될 수 있으며, 본 발명의 경우 상기 형광의 일부 파장을 상기 식별필터(310)를 이용하여 차단하고 있다. 상기 식별필터(310)는 한 개 이상의 장파장통과필터(long-pass filter), 단파장통과필터(short-pass filter), 대역통과필터(band-pass filter) 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 상기 장파장통과필터는 상대적으로 장파장의 대역을 통과시키는 필터로 상기 필터를 사용하는 경우 단파장 부분을 차단할 수 있다. 또한 이와는 반대로 상기 단파장통과필터는 상대적으로 단파장의 대역을 통과시키는 필터로 상기 필터는 사용하는 경우 장파장 부분을 차단할 수 있다. 따라서 본 발명의 경우 이러한 장파장통과필터와 단파장통과필터를 조합하여 사용하는 것으로 일정대역대만을 통과시키는 식별필터로서 사용할 수 있다. 이와는 별도로 일정한 대역의 파장만을 통과시키는 대역통과필터를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명은 또한 형광체가 부착된 시료를 준비하는 단계; 상기 시료를 형광 현미경의 대물부에 위치시키는 단계; 상기 시료에 광원을 이용하여 여기광을 공급하는 단계; 상기 여기광에 의하여 발산된 형광 스펙트럼의 일부를 식별필터를 이용하여 차단하는 단계; 상기 식별필터를 통과한 형광을 분광시키는 단계; 및 상기 분광된 형광을 이용하여 시료의 종류를 판별하는 단계를 포함하는 바이오마커 식별방법에 관한 것이다.
상기 형광체가 부착된 시료를 준비하는 단계는 기판에 바이오마커 및 형광체를 부착하여 준비하는 단계로 일반적인 형광분석법과 유사하게 준비될 수 있다. 즉 기판에 포획프로브를 부착한 다음, 상기 포획프로브에 바이오마커를 결합시키고, 상기 바이오마커에 특이적으로 부착되는 검출프로브를 부착하여 준비될 수 있다. 또한 상기 검출프로브의 경우 위에서 살펴본 바와 같이 형광체를 포함하고 있어 후술할 여기광의 공급에 의하여 일정한 스펙트럼을 가지는 형광을 발산할 수 있다(도 10참조).
상기 프로브는 상기와 같이 바이오마커와 부착될 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 항체, 나노바디(nanobody), scFv(single-chain fragment variable) 등 항체의 변형체, 압타머(aptamer) 등을 포함한다.
상기와 같이 준비된 시료는 형광 현미경의 대물부에 위치된 다음, 상기 시료에 광원을 이용하여 여기광을 공급할 수 있다. 상기 여기광은 상기 시료에 포함되어 있는 형광체를 발광시킬 수 있는 에너지를 공급하는 광을 의미하는 것으로 상기 여기광을 이용하여 상기 형광체의 일부 전자가 들뜬 상태로 되며, 이러한 들뜬 상태의 전자가 정상 상태로 돌아오면서 일정한 파장의 형광을 발산하게 된다. 따라서 상기 형광체는 그 종류에 따라 적절한 여기광을 사용하여 여기시키는 것이 바람직하다. 아울러 본 발명의 경우 2~100종의 형광체를 포함하는 시료의 경우에도 동일한 여기광을 사용할 수 있음은 위에서 살펴본 바와 같다.
상기와 같이 여기광에 의하여 형광이 발산되면 상기 형광은 검출부로 입사될 수 있다. 이때 상기 검출부에 설치되는 식별필터에 의하여 상기 형광 스펙트럼의 일부가 차단될 수 있다(도 6 내지 도 8 참조). 이렇게 일부 파장이 차단된 형광은 분광수단을 거쳐 분광될 수 있으며, 위에서 살펴본 바와 같이 일측 또는 양측이 절단된 타원으로 관찰되어 각 형광의 종류, 나아가 형광체가 부착된 시료의 종류를 식별하는 것이 가능하다.
이때 상기 시료의 종류를 판별하는 단계를 상세히 살펴보면, 분광된 형광의 차단되는 지점을 인식하는 단계; 상기 차단되는 지점으로부터 상기 분광된 형광의 상대적인 위치 및 길이를 식별하는 단계; 및 상기 형광의 상대적인 위치 및 길이를 이용하여 시료의 종류를 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 분광된 형광은 형광의 파장 및 세기에 따라 타원형으로 관찰될 수 있다(도 6의 좌측그림 잠초). 이를 상세히 살펴보면, 상기 분광수단을 통과한 형광은 짧은 파장은 굴절률(=굴절각)이 크고, 긴 파장은 굴절률(=굴절각)이 작아 파장에 따라 길이가 길게 배열될 수 있다. 또한 상기와 같이 배열된 중간부분의 경우 발광피크가 포함되어 있어 더 밝게 관찰되므로 양측단보다 상대적으로 굵기가 굵게 관찰될 수 있다. 이를 종합하면 상기 분광수단을 통과한 형광은 타원형으로 관찰될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 식별필터를 이용하여 상기 형광 스펙트럼의 일부를 차단하고 있으므로, 상기 타원형의 일부가 잘라진 형태로 관찰될 수 있으며(도 6의 우측 그림), 이 잘라진 부분 즉 차단되는 지점을 인식하여 기준점으로 사용할 수 있다. 이때 상기 차단되는 지점의 인식은 사용자가 육안으로 확인하고 이를 수동으로 지정할 수도 있지만, 상기 차단되는 지점은 다른 부분과는 달리 직선형으로 차단되고 있으므로, 직선으로 형성된 광을 자동으로 인식하도록 제어된 인식장치를 이용하여 자동으로 지정될 수도 있다.
상기와 같이 차단된 지점의 인식이 완료된 이후 상기 차단된 지점과 분광된 형광의 상대적인 위치 및 길이를 식별할 수 있다. 상기 식별필터가 스펙트럼의 짧은 파장 부분을 차단하는 경우 상기 타원의 좌측이 잘려있는 형상으로 관찰되며(좌측이 짧은 파장을 가지도록 분광), 스펙트럼의 긴파장 부분을 차단하는 경우 우측부분이 잘려있는 타원으로 관찰될 수 있다.
따라서 상기 차단된 지점에서 우측으로 형광이 존재하는 경우 상기 형광의 발광피크가 상대적으로 짧은 파장을 가지는 형광체를 사용한 것이며, 차단된 지점에서 좌측으로 형광이 존재하는 경우 발광피크가 상대적으로 긴파장을 가지는 형광체를 사용한 것으로 식별할 수 있다. 아울러 양측이 잘려 있는 형상의 타원으로 관찰되는 경우 중간파장대의 발광피크를 가지는 형광체를 사용한 것으로 식별될 수 있다(도 7 참조).
또한 차단된 지점에서 동일한 방향으로 형광을 형성하는 형광체가 다수 존재하는 경우 차단된 지점으로부터 상기 형광의 총 길이 및 타원형의 가장 두꺼운 부분까지의 길이를 측정하여 각 형광체가 부착된 시료의 종류를 식별할 수 있다(도 8 참조). 이 경우 상기 형광의 총길이는 상기 식별 필터에 의하여 차단되지 않은 형광스펙트럼의 총 파장대역을 나타내며, 상기 타원형의 가장 두꺼운 부분은 상기 형광체에 의하여 발생되는 발광피크 지점을 의미하는 것이므로 이 두 가지를 종합적으로 관찰하여 동일한 방향에 차단된 지점이 형성된 경우에도 각 시료를 식별할 수 있다. 이는 도 11에 나타난 바와 같이 유사한 파장의 형광을 사용하는 경우에도 그 형광의 종류를 용이하게 식별할 수 있음을 의미한다. 도 11의 (a)에 나타난 바와 같이 유사한 발광색상을 가지는 형광체를 사용하는 경우 그 종류의 구분이 용이하지 않을 수 있다. 하지만 본 발명의 경우 도 11의 (b)와 같이 식별 필터 및 분광수단을 이용하여 형광을 분광한 다음, 일부를 차단하여 그 종류를 식별할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예
세 종류의 바이오마커(CA19-9, CRP, TTR)의 구별이 가능한지를 검증하기 위하여 CA19-9의 검출항체에는 형광체로서 CF647을, CRP의 검출항체에는 형광체로서 CF660R을, TTR의 검출항체에는 형광체로서 CF680R을 표지하여 준비하였다. 도 12에 나타난 바와 같이 상기 각 형광체는 실선(CF647), 파선(CF660R) 및 점선(CF680R)의 발광 스펙트럼을 나타내고 있다.
상기 각 형광체의 스펙트럼을 일부를 차단하기 위한 식별필터로 Semrock의 FF01-680/42-25 필터를 사용하였다. 이 식별필터는 657 nm 이상 704 nm 이하만 투과시킨다.
또한 상기 세 종류의 형광체는 도 13에 나타난 흡광 스펙트럼을 가진다. 따라서 세 종류의 형광체(CF647, CF660R, CF680R)를 동시에 여기시키기 위하여 633nm파장의 레이저를 여기광 광원으로 사용하였다.
실험예
기판 표면에 상기 실시예의 세 종류 바이오마커 포획항체를 부착하고, 세 종류의 바이오마커(CA19-9, CRP, TTR)를 주입하여 포획항체에 부착시킨 후, 형광체가 표지되어 있는 세 바이오마커의 검출항체를 주입하여 세 바이오마커와 결합시켰다.
상기 시료를 형광 현미경의 대물부에 위치시키고 광원을 이용하여 여기광(633nm 파장의 레이저)을 공급하였다. 상기 여기광에 의하여 발산된 형광을 관찰하였다.
도 14는 식별필터 및 분광수단을 사용하지 않은 형광의 모습이다. 각 형광체가 표지되어 있는 세 종류의 바이오마커가 형광을 발산하고 있지만 세 종류의 바이오마커를 구분할 수는 없는 것으로 확인되었다.
도 15는 식별필터 없이 분광수단(각도 7도 41분의 석영 웨지(wedge) 프리즘)만을 사용하여 형광을 관찰한 모습니다. 각 형광의 세기가 약간의 차이를 보이고 있지만, 이러한 약간의 차이만으로 형광을 구분하기는 어렵다.
도 16은 분광수단(각도 7도 41분의 석영 웨지(wedge) 프리즘)과 식별필터(Semrock의 FF01-680/42-25 필터)를 사용하여 형광을 관찰한 모습이다. 도 16의 (a)는 CF647로 파장이 짧은 부분이 제거되어 좌측이 절단되어 있는 형상으로 관찰되고 있고, (b)는 CF660R로 양측의 파장이 제거되어 양측이 절단된 형상으로 관찰되고 있다. 또한 (c)는 CF680R로 파장이 긴 부분이 제거되어 우측이 절단되어 있는 형상으로 관찰되고 있다.
도 16에 나타난 바와 같이 본 발명의 경우 식별필터를 사용하여 형광의 차단부 및 상기 차단부에서의 상대적인 위치와 길이를 파악하는 것으로 형광의 종류를 즉각적으로 인식할 수 있으며, 하나의 화면에서 형광을 판독할 수 있기 때문에 검출 영역 및 감도가 향상된 관찰결과를 확인할 수 있다.
상기 식별필터에 의한 차단효과를 확인하기 위하여 각 형광체를 식별필터와 분광수단을 통과시킨 다음, 분광 스펙트럼을 측정하였다. 도 17에 나타난 바와 같이 (a)의 경우(CF647) 좌측이 절단된 분포를 확인할 수 있었으며, (b)의 경우(CF660R) 양측이 절단된 분포를 보이는 것으로 나타났다. 또한 (c)의 경우(CF670R) 우측이 절단된 분포를 가지는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 식별 필터 및 분광수단을 사용하는 것으로 다수개의 형광체를 용이하게 식별할 수 있다는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
100 : 대물부
110 : 시료
120 : 대물렌즈
130 : 다이크로익 미러
200 : 광원부
210 : 광원
220 : 여기광 필터
300 : 검출부
310 : 식별 필터
320 : 분광수단
330 : 튜브렌즈
340 : 카메라
110 : 시료
120 : 대물렌즈
130 : 다이크로익 미러
200 : 광원부
210 : 광원
220 : 여기광 필터
300 : 검출부
310 : 식별 필터
320 : 분광수단
330 : 튜브렌즈
340 : 카메라
Claims (13)
- 시료에서 발산되는 형광을 분석하는 형광 현미경에 있어서,
상기 형광 현미경의 검출부에는 상기 검출부로 입사되는 형광 스펙트럼의 일부를 차단하는 식별필터 및 상기 시료에서 발산되는 형광을 분광시키는 분광수단이 설치되어 있으며,
상기 분광수단에 의하여 분광된 형광은 일측 또는 양측이 잘린 타원형으로 관찰되며,
상기 식별필터에 의하여 차단되는 지점으로부터 상기 분광된 형광의 상대적인 위치 및 길이를 식별하여 시료의 종류를 판별하는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경.
- 제1항에 있어서,
상기 식별필터는,
상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부; 및
상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 일부;
중 적어도 하나 이상을 차단하는 것인 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경.
- 제1항에 있어서,
상기 식별필터는,
상기 시료에서 발산되는 형광 중 짧은 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이하의 파장; 및
상기 시료에서 발산되는 형광 중 긴 파장의 발광피크를 가지는 형광 스펙트럼의 피크 파장 이상의 파장;
을 차단하는 것인 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경.
- 제1항에 있어서,
상기 시료에서 발산되는 형광은 2~100개의 발광피크를 가지며, 각각의 피크를 가지는 발광 스펙트럼의 일부 또는 전부가 오버랩되어 있는 것인 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경.
- 제1항에 있어서,
상기 시료에 포함된 형광체는 하나 이상의 여기광으로 동시에 발광되는 것인 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경.
- 제1항에 있어서,
상기 시료는 2~100종의 형광체를 포함하고 있는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경.
- 제1항에 있어서,
상기 시료는,
기판 상에 부착된 포획프로브;
상기 포획프로브와 결합된 바이오마커; 및
상기 바이오마커와 결합되며, 형광체를 포함하는 검출프로브;
를 포함하며,
상기 기판의 표면에는 2~100종의 검출프로브가 배열되어 있는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경.
- 제7항에 있어서,
상기 검출프로브는 1종 이상의 형광체가 부착되어 있으며,
상기 검출프로브와 결합된 바이오마커는 1종 이상의 발광피크를 가지는 바이오마커 식별이 가능한 형광 현미경.
- 삭제
- 삭제
- 형광체가 부착된 시료를 준비하는 단계;
상기 시료를 형광 현미경의 대물부에 위치시키는 단계;
상기 시료에 광원을 이용하여 여기광을 공급하는 단계;
상기 여기광에 의하여 발산된 형광 스펙트럼의 일부를 식별필터를 이용하여 차단하는 단계;
상기 식별필터를 통과한 형광을 분광시키는 단계; 및
상기 분광된 형광을 이용하여 시료의 종류를 판별하는 단계;
를 포함하되,
상기 형광은 일측 또는 양측이 잘린 타원형으로 관찰되며,
상기 시료의 종류를 판별하는 단계는,
분광된 형광의 차단되는 지점을 인식하는 단계;
상기 차단되는 지점으로부터 상기 분광된 형광의 상대적인 위치 및 길이를 식별하는 단계; 및
상기 형광의 상대적인 위치 및 길이를 이용하여 시료의 종류를 판별하는 단계;
를 포함하는 바이오마커 식별방법.
- 삭제
- 제11항에 있어서,
상기 형광체가 부착된 시료는 상이한 형광체가 각각 부착된 2~100종 바이오마커인 바이오마커 식별방법.
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