KR101414248B1 - 형광 이미징 장치 - Google Patents
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Abstract
형광 이미징 장치가 개시된다. 본 발명에 따른 형광 이미징 장치는, 형광 광원인 제1 광원; 피검사체에 백색광 또는 단색광을 조사하는 제2 광원; 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터; 여기필터를 투과한 여기광을 피검사체 쪽으로 투과시키되, 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 제2 광을 반사하는 제1 이색성미러; 제1 이색성미러에 의해 반사된 형광 방출광 및 제2 광을 집광하는 대물렌즈; 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및 방사필터를 투과한 형광 방출광 및 제2 광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치는, 형광 광원인 제1 광원; 피검사체에 백색광 또는 단색광을 조사하는 제2 광원; 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터; 여기필터를 투과한 여기광을 피검사체 쪽으로 반사시키되, 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 제2 광을 투과시키는 제2 이색성미러; 제2 이색성미러를 투과한 형광 방출광 및 제2 광을 집광하는 대물렌즈; 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및 방사필터를 투과한 형광 방출광 및 제2 광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 제1 광원에 의한 여기광이 대물렌즈를 거치지 않고 피검사체에 조사되도록 하여 제1 광원과 피검사체를 근접 배치할 수 있고 이에 따라 광량이 강한 여기광을 피검사체에 조사할 수 있어 강한 세기의 형광신호를 얻을 수 있고, 제1 광원에 의한 여기광과 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 백색광의 광 경로가 일치하지 않아 백그라운드 레벨(background level)이 낮아져 형광 이미지에서 높은 에스엔 비(S/N ratio)를 얻을 수 있으며, 제1 이색성미러에 의하여 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 백색광을 반사하도록 하여 형광 이미지 및 명시야 이미지의 관찰 시 제1 이색성미러의 제거 없이 관찰하게 되어 빛의 굴절에 따른 광 경로 변화를 배제하여 형광 이미지와 명시야 이미지의 비교가 용이하다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치는, 형광 광원인 제1 광원; 피검사체에 백색광 또는 단색광을 조사하는 제2 광원; 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터; 여기필터를 투과한 여기광을 피검사체 쪽으로 반사시키되, 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 제2 광을 투과시키는 제2 이색성미러; 제2 이색성미러를 투과한 형광 방출광 및 제2 광을 집광하는 대물렌즈; 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및 방사필터를 투과한 형광 방출광 및 제2 광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 제1 광원에 의한 여기광이 대물렌즈를 거치지 않고 피검사체에 조사되도록 하여 제1 광원과 피검사체를 근접 배치할 수 있고 이에 따라 광량이 강한 여기광을 피검사체에 조사할 수 있어 강한 세기의 형광신호를 얻을 수 있고, 제1 광원에 의한 여기광과 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 백색광의 광 경로가 일치하지 않아 백그라운드 레벨(background level)이 낮아져 형광 이미지에서 높은 에스엔 비(S/N ratio)를 얻을 수 있으며, 제1 이색성미러에 의하여 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 백색광을 반사하도록 하여 형광 이미지 및 명시야 이미지의 관찰 시 제1 이색성미러의 제거 없이 관찰하게 되어 빛의 굴절에 따른 광 경로 변화를 배제하여 형광 이미지와 명시야 이미지의 비교가 용이하다.
Description
본 발명은 형광 이미징 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 형광 현미경 광학계에 기반하고 있는 이미징 장치에 관한 것으로서, 서로 다른 형광물질(Fluorophore)에 의해 염색된 피검사체의 형광영상을 관찰할 수 있도록 이루어고, 구조가 간단하고 조작이 용이한 형광 이미징 장치에 관한 것이다.
시료에 자외선과 단파장의 가시광선을 조사하면 시료의 염료 분자가 발광을 하게 되는데, 그때 방출되는 가시광선 범위의 형광을 관찰하는 현미경을 형광현미경(Fluorescent Microscope, 螢光顯微鏡)이라고 한다.
형광현미경의 시료는 스스로 형광을 띠거나 단파장을 흡수했을 때 형광을 내는 요소가 있어야 한다. 이를 위하여, 시료에 형광 물질(형광색소)을 처리한 후, 시료에 형광 물질의 흡수 파장의 광을 조사하여 시료로부터 발산되는 방사광을 통해 시료를 관찰한다.
형광현미경은 매우 적은 양의 형광 물질을 쉽게 감지할 수 있기 때문에 사람이 식별하기 힘든 시료나 세포 등에 있는 형광물질의 분포 및 단백질의 이동경로 연구에 쓰인다.
또한 형광 현미경은 핵산, 세포 내 물질 또는 세포 자체의 특성을 자동으로 분석해주는 다양한 형태의 이미지 장치에 사용되어 오고 있다. 일례로 자동 세포 계수기의 경우 명시야 광학계 현미경이 내장되어 많이 사용되어 왔으나 측정하고자 하는 세포가 포함된 검체가 순수 분리되지 않은 경우 명시야 광학계에서는 정확한 측정값을 제공하지 못한다. 이를 극복하기 위해 검체를 형광 염색하고 형광 현미경법에 의해 측정하는 형광 자동 세포계수기가 개발되어 왔다. 또한 DNA 시퀀서, DNA 칩 스캐너, 이미지 사이토메트리와 같은 장비도 기본적으로 형광 현미경 광학계를 내장하고 이를 적절한 구동부 및 소프트웨어와 연결시킴으로써 원하는 형광 영상을 획득하고 이를 분석하도록 이루어진다.
일반적인 형광현미경의 구성 및 작용은 다음과 같다.
종래의 형광현미경에서는 여기필터(excitation filter)를 통하여 백색광 중에서 플레이트 위에 놓인 시료에 부착된 형광체의 흡수 파장과 일치하는 단색광을 선별하고, 선별된 흡수 파장의 단색 광의 경로를 색선별 거울(dichroic mirror)을 통해 조정하여 대물렌즈를 통해 시료에 조사하고, 방사필터(emission filter)를 통하여 대물렌즈 및 색선별 거울을 통과한 시료의 형광체에 의해 발생한 광에서 시료의 형광체의 발색 파장과 일치하는 광을 선별하여 이미지센서로 제공한다.
이미지센서는 접안 렌즈 또는 CCD와 같은 촬상소자로 구현되며 시료에 부착된 형광체의 발색 파장을 검출하여 보임으로써 시료의 형상을 관찰할 수 있도록 한다.
최근에는, 시료에 조사되는 광(光)에 따라 단일한 형광영상을 얻는 구조가 아니고, 다양한 광을 조사하여 형광영상을 얻은 후 이를 서로 비교함으로써 시료의 정확한 형상을 관찰하도록 하는 형태의 형광현미경이 개발되고 있으며, 이러한 형광현미경의 개략적인 구성이 도 1 및 도 2에 도시된다.
도 1에 도시되는 형광현미경은, 각 파장마다 별도의 광원을 사용하도록 하고 있으며, 필요에 따라 각 필터조립체(100)(광원(101), 집광렌즈(102), 여기필터(103, excitation filter), 이색성미러(104, dichroic mirror) 및 방사필터(105, emission filter))를 교체하면서 관찰이 이루어지도록 하고 있다.
그러나 우선 도 1에 도시된 형광현미경의 경우, 광원(101)이 대물렌즈(107)을 거쳐 조사되기 때문에 광원(101)에서 피검사체(S)까지 거리가 멀어지게 되고, 이에 따라 광량이 약하여 관찰되는 형광신호의 세기가 약하게 되는 문제점이 있다.
또한 이러한 형태의 경우, 개별적인 필터조립체(100)를 구비하여야 하므로, 형광현미경의 기구적 구성이 복잡하고, 부피가 크며 제조단가가 상승할 수밖에 없다.
도 2에 도시되는 형광현미경은, 여기광의 조사를 위한 광원(101) 및 여기필터(102)는 하나만 구비되도록 하고, 이색성미러(104)와 이미지센서(106)를 여러개 사용하여 여러 파장의 빛을 검출하도록 구성되어 있다.
도 2에 도시된 형태의 형광현미경은, 도 1에서와 같이 필터조립체의 이동이 필요없어 안정적인 구조를 가지는 것이나, 역시 광원(101)이 대물렌즈(107)을 거쳐 피검사체(S)에 조사되기 때문에 광량이 약하여 관찰되는 형광신호의 세기가 약하게 되는 문제점이 있고, 이색성미러(104) 및 고가의 이미지센서(106)를 다수 사용하여야 하는 것이므로, 역시 제조단가가 상승하는 문제점이 있다.
또한, 도 1 및 도 2에 도시되는 형광현미경은, 대물렌즈(107)와 이미지센서(106) 사이에 이색성미러(104)가 위치하고 명시야 이미지를 관찰할 때에는 이색성미러(104)를 빼야 되는데, 이색성미러(104)가 있는 경우와 없는 경우에는 빛의 굴절로 인해 빛의 경로가 서로 달라져 명시야 이미지(bright field image)와 형광 이미지(fluorescence image)가 서로 겹쳐지지 않고 큰 차이가 발생하게 되어, 양 이미지의 비교가 곤란한 문제점이 있게 된다.
이를 해결하기 위하여 유한 콘주게이트 대물렌즈(finite conjugate objective lens) 대신에 무한 보정 대물렌즈(infinity-corredted objective lens)를 사용하는데, 이 경우 정해진 초점거리(focal length)를 가지는 튜브렌즈(tube lens)가 추가로 필요하여 더욱 많은 공간이 필요하게 되고 장비의 크기가 커지는 문제점이 있게 된다.
본 발명의 목적은, 형광 광원을 대물렌즈와 피검사체 사이의 광축(on-axis)에 위치시킴으로써 높은 광량을 조사할 수 있고, 형광 이미지 및 명시야 이미지의 관찰 시 빛의 굴절에 따른 광 경로 변화를 배제할 수 있으며, 광원의 빛이 대물렌즈 또는 이미지센서로 향하지 않아 백그라운드 레벨(background level)이 낮아져 형광 이미지에서 높은 에스엔 비(S/N ratio)를 얻을 수 있는 형광 이미징 장치를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 서로 다른 형광물질(fluorophore)에 의해 염색된 피검사체의 이미지를 관찰할 수 있고, 구조가 간단하고 안정된 조작이 이루어질 수 있으며, 포커스 시프트(focus shift) 발생을 해소할 수 있는 형광 이미징 장치를 제공하는 것이다.
상기 목적은, 형광 광원인 제1 광원; 피검사체에 백색광 또는 단색광을 조사하는 제2 광원; 상기 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터; 상기 여기필터를 투과한 여기광을 상기 피검사체 쪽으로 투과시키되, 상기 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 상기 제2 광원에 의한 제2 광을 반사하는 제1 이색성미러; 상기 제1 이색성미러에 의해 반사된 상기 형광 방출광 및 제2 광을 집광하는 대물렌즈; 상기 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및 상기 방사필터를 투과한 상기 형광 방출광 및 상기 제2 광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치에 의해 달성된다.
또한 상기 목적은, 형광 광원인 제1 광원; 피검사체에 백색광 또는 단색광을 조사하는 제2 광원; 상기 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터; 상기 여기필터를 투과한 여기광을 상기 피검사체 쪽으로 반사시키되, 상기 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 상기 제2 광원에 의한 제2 광을 투과시키는 제2 이색성미러; 상기 제2 이색성미러를 투과한 상기 형광 방출광 및 제2 광을 집광하는 대물렌즈; 상기 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및 상기 방사필터를 투과한 상기 형광 방출광 및 상기 제2 광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치에 의해 달성된다.
또한 상기 목적은, 형광 광원인 제1 광원; 상기 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터; 대물렌즈와 피검사체 사이에 위치하며, 상기 여기필터를 투과한 여기광을 상기 피검사체 쪽으로 투과시키되, 상기 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광을 반사하는 제1 이색성미러; 상기 제1 이색성미러에 의해 반사된 상기 형광 방출광을 집광하는 대물렌즈; 상기 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및 상기 방사필터를 투과한 상기 형광 방출광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치에 의해 달성된다.
또한 상기 목적은, 형광 광원인 제1 광원; 상기 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터; 대물렌즈와 피검사체 사이에 위치하며, 상기 여기필터를 투과한 여기광을 상기 피검사체 쪽으로 반사시키되, 상기 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광을 투과시키는 제2 이색성미러; 상기 제2 이색성미러를 투과한 상기 형광 방출광을 집광하는 대물렌즈; 상기 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및 상기 방사필터를 투과한 상기 형광 방출광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치에 의해 달성된다.
여기서 상기 제1 광원, 여기필터, 제1 이색성미러 및 제2 이색성미러는 파장별로 구분되어 다수개로 구비될 수 있다.
또한, 상기 방사필터는, 다수개로 구비되어 서로 다른 영역의 파장을 투과시키고, 상기 형광 방출광의 경로 상에 선택적으로 배치될 수 있다.
그리고 다수개로 구비되는 상기 방사필터는, 서로 두께가 상이하도록 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 형광현미경에서, 다수개로 구비되는 상기 방사필터는, 서로 동일평면상에 위치하여 이동하도록 이루어질 수 있다.
또한 상기 방사필터가 결합되는 필터휠을 더 포함하여 이루어지고, 상기 필터휠은, 회전축을 기준으로 회전하면서 상기 각 방사필터를 상기 형광 방출광의 경로 상에 배치하도록 이루어진다.
또한 구동모터; 및 상기 구동모터에 의해 회전하는 구동기어를 더 포함하여 이루어지고, 상기 필터휠의 테두리에는 기어가 형성되며, 상기 필터휠은 상기 구동기어와 직접 또는 간접적으로 맞물려 회전하도록 이루어진다.
본 발명에 따른 형광현미경에서, 다수개로 구비되는 상기 방사필터가 이루는 면은, 상기 형광 방출광의 경로와 수직을 이룬다.
또한, 상기 여기필터를 투과하는 광의 중심파장은 360nm이고, 상기 제1 이색성미러에 의해 투과되는 광의 기준 파장 또는 상기 제2 이색성미러에 의해 반사되는 광의 기준파장은 400nm이고, 상기 방사필터는, 450nm 및 530nm의 파장을 투과시키도록 조합될 수 있다.
이와 달리, 상기 여기필터를 투과하는 광의 중심파장은 475nm이고, 상기 제1 이색성미러에 의해 투과되는 광의 기준 파장 또는 상기 제2 이색성미러에 의해 반사되는 광의 기준파장은 500nm이며, 상기 방사필터는, 530nm 및 600nm의 파장을 투과시키도록 조합될 수 있다.
또한 이와 달리, 상기 여기필터를 투과하는 광의 중심파장은 525nm이고, 상기 제1 이색성미러에 의해 투과되는 광의 기준 파장 또는 상기 제2 이색성미러에 의해 반사되는 광의 기준파장은 560nm이며, 상기 방사필터는, 595nm 및 690nm의 파장을 투과시키도록 조합될 수 있다.
본 발명에 의하면, 제1 광원에 의한 여기광이 대물렌즈를 거치지 않고 피검사체에 조사되도록 하여 제1 광원과 피검사체를 근접 배치할 수 있고 이에 따라 광량이 강한 여기광을 피검사체에 조사할 수 있어 강한 세기의 형광신호를 얻을 수 있고, 제1 이색성미러에 의하여 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 제2 광(백색광 또는 단색광)을 반사하도록 하여 형광 이미지 및 명시야 이미지의 관찰 시 제1 이색성미러의 제거 없이 관찰하게 되어 빛의 굴절에 따른 광 경로 변화를 배제하여 형광 이미지와 명시야 이미지의 비교가 용이하다.
또한, 광원, 집광렌즈, 여기필터 및 이색성미러를 1개씩만 사용하면서도 다수의 방사필터를 통해 서로 다른 이미지를 획득할 수 있고 구조가 간단하고 제조비용을 줄일 수 있다.
또한, 서로 다른 형광물질에 의해 염색되는 피검사체를 관찰할 때 종래의 형광현미경에서와 같이 필터조립체(광원, 초점랜즈, 여기필터, 이색성미러 및 방사필터를 포함) 전체를 이동시키지 않고 방사필터만을 이동시키면 되므로, 이동부의 크기 및 부하를 줄이고 광 경로의 정렬상태 변화를 최소화할 수 있다.
또한, 방사필터의 두께가 상이하도록 하고 투과되는 형광 방출광의 파장에 맞게 배치되도록 함으로써, 형광 방출광이 이색성미러 및 방사필터를 거치면서 초점이 변화되는 것을 최소화할 수 있다.
도 1 및 도 2는 종래의 형광현미경의 개략적인 구성을 도시한 도면,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광 이미징 장치의 개략적인 구성을 도시한 도면,
도 4은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치의 개략적인 구성을 도시한 도면,
도 5은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치의 개략적인 구성을 도시한 도면,
도 6는 형광현미경에서 포커스 시프트(focus shift)가 발생되는 것을 나타낸 도면,
도 7는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치의 일부 구성을 도시한 사시도,
도 8은 본 발명에 따른 형광 이미징 장치에 의해 관찰된 이미지를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광 이미징 장치의 개략적인 구성을 도시한 도면,
도 4은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치의 개략적인 구성을 도시한 도면,
도 5은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치의 개략적인 구성을 도시한 도면,
도 6는 형광현미경에서 포커스 시프트(focus shift)가 발생되는 것을 나타낸 도면,
도 7는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치의 일부 구성을 도시한 사시도,
도 8은 본 발명에 따른 형광 이미징 장치에 의해 관찰된 이미지를 나타낸 사진이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세하게 설명하면 다음과 같다. 다만, 본 발명을 설명함에 있어서, 이미 공지된 기능 혹은 구성에 대한 설명은, 본 발명의 요지를 명료하게 하기 위하여 생략하기로 한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광 이미징 장치(1)의 개략적인 구성을 도시한 도면이다.
본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)는 형광 현미경 광학계에 기반하고 있는 이미징 장치를 의미하며, 이에 따라 통상의 형광 현미경은 물론, 자동 세포계수기, 형광 자동 세포계수기, DNA 시퀀서, DNA 칩 스캐너, 이미지 사이토메트리와 같은 장비 또한 본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)에 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따른 형광 이미징 장치(1)는, 제1 광원(10), 여기필터(30), 제1 이색성미러(40), 대물렌즈(50), 방사필터(60) 및 디텍터(70)를 포함하여 이루어지며, 또한, 제2 광원(80)을 더 포함하여 이루어질 수 있다.
제1 광원(10)은 형광 광원(fluorescence light source)이고, UV LED, 청색 LED, 녹색 LED, 노란색 LED, 주황색 LED, 빨간색 LED 등으로 이루어질 수 있으며, 필요에 따른 파장의 여기광을 공급하도록 이루어진다. LED(light emitting diode)로 이루어지는 제1 광원(10)은, 수명이 길고 점등시간에 비하여 광량이 저하되는 비중이 작아 안정적으로 피검사체(S)를 관찰할 수 있고, 발열량이 작으므로 열변형이 생기는 현상을 방지할 수 있으며, LED 자체의 크기가 작기 때문에 본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)의 크기를 줄이는데 기여할 수 있다.
본 발명에서 제1 광은 제1 광원(10)에 의해 조사된 빛으로서, 제2 광과 구분된다. 제1 광원(10)으로부터 방사된 제1 광은 집광렌즈(20)(focusion lens)를 거쳐 여기필터(30)로 전달된다.
여기필터(30)(excitation filter)는 제1 광원(10)에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시킨다.
제1 광원(10), 집광렌즈(20) 및 여기필터(30)는 도 3에 도시된 바와 같이 여기광이 반사경(M)에 의하여 반사되도록 배치될 수 있고, 반사경(M) 없이 피검사체(S)를 향하는 방향(도면상 세로 방향)으로 바로 배치되는 형태로 이루어질 수 있음은 물론이다.
제2 광원(80)은, 여기광의 경로의 연장선 상에서 피검사체(S) 쪽(제1 광원의 반대쪽)에 형성되고, 피검사체(S)에 백색광 또는 단색광을 조사하도록 이루어진다. 본 발명에서 제2 광은 제2 광원(80)에 의해 조사된 빛으로서, 백색광 또는 단색광(단파장의 빛)으로 이루어질 수 있다. 피검사체(S)에 조사된 제2 광은 제1 이색성미러(40) 및 방사필터(60)를 거쳐 디텍터(70)로 전달되며, 디텍터(70)로 하여금 명시야 이미지를 획득할 수 있도록 한다.
제1 이색성미러(40)(dichroic mirror)는 여기필터(30)를 투과한 여기광을 피검사체 쪽으로 투과시키되, 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 제2 광을 반사시킨다.
일반적으로, 이색성미러(dichroic mirror)는 특정 파장의 광은 반사시키고 다른 파장의 광은 투과되도록 이루어질 수 있다. 예컨대, 단파장의 광은 반사시키며 장파장의 광은 투과되도록 이루어질 수 있고, 반대로 단파장의 광은 투과시키며 장파장의 광은 반사되도록 이루어질 수 있다.
본 발명에서 제1 이색성미러(40)는 단파장의 광은 투과시키며 장파장의 광은 반사시키도록 이루어지며, 즉 제1 이색성미러(40)는 여기필터(30)를 투과한 여기광은 피검사체(S) 쪽으로 투과시키고, 피검사체(S)로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 제2 광을 반사시켜 방사필터(60) 및 디텍터(70) 쪽으로 전달되도록 한다. 제1 이색성미러(40)는 대물렌즈(50)와 피검사체(S) 사이에 위치한다.
그리고 제1 광원(10), 여기필터(30) 및 제1 이색성미러(40)는 파장별로 구분되어 다수개로 구비될 수 있다. 즉, 도 4에 도시된 형태와 유사하게, 제1 이색성미러(40)가 복수 개로 구비되고 각각의 제1 이색성미러(40) 별로 투과되는 기준 파장을 달리 하여, 순차적인 파장 범위의 여기광이 각각의 제1 광원(10)에서 피검사체(S) 쪽으로 전달될 수 있도록 이루어질 수 있다.
대물렌즈(50)(object lens)는 제1 이색성미러(40)에 의해 반사되는 형광 방출광 및 제2 광을 집광하여 피검사체(S) 측으로 전달한다.
본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)에서 피검사체(S), 즉 시료들은 특별한 시약으로 처리된다. 피검사체(S) 쪽으로 전달된 여기광은 시료의 에너지를 일시적으로 들뜬 상태(excited state)로 만들고, 시료는 흡수한 에너지를 다시 방출하면서 안정한 상태로 돌아가고, 이때 일정한 형광(fluorescent light)을 방출하게 된다.
그런데 이때, 다시 방출된 빛은 약간 적색 방향으로 기울어진 파장을 갖게 된다. 예를 들어 청색 광선이 흡수되면 그로부터 녹색 광선이 방사되고, 녹색 광선은 황색 빛으로 변환된다. 황색은 붉은 오렌지색으로 변환되고, 육안으로 볼 수 없는 UV 광선은 가시 광선으로 변한다. 이 변화를 스토크 쉬프트(Stokes Shift)라고 한다.
이러한 스토크 쉬프트에 의하여 형광 방출광은 여기광에 비하여 좀더 긴 파장을 갖게 되고, 제1 이색성미러(40)를 거침에 있어서, 여기광은 투과되고 형광 방출광은 반사하게 된다.
피검사체(S)로부터 방출되는 형광 방출광은 제1 이색성미러(40)에서 반사된 후 대물렌즈(50)를 통과하고, 방사필터(60)를 거치게 된다.
방사필터(60)(emission filter)는 피검사체(S)로부터 방출되는 형광 방출광으로부터, 광학적 잡음을 제거하고 원하는 파장의 형광 방출광 만을 선별하여 디텍터(70)로 전달한다.
본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)에서 디텍터(70)는, 방사필터(60)를 통과하여 형광 방출광에 의해 피검사체(S)(시료)의 이미지를 시각적으로 구현하기 위한 구성이다. 이를 위하여 디텍터(70)는 CCD(charge coupled device) 또는 CMOS(complementary metal-oxide semiconductor)를 포함하여 이루어질 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)에서는, 제1 광원(10)의 여기광이 대물렌즈(50)을 거쳐 피검사체(S)에 조사되는 것이 아니고, 제1 광원(10)을 대물렌즈와 피검사체 사이의 광축(on-axis)에 위치시킴으로써 제1 광원(10)에서 피검사체(S)까지 거리를 줄여 높은 광량의 빛을 조사할 수 있게 되고, 이에 따라 강한 형광신호에 의한 선명한 이미지를 얻을 수 있게 된다.
또한, 제1 광원(10)은 피검사체(S) 위쪽에 배치되는 것이 아니고 아래쪽에 배치되어, 제1 이색성미러(40)에 의해 반사되어 대물렌즈(50) 및 디텍터(70)로 전달되는 형광 방출광의 광경로와 일치하지 않으므로, 백그라운드 레벨(background level)이 낮아져 형광 이미지에서 높은 에스엔 비(S/N ratio)를 얻을 수 있게 된다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치(1)의 개략적인 구성을 도시한 도면이고, 도 5은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치(1)의 개략적인 구성을 도시한 도면이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따른 형광 이미징 장치(1)는, 제1 광원(10), 여기필터(30), 제2 이색성미러(41), 대물렌즈(50), 방사필터(60) 및 디텍터(70)를 포함하여 이루어질 수 있고, 또한 제2 광원(80)을 더 포함하여 이루어질 수 있다.
그리고 제1 광원(10), 여기필터(30) 및 제2 이색성미러(41, 42, 43)는 파장별로 구분되어 다수개로 구비될 수 있다.
상술한 바와 같이, 이색성미러(dichroic mirror)는 특정 파장의 광은 반사시키고 다른 파장의 광은 투과되도록 이루어질 수 있는데, 본 발명에서 제2 이색성미러(41)는 단파장의 광은 반사시키며 장파장의 광은 투과시키도록 이루어지며, 즉 제2 이색성미러(41)는 여기필터(30)를 투과한 여기광은 피검사체(S) 쪽으로 반사시키고, 피검사체(S)로부터 방출되는 형광 방출광 및 제2 광원에 의한 제2 광은 투과시켜 방사필터(60) 및 디텍터(70) 쪽으로 전달되도록 한다. 제2 이색성미러(41)은 대물렌즈(50)와 피검사체(S) 사이에 위치한다.
그리고 도 4에 도시된 바와 같이, 제2 이색성미러(41) 이외에 제2 이색성미러(42 및 43)가 더 구비될 때, 제2 이색성미러(42)에 의해 반사되는 기준 파장은 제2 이색성미러(41)에 의해 반사되는 기준 파장보다 낮고, 제2 이색성미러(43)에 의해 반사되는 기준 파장은 제2 이색성미러(42)에 의해 반사되는 기준 파장보다 낮도록 이루어져 순차적인 파장 범위의 여기광이 각각의 제1 광원(10)에서 피검사체(S) 쪽으로 전달될 수 있도록 이루어질 수 있다.
도 6는 형광현미경에서 포커스 시프트(focus shift)가 발생되는 것을 나타낸 도면이고, 도 7는 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치(1)의 일부 구성을 도시한 사시도이며, 도 8은 본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)에 의해 관찰된 이미지를 나타낸 사진이다.
본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)에서, 방사필터(60)는 2개 이상으로 구비되어 서로 다른 영역의 파장을 투과시키도록 이루어진다. 즉, 각 방사필터(60)는 서로 다른 형광물질로 염색된 시료에 의한 형광 방출광에 맞도록, 투과시키는 파장의 빛이 상이하도록 이루어진다.
그리고 방사필터(60)는, 형광 방출광의 경로 상에 선택적으로 배치되게 된다.
아울러, 2개 이상으로 구비되는 방사필터(60)는 서로 두께가 상이하도록 이루어져 각각 서로 다른 영역의 파장을 투과시킬 때 발생할 수 있는 포커스 시프트를 보정할 수 있다.
도 6에 도시된 바와 같이, 형광현미경에서 제2 이색성미러(41)를 통과하는 빛은 경로의 변화가 발생되고 이에 따라 초점이 변화되는 포커스 시프트(focus shift)가 발생된다. 이러한 초점 변화를 해소하기 위하여 자동으로 초점을 조정하는 오토포커스장치가 사용되고 있으나 매우 고가이며, 사용자가 각 필터의 위치를 조정하여 초점을 맞출 수 있으나, 이러한 조작은 오히려 전체적인 필터 정렬 상태를 흐트러뜨릴수 있으며 조작이 번거로운 문제점이 있다.
본 발명에서는 이러한 문제점을 해소하기 위하여, 파장에 따른 방사필터(60)의 두께를 상이하도록 한다.
빛은 파장이 길수록 굴절율이 작으며, 파장이 짧을수록 굴절율이 증가하므로, 상대적으로 단파장의 형광 방출광이 제2 이색성미러(41)를 통과할 때 굴절 정도가 크고, 상대적으로 장파장의 형광 방출광이 제2 이색성미러(41)를 통과할 때 굴절 정도가 작게 된다.
이에 따라, 상대적으로 단파장의 빛이 제2 이색성미러(41)를 통과할 때 경로의 변화가 크게 이루어지므로 각 파장에 따라 방사필터(60)의 두께를 조절하여 빛의 경로 변화 보상을 이룰 수 있다.
그리고 본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)는, 제1 광원(10), 여기필터(30), 제1 이색성미러(40), 제2 이색성미러(41) 및 대물렌즈(50)의 이동없이 방사필터(60)만이 이동가능하게 이루어지고, 피검사체(S)에서 방사필터(60) 쪽으로 방출되는 형광 방출광의 경로 상에, 다수의 방사필터(60)가 선택적으로 배치되게 된다.
이를 위하여 본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)는, 방사필터(60)가 결합되는 필터휠(61), 필터휠(61)의 회전을 위한 구동모터(62) 및 구동기어(63)를 더 포함하여 이루어진다.
필터휠(61)은 원판형으로 이루어져 원주방향으로 다수의 개구된 구멍이 형성된다. 이러한 개구된 구멍에 각 방사필터(60)가 결합된다. 필터휠(61)의 중앙에는 회전축(61a)이 형성되고, 필터휠(61)은 이러한 회전축(61a)을 기준으로 회전하도록 이루어진다. 필터휠(61)이 회전하면서 각 방사필터(60)가 형광 방출광의 경로 상에 배치되게 된다. 방사필터(60)는, 파장이 서로 겹치거나 신호가 약해 검출이 곤란한 것을 방지하기 위하여 3개 이하로 구비되는 것이 바람직하다. 그리고, 필터휠(61)의 테두리에는 원주방향을 따라 기어가 형성될 수 있다.
구동모터(62)는 필터휠(61)의 일측에 형성되고, 방사필터(60)의 교체가 필요한 경우 제어신호에 따라 구동되도록 이루어진다. 구동기어(63)는 구동모터(62)에 의해 회전하고, 필터휠(61)과 직접 또는 간접적으로 맞물려 회전하며 필터휠(61)을 회전시킨다.
이와 달리, 구동모터(62)는 필터휠(61)과 벨트 등에 의해 연결될 수 있고, 필터휠(61)의 회전축에 직접 연결될 수 있다.
필터휠(61)에 결합된 각 방사필터(60)는 서로 동일평면상에 위치하여 이동하게 되고, 방사필터(60)가 이루는 면은 형광 방출광의 경로와 수직을 이루게 된다.
이에 따라, 서로 다른 형광물질에 의해 염색되는 피검사체(S)를 관찰할 때, 종래의 형광 이미징 장치(1)에서와 같이 필터조립체(광원, 집광렌즈, 여기필터, 이색성미러 및 방사필터를 포함) 전체를 이동시키는 것이 아니라, 필터휠(61)에 의하여 방사필터(60)만을 이동시키면 되므로 이동부의 크기 및 부하를 줄일 수 있고, 광 경로의 변화 없이 방사필터(60)를 안정되게 교차할 수 있으므로 광 경로의 정렬상태를 안정적으로 유지시킬 수 있게 된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따른 형광 이미징 장치(1)에서, 여기필터(30)를 투과하는 광의 중심파장은 360nm이고, 제1 이색성미러(40)에 의해 투과되는 광의 기준 파장 또는 제2 이색성미러(41)에 의해 반사되는 광의 기준파장은 400nm이며, 방사필터(60)는, 450nm 및 530nm의 파장을 투과시키도록 조합될 수 있다. 450nm의 파장을 투과시키는 방사필터(60)는 530nm의 파장을 투과시키는 방사필터(60)와 두께가 다를 수 있다.
즉, 450nm 및 530nm의 파장을 투과시키도록 2개의 방사필터(60)가 구비되도록 하고, 이때 제1 광원(10)은 UV LED로 이루어지고, 450nm의 방사필터(60)로 감지되는 피검사체(S)는 DAPI로 염색되도록 하고, 530nm의 방사필터(60)로 감지되는 피검사체(S)는 GFP 또는 Acridine orange로 염색되도록 할 수 있다.
이에 따라 여기필터(30)를 투과한 여기광은 제1 이색성미러(40)를 기준으로 단파장으로 이루어져 제1 이색성미러(40)를 투과하거나 제2 이색성미러(41)를 기준으로 단파장으로 이루어져 제2 이색성미러(41)에 의해 반사되고, 피검사체(S)에 조사된 후 방출되는 형광 방출광은 형광물질에 따라 다른 파장을 나타내며 장파장으로 변환되어 각 방사필터(60)를 투과한 후 디텍터(70)에 의해 감지되게 된다.
또한, 본 발명에 따른 형광 이미징 장치(1)에서, 여기필터(30)를 투과하는 광의 중심파장은 475nm이고, 제1 이색성미러(40)에 의해 투과되는 광의 기준 파장 또는 제2 이색성미러(41)에 의해 반사되는 광의 기준파장은 500nm이며, 방사필터(60)는, 530nm 및 600nm의 파장을 투과시키도록 조합될 수 있다.
즉, 530nm 및 600nm의 파장을 투과시키도록 2개의 방사필터(60)가 구비되도록 하고, 이때 제1 광원(10)은 청색 LED로 이루어지고, 530nm의 방사필터(60)로 감지되는 피검사체(S)는 GFP 또는 Acridine orange로 염색되도록 하고, 600nm의 방사필터(60)로 감지되는 피검사체(S)는 Ethidium bromide 또는 Propidium iodide로 염색되도록 할 수 있다.
도 8은 이러한 실시예에 따라 획득된 이미지에 해당되며, 도 8(a)는 Acridine orange 에 의해 염색되고 530nm의 방사필터(60)를 사용한 경우이고, 도 8(b)는 Propidium iodide 에 의해 염색되고 600nm의 방사필터(60)를 사용한 경우이다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광 이미징 장치(1)에서, 여기필터(30)를 투과하는 광의 중심파장은 525nm이고, 제1 이색성미러(40)에 의해 투과되는 광의 기준 파장 또는 제2 이색성미러(41)에 의해 반사되는 광의 기준파장은 560nm이며, 방사필터(60)는, 595nm 및 690nm의 파장을 투과시키도록 조합될 수 있다.
즉, 595nm 및 690nm의 파장을 투과시키도록 2개의 방사필터(60)가 구비되도록 하고, 이때 제1 광원(10)은 녹색 LED로 이루어지고, 595nm의 방사필터(60)로 감지되는 피검사체(S)는 RFP로 염색되도록 하고, 690nm의 방사필터(60)로 감지되는 피검사체(S)는 Cy5로 염색되도록 할 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명에 의하면, 광원, 집광렌즈(20), 여기필터(30) 및 제1 이색성미러(40)를 1개씩만 사용하면서도 다수의 방사필터(60)를 통해 서로 다른 이미지를 획득할 수 있고 구조가 간단하고 제조비용을 줄일 수 있다. 특히, 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하여, 세포(cell)의 개수를 카운터하여 정보를 획득하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 서로 다른 형광물질에 의해 염색되는 피검사체(S)를 관찰할 때 종래의 형광 이미징 장치(1)에서와 같이 필터조립체(광원, 초점랜즈, 여기필터(30), 제1 이색성미러(40)(또는 제2 이색성미러(41)) 및 방사필터(60)를 포함) 전체를 이동시키지 않고 방사필터(60)만을 이동시키면 되므로, 이동부의 크기 및 부하를 줄이고 광 경로의 정렬상태 변화를 최소화할 수 있게 된다.
앞에서, 본 발명의 특정한 실시예가 설명되고 도시되었지만 본 발명은 기재된 실시예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 수정 및 변형할 수 있음은 이 기술의 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 일이다. 따라서, 그러한 수정예 또는 변형예들은 본 발명의 기술적 사상이나 관점으로부터 개별적으로 이해되어서는 안되며, 변형된 실시예들은 본 발명의 특허청구범위에 속한다 하여야 할 것이다.
1 : 형광 이미징 장치 10 : 제1 광원
20 : 집광렌즈 30 : 여기필터
40 : 제1 이색성미러 41, 42, 43 : 제2 이색성미러
50 : 대물렌즈
60 : 방사필터 61 : 필터휠
61a : 회전축 62 : 구동모터
63 : 구동기어
70 : 디텍터 80 : 제2 광원
S : 피검사체
20 : 집광렌즈 30 : 여기필터
40 : 제1 이색성미러 41, 42, 43 : 제2 이색성미러
50 : 대물렌즈
60 : 방사필터 61 : 필터휠
61a : 회전축 62 : 구동모터
63 : 구동기어
70 : 디텍터 80 : 제2 광원
S : 피검사체
Claims (11)
- 형광 광원인 제1 광원;
피검사체에 백색광 또는 단색광을 조사하는 제2 광원;
상기 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터;
상기 여기필터를 투과한 여기광을 상기 피검사체 쪽으로 투과시키되, 상기 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 상기 제2 광원에 의한 제2 광을 반사하는 제1 이색성미러;
상기 제1 이색성미러에 의해 반사된 상기 형광 방출광 및 제2 광을 집광하는 대물렌즈;
상기 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및
상기 방사필터를 투과한 상기 형광 방출광 및 상기 제2 광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 형광 광원인 제1 광원;
피검사체에 백색광 또는 단색광을 조사하는 제2 광원;
상기 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터;
상기 여기필터를 투과한 여기광을 상기 피검사체 쪽으로 반사시키되, 상기 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광 및 상기 제2 광원에 의한 제2 광을 투과시키는 제2 이색성미러;
상기 제2 이색성미러를 투과한 상기 형광 방출광 및 제2 광을 집광하는 대물렌즈;
상기 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및
상기 방사필터를 투과한 상기 형광 방출광 및 상기 제2 광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 형광 광원인 제1 광원;
상기 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터;
대물렌즈와 피검사체 사이에 위치하며, 상기 여기필터를 투과한 여기광을 상기 피검사체 쪽으로 투과시키되, 상기 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광을 반사하는 제1 이색성미러;
상기 제1 이색성미러에 의해 반사된 상기 형광 방출광을 집광하는 대물렌즈;
상기 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및
상기 방사필터를 투과한 상기 형광 방출광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 형광 광원인 제1 광원;
상기 제1 광원에 의해 조사된 여기광을 선택적으로 투과시키는 여기필터;
대물렌즈와 피검사체 사이에 위치하며, 상기 여기필터를 투과한 여기광을 상기 피검사체 쪽으로 반사시키되, 상기 피검사체로부터 방출되는 형광 방출광을 투과시키는 제2 이색성미러;
상기 제2 이색성미러를 투과한 상기 형광 방출광을 집광하는 대물렌즈;
상기 대물렌즈에 의해 집광된 형광 방출광 중 특정 파장의 광을 투과시키는 방사필터; 및
상기 방사필터를 투과한 상기 형광 방출광으로부터 이미지를 감지하는 디텍터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 제1 광원, 여기필터 및 제1 이색성미러는 파장별로 구분되어 다수개로 구비되는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 제2항 또는 제4항에 있어서,
상기 제1 광원, 여기필터 및 제2 이색성미러는 파장별로 구분되어 다수개로 구비되는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방사필터는, 다수개로 구비되어 서로 다른 영역의 파장을 투과시키고, 상기 형광 방출광의 경로 상에 선택적으로 배치되는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 제7항에 있어서,
다수개로 구비되는 상기 방사필터는, 서로 두께가 상이하도록 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 제7항에 있어서,
다수개로 구비되는 상기 방사필터는, 서로 동일평면상에 위치하여 이동하는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 제8항에 있어서,
상기 방사필터가 결합되는 필터휠을 더 포함하여 이루어지고,
상기 필터휠은, 회전축을 기준으로 회전하면서 상기 각 방사필터를 상기 형광 방출광의 경로 상에 배치하는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치. - 제7항에 있어서,
다수개로 구비되는 상기 방사필터가 이루는 면은, 상기 형광 방출광의 경로와 수직을 이루는 것을 특징으로 하는 형광 이미징 장치.
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