ES2956312T3 - Estándar de calibración para microscopía de evanescencia - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un estándar de calibración para determinar una caída de intensidad relacionada con un campo evanescente generado cerca de la interfaz entre una muestra a analizar y un sustrato sobre el cual se depositará dicha muestra, métodos de preparación y análisis y su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Estándar de calibración para microscopía de evanescencia
Dominio técnico y técnica anterior
La técnica de microscopía de fluorescencia se ha convertido en una herramienta esencial en biología y las ciencias biomédicas, así como en la ciencia de los materiales, debido a su especificidad y rechazo de fondo que no están fácilmente disponibles con otros modos de contraste de microscopía óptica tradicional. La aplicación de una matriz de fluorocromos ha permitido identificar células y componentes celulares submicroscópicos con un alto grado de especificidad entre materiales no fluorescentes. De hecho, el microscopio de fluorescencia es capaz de revelar la presencia de una sola molécula. A través del uso de múltiples etiquetados de fluorescencia, diferentes sondas pueden identificar simultáneamente varias moléculas diana y a la vez seguirlas.
El principio del funcionamiento de un microscopio de fluorescencia es irradiar la muestra con una banda deseada y específica de longitudes de onda, y luego separar la fluorescencia emitida, mucho más débil, de la luz de excitación y de la autofluorescencia potencial del instrumento y la muestra. Típicamente, para una muestra que sea adecuada para microscopía de fluorescencia, debe etiquetarse con fluorescencia. Existen varios métodos de etiquetado; las principales técnicas son el etiquetado con tintes fluorescentes químicos de molécula pequeña o, en el caso de muestras biológicas, la expresión de una proteína fluorescente. Alternativamente, se puede utilizar la fluorescencia intrínseca de una muestra (es decir, la autofluorescencia), sin embargo, esta última es más tenue y espectralmente más grande y, por lo tanto, se confunde más fácilmente con la fluorescencia del instrumento u otros fondos.
En microscopía de fluorescencia, la eliminación de la fluorescencia de fondo del exterior del plano focal puede mejorar drásticamente la relación señal/ruido y, en consecuencia, la resolución espacial y espectral de las características o eventos de interés. Aumentar la resolución espacial es especialmente importante en la microscopía biológica, donde lograr una resolución nanométrica isotrópica (es decir, en xyz) es de interés para el estudio del espacio cercano a la membrana, particularmente el estudio del tráfico vesicular y la señalización celular.
Se han desarrollado varias técnicas de microscopía de fluorescencia, para restringir la excitación y detección de fluoróforos a una región delgada de la muestra. Entre ellos, las microscopías de onda evanescente ofrecen un filtrado axial de aproximadamente 100 nm, utilizando ya sea un confinamiento de excitación (es decir, reducir la fracción de volumen de la célula en la que se excita la fluorescencia), como en la reflexión interna total (TIR, por sus siglas en inglés), o una selectividad de emisión, como en la microscopía de fluorescencia de ángulo supercrítico (SAF, por sus siglas en inglés).
La microscopía de fluorescencia total de reflexión interna (TIRF, por sus siglas en inglés) logra un seccionamiento axial de subdifracción al confinar la excitación de la fluorescencia a una capa delgada cercana a la interfaz de célula/sustrato. Sin embargo, el espesor exacto de esta lámina de luz es difícil de medir, y se ha informado de grandes desviaciones respecto al decaimiento exponencial de intensidad calculado de la onda evanescente. Esto conduce a grandes imprecisiones en las afirmaciones del confinamiento de luz en la interfaz reflectante y, en consecuencia, en las intensidades de fluorescencia. Peor aún, la interpretación cuantitativa de los cambios de concentración de fluoróforo, las distancias axiales o las trayectorias de partículas individuales, se ven afectadas por grandes barras de error o simplemente son incorrectas.
Aunque se han propuesto diversas técnicas para calibrar el decaimiento de la intensidad de penetración de la onda evanescente, los dispositivos existentes para calibrar los decaimientos de onda evanescente son de construcción casera y, por lo tanto, dependientes del usuario. De hecho, actualmente no existe ningún método que permita una comparación de la calidad de los instrumentos, los datos y los resultados científicos, a través de las imágenes, los experimentos y los laboratorios. En ausencia de una solución simple y versátil, muchos autores recurren a utilizar la profundidad de penetración teórica (calculada), (que es incorrecta, como lo demuestran muchas publicaciones), 0 si no, trabajan de una manera semicuantitativa que utiliza TIRF solo como técnica para la mejora del contraste.
El artículo de Christian Niederauer y cols.: “ Direct characterization of the evanescent field in objective-type total internal reflection fluorescence microscopy” , OPTICS EXPRESS, vol. 26, no. 16, 27 de julio de 2018, página 20492, divulga un estándar de calibración para la profundidad de penetración de un microscopio TIRF, que incluye una capa polimérica escalonada, de un índice de refracción cercano al agua, con partículas fluorescentes inmovilizadas en ella.
Resumen de la invención
El objetivo de la invención es superar todas o partes de los inconvenientes mencionados anteriormente.
Según un primer aspecto, la invención proporciona un estándar de calibración que imita un sustrato dieléctrico (p. ej., un portaobjetos de microscopio), y una muestra de prueba (p. ej., una célula) para ser analizada mediante microscopía de fluorescencia evanescente. La invención se define por el estándar de calibración de la reivindicación 1 adjunta y por el método de la reivindicación 17 adjunta.
Convenientemente, dicho estándar de calibración mejora las mediciones cuantitativas del espesor del campo evanescencia generado cerca de la interfaz de muestra/sustrato dieléctrico durante la fluorescencia de reflexión interna total y, por lo tanto, cuantifica la distancia axial nanométrica del fluoróforo. El estándar de calibración sirve igualmente en ensayos de fluorescencia de ángulo supercrítico, al proporcionar un estándar de calibración que presenta material emisor de fluorescencia (p. ej., fluoróforos moleculares o agregados de fluoróforo molecular) a una distancia controlada y conocida del portaobjetos de microscopio.
Más específicamente, la invención proporciona un estándar de calibración para determinar una información relacionada con un campo evanescente generado cerca de la interfaz, entre una muestra a analizar y un sustrato sobre el que se va a depositar dicha muestra, comprendiendo dicho estándar de calibración
- al menos una estructura en capas apilada sobre un sustrato dieléctrico, comprendiendo dicha estructura en capas al menos una capa espaciadora y al menos una capa emisora de fluorescencia, que contiene al menos un material emisor de fluorescencia;
- en donde dicho sustrato dieléctrico es de un índice de refracción más alto que el del al menos una capa espaciadora;
- en donde al menos una capa espaciadora se apila sobre dicho sustrato dieléctrico, imitando la interfaz entre dicho sustrato dieléctrico y dicha al menos una capa espaciadora una interconexión entre un sustrato dieléctrico y una muestra a analizar; y
- en donde dicha al menos una capa emisora de fluorescencia se dispone a una distancia (z) controlada fija de dicha interfaz.
En la invención, dicho estándar de calibración comprende un dispositivo en capas
apilado sobre un sustrato dieléctrico, imitando la interfaz entre dicho sustrato dieléctrico y dicho dispositivo en capas una interfaz entre el sustrato dieléctrico y una muestra a analizar,
el dispositivo en capas presenta sobre dicho sustrato dieléctrico una superficie S, y comprende:
- una serie de estructuras en capas apiladas sobre el sustrato dieléctrico, una encima de la otra,
- comprendiendo cada estructura en capas: una capa espaciadora, y encima una capa emisora de fluorescencia que contiene al menos un material emisor de fluorescencia;
- dicho sustrato dieléctrico es de un índice de refracción más alto que el de las capas espaciadoras;
- una primera capa espaciadora en contacto con dicho sustrato dieléctrico, para presentar una superficie plana sobre la que se deposita la pila de las estructuras en capas; la primera capa espaciadora es para tratar previamente la superficie
- estando cubierta una capa emisora final con una capa protectora final, en donde:
- cada capa tiene un espesor constante (u homogéneo) sobre la superficie S; en otros términos, en la presente invención, la posición axial z de la capa es muy precisa, el espesor de cada capa apilada sobre otra capa es constante y se sitúa en la misma ubicación a lo largo del eje z sobre toda la superficie S; por tanto, la invención permite determinar exactamente la intensidad en la posición axial z,
- cada capa emisora de fluorescencia se dispone a una distancia (z) axial controlada fija de dicha interfaz,
- cada emisor de fluorescencia difiere en al menos un parámetro de fluorescencia entre dichas estructuras en capas,
- comprendiendo cada capa emisora de fluorescencia al menos un material emisor de fluorescencia con al menos un parámetro de fluorescencia diferente del material emisor de fluorescencia de otra capa emisora de fluorescencia: longitudes de onda de emisión, direccionalidad de emisión, polarizabilidades de emisión, o tiempos de vida de fluorescencia,
de modo que cada capa emisora de fluorescencia que tiene un parámetro de fluorescencia específico a una distancia (z) axial controlada fija de la interfaz, a una longitud de onda de excitación común,
para determinar el decaimiento axial de la intensidad axial evanescente a partir de la combinación de estos parámetros de fluorescencia específicos medidos a diferentes distancias (z) axiales controladas de la interfaz.
Ventajosamente, el espesor de la serie de las estructuras en capas es de la misma escala de longitud que el decaimiento de intensidad del campo evanescente; en otros términos, el espesor es proporcional a la longitud del decaimiento de intensidad del campo evanescente.
Por ejemplo, significa que el espesor de la serie de las estructuras en capas puede estar a una distancia axial entre el máximo de la intensidad del campo evanescente y una intensidad dada de la intensidad del campo evanescente (por ejemplo, igual al 5 % del máximo de la intensidad del campo evanescente; o más allá de la intensidad mínima, pero cerca de la intensidad mínima).
En la invención, cada capa emisora de fluorescencia tiene un espectro de excitación que permite la excitación a la misma longitud de onda de excitación, de modo que cada capa emisora de fluorescencia puede tener una intensidad espectral específica a una distancia (z) axial controlada fija de la interfaz, en una longitud de onda de excitación común, para determinar el decaimiento axial de la intensidad del campo evanescente a partir de la combinación de estas intensidades espectrales específicas medidas a diferentes distancias (z) axiales controladas de la interfaz.
Ventajosamente:
- cada capa emisora de fluorescencia presenta una concentración de fluoróforos constante (u homogénea) sobre la superficie S,
- cada capa espaciadora presenta un índice de refracción constante (u homogéneo) sobre la superficie S.
En una realización, se deposita una capa de recubrimiento intermedia entre cada capa emisora y cada capa espaciadora adyacente.
Ventajosamente, cada capa se deposita mediante:
- recubrimiento por centrifugación; o
- deposición Capa por capa (LBL, por sus siglas en inglés); o
- pulverización catódica.
Por lo tanto, ventajosamente, las capas del estándar de calibración son capas delgadas.
Ventajosamente, el dispositivo en capas tiene un espesor (d) de entre 400 nm y 5 micrómetros.
Ventajosamente, cuanto más una capa emisora de fluorescencia se aleja de la interfaz, más fluorescente será esta capa emisora.
Ventajosamente, dicho material emisor de fluorescencia se selecciona de la lista:
- fluoróforos orgánicos;
- puntos cuánticos;
- nuvToa Se xappovo.
Se pueden utilizar los siguientes fluoropolímeros:
- poli(2,2,3,3,3-pentafluoropropilmet acrilato), disolvente: tetrahidrofurano, dicorometano
- poli(1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropil acrilato), disolvente: anisol
- my-133-MC® (empresa: mypolymers, Nes ziona, Israel, documento adjunto), disolvente: Novec 7500 [2-(trifluorometil)-3-Etoxidodecafluorohexano)/Novec 7100 (metoxiperfluorobutano) (ambos de la empresa 3M, EE. UU., hoja de datos de seguridad adjunta); el polímero MY133 es un fluoropolímero, y la categoría de disolvente es un hidrofluoroéter. - polímeros de bajo índice de refracción (IR), como se definen en este enlace web: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/materials-science/organic-electronics/refractive-indexcoatings.html (último acceso con fecha de 12 de septiembre)
Otros cristales iónicos con IR < 1,37
Fluoruro de sodio, IR = 1,326
Fluoruro de potasio, IR = 1,36
Na3AIF6-Cryolita, IR = 1,338 en ~600 nm.
En una realización, la al menos una capa espadadora está hecha de un polímero de calidad óptica o de material transparente inorgánico, con un índice de refracción que varía entre 1,3 y 1,8, preferiblemente entre 1,3 y 1,6, incluso más preferiblemente entre 1,33 a 1,51.
Por ejemplo, las muestras biológicas son mezclas complejas de carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, que tienen un índice de refracción promedio típicamente de 1,35-1,38, que varía localmente de 1,33 a 1,51, con una gran heterogeneidad en una escala submicrométrica.
Además, esta divulgación propone un método para fabricar dicho estándar de calibración.
Además, según otro aspecto, la invención propone un método que utiliza el estándar de calibración de la invención, para cuantificar el campo evanescente generado cerca de una interfaz de muestra de prueba/sustrato dieléctrico durante los ensayos de fluorescencia de reflexión interna total o de fluorescencia de ángulo supercrítico.
En particular, la invención propone un método para determinar una información relacionada con un campo evanescente generado cerca de una interfaz entre una muestra a analizar y un sustrato dieléctrico en el que se va a depositar dicha muestra, y/o para ajustar dicha información; comprendiendo dicho método:
a) proporcionar al menos una muestra de calibración de la invención,
b) colocación de dicho estándar de calibración en una etapa de microscopio,
c) iluminar dicho estándar de calibración a una longitud de onda (A) dada y un ángulo de incidencia [0 (2)] dado,
d) detectar la emisión del al menos un material emisor de fluorescencia contenido en cada capa emisora de fluorescencia, utilizándose dicha detección para la determinación de una información relacionada con dicho campo evanescente.
El método propuesto también permite obtener un perfil de intensidad axial del campo evanescente generado cerca de una muestra de prueba/sustrato dieléctrico durante los ensayos de fluorescencia de reflexión interna total o de fluorescencia de ángulo supercrítico, al trazar la interrelación entre la distancia (z) conocida de la al menos una capa emisora de fluorescencia en el estándar de calibración y el valor medido de un parámetro de fluorescencia de dicha emisión detectada de la capa emisora de fluorescencia.
Además, permite determinar la distancia (z) de un material emisor de fluorescencia mediante el uso de un perfil de intensidad axial obtenido como se mencionó anteriormente.
Una ventaja del método de la invención es que se puede reproducir fácilmente a través de experimentos en el mismo microscopio o reproducirse en otro microscopio. Esto hace avanzar deseablemente la estandarización y la comparación de la calidad de los instrumentos, los datos y los resultados científicos, a través de las imágenes, los experimentos y los laboratorios.
Además, la invención permite estimar el espesor correspondiente de la capa de excitación de fluorescencia desde el lado de la célula de la interfaz célula/sustrato. Por supuesto, el operador de la microscopía puede, por iteración, ajustar los parámetros de entrada de microscopía TIR o SAF, para así alcanzar la profundidad de penetración deseada.
Contexto y definiciones
En la presente invención, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
El espesor es la dimensión axial de las capas a lo largo del eje z.
Reflexión interna total (TIR, por sus siglas en inglés) se refiere al cambio en la dirección de un frente de onda de luz en una interfaz entre dos medios dieléctricos diferentes, de modo que el frente de onda vuelva al medio desde el que se originó. La TIR solo es posible en situaciones en las que la luz de propagación encuentre un límite a un medio de menor índice de refracción. Su comportamiento refractivo se rige por la Ley de Snell: n(1) * sin0(1) = n(2) x sin0(2), donde n(2) es el índice de refracción más alto, y n(1) es el índice de refracción inferior. El ángulo del haz incidente, con respecto a la normal a la interfaz, se representa por 0(2), mientras que el ángulo de haz refractado dentro del medio de índice inferior, viene dado por 0(1). Cuando la luz golpea la interfaz de los dos materiales en un ángulo suficientemente alto, denominado ángulo crítico [0(c)], el haz refractada se propaga paralelo a la interfaz (90 grados con relación a la normal) y, en ángulos mayores, toda la luz se refleja completamente de vuelta al primer medio. Aplicando la ecuación a una investigación biológica típica de procesos de membrana celular, el índice de refracción del portaobjetos o cubreobjetos del microscopio se representa por n(2) (aproximadamente 1,5), mientras que n(1) representa el índice de refracción de la solución tampón acuosa o componentes citoplasmáticos (aproximadamente 1,33 a 1,38). Con n(2) mayor que n(1), cuando 0(2) excede el ángulo crítico 0(c), la reflexión interna total se produce dentro del medio de vidrio. En el ángulo de incidencia crítico, la refracción se produce a 90 grados [sen 0(1) = 1], y la Ley de Snell se reduce a n(2) x sin0(c) = n(1), o sin0(c) = n(1) / n(2)
y, por lo tanto, el ángulo crítico se puede expresar como 0(c) = sen-1[n(1) / n(2)]. En todos los ángulos mayores que el ángulo crítico, se produce la reflexión interna total, en la que esencialmente toda la luz se refleja de vuelta al primer medio. Aunque no pasa luz de campo lejano al segundo medio cuando incide en ángulos mayores que el ángulo crítico, la luz reflejada genera un campo (cercano) electromagnético altamente restringido adyacente a la interfaz, en el medio de índice inferior. Este campo se denomina campo evanescente, y dentro de una región limitada cerca de la interfaz, es capaz de excitar fluoróforos u otro material emisor de fluorescencia. El intervalo sobre el cual es posible la excitación está limitado por el decaimiento exponencial de la energía de onda evanescente en la dirección z (perpendicular a la interfaz). La siguiente ecuación define esta energía en función de la distancia desde la interfaz: E(z) = E(0)exp(-z/d); donde E(z) es la energía a una distancia z perpendicular de la interfaz, y E(0) es la energía en la interfaz. La profundidad de penetración (8) depende de la longitud de onda de la iluminación incidente [A(i)], el ángulo de incidencia, y los índices de refracción del medio en la interfaz, según la ecuación: 8 = A(i)/4n * [n(2)2sen20(2) - n(1)2]-1/2
Microscopía de Fluorescencia por reflexión interna total (TIRF, por sus siglas en inglés) se refiere a una técnica de microscopía que aprovecha el confinamiento de excitación de fluorescencia debido al decaimiento exponencial del campo evanescente generado por la reflexión interna total. Como se mencionó anteriormente, diversos factores cruciales rigen la utilización de la onda evanescente en la microscopía de TIR. Para que la reflexión interna total ocurra y produzca un campo evanescente, el índice de refracción del medio de sustrato debe ser mayor que el del medio de muestra [n(2) mayor que n(1)], y el ángulo de incidencia [0(2)] debe ser mayor que el ángulo crítico [0(c)]. La longitud de onda de iluminación incidente afecta tanto a la profundidad de penetración de la onda evanescente como a los fluoróforos específicos que se excitan, que deben tener parámetros de absorción apropiados en la banda de longitud de onda de la luz de iluminación. La implicación de los efectos de longitud de onda combinada con el hecho de que la energía de la onda evanescente disminuye exponencialmente en la dirección z, es que la excitación fluorescente altamente específica puede inducirse en una sección óptica muy delgada, típicamente menor de 100 nanómetros de espesor.
En la Figura 1 se ilustra un microscopio de TIRF de tipo objetivo.
Aquí, un rayo láser se enfoca en una posición excéntrica en el plano retrofocal de un objetivo de alta apertura numérica (NA, por sus siglas en inglés) (línea discontinua, ver imagen insertada) que genera un haz oblicuo que incide en la interfaz dieléctrica [n(2) > n(1)].
Para los ángulos de haz incidente que exceden el ángulo crítico 0(c), el haz se refleja totalmente en la interfaz (imagen del medio). Como consecuencia, una onda ‘evanescente' se configura en el medio m, y se propaga a lo largo de la superficie (el vector S de señalización está en la dirección x para un haz que incide de la izquierda), y su intensidad decae exponencialmente en la dirección axial con una constante de longitud del orden de 100 nm, para una interfaz de vidrio/agua (imagen de la derecha).
Alternativamente, la microscopía de TIRF puede implementarse utilizando otra geometría de prisma, en la que se utiliza un prisma externo para guiar la luz en un ángulo oblicuo a la interfaz reflectante, y se detecta la luz de excitación dispersada (TIR) o la fluorescencia (TIRF), desde el extremo lejano, con un objetivo de aire o de inmersión.
Microscopía de Fluorescencia de ángulo supercrítico (SAF, por sus siglas en inglés) se refiere a una técnica de microscopía basada en la selectividad de emisión de fluoróforo o en la evanescencia en la emisión. De hecho, los fluoróforos pueden considerarse como nano-antenas dipolares que, cuando se excitan, emiten un campo electromagnético evanescente que consiste en componentes de campo tanto cercano como lejano. La detección de fluorescencia normal solo captura la emisión de campo lejano. Según la misma lógica anterior, el campo evanescente generado por la radiación dipolo cerca del fluoróforo no irradia en un entorno homogéneo. Sin embargo, cuando una interfaz está presente dentro de este campo evanescente, una parte del campo evanescente se puede acoplar a la interfaz, y se convierte en propagativa. Por ejemplo, en la interfaz entre el agua y el vidrio, esta emisión se transmite al vidrio en direcciones más allá del ángulo crítico. Por lo tanto, aunque todos los fluoróforos, independientemente de su distancia superficial, pueden emitir emisión subcrítica, solo los fluoróforos ubicados en el entorno inmediato de la interfaz tienen dicha emisión supercrítica. Esta luz, a veces denominada “ luz prohibida” (porque no satisface la Ley de Snell-Descartes), puede representar hasta el 50 % de la transmisión de luz al vidrio. Esta emisión supercrítica disminuye muy rápidamente con la distancia a la interfaz (aproximadamente exponencial), y puede utilizarse para derivar la ubicación axial de los fluoróforos emisores. Un objetivo comercial actual de microscopio con aberturas numéricas muy altas, NA > n(1), puede recoger parte de esta luz supercrítica. En la Figura 2 se ilustra una representación esquemática de emisión direccional desde un emisor de fluorescencia de interfaz cercana en fluorescencia de ángulo supercrítico.
Material emisor de fluorescencia se refiere a cualquier especie orgánica o inorgánica que emita fluorescencia. Los emisores de fluorescencia pueden dividirse en varias clases principales.
Fluoróforos moleculares, también denominados “ fluoróforos de molécula pequeña” o “tintes” , comprenden ya sean moléculas inferiores sintéticas o naturales de 20-100 átomos (200-1000 Dalton) con diversas estructuras centrales, incluyendo derivados de xanteno, tales como fluoresceína, rodamina, verde Oregón, eosina, rojo Texas, y derivados de los mismos; derivados de cianina, tales como cianina, indocarbocianina, oxacobocianina, tiacibocianina y merocianina, y derivados de las mismos; derivados de cuadracina y cuadracinas sustituidas en anillo, tales como Seta, SeTau, tintes cuadrados, y derivados de los mismos; derivados de naftaleno, incluyendo dansilo, prodan, y derivados de los mismos;
derivados de cumarina; derivados de oxadiazol, tales como piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol y benzoxadiazol, y derivados de los mismos; derivados de antraceno, incluyendo derivados de antraquinonas, en particular DRAQ5, DRAQ7 y CyTRAK Orange, y derivados de los mismos; derivados de pireno, incluyendo azul cascada; derivados de oxazina, incluyendo rojo Nilo, azul Nilo, violeta cresyl, oxazina 170, y derivados de los mismos; derivados de acridina, incluyendo proflavina, naranja de acridina, amarillo de acridina, y derivados de los mismos; Derivados de arilmetetina, incluyendo auramina, violeta cristal, verde malaquita, y derivados de los mismos; derivados de tetrapirrol, incluyendo porfina, ftalocianina, bilirrubina, y derivados de los mismos. Ejemplos de fluoróforos moleculares utilizados particularmente en microscopía de fluorescencia son tetrasulfuro de meso-tetrafenilporfirina (TPPS4) y trisulfonato de meso-tetrafenilporfirina (TPPS3 ), 5-TAMRA (5-carboxitetrametilrodamina), rodamina b, calceína, rubpy2cl2, piranina, calcofluor blanco, bis(2,2'-bipiridina)-4'-metil-4-carboxibipiridina-rutenio N-succinimidilo éster-bis(hexafluorofosfato), y rojo Congo.
Los agregados de fluoróforos moleculares se forman por un ensamblaje altamente ordenado de fluoróforos moleculares. Las propiedades espectroscópicas de los agregados de fluoróforos moleculares son diferentes de las de los fluoróforos moleculares individuales o desordenados. Dependiendo de la orientación molecular en el agregado, se forman el agregado J y el agregado H. En el agregado J, las moléculas están alineadas en una disposición de cabeza a cola. Los agregados J se caracterizan por una banda aguda, desplazada hacia el rojo con respecto al monómero, y por una fuerte fotoluminiscencia con casi cero desplazamiento de Stokes. Por otro lado, en la alineación molecular del agregado H está lado a lado. Un ejemplo de agregados de fluoróforo molecular es el agregado J meso-tetra(4-sulfonatofenil)porfina (agregado J de TPPS).
Las proteínas fluorescentes son una clase de proteínas que comparten la propiedad única de ser autosuficientes para formar un cromóforo de longitud de onda visible a partir de una secuencia de 3 aminoácidos dentro de su propia secuencia polipeptídica. Los ejemplos de dichas proteínas fluorescentes son, entre muchos otros, GFP (verde), YFP (amarillo) y RFP (rojo).
Las proteínas fluorescentes pueden unirse a otras proteínas específicas para formar una proteína de fusión, sintetizada en células después de la transfección de un portador plasmídico adecuado.
Los nanocristales fluorescentes son nanopartículas de estado sólido más grandes, generalmente caracterizadas por un bajo fotoblanqueo y altos rendimientos cuánticos. Por ejemplo, los Puntos cuánticos (QD, por sus siglas en inglés) son partículas semiconductoras nanométricas que generalmente presentan un espectro de emisión estrecho sintonizable de tamaño (el pico de emisión se desplaza hacia el rojo con un tamaño de partícula creciente), una emisión más brillante que los tintes orgánicos, un espectro de excitación amplio, y una fotoestabilidad excelente. Además, pueden absorber y emitir fotones que van desde el UV hasta el IR. Los Puntos cuánticos de carbono (CD, por sus siglas en inglés) son una nueva clase de nanomateriales fluorescentes de carbono, con las propiedades atractivas de alta estabilidad, buena conductividad, baja toxicidad,respetuosos con el medioambiente, rutas sintéticas simples, así como propiedades ópticas comparables a los puntos cuánticos
Los materiales emisores de fluorescencia se consideran que tienen una longitud de onda de excitación común cuando presentan espectros de excitación superpuestos, y un brillo molecular aproximadamente comparable. Ventajosamente, el pico de excitación de los materiales emisores de fluorescencia que tienen una longitud de onda de excitación común, difiere en no más de 80 nm, más ventajosamente en no más de 50 nm. Ventajosamente, se consideran que los materiales emisores de fluorescencia tienen una longitud de onda de excitación diferente cuando su longitud de onda de excitación difiere en más de 80 nm, más ventajosamente en no más de 50 nm.
Los materiales emisores de fluorescencia se consideran que tienen una longitud de onda de emisión distintiva cuando tienen picos de emisión no superpuestos. Esto no requiere espectros de emisión no superpuestos, pero, de forma ventajosa, el pico de emisión de los materiales emisores de fluorescencia que tienen una longitud de onda de emisión difiere en más de 50 nm, más ventajosamente en más de 80 nm.
Dieléctrico se refiere a la propiedad de un material aislante eléctrico que puede polarizarse mediante un campo eléctrico aplicado. Cuando se coloca un dieléctrico en un campo eléctrico, las cargas eléctricas no fluyen a través del material como lo hacen en un conductor, sino que solo cambian ligeramente desde sus posiciones de equilibrio promedio, provocando una polarización dieléctrica. Una interfaz dieléctrico-dieléctrico, también denominada interfaz dieléctrica, es una interfaz entre dos medios dieléctricos.
Polímero transparente de calidad óptica se refiere a un polímero transparente y no emisor (es decir, no fluorescente). En otros términos, dicho material polimérico permite que la luz pase a través suya, de modo que los objetos de detrás pueden verse claramente y no presentan autofluorescencia. Los polímeros de calidad óptica tienen un índice de refracción de entre 1,3 y 1,8, preferiblemente de entre 1,3 y 1,6, más preferiblemente de entre 1,33 y 1,51, incluso más preferiblemente de entre 1,37 y 1,51 (es decir, similar al de una muestra biológica, tal como una célula), se describen ejemplos en la siguiente tabla:
Breve descripción de las figuras
La Figura 1, ya analizada, es una vista esquemática, representación esquemática de la configuración de TIRF de tipo objetivo comúnmente usada.
La Figura 2, también analizada, es una representación esquemática de la emisión del emisor de fluorescencia en una fluorescencia de ángulo supercrítico.
La Figura 3 es una representación esquemática de una única muestra de calibración de capa emisora de fluorescencia, fuera del alcance de la invención, compuesta por un polímero transparente (A, B) y una capa emisora de fotofluorescencia (e).
La Figura 4 es una representación esquemática de una muestra de calibración de capa emisora de fluorescencia gruesa, fuera del alcance de la invención.
La Figura 5 es una representación esquemática de dos variantes de una muestra de calibración de un emisor multifluorescente.
La Figura 6 es una representación esquemática de un estándar de calibración empaquetado en un soporte de estándar de calibración más grande (dimensionado a tamaño de microscopio).
La Figura 7 ilustra una imagen del plano de muestra de epifluorescencia obtenida con una muestra de una sola capa de un solo agregado J recubierto por centrifugación (en la parte superior de una capa espadadora de 50 nm), tras una excitación de 488 nm, vista a través de un espejo dicroico de 491 nm y un filtro de paso de banda de emisión 525/40, para ilustrar la homogeneidad sobre un área superficial grande.
Las Figuras 8A y 8B muestran patrones de radiación experimentales de capas de fluoróforo delgadas, ya sea para una interfaz vidrio/aire (a), o para una interfaz de vidrio y el mismo tinte incrustado en un medio que tiene un índice de refracción cercano al agua (1,33).
Descripción detallada
Una capa emisora de fluorescencia.
Según una primera realización fuera del alcance de la presente invención, el estándar de calibración comprende una estructura en capas que comprende una capa emisora de fluorescencia.
En esta realización, la capa espaciadora apilada sobre el sustrato dieléctrico (p. ej., un cubreobjetos de microscopio), tiene un espesor ventajosamente de 2 nm o más, 3 nm o más, 4 nm o más, 5 nm o más. De forma más ventajosa, la capa espaciadora apilada sobre el sustrato dieléctrico tiene un espesor que varía entre 5 y 30 nm, preferiblemente entre 5 y 20 nm, preferiblemente entre 5 y 15 nm.
En una realización específica, la capa emisora de fluorescencia comprende un material emisor de fluorescencia apilado sobre una capa de polímero. En esta realización, la capa de polímero sobre la que se apila el material emisor de fluorescencia actúa como una capa inferior cuyo espesor varía ventajosamente entre 0,5 nm y 2 nm, y/o el espesor de la capa del material emisor de fluorescencia varía ventajosamente de 0,5 nm a 2 nm, preferiblemente es de aproximadamente 1 nm. Por ejemplo, la capa de polímero que actúa como una capa inferior puede estar hecha de PDDA.
Dicha realización se ilustra con referencia a la Figura 3. El estándar de calibración incluye un sustrato dieléctrico (p. ej., un cubreobjetos de microscopio) que tiene una superficie. Una estructura en capas se dispone en una parte de la superficie. La estructura en capas comprende capas espaciadoras (A, B) y una capa de emisor de fluorescencia (e). La capa espaciadora (B) actúa como una capa protectora final. El espesor mínimo de A es del orden de 5-10 nm, y pueden realizarse diferentes muestras que tengan un espesor diferente de A. B es aproximadamente 4 nm, y B es aproximadamente 600 nm. El sustrato dieléctrico es típicamente un cubreobjetos de vidrio (p. ej., borosilicato, BK-7) de aproximadamente 170 μm de espesor, pero pueden requerirse otros materiales y espesores, dependiendo del objetivo específico utilizado.
En otra realización específica, la capa de material emisor de fluorescencia está incrustada dentro de dicha capa de polímero, y el espesor de la capa única de emisor de fluorescencia varía ventajosamente entre 200 y 1000 nm, preferiblemente varía entre 200 y 800 nm. En esta realización particular, la estructura en capas puede o no estar cubierta con una capa espaciadora como capa protectora final.
Dicho estándar de calibración, fuera del alcance de la invención, se ilustra en la Figura 4. Incluye un sustrato dieléctrico (p. ej., un cubreobjetos de microscopio) y una estructura en capas dispuesta sobre dicho sustrato. La estructura en capas comprende una capa espaciadora A, cuyo espesor varía entre 5 nm y 20 nm, y una capa gruesa de emisor de fluorescencia, cuyo espesor es de aproximadamente 800 nm.
Se pueden contemplar adicionalmente otras realizaciones. En la invención, el estándar de calibración comprende una pluralidad de estructuras en capas dispuestas sobre el mismo sustrato, comprendiendo cada estructura en capas una capa emisora de fluorescencia.
En la invención, la distancia controlada fija entre la interfaz y dicha capa única emisora de fluorescencia de cada estructura en capas, difiere entre dichas estructuras en capas, y la curva de calibración se construye a partir de una serie de mediciones en estas diferentes estructuras en capas.
Pluralidad de capas emisoras de fluorescencia.
Según otra realización, el estándar de calibración comprende una estructura en capas que comprende una pluralidad de capas emisoras de fluorescencia.
En esta realización, las capas emisoras de fluorescencia están dispuestas a una distancia (z) controlada fija diferente de dicha interfaz. Más precisamente, las capas emisoras de fluorescencia se apilan una sobre la otra, y cada una preferiblemente separada por al menos una capa espaciadora. Ventajosamente, las capas emisoras de fluorescencia están separadas por capas espaciadoras cuyo espesor varía entre 10 y 100 nm, preferiblemente entre 30 y 50 nm.
En esta realización, el espesor de la estructura en capas completa, incluyendo las capas espaciadoras y las capas emisoras de fluorescencia, varía entre 200 y 1000 nm, preferiblemente varía entre 300 y 900 nm.
En esta realización particular, las capas emisoras de fluorescencia pueden tener diferentes longitudes de onda de emisión, es decir, la altura del fluoróforo está codificado por color.
En la invención, el estándar de calibración comprende una pluralidad de capas emisoras de fluorescencia. Ventajosamente, el estándar de calibración puede comprender 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, o incluso hasta 10 capas emisoras de fluorescencia. Para la aplicación prevista, son prácticas hasta 6 capas emisoras de fluorescencia, y normalmente 3 puede ser suficientes.
Un ejemplo de dicha muestra de calibración de emisores multifluorescentes, se ilustra en la Figura 5. Incluye un sustrato dieléctrico (p. ej., un cubreobjetos de microscopio). Una estructura en capas se dispone sobre una parte de la superficie superior de dicho sustrato. La estructura en capas comprende capas espaciadoras A, B, C y D, en donde D actúa una capa protectora final, con un espesor de capa A que varía entre 5 nm y 20 nm, B y C que varía entre 10 nm y 100 nm, y D que varía entre 400 nm y 800 nm, típicamente 500-600 nm. Las capas emisoras de fluorescencia e1, e2 y e3, tienen grosores de aproximadamente 2 nm-20 nm. Todo el espesor de la muestra, d, es de aproximadamente 800 nm-1000 nm. Los emisores de fluorescencia e1, e2 y e3 tienen diferentes espectros de excitación o emisión.
Según otra realización, el estándar de calibración puede comprender una pluralidad de estructuras en capas dispuestas una al lado de la otra, comprendiendo cada estructura en capas una pluralidad de capas emisoras de fluorescencia.
Sustrato dieléctrico
Ventajosamente, el sustrato dieléctrico está en forma de capa, de forma más ventajosa una capa con forma rectangular, de forma aún más ventajosa en forma de cubreobjetos de microscopio.
Ventajosamente, el espesor del sustrato dieléctrico varía entre 150 y 200 μm, de forma más ventajosa, varía entre 160 y 190 μm, de forma aún más ventajosa varía entre 160 y 180 μm, de forma típica es de aproximadamente 170 μm. El espesor del sustrato dieléctrico influye en la calidad de la información (p. ej., la resolución axial) que se puede obtener a partir de una muestra, dependiendo de parámetros tales como NA objetivo y, en su caso, el medio de inmersión. Un experto en la técnica sabe que puede adaptar el espesor, quizás fácilmente, según su objetivo y los parámetros mencionados anteriormente.
Ventajosamente, el sustrato dieléctrico mide aproximadamente el ancho, la longitud y el espesor de un cubreobjetos de microscopio, preferiblemente un cubreobjetos de microscopio de fluorescencia.
Ventajosamente, el sustrato dieléctrico se presenta en forma de un cubreobjetos circular, por ejemplo, en forma de un cubreobjetos circular que tiene un diámetro que varía de 50 μm a 3, 5, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 60 mm o 100 mm, preferiblemente un diámetro de aproximadamente 100 μm, 10 mm, 12 mm, 18 mm o 25 mm.
Ventajosamente, el sustrato dieléctrico se presenta en forma de un cubreobjetos rectangular, por ejemplo, un cubreobjetos rectangular que tiene una longitud y/o una anchura que varía de 50 μm a 3, 5, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 60 mm o 100 mm, por ejemplo, en forma de un cubreobjetos rectangular que tiene un tamaño de 3*3 mm.
Ventajosamente, el sustrato dieléctrico está hecho de un material de calidad óptica. Dicho material de calidad óptica puede seleccionarse de vidrio de calidad óptica (tal como vidrio de cal sodada, o vidrio de borosilicato) o plástico de calidad óptica. También se puede utilizar material de cuarzo o zafiro. Preferiblemente, dicho material está hecho de un material que tiene un índice de refracción de al menos 1,5, preferiblemente está hecho de un índice de refracción comprendido entre 1,5 y 2,5, más preferiblemente comprendido entre 1,5 y 2,3.
En una realización, el sustrato dieléctrico está hecho de vidrio que tiene un índice de refracción comprendido entre 1,50 y 1,55, preferiblemente un índice de refracción de aproximadamente 1,52. En otra realización, el sustrato dieléctrico está hecho de zafiro que tiene un índice de refracción comprendido entre 1,78 y 2,3.
Interfaz
La interfaz entre dicho sustrato dieléctrico y dicha al menos una capa espaciadora imita una interconexión entre un sustrato dieléctrico y una muestra a analizar. Esto se logra, ventajosamente, cuando los polímeros de calidad óptica utilizados en el estándar de calibración tienen un índice de refracción que se aproxima al de la muestra a analizar. Preferiblemente, dichos polímeros tienen un índice de refracción comprendido entre 1,3 y 1,8, preferiblemente 1,3 a 1,6, más preferiblemente entre 1,33 y 1,51, aún más preferiblemente entre 1,37 y 1,51.
Capa espaciadora
Las capas espaciadoras son útiles para ajustar la distancia entre la al menos una capa emisora de fluorescencia y la interfaz del estándar de calibración que imita la interfaz entre una interfaz entre un sustrato dieléctrico y una muestra a analizar.
Ventajosamente, la capa espadadora está hecha de un material seleccionado de entre un polímero transparente de calidad óptica mencionado anteriormente, o de un material de calidad óptica transparente inorgánico, p. ej., TiO2.
Preferiblemente, el índice de refracción de las capas espaciadoras se aproxima al índice de refracción de la muestra a analizar. Más preferiblemente, el índice de refracción de la capa espaciadora se aproxima al índice de refracción de las células, de forma ventajosa, el índice de refracción de la capa espaciadora varía de 1,3 a 1,8, preferiblemente 1,3 a 1,6, de forma ventajosa 1,3 a 1,5, más preferiblemente entre 1,33 y 1,51, incluso más preferiblemente entre 1,37 a 1,51.
Cuando el estándar de calibración comprende una pluralidad de capas espaciadoras, las capas espaciadoras se hacen ventajosamente del mismo material.
Ventajosamente, la capa espaciadora apilada sobre el sustrato dieléctrico tiene un espesor de 2 nm o más, 3 nm o más, 4 nm o más, 5 nm o más. De forma más ventajosa, la capa espaciadora apilada sobre el sustrato dieléctrico tiene un espesor que varía entre 5 y 50 nm, preferiblemente entre 5 y 20 nm.
Ventajosamente, cada capa espaciadora que separa dos capas emisoras de fluorescencia, tiene un espesor de 2 nm o más, 3 nm o más, 4 nm o más, 5 nm o más. De forma más ventajosa, la capa espaciadora que separa dos capas emisoras de fluorescencia, tiene un espesor que varía entre 2 nm y 1000 nm, entre 2 nm y 700 nm, entre 2 nm y 500 nm, entre 2 nm y 100 nm, entre 2 nm y 50 nm, entre 5 y 50 nm, preferiblemente entre 5 y 20 nm.
Capa emisora de fluorescencia
Ventajosamente, una capa emisora de fluorescencia contiene un material emisor de fluorescencia y una capa de polímero.
En una realización, la capa de material emisor de fluorescencia está incrustada dentro de dicha capa de polímero, ventajosamente incrustada homogéneamente dentro de dicha capa de polímero. En esta realización, la capa de polímero en la que se incorpora el material emisor de fluorescencia está hecha de un polímero seleccionado entre polímeros transparentes de calidad óptica mencionados anteriormente, tales como PDDA.
En otra realización, el material emisor de fluorescencia se apila sobre dicha capa de polímero. En esta realización, la capa de polímero sobre la que se apila el material emisor de fluorescencia actúa como una capa inferior. Por lo tanto, en esta realización, la capa emisora de fluorescencia está compuesta por una capa de material emisor de fluorescencia apilada sobre una capa espaciadora que actúa como capa inferior. En esta realización, la capa inferior ejerce una fuerza de adhesión sobre el material emisor de fluorescencia de la capa emisora de fluorescencia. La fuerza de adhesión puede deberse al enclavamiento mecánico de la capa inferior y la capa emisora de fluorescencia, a fuerzas no específicas (p. ej., fuerzas de Van der Waals entre el polímero que constituye la capa inferior y el material emisor de fluorescencia), fuerzas electrostáticas (p. ej., los átomos/moléculas del polímero que constituyen la capa inferior y el material emisor de fluorescencia forman enlaces electrostáticos) o fuerzas químicas (p. ej., los átomos/moléculas del polímero que constituyen la capa inferior y el material emisor de fluorescencia forman enlaces químicos que pueden ser de hidrógeno, iónicos o de carácter covalente). Preferiblemente, el polímero que ejerce una fuerza de adhesión (p. ej., fuerza de adhesión electrostática) sobre el material emisor de fluorescencia es un polímero transparente de calidad óptica, tal como PDDA o PSS.
En una realización específica, la capa emisora de fluorescencia se dispone entre dos capas, cada una ejerciendo una fuerza de adhesión sobre la capa emisora de fluorescencia.
Ventajosamente, el espesor de la capa de polímero que actúa como una capa inferior varía entre 0,5 nm y 2 nm, preferiblemente es aproximadamente 1 nm. Ventajosamente, el espesor de la capa de material emisor de fluorescencia varía de 0,5 nm a 2 nm, preferiblemente es de aproximadamente 1 nm.
Ventajosamente, el material emisor de fluorescencia se selecciona entre el material emisor de fluorescencia mencionado anteriormente. Preferiblemente, el material emisor de fluorescencia se selecciona entre fluoróforo molecular, agregados de fluoróforo molecular, proteínas fluorescentes, o nanocristales fluorescentes, tales como puntos cuánticos.
Ventajosamente, el espesor de una capa emisora de fluorescencia varía entre 1 nm y 1000 nm, más preferiblemente varía entre 1 y 800 nm.
Capa protectora final
Ventajosamente, la estructura en capas se cubre con una capa espaciadora como una capa protectora final.
Ventajosamente, la capa espaciadora está hecha de polímero seleccionado entre polímeros transparentes de calidad óptica mencionados anteriormente, preferiblemente hecho del mismo polímero del que se hace la capa espaciadora apilada sobre el sustrato dieléctrico.
Espesor completo de la estructura en capas
En una realización, el espesor completo de la estructura en capas no es más de 5 |jm, de forma ventajosa no más de 2 |jm. En otra realización, el espesor completo de la estructura en capas es submicrométrico.
En otra realización, el espesor completo de la estructura en capas varía entre 50 nm y 1 jm , 50 nm y 500 nm, 50 y 200 nm, 100 y 500 nm.
Preparación del estándar de calibración
Otro aspecto de esta descripción, no cubierto por las reivindicaciones, es un método para fabricar un estándar de calibración como se describe en la presente descripción, dicho método comprende formar en un sustrato dieléctrico una estructura en capas, comprendiendo dicha estructura en capas al menos una capa espaciadora y al menos una capa emisora de fluorescencia que contiene al menos un material emisor de fluorescencia, en donde dichas capas se depositan una encima de otra mediante técnicas seleccionadas de entre recubrimiento por centrifugación, capa por capa (LBL), método de Langmuir-Blodgett, evaporación.
Ventajosamente, el método para fabricar un estándar de calibración como se describe en la presente memoria, comprende las siguientes etapas:
i. proporcionar un sustrato dieléctrico;
ii. depositar una o varias veces una capa espaciadora y una capa emisora de fluorescencia como se describe en la presente memoria;
iii. opcionalmente, depositar una capa protectora final.
Etapa (ii)
Ventajosamente, la deposición de capas espaciadoras en la etapa (ii) se realiza por recubrimiento por centrifugación y, opcionalmente, por deposición LBL o por pulverización catódica (en el caso de óxidos inorgánicos).
El recubrimiento por centrifugación y la deposición LBL son técnicas de fabricación de películas delgadas, bien conocidas por los expertos en la técnica. Por lo tanto, el experto en la técnica puede fabricar un estándar de calibración según la invención, conociendo la estructura en capas (p. ej., el espesor de la capa y las composiciones de la capa) a depositar. 1ra implementación: etapa (ii) deposición de capa emisora de fluorescencia mediante recubrimiento por centrifugación En una primera implementación, la capa emisora de fluorescencia a depositar se compone de un material emisor de fluorescencia incrustado dentro de una capa de polímero. En esta realización, la deposición de la capa emisora de fluorescencia en la etapa (ii) se realiza ventajosamente mediante recubrimiento por centrifugación.
2da implementación: etapa (ii) deposición de la capa emisora de fluorescencia aplicando la técnica de deposición Capa por capa (LBL).
En una segunda implementación, la capa emisora de fluorescencia a depositar está compuesta por un material emisor de fluorescencia apilado sobre una capa de polímero que actúa como una capa inferior. En esta realización, la deposición de la capa emisora de fluorescencia en la etapa (ii) se realiza ventajosamente mediante deposición capa por capa. En esta implementación, la deposición de la capa espaciadora en la etapa (ii) se realiza ventajosamente mediante recubrimiento por centrifugación.
Ventajosamente, la deposición de capas emisores de fluorescencia en la etapa (ii) consiste en depositar sucesivamente una capa de un polímero de calidad óptica que ejerce una fuerza de adhesión sobre el material emisor de fluorescencia (p. ej., una fuerza de adhesión electrostática), tal como PDDA o PSS, seguido de una capa de material emisor de fluorescencia, tal como TPPS4, opcionalmente seguido de una capa de un polímero transparente de calidad óptica que ejerce una fuerza de adhesión sobre el material emisor de fluorescencia (p. ej., una fuerza de adhesión electrostática), tal como PSS.
Ejemplos de preparación del estándar de calibración
Los productos químicos utilizados en los Ejemplos se adquirieron de SIGMA-ALDRICH.
Se ha utilizado el siguiente sustrato:
- sustrato de borosilicato (BK-7) con índice de refracción, n3 = 1,514 a 488 nm.
Se han utilizado los siguientes polímeros:
- poli(2,2,3,3,3-pentafluoropropil metacrilato) -(PFA);
- polidialildimetilamonio -(PDDA)
- poliestireno sulfonato (PSS)
- alcohol polivinílico (PVA)
Se han utilizado los siguientes emisores de fluorescencia:
- agregado J de meso-tetra(4-sulfonatofenil)porfina (TPPS4);
- tetrafenilporfina tetrasulfonato (TPPS4 o “ Base de TPPS” );
- CAS N° 1461-15-0 (calceína)
A menos que se indique lo contrario, todos los materiales se usaron tal como se recibieron de los fabricantes.
Las muestras de calibración se caracterizaron por:
- elipsometría, para medir los espesores de las capas
Ejemplo 1: Preparación de una muestra 1 (Muestra 1) de calibración de una sola capa emisora de fluorescencia fuera del alcance de la invención.
1.1 Material y métodos
El material utilizado para la fabricación de la capa espaciadora/protectora A se prepara disolviendo 0,015 mM de PFA en THF.
El material utilizado para la fabricación de la capa espaciadora/protectora B se prepara disolviendo 0,3 mM de PFA en THF. El material utilizado para la fabricación de la capa emisora de fluorescencia (e) se prepara mediante la disolución de 1 mM de TPPS4 en agua desionizada, pH = 3.
Se limpió un cubreobjetos BK-7 #1,5 (170 μm) utilizando Elmanex/agua desionizada (1:10) durante 20 min en un sonicador, y luego se enjuagó cuidadosamente con agua desionizada durante al menos 30 segundos. Se encontró que este proceso era importante para lograr películas delgadas homogéneas.
La deposición de la capa fina se logró mediante una combinación de dos técnicas diferentes:
Para las capas espaciadoras/protectoras (indicadas como A/B en las Figuras 3-5) se utilizó revestimiento por centrifugación (5.000 RPM, 1 min), dando como resultado una capa delgada de aproximadamente 5-10 nm de espesor para 0,015 mM de PFA, y 600 nm para 0,3 mM de PFA (indicada como capa B o D).
Para la deposición de la capa emisora luz de fluorescencia, se utilizó la técnica capa por capa (LBL), utilizando las siguientes soluciones y la siguiente secuencia: PDDA (1:10), TPPS4 y PSS (1:10), todo en agua desionizada. La muestra se sumergió en cada una de las soluciones durante aproximadamente 30 segundos, dando como resultado una película homogénea de aproximadamente 4 nm de espesor.
1.2 Resultados
Se obtiene una muestra 1 de calibración de capa de emisor de fluorescencia única, como se muestra en la Figura 1. El espesor mínimo de A es del orden de 5-10 nm, y pueden realizarse diferentes muestras que tienen un espesor diferente de A (véase más adelante), e es aproximadamente 4 nm, y B es aproximadamente 600 nm.
El sustrato es un cubreobjetos BK-7 de aproximadamente 170 μm de espesor.
Ejemplo 2: Preparación de una muestra 2 (Muestra 2) de calibración de capa emisora multifluorescente según la invención.
2.1 Material y métodos
La Muestra 2 se fabricó como la Muestra 1, pero con capas adicionales como se describe en la Figura 5. Para las capas emisoras de fluorescencia (e1, e2, e3) seguimos el mismo procedimiento que antes, así como para la capa espaciadora/protectora. Para la última capa protectora D, utilizamos 0,2 mM de PFA.
Todos los emisores de fluorescencia (e1, e2 y e3) se excitan con longitud de onda de excitación láser de 488 nm. Sus longitudes de onda de emisión son diferentes y se mencionan en la tabla a continuación.
2.2 Resultados
Se obtuvo una muestra 2 de calibración multifluorescente. A, B, C y D se componen de una capa transparente óptica de polímero, con grosores de A = 5 nm-20 nm, B, C = 50 nm-80 nm, y D es aproximadamente 400 nm-600 nm, los espesores de las capas de emisores de fluorescencia e1, e2 y e3 son de aproximadamente 2 nm-20 nm. El espesor completo de la muestra, d, es de aproximadamente 800 nm. Los emisores de fluorescencia e1, e2 y e3 tienen espectros de emisión diferentes.
Ejemplo 3: Preparación de una muestra (Muestra 3) de calibración de capa de emisor de fluorescencia gruesa fuera del alcance de la invención.
3.1 Material y métodos
La Muestra 3 (Figura 4) se fabricó como la Muestra 1, excepto que el emisor de fluorescencia (TPPS4) se incrustó en PVA (100 mg en 2 ml de agua desionizada), y después se recubrió por centrifugación durante 1 min, 800 RPM.
3.2 Resultados
Se obtuvo una muestra 3 de calibración de capa (aproximadamente 800 nm) gruesa emisora de fluorescencia. El espaciador A delgado es como en el Ejemplo 1 y 2.
Determinar una información relacionada con un campo evanescente
Otro aspecto de la invención es un método para determinar una información relacionada con un campo evanescente generado cerca de una interfaz entre una muestra a analizar y un sustrato dieléctrico en el que se va a depositar dicha muestra, y/o para ajustar dicha información; que comprende:
a) proporcionar al menos una muestra de calibración como en la presente invención,
b) colocar dicho estándar de calibración en una etapa de microscopio,
c) iluminar dicho estándar de calibración en una longitud de onda (A) dada y un ángulo de incidencia [0 (2)] dado, d) detectar la emisión del al menos un material emisor de fluorescencia contenido en cada capa emisora de fluorescencia, utilizándose dicha detección para la determinación de una información relacionada con dicho campo evanescente.
La iluminación de la etapa c) se lleva a cabo con una longitud de onda capaz de excitar el material emisor de fluorescencia de cada uno del estándar de calibración n. Esto puede obtenerse iluminando el estándar de calibración con una longitud de onda que se superponga al espectro de excitación del emisor de fluorescencia, por ejemplo, utilizando una fuente láser o una fuente de luz blanca con un filtro de excitación adecuado.
La etapa de detección d) comprende medir el valor de al menos un parámetro de fluorescencia de la al menos una capa emisora de fluorescencia detectada por la emisión que varía en función de la intensidad del campo evanescente, tal como la intensidad de emisión de la capa emisora de fluorescencia, la longitud de onda de emisión de la capa emisora de fluorescencia, la polarización de la capa emisora de fluorescencia, el tiempo de vida de fluorescencia de la capa emisora de fluorescencia, el patrón de radiación de emisión de la capa emisora de fluorescencia.
Determinación del decaimiento axial de la intensidad de un campo evanescente
1ra implementación: una capa emisora de fluorescencia (fuera del alcance de la presente invención)
En una realización, la información a determinar es la caracterización del decaimiento axial de la intensidad de campo evanescente. Dicha información puede obtenerse implementando un método que comprende:
- Proporcionar n estándares de calibración comprendiendo una sola capa emisora de fluorescencia, teniendo cada uno capas emisoras de fluorescencia dispuestas a diferentes distancias (zn) controladas fijas con respecto a la interfaz, - para cada estándar de calibración, iluminar el estándar de calibración y medir los parámetros de fluorescencia (Mn) para al menos un parámetro físico que varíe en función de la intensidad del campo evanescente;
- emitir una información que caracterice el decaimiento de intensidad del campo evanescente,
en donde la información describe la relación entre el al menos un parámetro físico medido (Mn) obtenido con cada estándar de calibración que comprende una única capa emisora de fluorescencia y las distancias (zn) controladas fijas. TIR
En una realización, cada estándar de calibración se ilumina en condiciones de TIR. En particular, el estándar de calibración se ilumina con un ángulo de incidencia [0(2)] mayor que el ángulo crítico [0(c)] y la medición realizada en el plano focal frontal.
En esta realización, los parámetros físicos medidos (Mn) obtenidos con una calibración cuya capa emisora de fluorescencia está a una distancia (zn) desde la interfaz, se puede normalizar mediante (Mn,E P i), con (Mn ,E P i) representando el parámetro de fluorescencia medido obtenido con el mismo estándar de calibración con un [0(2)] = 0. La relación (Mn)/(Mn ,E P i) representa los parámetros de fluorescencia medidos normalizados.
Además, en esta realización, (Mn) puede obtenerse en varios ángulos de incidencia 0(2) de haz.
En esta realización, los parámetros de fluorescencia medidos (Mn) o los parámetros de fluorescencia medidos normalizados (Mn)/(Mn ,E P i) pueden representarse gráficamente en función de (zn).
Una función puede ajustarse con los parámetros de fluorescencia medidos (Mn) obtenidos o los parámetros de fluorescencia medidos normalizados (Mn)/(Mn,EH) para obtener un conjunto de parámetros, describiendo el decaimiento de intensidad. Como resultado de la etapa de ajuste, se obtiene un conjunto de parámetros que describen el decaimiento de intensidad. Esta función puede ser típicamente una doble exponencial, en la que el término con la longitud de decaimiento más corta corresponde a la parte evanescente en la luz de excitación, y la longitud de decaimiento es la profundidad de penetración efectiva, y la parte de intervalo más largo es un componente de excitación no evanescente. Aparte de las dos constantes de longitud (una longitud corta y larga de decaimiento exponencial), el peso relativo de las dos funciones se utiliza para estimar la proporción de evanescente frente a la luz de excitación de propagación. El ajuste no está restringido a dobles exponenciales y también pueden utilizarse otras funciones, tales como exponenciales, exponenciales estiradas u otros.
Preferiblemente, el parámetro de fluorescencia que varía en función de la intensidad del campo evanescente, se selecciona de la intensidad de emisión de la capa emisora de fluorescencia, la polarización de la capa emisora de fluorescencia, la direccionalidad de la capa emisora de fluorescencia, el tiempo de vida de fluorescencia de la capa emisora de fluorescencia, y el patrón de radiación de la capa emisora de fluorescencia.
SAF
En otra realización, cada estándar de calibración se ilumina, y la fluorescencia se recoge en condiciones de SAF. Esta realización utiliza la captación de imágenes del plano de Fourier (plano de la pupila) del objetivo, en lugar del plano de la muestra, y analizando el patrón de radiación obtenido.
Al patrón de radiación se le puede captar imágenes colocando una lente de Bertrand en la trayectoria óptica de detección, de modo que se forme una imagen del plano de la pupila posterior del objetivo, en lugar del plano de la muestra. En esta realización, la distancia (z) de la capa emisora de fluorescencia corresponde ventajosamente a un parámetro de radiación dependiente de la distancia.
En esta realización, los parámetros de fluorescencia medidos (Mn) obtenidos con una calibración cuya capa emisora de fluorescencia está a una distancia (zn) desde la interfaz, son la cantidad de fluorescencia supercrítica (Mn,SA F) y fluorescencia subcrítica (o infracrítica) (Mn,UAF).
En esta realización, la relación (Mn,SAF)/(Mn,UAF) puede utilizarse en función de (zn).
Como se mencionó anteriormente, una función puede ajustarse con la relación (Mn,SAF)/(Mn,UAF) para obtener un conjunto de parámetros que describen el decaimiento de intensidad. Como resultado de la etapa de ajuste, se obtiene un conjunto de parámetros que describen el decaimiento de intensidad. Esta función puede ser típicamente una única exponencial.
En una implementación más elaborada, se simula el patrón de radiación de una capa homogénea de emisores de fluorescencia orientados isotópicamente, y este patrón de radiación simulado se ajusta con el patrón de radiación medido, con la distancia z(0) del emisor de fluorescencia como variable de ajuste.
Por lo tanto, los métodos detallados anteriormente permiten determinar la relación entre al menos un parámetro de fluorescencia medido (Mn) y las distancias (zn) controladas fijas con respecto a un campo evanescente generado cerca de una interfaz entre una muestra a analizar y un sustrato dieléctrico sobre el que se va a depositar dicha muestra. Esta información es importante, ya que permite una buena estimación del espesor de la capa de excitación de fluorescencia de una interfaz de célula/sustrato real iluminada correspondiente, en las mismas condiciones.
Como se mencionó anteriormente, el parámetro de fluorescencia que varía en función de la intensidad del campo evanescente, puede seleccionarse de la intensidad de emisión de la capa emisora de fluorescencia, de la polarización de la capa emisora de fluorescencia, de la direccionalidad de la capa emisora de fluorescencia, del tiempo de vida de fluorescencia de la capa emisora de fluorescencia, y del patrón de radiación de la capa emisora de fluorescencia.
2da implementación: Pluralidad (serie) de capas emisoras de fluorescencia
En la invención, el decaimiento de intensidad axial del campo evanescente puede obtenerse utilizando un estándar de calibración, comprendiendo una pluralidad de capas emisoras de fluorescencia. La invención es particularmente ventajosa, ya que, a diferencia del caso de un emisor de fluorescencia simple, el método a continuación permite mediciones rápidas e instantáneas para obtener la información deseada en relación con el campo evanescente. Dicho método puede obtenerse implementando un método que comprende:
- Proporcionar estándares de calibración que comprenden m capas emisoras de fluorescencia, teniendo cada uno capas emisoras de fluorescencia dispuestas a diferentes distancias (zm) controladas fijas con respecto a la interfaz,
- para dicho estándar de calibración medir el parámetro de fluorescencia (M) que varía en función de la intensidad del campo evanescente;
- emitir una información que caracterice el decaimiento de intensidad del campo evanescente,
en donde la información describe la relación entre el al menos un parámetro de fluorescencia medido (Mm) obtenido con el estándar de calibración que comprende una pluralidad de capas emisoras de fluorescencia, y las distancias (zm) controladas fijas.
En esta realización, los parámetros de fluorescencia pueden recogerse en forma de información mixta. Por ejemplo, si se mide la intensidad de emisión de la capa emisora de fluorescencia, la emisión se recoge en forma de múltiples bandas espectrales que corresponden a una cierta combinación de intensidades espectrales.
Por lo tanto, en esta realización, la medición del parámetro de fluorescencia (M) puede utilizarse para calcular la contribución de cada capa emisora de fluorescencia, de forma ventajosa utilizando la fórmula que relaciona la contribución de una capa emisora de fluorescencia a algunos parámetros del material emisor de fluorescencia que contiene (p. ej., concentración, brillo, eficiencia de excitación), y la sensibilidad espectral del detector.
En una realización particular, la contribución de una capa emisora de fluorescencia se calcula retrospectivamente mediante el uso del producto de la concentración de emisores de fluorescencia * la eficiencia del emisor de fluorescencia * eficiencia de excitación * sensibilidad espectral del detector. En otros términos, el peso relativo de cada capa emisora de fluorescencia corresponde al producto de la concentración del emisor de fluorescencia * brillo del emisor de fluorescencia * eficiencia de excitación * sensibilidad espectral del detector.
Como se utiliza en el presente documento, el brillo del emisor de fluorescencia representa el producto: extinción molar * rendimiento cuántico de fluorescencia.
Como se mencionó anteriormente, los términos lineales se pueden cancelar normalizando las intensidades medidas en TIR con las intensidades correspondientes medidas en EPI, y la desmezcla espectral (no lineal) da el decaimiento axial de la distribución de luz de excitación desde una única medición espectral.
Alternativamente, como en la realización que utiliza un estándar de calibración de emisor de fluorescencia simple, no solo se pueden analizar las intensidades espectrales, sino también el patrón de radiación del emisor de fluorescencia. Además, otras lecturas que varían en función de la intensidad del campo evanescente, incluyendo la polarización de la fluorescencia emitida o la vida útil de la fluorescencia, pueden utilizarse fácilmente por el experto en la técnica, para implementar los métodos descritos anteriormente.
Ajuste de una información relacionada con el campo evanescente
El método puede comprender, además, una etapa en donde se ajusta la información determinada como se detalló anteriormente.
Dicha realización comprende ajustar la longitud de onda (A) y/o el ángulo de incidencia [0(2)] de la luz que ilumina el estándar de calibración, de modo que el parámetro de fluorescencia medido corresponda a un valor deseado de profundidad de penetración del campo evanescente.
Programa informático
Un aspecto adicional se refiere a un programa informático que comprende instrucciones de códigos para la ejecución de etapas del método, para determinar una información relacionada con un campo evanescente, cuando dicho programa se ejecuta en un ordenador.
En este aspecto, el ordenador está preferiblemente conectado a una disposición de microscopio y está configurado preferiblemente para emitir al menos un medio para medir un parámetro de fluorescencia.
En una realización preferida, no cubierta por las reivindicaciones, el programa informático comprende instrucciones de códigos para la ejecución de etapas del método, utilizando el estándar de calibración que comprende una pluralidad de capas emisoras de fluorescencia, en donde las instrucciones de los códigos están adaptadas para ejecutar una etapa de cálculo retrospectivo cuando dicho programa se ejecuta en un ordenador.
Configuración de iluminación
En una realización correspondiente a una configuración TIR, el estándar de calibración se ilumina de tal manera que el medio de incidencia de iluminación es la superficie estándar de calibración que tenga el mayor índice de refracción (es decir, la superficie del sustrato dieléctrico en la que no se haya apilado estructura en capas). En esta realización, el estándar de calibración se ilumina ventajosamente con un ángulo de incidencia [0(2)] mayor que el ángulo crítico [0(c)].
En otra realización correspondiente a una configuración SAF, el estándar de calibración puede iluminarse de tal manera que el medio de incidencia de iluminación es o la superficie estándar de calibración que tenga el mayor índice de
refracción (es decir, la superficie del sustrato dieléctrico en la que no se haya apilado una estructura en capas) o el índice de refracción inferior [es decir, la superficie del sustrato dieléctrico en la que se hayan apilado la(s) estructura(s) en capas]. Soporte estándar de calibración
En una realización, el estándar de calibración se coloca en la etapa del microscopio mediante el uso de un soporte estándar de calibración en forma y/o espesor de un portaobjetos de microscopio.
Este soporte comprende una parte de base que define una abertura pasante que permite que un haz de iluminación desde el exterior del soporte pase a través de la abertura. Además, la abertura está dimensionada para recibir un estándar de calibración. La abertura pasante puede estar bordeada por paredes que actúan como topes para detener un desplazamiento del estándar de calibración con respecto al soporte estándar de calibración. El estándar de calibración puede colocarse de manera simple sobre el soporte, o unirse a él.
El soporte estándar de calibración permite ventajosamente manejar la calibración durante los ensayos y almacenar el estándar de calibración.
Ventajosamente, el soporte estándar de calibración mide aproximadamente el ancho y la longitud de un portaobjetos de microscopio, por lo general, aproximadamente 75 mm * 25 mm, o 76*26 mm. El soporte estándar de calibración puede medir un intervalo de tamaños correspondientes al portaobjetos de microscopio utilizado con fines especiales, como 75*50 mm para uso geológico, 46*27 mm para estudios petrográficos, y 48*28 mm para secciones delgadas, entre otros. El soporte estándar de calibración es ventajosamente más grueso que el estándar de calibración, por ejemplo, es aproximadamente 0,6 mm o más, preferiblemente aproximadamente 1 mm o más. La parte de base puede estar hecha de cualquier material sólido, tal como vidrio, plástico o metal.
Dicho soporte estándar de calibración se ilustra en la Figura 6. El estándar (62) de calibración en el que las mediciones se realizan tienen una forma rectangular que tiene una longitud y un ancho de aproximadamente 12 mm a 25 mm, y un espesor de aproximadamente 170 μm, mientras que el soporte (61) estándar de calibración mide aproximadamente la anchura y la longitud de un portaobjetos de microscopio, por lo general, aproximadamente 75 mm * 25 mm, y tiene aproximadamente 1 mm de espesor, lo que permite un mejor manejo que si el estándar de calibración fuese manipulado sin soporte.
Ejemplos de uso del estándar de calibración
Ejemplo 1: Protocolo de medición típica con muestra de tipo 1 (capa de tinte homogénea única)
1. Material y métodos
1.1 Control en epifluorescencia (EPI)
1.1.1 montar la muestra en el microscopio;
1.1.2 elegir la longitud de onda del láser o de la fuente de luz blanca con filtro de excitación coincidente, que se superponga con el espectro de excitación de fluoróforo; 1.1.3 elegir el espejo dicroico coincidente y el filtro de emisión; 1.1.4 enfocar a la capa de interfaz;
1.1.5 tomar imágenes de plano de enfoque de la muestra de calibración (véase la Figura 7).
1.2 adquisición de imágenes de TIRF de ángulo variable
1.2.1 cambiar a la excitación de onda evanescente (TIRF);
1.2.2 reenfocar (obsérvese el enfoque con respecto a EPI);
1.2.3 comenzando con theta = 0° (que debería ser idéntico a EPI), tomar imágenes de TIRF en diferentes ángulos polares de haz (la configuración debe calibrarse de modo que el ángulo del haz entrante con respecto al eje óptico se conozca con un máximo de 0,5°);
1.2.4 adquirir una serie de imágenes de TIRF en ángulo variable;
1.2.5 repetir la etapa (1.2.4) en 5-10 ubicaciones diferentes en la muestra;
1.2.6 elegir regiones de interés (ROI, por sus siglas en inglés) en la muestra;
1.2.7 tomar diez imágenes oscuras de la misma muestra (con agitación láser), promediar para constituir la imagen oscura promedio.
1.3 Análisis de imágenes
1.3.1 sustraer el fondo local medido en la imagen oscura promedio
1.3.2 trazar, para cada ROI n, la señal corregida por el fondo (F-B)(n) frente al ángulo del haz theta
1.3.3 ajustar la gráfica con la expresión analítica de señal frente al ángulo
1.3.4 repetir las etapas 1.1-1,3.3 para las muestras con diferentes capas espaciadoras, separando el sustrato de vidrio y la capa de tinte, z(m) indicando m espesores de espaciadores diferentes;
1.3.5 para un ángulo de haz determinado, trazar la gráfica de (F-B)(n) frente a z(m);
1.3.6 ajustar un doble exponencial con los datos. El exponencial de corto alcance proporcionará la profundidad de penetración efectiva, el exponencial de largo alcance proporcionará la contribución (no deseada) no evanescente de campo lejano, respectivamente.
Los pesos (factores preexponenciales) de los dos términos mono-exponencial proporcionarán la contribución relativa de la luz evanescente y no evanescente.
Resultados
La Figura 7 ilustra una imagen del plano de muestra de epifluorescencia de una muestra de una sola capa de un agregado J único recubierto por centrifugación (en la parte superior de una capa espaciadora de 50 nm), tras una excitación de 488 nm, vista a través de un espejo dicroico de 491 nm y un filtro de paso de banda de emisión de 525/40.
Ejemplo 2: Protocolo variante para capa de tinte “ semi-infinita”
Más simple que las muestras 3-D anteriores, cubrir un cubreobjetos con una solución de fluoróforo diluida y generando así una capa de espesor “ infinito” (d >> 5), crea un mar homogéneo de fluorescencia que pueda utilizarse junto con VA-TIRF para calcular la profundidad de penetración efectiva a partir de la variación de la fluorescencia acumulativa. Asumiendo un EW que decae mono-exponencialmente con una longitud de decaimiento 5(0) y un componente de largo alcance con D >> 5, la superposición de dos exponenciales,
describe el decaimiento de la intensidad axial. Aquí, suponemos que D solo varía lentamente con Q, si acaso. Después de la integración sobre z en los límites [0, «], la ecuación 3 produce una dependencia lineal de la fluorescencia medida en 5(Q),
porque el segundo término es un desplazamiento independiente de ángulo. Si la ecuación 4 se normaliza para la dependencia de Q de la intensidad incidente en la interfaz, Io(z = 0), p. ej., registrando Fo(Q) de una película de fluoróforo delgada en la interfaz, entonces la dependencia implícita de Q en A y B se cancela. Por supuesto, para que la integral se resuelva como se ha indicado, aquí se asume que el término dependiente de Q del decaimiento de intensidad sigue una monoexponencial.
Ejemplo 3: Protocolo variante utilizando detección de SAF
Una variante del protocolo anterior utiliza la captación de imágenes del plano de Fourier (plano de la pupila) del objetivo, en lugar del plano de la muestra, y analiza el patrón de radiación, en lugar de la intensidad absoluta, 1.5.1 montar la lente de Bertrand en la trayectoria óptica de emisión;
1.5.2 verificar, para una interfaz vidrio/aire el patrón de radiación esperado para una capa de tinte delgada, recubierta directamente por centrifugación sobre la superficie (Figura 8a);
1.5.3 cambiar a la muestra de prueba como en 1.1 y, utilizando los mismos filtros y configuraciones anteriores, adquirir la imagen de SAF del tinte incrustado en las capas espaciadoras y protectoras del polímero con índice coincidente; 1.5.4 tomar imágenes SAF para diferentes alturas z(m) de fluoróforo;
1.5.5 igual que en 1.5.4, para diferentes ángulos de haz theta (n);
1.5.6 igual que en 1.5.5, para diferentes áreas de capa de tinte que NO contenga polímero;
1.5.7 integrar la intensidad dentro del círculo amarillo (fluorescencia de ángulo infracrítica, UAF) y dentro de la abertura circular definida por los anillos amarillos y morados;
1.5.8 SAF debería aumentar con la altura z(m) decreciente del fluoróforo, y alcanzar cero para una z de aproximadamente 1 |jm. Trazar las intensidades de SAHUAF como z(m);
1.5.9 SAF no debería variar para los diferentes ángulos de haz theta(n) (CONTROL);
1.6.0 ajustar un solo exponencial con datos de SAHUAF frente a z(m). Obtener una profundidad de penetración efectiva. Resultados:
Los resultados se ilustran en la Figura 8A y la Figura 8B. La Figura 8A y la Figura 8B muestran patrones de radiación experimentales de una capa de fluoróforo delgada, ya sea para una interfaz vidrio/aire (A), o para una interfaz de vidrio y el mismo tinte incrustado en un medio que tenga un índice de refracción cercano al agua (B). Obsérvese la emisión en ángulos más altos, lo que conduce a un círculo brillante más grande.
La Figura 8B muestra un resultado típico, como se puede ver, el “ halo” de fluorescencia de ángulo supercrítico (SAF) que emana hacia ángulos “ prohibidos” más allá de la línea blanca, capturado por el objetivo de alta apertura numérica (el límite externo corresponde a la NA limitante del objetivo).
Para la muestra de triple color, estas etapas, descritas aquí para m muestras diferentes, se multiplexan (m = 3) en un cubreobjetos, lo que permite una medición de una única toma.
Claims (19)
1. Un estándar (1) de calibración para determinar un decaimiento de intensidad axial de campo evanescente relacionado con un campo evanescente generado cerca de la interfaz entre una muestra a analizar y un sustrato sobre el que se va a depositar dicha muestra, comprendiendo dicho estándar (1) de calibración un dispositivo en capas apilado sobre un sustrato dieléctrico (2), imitando la interfaz entre dicho sustrato dieléctrico (2) y dicho dispositivo en capas una interfaz entre el sustrato dieléctrico (2) y una muestra a analizar,
el dispositivo en capas presenta sobre dicho sustrato dieléctrico (2), una superficie S, y comprende:
-una serie de estructuras en capas apiladas en el sustrato dieléctrico (2), una encima de la otra, -comprendiendo cada estructura en capas: una capa (3) espaciadora, y una capa (4) emisora de fluorescencia que contiene al menos un material emisor de fluorescencia;
-dicho sustrato dieléctrico (2) tiene un índice de refracción más alto que las capas (3) espaciadoras; -estando una primera capa espaciadora (3a) en contacto con dicho sustrato dieléctrico (2), para presentar una superficie plana sobre la que se deposita la pila de las estructuras en capas; -estando una capa (4) emisora cubierta con una capa (5) protectora final,
en donde:
-cada capa tiene un espesor constante sobre la superficie S;
-cada capa (4) emisora de fluorescencia está dispuesta a una distancia (z) axial controlada fija de dicha interfaz,
-comprendiendo cada capa (4) emisora de fluorescencia al menos un material emisor de fluorescencia que tiene al menos un parámetro de fluorescencia diferente del material emisor de fluorescencia de otra capa (4) emisora de fluorescencia: longitudes de onda de emisión, polarizabilidades de emisión, o vidas útiles de fluorescencia,
teniendo cada capa (4) emisora de fluorescencia un espectro de excitación que permite la excitación a una misma longitud de onda de excitación,
de modo que cada capa (4) emisora de fluorescencia tiene un parámetro de fluorescencia específico a una distancia (z) axial controlada fija de la interfaz, en la longitud de onda de excitación común,
para determinar el decaimiento axial de la intensidad axial evanescente a partir de la combinación de estos parámetros de fluorescencia específicos medidos a diferentes distancias (z) axiales controladas de la interfaz.
2. El estándar (1) de calibración según la reivindicación 1, en donde el espesor de la serie de las estructuras en capas es de la misma escala de longitud que el decaimiento de la intensidad del campo evanescente.
3. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores 1-2, en donde:
-cada capa (4) emisora de fluorescencia presenta una concentración constante de fluoróforo sobre la superficie S,
-cada capa (3) espaciadora presenta un índice de refracción constante sobre la superficie S.
4. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores 1-3, en donde se deposita una capa protectora intermedia entre cada capa (4) emisora y cada capa (3) espaciadora adyacente.
5. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde cada capa se deposita mediante:
-recubrimiento por centrifugación;
-deposición capa por capa (LBL); o
-pulverización catódica.
6. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, teniendo el dispositivo en capas un espesor entre 400 nm y 5 micrómetros.
7. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde cada una de las capas (3) espaciadoras tienen un espesor que varía de 1 nm a 1000 nm.
8. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde cada una de las capas (4) emisoras de fluorescencia tiene un espesor que varía de 2 nm a 30 nm.
9. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde algunas capas (4) emisoras de fluorescencia tienen un espesor inferior a 2 nm.
10. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde la capa protectora intermedia tiene un espesor inferior a 5 nm.
11. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde la capa (5) protectora final presenta un espesor superior a 400 nm.
12. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde mientras más distante de la interfaz esté una capa (4) emisora de fluorescencia, más fluorescente será esta capa (4) emisora.
13. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde el material emisor de fluorescencia contenido en las capas (4) emisoras de fluorescencia tiene diferentes longitudes de onda de emisión.
14. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde cada una de las capa (3) espaciadora están hechan de un polímero transparente de calidad óptica o de un óxido inorgánico transparente de calidad óptica, teniendo índice de refracción de entre 1,3 y 1,8, preferiblemente de entre 1,3 y 1,6, más preferiblemente de entre 1,33 y 1,51.
15. El estándar (1) de calibración según las reivindicaciones anteriores, en donde la capa (4) emisora de fluorescencia comprende un material emisor de fluorescencia y una capa de polímero,
en donde dicho material emisor de fluorescencia o está incrustado dentro de dicha capa de polímero o en donde dicho material emisor de fluorescencia se apila sobre dicha capa de polímero, actuando así como una capa inferior.
16. El estándar (1) de calibración de las reivindicaciones anteriores, en donde
El dicho material emisor de fluorescencia se selecciona de la lista:
-fluoróforos orgánicos;
-puntos cuánticos;
-puntos de carbono.
17. Un método para determinar un decaimiento axial de campo evanescente relacionado con un campo evanescente generado cerca de una interfaz entre una muestra a analizar y un sustrato dieléctrico (2) en el que se va a depositar dicha muestra, y/o para ajustar dicho decaimiento de intensidad axial de campo evanescente; que comprende:
a) proporcionar al menos una muestra de calibración como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16,
b) colocar dicho estándar (1) de calibración en una etapa de microscopio,
c) iluminar dicho estándar (1) de calibración a una longitud de onda (A) dada y un ángulo de incidencia [0(2)] dado,
d) detectar la emisión del al menos un material emisor de fluorescencia contenido en cada capa (4) emisora de fluorescencia, utilizándose dicha detección para la determinación de un decaimiento de intensidad axial de campo evanescente relacionado con dicho campo evanescente,
por la medida del valor de al menos un parámetro de fluorescencia de dicha emisión, que varía en función de la intensidad del campo evanescente, tal como la intensidad de emisión del material emisor de fluorescencia, la longitud de onda de emisión del material emisor de fluorescencia, la polarización de emisión del material emisor de fluorescencia, la direccionalidad de emisión del material emisor de fluorescencia, o el tiempo de vida de emisión de fluorescencia del material emisor de fluorescencia.
18. El método según la reivindicación anterior 17, en donde las etapas son:
-proporcionar un estándar (1) de calibración que comprende m capas (4) emisoras de fluorescencia, cada una teniendo una capa (4) emisora de fluorescencia dispuesta a diferentes distancias (zm) controladas fijas con respecto a la interfaz,
-medir para dicho estándar (1) de calibración los parámetros de fluorescencia (M) que varían en función de la intensidad de campo evanescente;
-emitir el decaimiento de intensidad del campo evanescente que describe la relación entre el al menos un parámetro de fluorescencia medido (Mm) obtenido con el estándar (1) de calibración, que comprende una pluralidad de capas (4) emisoras de fluorescencia y las distancias (zm) controladas fijas.
19. El método según las reivindicaciones anteriores 17 a 18, en donde comprende además
ajustar la longitud de onda (A) y/o el ángulo de incidencia [0(2)], de la luz que ilumina el estándar (1) de calibración, de modo que el parámetro de fluorescencia medido corresponda a un valor deseado de decaimiento de la intensidad del campo evanescente
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