KR20090064917A - 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표면 플라즈몬 공명 효과를 이용하여 형광체가 부착된 생체 시료의 형광 신호를 극대화시켜 상기 생체 시료를 관찰할 수 있도록 하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광 현미경에 관한 것으로서, 특정 형광체의 흡수 파장과 일치하는 파장의 단색 광을 TM 모드로 제공하는 단색광 제공부와, 상기 단색광에 의해 표면 플라즈몬 공명이 여기되어, 플라즈몬 소산 장(evanescent field) 내에 존재하는 시료에 부착된 상기 특정 형광체의 형광 신호를 증폭하는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, 이하 SPR이라 함) 센서와, 상기 시료의 형상을 관찰할 수 있도록 상기 SPR 센서에서 증폭된 상기 형광 신호를 검출하는 제1 광 검출부를 포함하여 이루어진다.
표면 플라즈몬 공명, 형광현미경, 시료, 형광체,
Description
본 발명은 표면 플라즈몬 공명 효과를 이용하여 형광체가 부착된 생체 시료의 형광 신호를 극대화시켜 상기 생체 시료를 관찰할 수 있도록 하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광 현미경에 관한 것이다.
본 발명은 정보통신부 및 정보통신연구진흥원의 IT원천기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다[과제관리번호: 2006-S-007-02, 과제명: 유비쿼터스 건강 관리 모듈 시스템].
형광현미경(fluorescent microscope, 螢光顯微鏡)은, 형광체가 특정 파장의 빛을 흡수하면 형광을 발하는 원리를 이용하여, 시료에 형광 물질(형광색소)을 처리한 후, 상기 시료에 상기 형광 물질의 흡수 파장의 광을 조사하여, 상기 빛을 발하는 형광 물질을 통해 상기 시료를 관찰하는 장치를 말하는 것으로서, 생물학적 물질의 검사에 많이 이용된다.
도 1은 일반적인 형광현미경의 구성을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 1을 참조하여 설명하면, 기존의 형광현미경에서는, 제1 광필터(11)를 통하여, 백색광(10) 중에서 플레이트(16) 위에 놓인 시료(17)에 부착된 형광체의 흡수 파장과 일치하는 단색광을 선별하고, 상기 선별된 흡수 파장의 단색 광(10a)의 경로를 색선별 거울(dichroic mirror)(13)을 통해 조정하여, 대물렌즈(12)를 통해 시료(17)에 조사하고, 그리고 제2 광필터(14)를 통하여 상기 대물렌즈(12) 및 색선별 거울(13)을 통과한 상기 시료(17)의 형광체에 의해 발생한 광(10b)에서 상기 시료(17)의 형광체의 발색 파장과 일치하는 광을 선별하여 수광부(15)로 제공한다.
상기 수광부(15)는 접안 렌즈 또는 CCD와 같은 촬상소자로 구현되는 것으로서, 상기와 같이 입사되는 상기 시료(17)에 부착된 형광체의 발색 파장을 검출하여 보임으로써, 상기 시료(17)의 형상을 관찰할 수 있게 한다.
한편, 표면 플라즈몬 공명 센서는, TM(Transverse Magnetic) 모드로 편광된 광이 공명 조건을 만족하는 각도로 금속 박막에 입사하는 경우에 발생하는 표면 플라즈몬 공명(SPR:Surface Plasmon Resonance)을 이용한 센서이다.
상기 금속 박막에 입사하는 광원의 파수벡터(wavevector)와 표면 플라즈몬의 파수벡터(wavevector)가 서로 일치하게 되는 공명 조건에서는 입사되는 빛의 에너지가 거의 모두 표면 플라즈몬 모드로 흡수되기 때문에, 결과적으로 금속 표면에서 전반사되는 빛의 세기는 최소가 된다. 이때, 상기 금속 표면 위에 존재하는 유전 물질의 미세한 굴절률의 변화가 공명 조건을 변화시키게 되는데, 이러한 공명 조건의 변화를 측정함으로써 생화학적 상호 작용들을 정량 분석할 수 있다. 상기 표면 플라즈몬 공명 센서는 생체 분자의 상호 작용을 형광물질과 같은 표지자 없이 측정할 수 있는 대표적인 비표지 방식 바이오 센서로 알려져 있다.
이러한 표면 플라즈몬 공명 센서의 개략적인 구조를 도 2a 내지 도 2c를 참조하여 설명한다.
도 2a 내지 도 2c를 참조하면, 표면 플라즈몬 공명 센서는, 일반적으로 프리즘(21a,21b,21c)과, 평판형 투명 유전체 기판(22)과, 금속 박막(23)으로 이루어져, 광원(24a,24b,24c)에서 발생된 광을 편광기(25a,25b,25c)를 거쳐 TM 모드로 편광시킨 후 상기 프리즘(21a,21b,21c)을 거쳐 금속박막(23)으로 입사한 후, 상기 금속 박막(23)에서 반사되어 프리즘(21a,21b,21c)로 방출되는 반사광을 수광 소자(26a,26b,26c)에서 검출하도록 구현된다.
상기 프리즘(21)을 통해 입사된 광에 의해서 금속 박막(23)에서 표면 플라즈몬 공명이 발생하는데, 상기 표면 플라즈몬의 공명 조건 변화를 상기 수광 소자(26a,26b,26c)에서 검출된 반사광의 분석을 통해 검출함으로써, 상기 금속 박막(23)의 표면에 위치한 시료(20)에 의한 유효 굴절률 혹은 유효 두께의 변화를 측정한다.
더 구체적으로, 도 2a에 보인 SPR 바이오 센서는, 광원(24a)에서 발생한 단파장의 입사광을 편광기(25a)를 통해 TM 모드로 편광시켜 프리즘(21a)으로 입사시키는데 있어서, 구동부(미 도시)를 통해 상기 광원(24a)을 움직여 입사 각도를 변화시킴으로써, 금속 박막(23) 위에 존재하는 시료(20)의 유효굴절률 혹은 유효두께의 변화에 의한 SPR 각도의 변화를 측정한다.
그리고, 도 2b에 보인 SPR 바이오 센서는, 광원(24b)으로부터 발생된 단파장의 입사광의 입사 각도를 고정하되, 상기 입사광을 이차원 평면 형태로 확장하여 제공하고, 상기 수광 소자(26b)를 CCD와 같은 2차원 수광 소자로 구현함으로써, 금속 박막(23) 위의 각 점마다 나타나는 시료(20)로 인한 서로 다른 유효 굴절률 또는 유효 두께 변화를 상대적인 명암 차이로 표현한다. 이는 일반적으로 다채널 센서 시스템의 한 형태로 응용된다.
그리고 도 2c에 보인 SPR 바이오 센서는, 상기 광원(24c)으로부터 발생된 단파장의 입사광이 프리즘(21c)의 모든 표면에 대해 수직으로 입사할 수 있도록 렌즈(27)를 이용하여 입사광의 초점을 조절한 것으로서, 도 2a에서와 같이, 금속 박막(23) 위에 존재하는 시료(20)로 인한 유효 굴절률 혹은 유효 두께의 변화를 SPR 각도 변화로 측정한다.
상술한 기존의 SPR 바이오 센서는, 센서 표면에 단분자 막 (self-assembled monolayer, SAM)을 형성하거나 여타 생화학적인 처리를 쉽게 하기 위하여, 또한, 프리즘(21a,21b,21c)의 반복적인 사용을 위해서, 상기 금속 박막(23)을 프리즘(21a,21b,21c)의 반사면에 직접 형성하지 않고, 프리즘(21a,21b,21c)과 동일한 굴절률을 갖는 슬라이드 글래스(slide glass) 혹은 마이크로스코프 커버 슬립(microscope cover slip) 등의 평판 형 투명 유전체 기판(22) 위에 형성한 후, 상기 평판형 투명 유전체 기판(22)과 프리즘(21a,21b,21c)의 사이에 인덱스 매칭 오일을 도입한다.
그런데, 상기에서 설명한 기존의 형광현미경은, 색선별 거울(dichoric mirror)에 의해 투과 혹은 반사되는 시료에 부착된 형광체의 발색 파장 광과 흡수 파장 광의 광로가 동일하기 때문에, 광학적 잡음이 포함될 수 있는데, 이러한 광학적 잡음의 제거를 상기 발색 파장 또는 흡수 파장을 선별하는 광 필터의 성능에 주로 의지한다는 단점이 있다.
이를 개선하기 위해서는, 기본적으로 상기 시료로 인가되는 흡수 파장 광과, 발색 파장 광의 경로를 완전히 다르게 하여야 한다.
본 발명은 상기 요구를 해결하기 위한 것으로서, 형광체의 흡수 파장 광과 형광체의 발색 파장 광의 광로를 완전히 분리하여 신호대 잡음비를 개선한 표면 플라즈몬 공명을 형광 현미경을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명의 실시 형태에 의한 형광 현미경은, 특정 형광체의 흡수 파장과 일치하는 파장의 단색 광을 TM 모드로 제공하는 단색광 제공부; 상기 단색광에 의해 표면 플라즈몬 공명이 여기되어, 플라즈몬 소산 장 내에 존재하는 시료에 부착된 상기 특정 형광체의 형광 신호를 증폭하는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, 이하 SPR이라 함) 센서; 및 상기 시료의 형상을 관찰할 수 있도록 상기 SPR 센서에서 증폭된 상기 형광 신호를 검출하는 제1 광 검출부를 포함하여 구현된다.
본 발명의 다른 실시 형태에 의하면, 상기 형광현미경은, 상기 SPR 센서의 공명 조건을 관찰할 수 있도록 상기 SPR 센서에서 전반사되어 방출되는 상기 TM 모드의 단색광을 검출하는 제2 광 검출부를 더 포함하여 이루어진다.
상기 단색광 제공부는, 상기 TM 모드의 단색광을 상기 SPR 센서의 표면 플라즈몬의 공명 각도에 맞추어 제공하며, 광원; 상기 광원에서 발생한 광 중에서 상기 특정 형광체의 흡수 파장과 일치하는 파장의 단색 광만을 투과시키는 제1 광 필터; 및 상기 제1 광 필터를 투과한 상기 단색 광을 TM 모드로 변환하는 편광기를 포함하여 구현된다.
그리고, 상기 SPR 센서는, 평판형 투명 유전체 기판; 상기 평판형 투명 유전체 기판의 상부에 형성되어 표면 플라즈몬을 지지하는 금속 박막; 상기 평판형 투명 유전체 기판의 하부에 형성되어 상기 단색광 제공부으로부터 입사면으로 제공된 형광체의 흡수 파장과 일치하는 TM 모드의 단색 광을 상기 금속 박막으로 입사시켜 상기 표면 플라즈몬 공명을 여기시키고, 상기 금속 박막에서 반사된 상기 단색광을 방사면으로 방출하는 프리즘; 및 상기 금속 박막 위에 일정 두께로 형성되어, 시료에 부착된 형광체와 상기 금속 박막 사이의 최소 간격을 상기 두께로 유지시킴으로써 상기 형광체로부터 상기 금속 박막으로의 비 방사형 에너지 전달을 방지하는 스페이서를 포함하여 구현된다.
또한, 상기 제1 광 검출부는, 상기 SPR 센서의 상부에 위치하여, 상기 SPR 센서로부터 입사되는 광 중에서 상기 특정 형광체의 발색 파장에 일치하는 파장의 단색 광만을 투과하는 제2 광 필터; 및 상 기 제2 광 필터를 투과한 발색 파장 광을 수광하여, 그 형상을 관찰할 수 있도록 하는 수광부로 이루어진다.
상기와 같이 구성된 본 발명에 의한 형광현미경은, 표면 플라즈몬 공명 센서에서 유도되는 플라즈몬 소산 장을 이용하여 형광체의 형광 신호를 증폭시키고, 상기 형광체의 흡수 파장 광을 내부 전반사를 이용하여 관찰 지점으로부터 완전히 차단함으로써, 형광현미경에서의 신호대 잡음 비를 크게 개선할 수 있는 우수한 효과가 있다.
또한, 상술한 신호대 잡음 비의 개선을 통하여, 기존의 형광현미경에 비해 높은 감도와 작은 배경신호를 기대할 수 있으며, 특정한 형광체의 특성에 맞는 소형화된 형광현미경을 구성할 수 있는 우수한 효과가 있다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있는 바람직한 실시 예를 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시 예에 대한 동작 원리를 상세하게 설명함에 있어 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다.
또한, 도면 전체에 걸쳐 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 동일 한 도면 부호를 사용한다.
덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 '연결'되어 있다고 할 때, 이는 '직접적으로 연결'되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 '간접적으로 연결'되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 구성 요소를 '포함'한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라, 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 형광현미경의 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 형광 현미경은, 특정 형광체의 흡수 파장과 일치하는 파장의 단색 광(이하, 흡수 파장 광이라 함)을 TM 모드로 제공하는 단색광 제공부(31)와, 상기 단색광 제공부(31)에서 TM 모드로 제공된 흡수 파장 광에 의해 표면 플라즈몬 공명이 여기되며, 플라즈몬 소산 장내에 존재하는 상기 특정 형광체의 형광 신호를 증폭하는 SPR 센서(32)와, 상기 시료의 형상을 관찰할 수 있도록 상기 SPR 센서(32)에서 증폭된 상기 형광 신호를 검출하는 제1 광 검출부(33)를 포함하며, 상기에 더하여, 상기 SPR 센서(32)의 공명 조건을 관찰할 수 있도록 상기 SPR 센서(32)에서 전반사되는 상기 TM 모드의 흡수 파장 광을 검출하는 제2 광 검출부(34)를 더 포함할 수 있다.
더 구체적으로, 상기 단색광 제공부(31)는, 광원(311)과, 상기 광원(311)에서 발생한 광 중에서 상기 특정 형광체의 흡수 파장 광을 투과하는 제1 광 필 터(312)와, 상기 제1 광 필터(312)를 투과한 흡수 파장 광을 TM 모드로 변환하는 편광기(312)를 포함한다. 상기 광원(311)은, 예를 들어, 텅스텐-할로겐 램프(QTH lamp), 레이저, LED(Light-emitting diode)를 포함하는 단색 광원 혹은 백색의 광원으로 구현될 수 있다. 또한, 상기 광원(311)은 점 광원, 확장된 평행 광원, 쐐기 형 광원 등 여러 가지 형태의 광원이 이용될 수 있다.
더불어, 상기 단색광 제공부(31)는, 필요에 따라서 상기 TM 모드의 흡수 파장 광을 이차원의 확장된 평행 광으로 만드는 하나 이상의 렌즈(구면 렌즈 혹은 원통 렌즈)(도시 생략)를 상기 편광기(312)의 후단에 더 배치할 수 있다. 이 경우, 상기 흡수 파장 광은 이차원의 평행 광 형태로 상기 SPR 센서(32)에 입사된다.
이때, 상기 단색광 제공부(31)에서 SPR 센서(32)로 제공되는 흡수 파장 광의 입사 각도는 상기 SPR 센서(32)의 표면 플라즈몬 공명 각도로 고정된다.
따라서, 상기 단색광 제공부(31)로부터 공명 각도로 입사되는 흡수 파장 광에 의해서, SPR 센서(32)에 표면 플라즈몬 공명이 여기된다.
상기 SPR 센서(32)의 상세 구조를 살펴보면, 상기 SPR 센서(32)는, 프리즘(321)과, 평판형 투명 유전체 기판(322)과, 금속 박막(323)과, 스페이서(324)를 포함한다.
상기 프리즘(321)은 상기 단색광 제공부(31)로부터 공명 각도로 입사면을 통해 입사되는 흡수 파장 광을 상기 평판형 투명 유전체 기판(322)과 금속 박막(323)의 경계면으로 전달하고, 상기 경계면에서 전반사되는 흡수 파장 광을 방사면으로 방출하는 광학적 커플링 기능을 수행한다. 더 구체적으로, 상기 프리즘(321)은 삼 각 기둥 형상으로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 평판형 투명 유전체 기판(322)의 위에는 상기 금속 박막(323)이 형성되며, 그 하부에는 삼각기둥형상의 프리즘(321)이 일면이 접한다.
이때, 상기 프리즘(321)과 상기 평판형 투명 유전체 기판(322)은 인덱스 매칭 오일 등을 통해 결합되거나, 동일한 재료(예를 들어, 고 굴절율의 투명 플라스틱)로 일체로 형성될 수 있다. 상기 일체로 형성되는 경우에 대해서는 추후에 더 구체적으로 설명한다.
그리고, 상기 금속 박막(323)은 표면 플라즈몬을 지지하는 금속으로 이루어져, 공명 각도로 입사된 상기 단색 광에 의해 표면 플라즈몬 공명이 발생한다. 더 구체적으로, 상기 금속 박막(323)은, 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 알루미늄(Al) 등과 같이 외부 자극에 의해 전자의 방출이 쉽고 음의 유전상수를 갖는 금속을 수십 나노미터(nm)의 두께로 형성하여 이루어진다. 상기 금속 중에서, 가장 예리한 SPR 공명 피크를 보이는 은(Ag)과, 우수한 표면 안정성을 나타내는 금(Au)이 보편적으로 이용된다.
상기 스페이서(324)는, 상기 시료(30)에 부착되어 있는 형광체(303)와 상기 금속 박막(323)이 특정 거리(약 10 nm)보다 더 근접할 때 일어날 수 있는 상기 형광체(303)에서 금속 박막(323)으로의 비 방사형 에너지 전달(non-radiative energy transfer)을 막기 위한 것이다.
도 3은, 샌드위치 면역 측정법을 예시하여 나타낸 것으로서, 상기 시료(30)에는 관찰 대상인 항원(304)과 결합할 수 있음과 동시에 형광체(303)가 결합된 감 지항체(302)가 투여되고, 상기 SPR 센서(32)의 스페이서(324) 상부에는 상기 관찰 대상인 항원(304)와 결합할 수 있는 포집항체(301)가 고정화되어 있다. 따라서, 항체와 항원 간의 생체 반응에 의하여, 상기 스페이서(324)의 표면에는, 포집항체(301)-항원(304)-감지항체(302)-형광체(303)의 결합이 나타난다.
이러한 생체 반응에 있어서, 상기 스페이서(324)는 형광체(303)와 금속 박막(323)이 소정 거리 이내로 근접하지 못하도록 이격시키는 역할을 한다.
따라서, 상기 스페이서(324)는, 일정한 두께를 갖는 유전매질로 이루어져, 상기 형광체(303)와 상기 금속 박막(323) 사이에 최소한의 이격 거리를 제공한다. 이때, 상기 스페이서(324)의 두께는 상기 형광 신호의 비 방사형 에너지 전달을 막으면서, 상기 형광체(303)가 상기 금속 박막(323)을 기준으로 그 수직 방향으로 지수함수적으로 감소하는 플라즈몬 소산 장의 영향을 받아 형광 신호가 증폭될 수 있는 범위로 설정되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 스페이서(324)는, 주로 금속 박막(323)의 표면에 고정화되기 쉬우며, 공간적 배향성(surface orientation), 균일한 공간분포, 그리고 그 표면을 쉽게 관능화(functionalize)할 수 있는 구조를 가져야 한다. 예를 들면, 단분자 막(self-assembled monolayer, SAM), PEG(polyethylene glycol), 및 dextran이 사용될 수 있다.
그 다음으로, 상기 제1 광 검출부(33)는, 상기 SPR 센서(32)의 금속 박막(323)을 기준으로, 프리즘(321)이 형성된 방향과 반대 방향, 즉, 상기 SPR 센서(32)의 시료(30)가 놓이는 스페이서(324) 상부의 소정 높이에 형성되어, 상기 시 료(30)에 포함된, 상기 금속 박막(323)의 표면 플라즈몬 공명에 의해 증폭된 형광체(303)의 형광 신호를 검출한다. 이를 위하여, 상기 제1 광 검출부(33)는, 상기 시료(30)로부터 발생된 광 중에서 상기 형광체(303)의 발색 파장에 일치하는 파장의 단색 광(이하, 발색 파장 광이라 한다)을 투과하는 제2 광 필터(331)와, 상기 제2 광 필터(331)를 투과한 발색 파장 광을 수광하여, 그 형상을 관찰할 수 있도록 하는 수광부(332)를 포함하여 이루어진다. 형광현미경은 목적물의 형상이나 생체 반응 관찰을 목적으로 하므로, 상기 수광부(332)는 접안 렌즈 또는 2차원 수광 소자인 CCD 등으로 구현될 수 있다.
상기와 같이 구성되는 형광현미경의 동작을 시료(30)에 포함된 항원(304)을 샌드위치 면역측정법을 이용하여 관찰하고자 하는 경우를 예로 들어 설명한다.
상기 예에서, 상기 시료(30)에는 목적 분자인, 형광체(303)와 결합되어 있으면서 동시에 상기 목적 분자인 항원(304)과 결합하는 감지항체(302)가 투입되고, 상기 SPR 센서(32)의 스페이서(324)에는 상기 항원(304)와 특이 결합할 수 있는 포집항체(301)가 고정화되어, 생체 반응에 의하여, 스페이서(324)의 표면에 포집항체(301)-항원(304)-감지항체(302)-형광체(303) 순으로 결합된다.
상기 상태에서, 단색광 제공부(31)을 통해 상기 SPR 센서(32)의 프리즘(321)으로 상기 형광체(303)의 흡수 파장과 일치하는 파장을 갖는 TM 모드의 흡수 파장 광을 상기 금속 박막(323)에 공명 각도로 입사하면, 상기 금속 박막(323)의 표면에서, 표면 플라즈몬 공명이 나타나며, 이때의 플라즈몬 소산 장에 의해 상기 스페이 서(324)의 표면에 위치한 형광체(303)의 형광 신호, 즉 발색 파장 광이 증폭되고, 상기 증폭된 발색 파장 광은 그 상부에 위치한 제1 광검출부(33)에서 검출된다.
이때, 표면 플라즈몬 공명이 나타나는 상기 금속 박막(323)을 기준으로 볼때, 상기 흡수 파장 광은 금속 박막(323)의 하부에서 전반사되고, 상기 발색 파장 광은 금속 박막(323)의 상부에서 발생한다. 따라서, 상기 흡수 파장 광과 발색 파장 광의 경로는 완전하게 분리되며, 이에 상기 제1 광 검출부(33)에서 검출된 형광 신호에 대한 배경 신호를 감소시켜, 신호대 잡음 비를 개선할 수 있다.
상기에서, 형광체(303)에 대한 형광 신호의 증폭은, 상기 표면 플라즈몬 공명 파장이 상기 형광체(303)의 흡수 파장과 일치함에 의해 이루어지며, 플라즈몬 공명이 최대가 되면 상기 형광 신호의 증폭도 최대의 효과를 얻을 수 있다. 이때, 플라즈몬 공명이 최대가 되는 공명 각도는 동일한 파장 조건하에서 상기 금속 박막(323) 위의 유전체의 굴절률에 비례하므로, 측정 대상에 따라서 측정 범위 및 감도가 달라질 수 있다.
이때, 상기 스페이서(324)에 의해서 상기 형광체(303)와 금속 박막(323) 간의 거리가 조절되어, 형광체(303)의 금속 박막(323)에 대한 이차적인 에너지 전달을 막고, 그 결과 상기 증폭된 형광 신호를 유지할 수 있다.
또한, 상기 형광현미경은, 제2 광 검출부(34)를 통하여, 상기 SPR 센서(321)에서 전반사되는 흡수 파장 광을 수광하여, 상기 SPR 센서(321)에서의 플라즈몬 공명 각도의 변화를 검출하여, 상기 형광현미경의 제어에 이용할 수 있다.
도 4는 통상적으로 생체 분자의 표지에 자주 사용되는 형광체의 흡수 및 발색 스펙트럼을 나타낸 그래프로서, 특히 Alexa 647, Invitrogen 의 흡수 스펙트럼(41)과 발색 스펙트럼(42)를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 상기 흡수 스펙트럼(41)과 발색 스펙트럼(42)는 일부 중첩되므로, 제2 광 검출부(34)에서 광 필터를 통해 발색 파장 광만을 선별하더라도 일부 흡수 파장 광이 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명과 같이, 흡수 파장 광과 발색 파장 광을 경로가 완전히 분리되는 경우, 흡수 파장 광에 의한 영향은 완전히 제거할 수 있게 된다.
이상과 같이, 본 발명에 의한 형광 현미경은, 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하여 형광체의 형광 신호를 증폭시키는 것으로서, 이를 위해 이용되는 SPR 센서(32)로는 다양한 형태의 SPR 센서가 이용될 수 있다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명에 의한 형광현미경에 적용될 수 있는 SPR 센서의 다른 실시 예를 나타낸 도면이다. 이를 참조하여, 상기 형광현미경에 이용되는 SPR 센서에 대해서 더 구체적으로 설명한다.
먼저, 도 5a를 참조하면, 본 발명의 형광현미경에 구비되는 SPR 센서(40)는, 프리즘(42)이 하부 면에 일체로 형성된 센서 기판(41)과, 상기 센서 기판(42)의 프리즘(42)의 수직 방향에 위치한 상부 면에 형성되어 표면 플라즈몬을 지지하는 금속 박막(43)과, 상기 금속 박막(43) 위에 고정화되어 형광체로부터 금속 박막(43)으로의 이차적인 에너지 전달이 일어나지 않도록 상기 금속 박막(43)과 형광체와의 거리를 조절하는 스페이서(44)를 포함하여 이루어질 수 있다.
또한, 도 5b를 참조하면, 본 발명의 형광현미경에 구비되는 SPR 센서(50)는, 프리즘(52)이 하부면에 일체로 형성된 평판형의 투명한 센서 기판(51)과, 상기 프리즘(52)에서 수직방향 상부에 위치한 상기 센서 기판(51)의 상부면에 형성되어 표면 플라즈몬을 지지하는 금속 박막(53)과, 상기 금속 박막(53) 위에 고정화되어 형광체로부터 금속 박막(43)으로의 이차적인 에너지 전달이 일어나지 않도록 상기 금속 박막(53)과 형광체와의 거리를 조절하는 스페이서(54)와, 상기 스페이서(54)의 상부에 상기 금속 박막(54)의 표면 플라즈몬 공명에 의해 반사광이 최소가 되는 흡수 밴드에 직교 방향으로 형성되며 전부 또는 일부가 서로 다른 유전물질로 이루어지는 하나 이상의 채널(55)을 포함한다.
즉, 상기 센서 기판(41,51)은, 도 3에 보인 프리즘(321)과 평판형 투명 유전체 기판(322)가 동일한 재질로 일체로 형성된 것으로서, 이때, 상기 센서 기판(41,51)의 소재로는 Polystylene(PS), Polymethyl methacrylate(PMMA), Polycarbonate(PC), Cyclic olefin copolymer(COC)를 포함하는 고 굴절률을 갖는 투명한 광학 폴리머가 이용될 수 있다. 또한 상기 센서 기판(41,51)은 사출 성형(injection molding) 등과 같은 방법을 통하여 제조될 수 있다. 상기와 같은 센서 기판(41,51)을 구비함으로써, 프리즘(321)과 평판형 투명 유전체 기판(322) 사이에 인덱스 매칭 오일을 일일이 수작업으로 도입할 필요가 없어지고, 따라서 사용상의 편의를 높일 수 있게 된다.
상기 금속 박막(43,53)은 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 알루미늄(Al) 등과 같 이 외부 자극에 의해 전자의 방출이 쉽고 음의 유전상수를 갖는 금속을 수십 나노미터(nm)의 두께로 형성한 것으로서, 상기 금속 중에서, 가장 예리한 SPR 공명 피크를 보이는 은(Ag)과, 우수한 표면 안정성을 나타내는 금(Au)이 보편적으로 이용된다.
그리고 상기 프리즘(42,52)은 입사 광을 상기 금속 박막(43,53)으로 조사하여 표면 플라즈몬 공명을 여기시키고, 상기 금속 박막(43,53)에서 반사된 광을 방출하는 것으로서, 삼각 기둥 형상으로 이루어진다.
더 구체적으로, 상기 센서 기판(41,51)은 사용상의 편의를 위하여 보편적으로 이용되는 검출용 스틱과 동일한 형상 및 크기로 형성할 수 있으며, 예를 들면, 직사각형 형상으로 구현한다. 즉, 소정 두께의 직사각형 형상의 센서 기판(41,51)의 일측 하부 면에 프리즘(42,52)이 일체로 형성되어 있고, 상기 프리즘(42,52)의 수직 방향 상부에 위치한 센서기판(41,51) 상부 면에 금속 박막(43,53)이 형성된다.
그리고, 상기 스페이서(44,54)는, 관찰하고자 하는 목적 물질의 표지 물질인 형광체와 상기 금속 박막(43,53)이 특정 거리(약 10 nm)보다 더 근접할 때 일어날 수 있는 금속 박막(43,53)으로의 형광 신호의 비 방사형 에너지 전달(non-radiative energy transfer)을 막기 위하여, 상기 형광체와 금속 박막(43,53) 사이에 최소한의 이격 거리를 제공한다. 상기 스페이서(44,54)의 두께는 상기 형광 신호의 비 방사형 에너지 전달을 막으면서, 상기 형광체의 형광 신호가 상기 금속 박막(43,53)을 기준으로 그 수직 방향으로 지수함수적으로 감소하는 플라즈몬 소산 장의 영향을 받아 증폭되는 범위로 설정되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 스페이서(44,54)는, 금속 박막(43,53)의 표면에 고정화되기 쉬우며, 공간적 배향성(surface orientation), 균일한 공간분포, 그리고 그 표면을 쉽게 관능화(functionalize)할 수 있도록, 단분자 막(self-assembled monolayer, SAM), PEG(polyethylene glycol), 및 dextran으로 구현된다.
상기 구성에 의하면, 도 5a에 보인 SPR 센서(40)는, 상기 스페이서(44)의 표면에 목적 물질과 특이 결합하는 생체 분자를 고정화시킨 후, 그 위에 목적 물질과 결합하는 형광체가 부착된 시료를 투입하면, 상기 시료의 목적 물질과, 상기 스페이서(44)에 고정화된 생체분자가 결합된다.
상기 상태에서, 상기 SPR 센서(40)를 도 3과 같은 구조의 형광현미경 내의 검사 위치에 놓고, 상기 형광체의 흡수 파장 광을 TM 모드로 인가하면, 상기 SPR 센서(40)서 표면 플라즈몬 공명이 발생함에 의해, 상기 플라즈몬 소산 장내에 위치한 상기 형광체의 형광 신호가 증폭됨으로써, 제1 광검출부(33)를 통하여, 상기 SPR 센서(40)의 스페이서 표면에 결합된 상기 형광체를 부착한 목적물질을 관찰할 수 있게 된다.
더하여, 도 5b에 보인 SPR 센서(50)는, 상기 스페이서(54) 위에 형성된 하나 이상의 채널(55)을 더 포함하고 있는 것으로서, 이때, 상기 하나 이상의 채널(55)은, 각 채널의 일부 혹은 전부가 서로 다른 굴절률을 갖는 유전물질(즉, 서로 다른 목적 분자와 특이 결합하는 생체 분자)로 이루어지는 것으로서, 상기 하나 이상의 채널(53) 각각에 서로 다른 목적 물질이 결합될 수 있다. 따라서, 상기 도 5b에 보 인 SPR 센서(50)를 이용하는 경우, 서로 다른 목적 물질을 동시에 관찰할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시 예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경할 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게 있어 명백할 것이다.
도 1은 기존의 형광 현미경의 구조를 나타낸 모식도,
도 2a 내지 도 2c는 일반적인 표면 플라즈몬 공명(SPR) 센서의 구조를 나타낸 모식도,
도 3은 본 발명의 일 실시 형태에 따른 형광 현미경의 구조를 보인 모식도,
도 4는 통상적으로 생체 분자의 표지에 자주 사용되는 형광체의 흡수 및 발색 스펙트럼을 나타낸 그래프, 그리고
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 형광현미경에 이용되는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 센서의 다른 예시도이다.
Claims (16)
- 특정 형광체의 흡수 파장과 일치하는 파장의 단색 광을 TM 모드로 제공하는 단색광 제공부;상기 단색광에 의해 표면 플라즈몬 공명이 여기되어, 플라즈몬 소산 장 내에 존재하는 시료에 부착된 상기 특정 형광체의 형광 신호를 증폭하는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, 이하 SPR이라 함) 센서; 및상기 시료의 형상을 관찰할 수 있도록 상기 SPR 센서에서 증폭된 상기 형광 신호를 검출하는 제1 광 검출부를 포함하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제1항에 있어서,상기 단색광 제공부는, 상기 TM 모드의 단색광을 상기 SPR 센서의 표면 플라즈몬의 공명 각도에 맞추어 제공하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제1항에 있어서,상기 SPR 센서의 공명 조건을 관찰할 수 있도록 상기 SPR 센서에서 전반사되어 방출되는 상기 TM 모드의 단색광을 검출하는 제2 광 검출부를 더 포함하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제1항에 있어서, 상기 단색광 제공부는,광원;상기 광원에서 발생한 광 중에서 상기 특정 형광체의 흡수 파장과 일치하는 파장의 단색 광만을 투과시키는 제1 광 필터; 및상기 제1 광 필터를 투과한 상기 단색 광을 TM 모드로 변환하는 편광기를 포함하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광 현미경.
- 제1항에 있어서, 상기 SPR 센서는,평판형 투명 유전체 기판;상기 평판형 투명 유전체 기판의 상부에 형성되어 표면 플라즈몬을 지지하는 금속 박막;상기 평판형 투명 유전체 기판의 하부에 형성되어 상기 단색광 제공부으로부터 입사면으로 제공된 형광체의 흡수 파장과 일치하는 TM 모드의 단색 광을 상기 금속 박막으로 입사시켜 상기 표면 플라즈몬 공명을 여기시키고, 상기 금속 박막에서 반사된 상기 단색광을 방사면으로 방출하는 프리즘; 및상기 금속 박막 위에 일정 두께로 형성되어, 시료에 부착된 형광체와 상기 금속 박막 사이의 최소 간격을 상기 두께로 유지시킴으로써 상기 형광체로부터 상기 금속 박막으로의 비 방사형 에너지 전달을 방지하는 스페이서를 포함하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 광 검출부는,상기 SPR 센서의 상부에 위치하여, 상기 SPR 센서로부터 입사되는 광 중에서 상기 특정 형광체의 발색 파장에 일치하는 파장의 단색 광만을 투과하는 제2 광 필터; 및상기 제2 광 필터를 투과한 발색 파장 광을 수광하여, 그 형상을 관찰할 수 있도록 하는 수광부로 이루어지는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제4항에 있어서, 상기 광원은,텅스텐-할로겐 램프(QTH lamp), 레이저, LED(Light-emintting diode)를 포함하는 단색 광원 혹은 백색의 광원으로 구현되는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광 현미경.
- 제4항에 있어서, 상기 단색광 제공부는,상기 편광기의 후단에 구비되어, 상기 TM 모드의 단색 광을 이차원의 확장된 평행 광으로 만드는 하나 이상의 렌즈를 더 포함하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제5항에 있어서, 상기 SPR 센서는상기 스페이서의 상부에 형성되며, 일부 또는 전부가 서로 다른 목적 물질과 결합되는 서로 다른 유전 물질로 이루어진 하나 이상의 채널을 더 포함하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광 현미경.
- 제5항에 있어서, 상기 프리즘은삼각 기둥 형상으로 이루어진 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광 현미경.
- 제5항에 있어서,상기 프리즘과 상기 평판형 투명 유전체 기판은 동일한 소재로 일체로 형성되는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제5항에 있어서, 상기 금속 박막은금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 알루미늄(Al) 을 포함하는, 외부 자극에 의해 전자의 방출이 쉽고 음의 유전상수를 갖는 금속 그룹 중에서 하나로 이루어지는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제5항에 있어서, 상기 스페이서는상기 금속 박막의 표면에 고정화되기 쉬우며, 공간적 배향성, 균일한 공간분포, 그리고 그 표면을 쉽게 관능화(functionalize)할 수 있는 물질로 이루어지는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제6항에 있어서,상기 수광부는 접안 렌즈 또는 2차원 수광 소자인 CCD로 구현되는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제11항에 있어서,상기 프리즘과 상기 평판형 투명 유전체 기판은 Polystylene(PS), Polymethyl methacrylate(PMMA), Polycarbonate(PC), Cyclic olefin copolymer(COC)를 포함하는 고 굴절률을 갖는 투명한 광학 폴리머로 구현되는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
- 제13항에 있어서, 상기 스페이서는단분자 막(self-assembled monolayer, SAM), PEG(polyethylene glycol), 및 dextran 중에서 하나로 구현되는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 형광현미경.
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