CN111413138B - 基于双重图像的生物成像装置和技术 - Google Patents

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Abstract

公开了用于检测样品中的生物分析物的方法、系统和装置。可以使用所公开技术通过使来自成角度的窄光束照明器的散射光成像来获得样品中分析物浓度的读数。可以将含有一种或多种生物、有机和无机分析物的流体样品转移到带有具有尺寸的一个或多个通道的微流体装置以产生毛细作用以进行样品输送，所述分析物包含蛋白、病毒、细菌、噬菌体、毒素、肽、DNA、RNA、激素、化学品、药物和同位素。所述微流体装置的几何形状可以包含储层和感测区域，其中对于窄光束扫描可以发生免疫测定反应。可以用特异性结合成份来涂布测试粒子，所述特异性结合成份用以结合样品中分析物上的结合对成份。测试粒子形成所述结合，且可以扫描粒子/分析物共轭物。

Description

基于双重图像的生物成像装置和技术
相关申请的交叉引用
此专利文件要求2015年12月23日提交的名为“荧光自由生物成像(FLUORESCENT-FREE BIOIMAGING)”的美国临时申请第62/387,575号的优先权和权益。之前提及的专利申请的全部内容以引用的方式并入以作为此文件的公开内容的一部分。
技术领域
此专利文件涉及使用荧光自由成像和生物感测技术的系统、装置和方法。
背景技术
呈流体中粒子形式的生物物质的成像在医药和生物应用中至关重要。用于此类应用的各种成像装置使用经特殊设计的成像系统来与微流体平台介接。
发明内容
公开设备、系统、方法和计算机可读媒体。在一些实例实施例中，一种生物成像设备可以包含微流体固持器，所述微流体固持器固持微流体装置以携载待测量的流体。所述设备可以进一步包含：光学不透明板，其形成在所述微流体固持器的第一侧上且被结构化成包含允许光穿过的一个或多个狭缝；和/或照明光源结构，其用以按预定角度朝向所述光学不透明板产生照明光以穿过一个或多个狭缝，以作为进入所述微流体装置以照明所述流体的定向照明光束。荧光材料可以邻近于所述光学不透明板放置在待由所述照明光照明以产生荧光的部位处，所述荧光穿过所述一个或多个狭缝进入所述微流体装置以照明所述流体。图像捕捉板可以放置在所述微流体固持器的第二侧上且被结构化成阻挡以所述预定角度传输穿过所述微流体装置的所述照明光，且包含允许传输以下的成像光圈：由通过所述照明光照明所述流体造成的从所述流体散射的光的一部分；和穿过所述流体的所述荧光的一部分，所述流体在通过所述荧光照明时投影由穿过所述成像光圈的所述流体中的粒子产生的阴影。
在另一方面中，公开一种方法，所述方法包含通过入射光源穿过一个或多个狭缝以预定角度照明目标，其中所述一个或多个狭缝将事件限为窄光束。所述方法可以进一步包含通过所述入射光源照明自发荧光层以产生自发荧光光源。所述方法还可包含通过成像器使从所述目标散射的光的第一部分成像，其中散射光的所述第一部分是通过所述目标散射的所述入射光源，其中所述成像器经定位成捕捉散射光的所述第一部分且经定位成捕捉经过所述目标的所述自发荧光光源的第二部分，其中所述目标根据通过所述目标阻挡的自发荧光光源而在所述成像器上产生阴影，且其中所述预定角度致使未经所述目标散射的入射光源从所述成像器阻挡。
在其它实例实施例中，一种生物成像装置可以包含被配置成发射入射光的光源和双重视觉成像场。所述双重视觉成像场可以包含：被制作成形成一个或多个狭缝的光束窄化结构，其含有至少一个衬底层；和自发荧光层，其安置在所述至少一个衬底层的表面上和/或覆盖所述一个或多个狭缝。所述光束窄化结构可以被配置成通过使穿过所述一个或多个狭缝的所述入射光倾斜而由所述光源发射的所述入射光产生光的窄光束。所述生物成像装置可以进一步包含微流体装置，所述微流体装置包含用于接纳包含目标粒子的样品流体的通道，每一通道包含由光的所述窄光束照明以照明所述样品流体中的所述目标粒子，从而产生从所述目标粒子散射的光的成像区。
所述生物成像装置可以包含以下特征中的任一个或呈任何可行组合的形式。所述至少一个衬底层上的所述一个或多个狭缝被布置成偏离另一衬底层上的一个或多个狭缝中心，从而使所述入射光倾斜。所述产生的散射光可以表示所述目标粒子的散射光图像。所述目标粒子的所述散射光图像可以包含暗场散射图像。所述自发荧光层可以被配置成从穿过所述一个或多个狭缝的所述入射光吸收预定波长以产生自发荧光，和/或可以通过所述自发荧光照明每一通道中的亮场成像区，从而照明所述成像区中的所述目标粒子。所述目标粒子的透射图像可以包含亮场透射图像。所述一个或多个狭缝的宽度范围可为2微米到20微米，或5微米到40微米，或1微米到5微米，或3微米到4微米，或3微米到10微米。所述光源可以被配置成以一角度引入所述入射光，从而产生成角度的窄光束。所述光源可以包含发光二极管。所述一个或多个狭缝中的两个之间的水平距离可以产生所述窄光束的预定宽度。所述自发荧光层可以包含光致抗蚀剂聚合物。所述自发荧光层可以被安置成在一个或多个狭缝之上形成一形状以变更所述入射光的路径。所述自发荧光层的所述形状可以包含微角锥形形状。所述自发荧光层的所述形状可以包含微半角锥形形状。所述自发荧光层可以被塑形成将所述入射光转换成窄光束，所述窄光束照明所述目标粒子中的至少一个以产生指示所述照明粒子的暗场图像的散射光。所述自发荧光层可以被配置成从所述入射光产生荧光，其中所述荧光照明所述成像区中的至少一个其它目标粒子以产生指示亮场图像的荧光透射光。所述目标粒子的透射光图像可以包含亮场透射图像。所述微流体装置可以包含毛细驱动微流体装置。所述微流体装置的大小可以被设置成十微米到几百微米。所述微流体装置可以包含多个层。所述微流体装置的所述多个层可以包含：顶部层，其包含至少一个样品引入入口和至少一个出口；中间层，其包含所述微流体通道；和底部层，其包含使得所述目标粒子能够经历特异性结合反应的储层图案。所述微流体装置的所述通道可以被安置成彼此平行且垂直地下伏于相应狭缝以实现多路检测。每一微流体通道可以装载有结合成份涂布粒子以用于多样品检测。
在另一方面中，存在一种移动生物成像系统。所述生物成像系统可以包含：生物成像装置，其包含被配置成发射入射光的光源和双重视觉成像场。所述双重视觉成像场可以包含：被各自制作成形成一个或多个狭缝的光束窄化结构，其含有至少一个衬底层；和自发荧光层，其安置在所述至少一个衬底层的表面上和/或覆盖所述一个或多个狭缝。所述光束窄化结构可以被配置成通过使穿过所述一个或多个狭缝的所述入射光倾斜而由所述光源发射的所述入射光产生光的窄光束。所述移动生物成像系统可以进一步包含微流体装置，所述微流体装置包含用于接纳包含目标粒子的样品流体的通道，每一通道包含由光的所述窄光束照明以照明所述样品流体中的所述目标粒子，从而产生从所述目标粒子散射的光的成像区；和/或成像器，其被配置成捕捉所述散射光并基于所述捕捉的散射光而产生散射光图像。
所述生物成像系统可以包含以下特征中的任一个或呈任何可行组合的形式。所述图像可以包含互补金属氧化物半导体(CMOS)成像器。所述CMOS成像器可以包含移动装置。所述移动装置可以包含智能电话。所述生物成像系统可以进一步包含安置在所述生物成像装置与所述成像器之间的外部透镜。所述生物成像装置可以被配置成指示亮场透射图像和暗场散射图像的光信号，且其中所述图像被配置成捕捉所述光信号以在所述成像器上相同视场内观测所述亮场透射图像和所述暗场散射图像。所述微流体装置可以包含毛细驱动微流体装置。所述微流体装置的大小可以被设置成10微米到几百微米。所述微流体装置可以包含多个层。所述多个层可以包含：顶部层，其包含至少一个样品引入入口和至少一个出口；中间层，其包含所述微流体通道；和/或底部层，其包含使得所述目标粒子能够经历特异性结合反应的储层图案。所述微流体装置的所述通道可以被安置成彼此平行且垂直地下伏于相应狭缝以同时实现多路检测。每一微流体通道可以装载有结合成份涂布粒子以用于多样品检测。
附图说明
图1A说明根据一些实例实施例的用以产生倾斜的窄光束光源以进行粒子检测的狭缝的实例；
图1B说明根据一些实例实施例的用以产生倾斜的窄光束光源和自发荧光以进行粒子检测的夹心狭缝的实例；
图1C说明根据一些实例实施例的用以产生倾斜的窄光束光源和自发荧光以进行粒子检测的夹心狭缝的另一实例；
图1D说明根据一些实例实施例的用以产生倾斜的窄光束光源和自发荧光以进行粒子检测的倾斜狭缝结构的另一实例；
图2A说明根据一些实例实施例的角锥形结构的实例；
图2B说明根据一些实例实施例的半角锥形结构的实例；
图3说明根据一些实例实施例的包含角锥形阵列的结构的实例；
图4A说明根据一些实例实施例的针对抗原的阳性测试中的实例反应；
图4B说明根据一些实例实施例的针对窄光束扫描的实例免疫分析；
图5说明根据一些实例实施例的用于多路检测的毛细驱动微流体装置的实例；
图6说明根据一些实例实施例的凝集测试的实例；
图7说明根据一些实例实施例的实例凝集测试；
图8说明根据一些实例实施例的夹心免疫分析测试的实例；且
图9说明根据一些实例实施例的设备的实例。
在可能的情况下，相同参考编号係指相同或相似的结构。
具体实施方式
此处公开的成像技术使用双重成像途径来捕捉样品的两个不同图像，以改进成像的可靠性和性能。在所公开的双重成像途径的各种应用中，可以使用装置中的现存成像传感器(例如智能电话的移动装置的摄像机中的CMOS传感器)来实施成像感测模块，而无需使用仅专用于生物成像应用的经特殊设计的成像感测模块。
包含智能电话、平板计算机等等的移动电子器件配备有各种传感器、无线连接性和处理能力。这些装置允许用户执行与工作和娱乐相关的数种不同操作和任务。在过去的几年中，已集中研究开发高级的基于智能电话的装置和应用，所述装置和应用提供具成本效益的移动保健以克服时间和地点的约束。移动装置提供对远程、资源受限、私有和公共设置实施移动保健的有效方式。用移动装置提供的信息进行诊断的实时结果可以存储在安全的云服务器上，且可由远程部位的医生存取。此提供经由远程医疗进行及时处理。即使智能电话的特征已明显改进包含较复杂的传感器，但生物检测仍然不可用。
生物检测仍然不可用的一个原因在于：传感器，尤其智能电话上的CMOS摄像机，不足够敏感以使用基于荧光的方法而从那个传统生物分析免疫分析产生具有足够质量的信号。窄光束技术可充分利用珠粒与介质之间的折射率差来产生可检测散射光以用于成像器，例如互补金属氧化物半导体(CMOS)成像器或任何其它类型的成像器。在不使用昂贵荧光分子和复杂样品制备方案的情况下，窄光束扫描可提供实时检测、在基于智能电话的平台上实施的单步反应方案。
可以使用所公开技术的实施方案的实例来提供用于同时在CMOS成像器上形成双重视觉成像场的技术、系统和装置，CMOS成像器用于定量地感测流体样品中分析物的存在。可以实施所公开技术而不需要基于荧光的成像技术。所公开的双重视觉成像技术可以适应在CMOS成像器的动态范围内的亮场和暗场图像。可以实施所公开技术通过将结合成份涂布粒子与结合对成份结合来检测生物、有机和无机分析物，例如细菌、病原体和/或其毒素、蛋白、噬菌体、病毒、肽、DNA、RNA、激素、化学品、药物、同位素或其它生物分子。结合成份指代例如抗体的分子，所述分子通过与目标分析物上的位点结合而产生信号，所述目标分析物意谓结合对成份。
在一个方面中，所公开技术可以各种方式实施以引入倾斜光束，以在极短持续时间内通过将结合成份共轭到分析物的结合对成份而检测具有高灵敏度和高特定性的分析物。
在另一方面中，所公开技术可以各种方式实施以在移动装置的CMOS成像器上产生双重视觉成像。
在又一方面中，所公开技术可以实施以将用以简化易于使用生物分析物检测的毛细驱动微流体用作芯片实验室装置。
所公开技术可提供一种系统，其引入倾斜窄光束以用于通过针对分析物的结合对成份利用结合成份的结合化学作用而有效地检测(例如，移动装置上)CMOS成像器上的分析物。举例来说，例如细菌的分析物含有至少一个结合对成份，其可与固定在粒子表面山上的诸如抗体的结合成份结合。生化反应提供多功能免疫分析。所公开技术可以准许广泛范围的免疫分析的方式实施，免疫分析例如竞争性均质免疫分析、竞争性异质免疫分析、单位点非竞争性免疫分析、两位点非竞争性免疫分析，和欲为有效且低成本定量检测的包夹非竞争性免疫分析。
实施例中的一个是转换定性免疫凝集途径以进行快速细菌级分类。当细菌的结合对成份与粒子的抗体之间发生结合化学作用时，多于一个粒子将捕捉用以形成粒子凝集的相同细菌，其中粒子凝集程度取决于样品中细菌的浓度。可以使用所公开技术通过收集粒子凝集的散射光来检测细菌的存在，散射光与细菌的结合成份和结合对成份结合，细菌的存在被记录在暗场成像条带中。为了观测粒子凝集的特征，所公开技术使用相同的CMOS成像器来描绘亮场成像条带中的总体凝集轮廓。为了克服强度差的数量级超出CMOS成像器的动态范围，所公开技术开发用以保持亮场透射图像和暗场散射图像的强度和对比度的技术，亮场透射图像和暗场散射图像被记录在相同CMOS成像器的两个管理体制中。
在一些实施方案中，使用具有狭缝的集成式微角锥形来获得粒子凝集的暗场大角度散射图像，所述狭缝用以产生割穿流动粒子凝集的窄光束的等效物。通过由白色LED灯的UV组分激发的材料的自发荧光、同时阻挡初级光束到达CMOS成像器，可以产生亮场透射图像。整体装置建构和操作起来极其简单，其由LED灯、至少一个经图案化狭缝和低成本放大率透镜以及在移动装置中找到的商用CMOS摄像机前面的光圈组成。
在穿过窄狭缝之后，LED灯形成穿过在下面流动的样品的窄光束扫描。取决于免疫分析的格式，结合成份涂布粒子可以在微通道内在流体样品中流动(免疫凝聚格式)，或与整个滑动微通道衬底一起移动(常规的免疫测定夹心格式)。行进穿过粒子/分析物共轭物的初级倾斜窄光束无法到达CMOS传感器，且在一些实例实施例中，仅仅由粒子/分析物共轭物以特定角度散射的光的一小部分可以到达CMOS传感器且形成由窄光束照明的单元的部分的暗场散射图像。在整体粒子/分析物共轭物穿过窄光束感测区域之后，可以记录全部粒子/分析物共轭物的散射图像。因为大角度散射可由物体的折射率和大小的对比度控管的米氏散射(Mie scattering)支配，所以粒子对散射图像作用最大，从而提供高灵敏度以进行分析物检测。根据由窄光束询问的暗场散射图案，可以将累积和/或微分散射强度用作对具有高对比度和空间分辨率的分析物的浓度的指示符。在预设时间延迟之后，所公开技术还可在与暗场散射图像隔一段距离的部位中产生相同粒子/分析物共轭物的亮场透射图像。获取亮场透射图像(其描绘沿循暗场散射图像的粒子/分析物共轭物)实现对真阳性检测的实时验证(无论来自粒子/分析物共轭物还是来自尘粒)。举例来说，在流体样品中，可能存在可以在暗场散射条带中产生相似散射强度或图案的残渣或尘粒。这些非想要杂质可能在数十到数百微米范围内。额外亮场透射场可直接地描绘这些杂质的形状，使得能够执行图像调谐方法。在此替代侦错方法的情况下，所公开技术可以特定方式实施，所述方式减少或最小化错误事件以达到高准确度。双重视觉成像使得能够记录在相同视场下的多个区域处从粒子/分析物共轭物散射的光，从而允许进行多路检测。
可以使用所公开技术通过提供以下各者来检测分析物：能够使光束倾斜和窄化以同时在相同CMOS成像器上形成双重视觉图像的技术；能够以受控制流动速率驱动流体分析物样本以实现分析物的结合对成份与固定在粒子表面上的结合成份之间的结合化学作用的毛细驱动微流体装置，其中至少一个结合对成份能够与抗体结合以形成结合复合物，且所述粒子/分析物共轭物的形成会产生信号，且免疫分析方法包括由于结合复合物反应而产生的数个特定粒子与分析物结合，其中通过分析物的浓度来确定通过所公开技术检测的暗场散射图像强度。
由于移动装置(例如还包含传感器、无线连接性和处理能力的智能电话)的流行度，移动平台上的保健应用合乎需要。举例来说，可以将存在于几乎所有移动装置中的CMOS成像器用于移动保健应用，这是因为通过将结合成份与结合对成份结合来检测分析物(例如，通过抗体检测例如抗原的细菌，或通过另一抗体检测血液中的抗体；或将化学毒素与其抗原决定基结合)揭示了大量健康和疾病信息。所公开技术提供高品质检测技术，其产生不需要复杂荧光标记设备和知识的移动平台。基于荧光的细胞仪和/或表面等离子共振(SPR)系统可以检测和读出台式平台或移动平台(例如床边和家用诊断设置中的智能电话)上的信号。所公开技术使用移动装置中的现存CMOS成像器而无需并入有复杂的流体控制装置、激光器、光电倍增管(PMT)检测器以及流式细胞仪需要的光学件，也不需要大功率显微镜以及用于基于图像的细胞仪的相关联光源和检测装置。通过消除这些复杂装置，移动装置的用户不需要专业化知识和技能或用以对样品染色或标注的辅助装置。在不染色的情况下，来自基于图像的细胞仪的图像可能缺乏用于病理学和组织学分析的对比度。使用移动装置中的CMOS成像器的所公开技术提供创新途径，以将倾斜的入射光束用作光源并收集散射光以供检测分析物，从而产生与移动装置中的CMOS成像器充分兼容的高品质检测结果。
可以使用所公开技术通过使窄光束倾斜用成像散射光来获得样品中分析物浓度的定量和定性读数。流体样品悬浮液可以含有一种或多种分析物，例如病毒、细菌、噬菌体、毒素、蛋白、肽、DNA、RNA、激素、化学品、药物和同位素，且可被转移到具有恰当尺寸的一个或多个通道的微流体装置，以产生毛细作用以进行样品输送。微流体装置的几何形状可被设计成包含用于进行免疫分析的反应室和感测区域，在所述感测区域中，允许测试粒子与反应室中的分析物反应。在一些实例实施例中，用特异性结合成份中的一个或多个来涂布测试粒子的表面，所述特异性结合成份用以结合样品中的分析物的结合对成份。一旦样品中例如蛋白、病毒、化学品和细菌的分析物进入储层区，一种或多种测试粒子就会与分析物形成共轭物。取决于所应用的免疫分析的格式，倾斜的入射窄光束将产生从粒子/分析物共轭物散射的光，接着成像到CMOS成像器上。在使用所公开技术的情况下，可同时在毛细驱动微流体装置上测量样品中一种或多种生物分析物浓度而不使用常规的荧光标注技术。
在所公开技术中，分析物的特异性结合对成份可与涂布在粒子表面上的结合成份(例如，抗体)相互作用。受体-配体相互作用可以形成粒子/分析物共轭物并产生散射信号。散射光可以成像在暗场条带中且进一步在CMOS成像器上的亮场透射成像区中进行检验。
在一些实例实施例中，所公开的主题使得具有有限动态范围的可用光强度的成像器能够捕捉从目标粒子散射的光和目标粒子的阴影，所述阴影通过目标粒子阻挡来自自发荧光源的光而产生。举例来说，可瞄准入射光使得入射光的直接路径不会到达成像器，但散射离开一个位置中的目标粒子的光会被成像器接收到。在一些实例实施例中，到达成像器的散射光的强度可以比直接照明的强度低。入射光可以进一步穿过自发荧光层，其使得产生自发荧光。自发荧光可以照明目标粒子的第二位置处的目标粒子，其中目标粒子可以归因于在目标粒子处于第二位置时所述粒子阻挡自发荧光而在成像器上产生阴影。
图1A到3展示倾斜的窄光束设备的实例实施例，所述设备具有在CMOS成像器上的粒子的双重视觉暗场散射图像和亮场透射图像。
图1A描绘所公开技术的实例实施例，其使用具有若干微米的狭缝通过以下操作而产生窄光束：使入射光倾斜，或在引入入射光源之前将例如透镜的光学组件放置在狭缝顶部上，或倾斜和透镜的组合。举例来说，狭缝的宽度可介于10微米与200微米之间。还可使用其它狭缝宽度。图1展示例示性夹层结构，其包含两狭缝层100和102，以及位于狭缝层100与102之间的自发荧光材料103。狭缝层100和102在本文中也可被称作衬底层。从光源104倾斜或成角度的光的一部分可以穿过狭缝层100和102以照明粒子105。光104可以θ之角度120入射在狭缝层100和102上。照明粒子105可以使入射光104中的一些散射以产生从粒子105散射的光106。散射光106可由例如智能电话的便携式装置中包含的成像器108接收到。成像器108可以是CMOS成像装置或任何其它类型的成像装置。在一些实例实施例中，可在成像器108之上使用小孔107以形成暗场散射图像。在与图1A和1B一致的一些实例实施例中，自发荧光材料103可以吸收一个或多个波长下的光104的一部分，且可以发荧光以产生另一光源109。在预定时间帧内，粒子105可以到达在由荧光109照明下的亮场透射成像区。还可通过用于暗场散射成像中的成像器108来检测亮场图像的形成。
在一个方面中，可以通过使用剥离方法在狭缝层100和102上形成经图案化金属膜来制作狭缝100A和102A。狭缝100A和102A的尺寸可介于大致10微米与200微米宽之间，所述狭缝是使用微影方法而制作，微影方法使用光致抗蚀剂作为模具以转印来自掩模的经设计图案。在一些实施方案中，例如狭缝100A和102A的狭缝的宽度可介于2微米与20微米之间，介于5微米与100微米之间，介于75微米与150微米之间，介于100微米与200微米之间，介于10微米与200微米之间，和/或介于3微米与10微米之间。微通道基础狭缝层102的尺寸和几何形状可被设计成使得可在预定时间内照明具有预定范围的大小的粒子105。入射光104可以预定角度120引入以形成倾斜的窄光束。举例来说，预定角度可介于20度与60度之间。还可使用其它角度。光源可以是不相关的，例如来自LED的可以穿过狭缝100A和102A而不造成绕射的光。自发荧光材料103可介于狭缝层100与102之间。可通过将光致抗蚀剂聚合物旋涂到衬底上来涂覆自发荧光材料103，接着用光或热量进行固化。狭缝100A和102A可偏移距离125以调整光束宽度和/或适应角度120以及狭缝100A和102A。在一些实例实施例中，窄光束的光束宽度可介于几微米与4微米之间，介于1微米与6微米之间，介于5微米与20微米之间，介于10微米与50微米之间，介于30微米与80微米之间，介于50微米与100微米之间，和/或介于1微米与100微米之间。
在与图1C一致的实施例中，可通过使用剥离方法在狭缝层100和102上形成经图案化金属膜来制作狭缝100A和102A。微通道基础狭缝层102的尺寸和几何形状可被设计成使得可在预定时间内照明具有预定范围的大小的粒子105。入射光104可以预定角度120引入以形成倾斜的窄光束。角度120可介于20度与60度之间，介于10度与30度之间，介于40度与70度之间，和/或介于50度与80度之间。光源可以是不相关的，例如来自LED的可以穿过狭缝100A和102A而不造成绕射的光。自发荧光材料103可介于狭缝层100与102之间。可通过将光致抗蚀剂聚合物旋涂到衬底上来涂覆自发荧光材料103，接着用光或热量进行固化。狭缝100A和102A可偏移距离125以调整光束宽度和/或适应角度120以及狭缝100A和102A。在一些实施例中，窄光束的光束宽度可介于3微米与4微米之间，介于1微米与6微米之间，介于5微米与20微米之间，介于10微米与50微米之间，介于30微米与80微米之间，介于50微米与100微米之间，和/或介于1微米与100微米之间。从光源104倾斜或成角度的光的一部分可以穿过狭缝层100和102以照明粒子105。照明粒子105可以使入射光104中的一些散射以产生从粒子105散射的光106。散射光106可由例如智能电话的便携式装置中包含的成像器108接收到。成像器108可以是CMOS成像装置或任何其它类型的成像装置。自发荧光材料103将形成用于透射成像的另一光源109。在预设延迟内，相同的粒子105将流动到位置111，在位置111处，自发荧光109将照明粒子105且在成像器108上接收到的亮场透射条带内形成图像112。在一些实例实施例中，图像112可以包含粒子105的阴影。举例来说，位置111中之粒子105可以阻挡光109，借此将粒子105的阴影投射在成像器108上。
根据一些实例实施例，图1A描绘通过粒子105散射的入射光104(且不展示来自层103的自发荧光)。图1B描绘照射在粒子105上的自发荧光109(且不展示散射光)。图1C同时描绘在适当位置以产生从入射光104散射的光106时的粒子105，且在位置111处待由自发荧光109照明时的粒子105。在一些实例实施例中，当粒子105在位置111中时，粒子105可以归因于由在位置111中的粒子105阻挡的自发荧光109而在成像器108上产生阴影。
在与图1D一致的实施例中，狭缝层110可以倾斜角度130以产生光104。倾斜的狭缝层110可以阻挡除了以大致垂直于角度130的角度进入的光以外的入射光。在单个狭缝层102的情况下，狭缝110的宽度和倾斜角130可以确定入射在粒子105上的窄光束宽度。在一些实例实施例中，倾斜的狭缝层110可非常接近于自发荧光材料103以避免可以扩宽窄光束的宽度的绕射。在一些实例实施例中，窄光束的光束宽度可介于3微米与4微米之间，介于1微米与6微米之间，介于5微米与20微米之间，介于10微米与50微米之间，介于30微米与80微米之间，介于50微米与100微米之间，和/或介于1微米与100微米之间。
图2A和2B展示根据一些实例实施例的例示性微角锥形201。微角锥形201可以包含形成在狭缝层203和狭缝210上的光致抗蚀剂。微角锥形201可以通过折射改变穿过狭缝210的入射光202的路径。举例来说，微角锥形201中的光致抗蚀剂可以经由与透镜相似的折射而变更入射光的路径。微角锥形201可以包含自发荧光材料，所述自发荧光材料发荧光以产生次级光源205，次级光源205用以照明例如粒子206的粒子。可以在狭缝的平面外方向上将入射光202引入到衬底203中。在一些实例实施例中，微角锥形201可以将光202聚焦到光束宽度为3到4微米、1到6微米、5到20微米、10到50微米、30到80微米、50到100微米和/或1到100微米的窄光束中。散射光204可以形成粒子的暗场图像以用于生物分析物检测。来自透镜材料的自发荧光或微角锥形201的次级光源205在成像器207的不同区中形成粒子206的亮场图像。两个相关图像，暗场大角度散射图像和亮场透射图像，可以使得影像处理算法能够消除因尘粒或残渣所致的假阳性信号，借此改进检测灵敏度和准确度。所公开技术在同一屏幕上提供两个相关图像，而不管亮场透射图像通常比大角度散射光亮5到6个数量级的事实。在无所公开技术的情况下，这两个相关图像，暗场大角度散射图像和亮场透射图像，无法形成在同一成像器上。在一些实例实施例中，图2B中的半角锥形220可以基于微角锥形220的几何形状而以预定角度引导入射光208。
在实例实施例中，图3中的外部透镜301可以放置在成像器302前面以形成图像。微角锥形303的阵列可以使狭缝层304与多个狭缝304A叠加。可以通过微角锥形303的阵列使入射光305偏转，且一个或多个粒子可以使通过成像器302上的透镜301聚焦的光散射。
免疫测定结合组分
所公开技术提供一种用于检测分析物的结合成份特有的结合对成份的检测方式，分析物的结合成份特有的结合对成份欲与结合机构互动使得结合复合物会形成以连接粒子和分析物，从而产生散射光以用于检测。当特异性结合反应引起有效交互和可检测的粒子/分析物共轭物时，如图4A和4B中所展示，可以在所公开的系统中分析分析物的任何结合对成份。举例来说，可以在免疫分析中使用多克隆抗体来检测抗原。抗体涂布的粒子(其可用于广泛多种材料，包含陶瓷、玻璃、聚合物和金属)可以作出响应以形成粒子凝集，包含通过固定在粒子上的抗体与分析物的抗原之间的特定反应调节的粒子的体外凝集。为了增强灵敏度并扩展当量点，将抗体固定在粒子表面上。当引入含有目标分析物的流体样品时，在粒子表面上的抗体与分析物表面上的抗原结合时，粒子凝集可以进行。经由特异性抗体/抗原免疫化学，粒子凝集可以提供一种进行快速和特异性生物分析物检测的简单无害方法。通过例如粒度均一性和固定在粒子上的抗体的质量的因素来确定检测的灵敏度、特异性和效率。
图4A说明根据一些实例实施例的在针对抗原的阳性测试中的实例反应；当用特异性结合成份涂布粒子以与分析物的结合对成份结合时，粒子凝集因为结合对成份的存在而发展。粒子上的结合成份不会辨识那些非特异性结合对成份，因此除非目标受体存在，否则不会展示凝集效应。
图4B说明用于窄光束扫描的例示性竞争性免疫分析。为了进行特异性生物分析物检测，将相同分析物固定在衬底上。用特异性结合成份涂布测试粒子以与分析物的结合对成份结合。根据一些实例实施例，当存在高含量的未知分析物时，将在衬底上捕捉到较少测试粒子，从而产生在窄光束扫描下收集的较少累积散射光。
在另一方面中，可以应用特定碳水化合物序列以检测生物分析物和其分泌的毒素组。举例来说，在允许细菌定居于环境表面或细胞上以供宿主细胞感染的大多数大肠杆菌(E.coli)菌株上找到1型菌毛。存在于肠内菌科表面上的1型菌毛可通过将分析物的化学作用与碳水化合物结合而负责如所展示的甘露糖和甘露糖苷结合活性。举例来说，甘露糖可以使用自组装甘露糖单层(SAM)制作来检测大肠杆菌。在所公开技术中，碳水化合物(例如，甘露糖)可共轭到二氧化硅粒子以产生多价碳水化合物部分，其用以放大响应信号。当引入分析物时，分析物的膜表面上的蛋白可以与碳水化合物分子(例如，甘露糖)结合。借此，可以形成大肠杆菌甘露糖复合物以用于分析物检测。
毛细驱动微流体
在考虑便携性和易用性的情况下，所公开技术提供毛细驱动微流体装置以对移动电子器件执行快速分析物检测。在图5中，尺寸小于几百微米的微流体装置可以包含多个层。虽然不限于图5中展示的层，但仅作为实例，图5展示三个层，其包含：(1)顶部层501，其包含至少一个样品引入入口和至少一个出口；(2)中间层502，其包含微流体通道；以及(3)底部层503，其包含可供进行配体-受体反应的储层图案。当在入口处分配含有分析物的样品时，毛细效应将液体驱动到微流体通道中。分析物上的结合对成份可以与粒子表面上的抗体反应并将粒子带到下游通道以用于感测。取决于分析物浓度含量，凝集程度可以变化，且散射光信号的强度可以指示生物分析物浓度。所公开的微流体装置设计使得能够准确地控制流体输送。
在一些实例实施例中，所公开的微流体装置可以与前述双重视觉成像系统集成在样品引入层501的顶部上。当将流体输送通过微流体通道时，将通过所公开的成像技术来询问微流体通道层502内的分析物。在另一实施例中，所公开的微流体装置设计可以与前述双重视觉成像系统集成在底部层503的底部上。举例来说，图2A中的微角锥形201和层203可以定位在顶部层501上方，且成像器207可以放置在底部层503下方。当将流体输送通过微流体通道时，将通过所公开的成像技术来询问微流体通道层502内的分析物。
在一些实施方案中，可以使用大肠杆菌O157:H7抗体涂布试剂盒(例如，哈迪诊断设备(Hardy Diagnostics))来示范对分析物的检测。图6展示分配在垫上以用于阳性和阴性测试的一滴灭活的大肠杆菌O157:H7抗原悬浮液。图6展示例示性凝集测试，其指示当存在大肠杆菌O157:H7时，将发生粒子凝集效应。与此对比，粒子凝集不会在非大肠杆菌O157悬浮液中发生。展示凝集图案差的实例和标准曲线以用于分析。在引入灭活的大肠杆菌O157:H7抗原试剂之后，展示90秒内测试垫上的粒子凝集。在光学显微镜下，抗体涂布粒子与大肠杆菌O157:H7抗原反应以在阳性测试中形成凝集。相比而言，未进行抗体涂布的粒子不会展示凝集的迹象以作为阴性对照。在微通道中用双重视觉成像系统来检验两个样品。由于大量粒子凝集，所以来自阳性样品的粒子凝集的图像在暗场区中展示为明亮区域。与此对比，归因于粒子凝集的不存在，阴性对照样品展示均一的无特征场。可以在同一成像器上同一视场内同时观测到亮场透射图像和暗场散射图像。亮场图像展示阳性样品的清晰对比度和阴性样品的无特征条带，此与在常规光学显微镜下的观测一致。此外，阳性样品比阴性样品展示暗场散射图像中更强的光点图案。在粒子凝集的此类独特特征的情况下，所公开技术可以产生检测目标分析物的明确结果。所公开技术可以进一步量化大肠杆菌O157:H7细胞。通过辨识凝集图案差和累积散射强度，高含量的抗原将具有较大的凝集和较低的累积散射强度；与其相反，抗体涂布珠粒在低含量抗原条件下具有更少机会与抗原结合以形成凝集，因此在窄光束扫描下，每一珠粒有助于散射光在暗场成像条带上产生高累积散射强度。图6中大肠杆菌O157:H7的标准曲线清楚地指示检测极限可以达到1到10个大肠杆菌细胞，其对区分大肠杆菌O157:H7的感染性剂量(>10个细胞)灵敏。
在一些实施例中，可以实施所公开技术以检测蛋白含量，从而使用窄光束扫描显微镜和免疫凝集方法来示范其它酶或蛋白检测的可行性。基质金属蛋白酶-8(MMP8)参与牙周炎疾病的发病机理并在梗塞演变以及心脏重塑中发挥重要作用。0.6μm的聚苯乙烯珠粒作为MMP8抗体载体以避免由于MMP8的较小大小而产生位阻。图7展示实例凝集测试，其指示当基质金属蛋白酶-8(MMP-8)存在时，粒子凝集程度将基于目前MMP-8的含量而改变。如所展示，当增大MMP8蛋白含量时，散射光强度会显著改变，其指示检测极限(LOD)可以在宽检测动态范围内达到20ng。可以通过抗体与蛋白的比率来调谐标准曲线，以得到线性Heidelberger-Kendall曲线下的大部分敏感区域。
在一些实施方案中，通过窄光束扫描平台应用夹心免疫分析。将C-反应蛋白(CRP)(其为人体内炎症的生物标记)的单克隆抗体固定到衬底上，接着使CRP抗原和抗体涂布粒子流动。当样品中的未知CRP含量较高时，将通过用窄光束进行扫描而在衬底上观测到更多所得的捕捉粒子。图8展示可被区分的CRP的LOD为50ng。图8展示例示性夹心免疫分析测试，其指示越高含量的C-反应蛋白(CRP)存在于样品中，将在窄光束扫描下观测到越多散射光点。
在一些实施方案中，平行毛细驱动微流体通道可以垂直地下伏于形成倾斜光束的狭缝，以同时实现多路检测。每一微流体通道可以装载有相同或不同的配体涂布粒子，以供使用相同成像器进行多样品检测。
与一些实例实施例一致，图9描绘将例如智能电话的移动装置上的CMOS成像器用作成像装置以用于基于本文中所公开的双重成像途径进行生物成像的实例。提供适配器以将基于图1A到3的生物成像系统机械地啮合到智能电话901(例如，iPhone，苹果公司)，且光学地啮合到智能电话901的CMOS成像传感器以执行双重成像操作，从而捕捉暗场散射光图像和亮场荧光图像。在所说明实例中，智能电话9-901可配备有CMOS成像器，CMOS成像器可用以实施双重视觉成像，例如前述暗场成像和亮场成像。适配器包含用以啮合到其中定位有智能电话摄像机的智能电话901的部分的机械啮合单元。提供软件狗902，其包含光源903(例如，LED)、固持器狭槽904和透镜905(例如，20X塑胶透镜)，以使微流体样品成像到智能电话901中的CMOS成像传感器上。当将智能电话901放置到软件狗902中时，光轴906将与智能电话901上的CMOS成像器自对准。为了执行检测，用户可以将具有光束窄化结构和适用的免疫测定试验的微流体装置907放置到样品滑件908上。在引入流体样品之后，将样品滑件插入到固持器狭槽904中。光源903可以通过光束窄化结构照明以产生双重视觉成像条带。在智能电话901处执行的可执行指令可以产生对由CMOS成像器接收到的图像的记录。在一些实例实施例中，可以执行影像处理以确定经散射入射光和/或阴影的大小和/或形状。可以使用图9中展示的适配器设计来连接除了智能电话以外的装置中的现存成像传感器，从而执行所公开的生物成像。此类其它装置的实例包含具有摄像机模块的平板计算机。
虽然本专利文件含有许多具体细节，但这些不应当解释成对任何发明的范围或可要求的内容的限制，而是作为对于特定发明的特定实施例可能特有的特征的描述。本专利文件中在单独实施例的上下文中描述的某些特征也可在单个实施例中组合地实施。相反，在单个实施例的上下文中描述的各种特征也可单独地在多个实施例中实施或以任何适合子组合来实施。此外，尽管上文可将特征描述为以某些组合起作用且甚至最初如此要求，但在一些状况下，可将来自所要求的组合的一或多个特征从组合中删除，并且所要求的组合可针对子组合或子组合的变化。
类似地，虽然在附图中按特定次序描绘操作，但此不应被理解为要求按所展示的特定次序或按循序次序执行此类操作，或执行所有所说明的操作，以实现所要结果。此外，此专利文件中描述的实施例中的各种系统组件的分离不应理解为在所有实施例中都要求此分离。
仅描述几个实施方案和实例，且可基于本专利文件中描述和说明的内容而作出其它实施方案、增强和变化。

Claims (4)

1.一种生物成像方法，包括：
通过入射光源穿过一个或多个狭缝以预定角度照明目标，其中所述一个或多个狭缝将入射限制为窄光束；
通过所述入射光源照明自发荧光层以产生自发荧光光源；以及
通过成像器使从所述目标散射的光的第一部分成像，其中散射光的所述第一部分是通过所述目标散射的所述入射光源，其中所述成像器被定位成捕捉散射光的所述第一部分且被定位成捕捉经过所述目标的所述自发荧光光源的第二部分，其中所述目标根据通过所述目标阻挡的自发荧光光源而在所述成像器上产生阴影，且其中所述预定角度致使未经所述目标散射的入射光源被阻挡而不会到达所述成像器。
2.根据权利要求1所述的生物成像方法，其中所述目标包含微流体装置，所述微流体装置包含用于接纳包含目标粒子的样品流体的一个或多个通道，其中每一通道包含用以产生从目标粒子散射的光的所述样品流体中的成像区，其中所述目标粒子通过所述入射光照明。
3.根据权利要求1所述的生物成像方法，其中所述成像器包含于智能电话中。
4.根据权利要求1所述的生物成像方法，其中所述一个或多个狭缝之间的水平距离产生所述窄光束的预定宽度。
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