JP6738070B2 - 光学的検出装置及び光学的検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、液体中に存在する標的物質等を、増強電場を用いた局所領域における光信号を利用して、光学的に検出する光学的検出装置及び光学的検出方法に関する。

近年、溶液中に存在する微小物質、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細菌等の生体関連物質に標識として蛍光物質を結合させて、センサーチップ表面での増強電場を用いて標識による発光を励起して、前記生体関連物質を検出・定量する方法が開発されている。また、細胞内の組織を蛍光染色して、染色された特定の部位を、センサーチップ表面での増強電場を用いて蛍光観察する方法が開発されている。これらの方法で用いられる増強電場を発生させる手法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が良く知られている。

ＳＰＲでは、クレッチマン配置と呼ばれる光学配置を用いて、プリズムに接したガラス表面の金薄膜と液体試料との界面での入射光の全反射によって、金薄膜上にＳＰＲを励起し、金薄膜表面に増強電場を形成することを特徴とする。ＳＰＲ励起増強蛍光分光法は、ＳＰＲによって金薄膜表面近傍において増強された光を励起光として、増強電場内に存在する蛍光分子を励起して、強い蛍光を生じさせ、バックグラウンド光が少ない蛍光観察を行う技術である（特許文献１参照）。

ＳＰＲと同様に、センサーチップ表面での増強電場を形成できる機構として導波モード（光導波モード、導波路モード、光導波路モード等とも呼ばれる。）の励起機構が良く知られている。（特許文献２〜５、及び非特許文献１〜６参照）。

従来の導波モード励起機構の構成例を図１３に示す。図１３はクレッチマン配置を用いた導波モード励起機構である。該機構では、光透過性基板９（板ガラスなど）と、その上に形成した金属層又は半導体層１０と、さらにその上に形成した光透過性誘電体層１１とからなる検出板４を用いる。検出板４の光透過性誘電体層１１が形成されている面（試料５との界面）と反対側の面に、屈折率調節オイルや光学用接着剤を介して光学プリズムを密着させ、第１の光照射部１から白色光やレーザ光を、プリズム３を通して検出板４に照射する。入射光は検出板に対して全反射条件で入射される。ある特定の入射角において、ある特定波長の入射光が検出板上の層構造内を伝搬する導波モードと結合し、導波モードが励起される。導波モードが励起されると、検出板表面において、前記特定波長の光の電場が増強され、増強電場が形成される。増強電場が形成されている光の波長は、分光器を用いて反射光の強度が減衰している波長を計測することで確認することができる。

検出板において、光透過性基板上に金属層が形成されている検出板において励起される導波モードは、しばしば、リーキーモード、または漏洩モード等と呼ばれる（非特許文献７参照）。また、検出板において、光透過性基板上に形成する半導体層には、シリコンやゲルマニウムまたはその混合材料を用いることが有効であることが知られている。光透過性誘電体層は、１つの誘電体材料で構成しても良いが、複数の誘電体材料を層状に重ねて形成すると、より高い電場強度の増強電場が形成可能であることが報告されている。（非特許文献８〜９参照）。

ＳＰＲの励起には、Ｐ偏光しか用いることができないが、導波モードの励起には、Ｐ偏光、Ｓ偏光の双方が使用可能である。導波モードの励起によって増強電場が得られる光の波長は、検出板の基板の屈折率、各層の複素屈折率及び厚さ、並びに入射光の入射角及び入射光の偏光方向によって決定される。導波モードは、これらの条件によっては、一度に複数の波長帯域で励起される。例えば、基板に厚さ０．７５ｍｍのシリカガラスを用い、半導体層として厚さ２００ｎｍのシリコン層を用い、光透過性誘電体層として、厚さ３００ｎｍのＳｉＯ_２ガラス層を用い、シリカガラスプリズムを介して検出板表面への入射角６７度でＳ偏光の白色光を照射すると、可視光領域において、図１４に示すように、波長５１３ｎｍ、５８８ｎｍ、７３６ｎｍに電場強度ピークを持つ３つの導波モードが励起される。

また、基板に溝を設けて、溝の底面、あるいは側面に傾斜面の角度が異なる検出領域を形成して、個々の傾斜面上でそれぞれ異なる物質を光学的に検出する装置が報告されている（特許文献６〜７参照）。

国際公開２０１５／１９４６６３公報 国際公開２００７／０２９４１４公報 特開２００９−０８５７１４公報 国際公開２０１０／０８７０８８公報 国際公開２０１２／０９８７５８公報 特開２０１０−１４５４０８公報 国際公開２０１３／０１１８３１公報

Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ １６，ｐｐ．２９−３９（１９９１年） Ｋ．Ｈ．Ａ．Ｌａｕ，Ｌ．Ｓ．Ｔａｎ，Ｋ．Ｔａｍａｄａ，Ｍ．Ｓ．Ｓａｎｄｅｒ，ａｎｄ Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０８，ｐｐ．１０８１２（２００４年） Ｍ．Ｆｕｊｉｍａｋｉ，Ｃ．Ｒｏｃｋｓｔｕｈｌ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ａｗａｚｕ，Ｊ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｙ．Ｋｏｇａｎｅｚａｗａ，Ｙ．Ｏｈｋｉ，ａｎｄ Ｔ．Ｋｏｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ １６，ｐｐ．６４０８−６４１６（２００８年） Ｍ．Ｆｕｊｉｍａｋｉ，Ｃ．Ｒｏｃｋｓｔｕｈｌ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ａｗａｚｕ，Ｊ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｎ．Ｆｕｋｕｄａ，Ｙ．Ｋｏｇａｎｅｚａｗａ，ａｎｄ Ｙ．Ｏｈｋｉ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，ｐｐ．０９５５０３−１−０９５５０３−７（２００８年） Ｍ．Ｆｕｊｉｍａｋｉ，Ｋ．Ｎｏｍｕｒａ，Ｋ．Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｋａｔｏ，Ｓ．Ｃ．Ｂ．Ｇｏｐｉｎａｔｈ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ａｗａｚｕ，ａｎｄＹ．Ｏｈｋｉ，Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ １８，ｐｐ．１５７３２−１５７４０（２０１０年） Ｍ．Ｆｕｊｉｍａｋｉ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｋａｔｏ，Ｋ．Ａｗａｚｕ，ａｎｄＹ．Ｏｈｋｉ，Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２３，ｐｐ．１０９２５−１０９３７（２０１５年） Ｒ．Ｐ．Ｐｏｄｇｏｒｓｅｋ，Ｈ．Ｆｒａｎｋｅ，Ｊ．Ｗｏｏｄｓ，ａｎｄ Ｓ．Ｍｏｒｒｉｌｌ，Ｓｅｎｓｏｒ．Ａｃｔｕａｔ．Ｂ５１ ｐｐ．１４６−１５１（１９９８年） Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ８， ０２２２０１ （２０１５） Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０８， ０５１０１ （２０１６）

増強電場を表面プラズモン共鳴によって形成する手法では、増強電場が得られる光の波長が、表面プラズモン共鳴を発生させるための金属層の金属材料によって制限されてしまう、という問題がある。増強電場を導波モードによって形成する手法では、増強電場が得られる光の波長は、検出板の基板の屈折率、各層の複素屈折率及び厚さ、並びに入射光の入射角及び入射光の偏光方向（以下、波長設定パラメータともいう。）によって任意に設定することができる。しかし、波長設定パラメータが一旦決められてしまうと、図１４に示したように特定の複数波長で同時に増強電場を形成することは可能であるが、これらの波長は、決定された波長設定パラメータによって一意的に決まってしまい、任意の２つ以上の波長で増強電場を得ることはできない。このように、従来の増強電場を用いた増強蛍光観察系では、２つ以上の任意の波長での励起による蛍光観察が困難であるという問題点があった。

その結果、増強電場を励起光に用いて蛍光観察を行う方法では、任意に設定可能な励起波長は一つまでという制約があり、生物学等で用いられる複数の異なる蛍光色素を用い、複数の異なる励起波長を用いて蛍光観測を行う多重染色と呼ばれる手法に対応できない、という課題があった。

従来の増強電場を用いて標的物質を検出する方法では、検出板上に標的物質を吸着または近接させて検出を行う。このため、検出板表面に非特異的に吸着した蛍光色素や検出板表面に非特異的に吸着した夾雑物に吸着した蛍光色素と、標的物質に吸着した蛍光色素とを区別することができず、ノイズが大きくなってしまうという問題があった。

本発明は、これらの問題を解決しようとするものであり、本発明は、増強電場を励起光に用いて試料の蛍光観察等を行う際に、任意の２つ以上の波長における増強電場を得ることができる光学的検出装置及び光学的検出方法を提供することを目的とする。また、本発明は、増強電場を用いて標的物質を光学的に検出するに際して、標識や夾雑物の非特異吸着によるノイズの影響を排除し、より高感度に、標的物質の検出が可能となる光学的検出装置及び光学的検出方法を提供することを目的とする。

本発明は、前記目的を達成するために、以下の特徴を有するものである。

（１）１つ以上の光照射部と、裏面から表面に向けて、光透過性基板、金属層又は半導体層、光透過性誘電体層の順で積層された積層構造を備える検出板と、前記検出板の裏面側に光学的に密着され、かつ光入射面のうちの少なくとも２つが、前記光入射面と前記検出板の表面とのなす角度である入射面角度がそれぞれ異なる複数の光入射面を有するプリズムと、前記検出板の前記表面上に標的物質を含む試料を保持可能な試料保持部と、前記検出板の前記表面側に配され、前記試料の検出領域からの光信号を検出する光検出部とを備え、前記光照射部からの光が、前記検出板の表面に対して固定された一の角度で、前記プリズムの前記複数の光入射面に入射し、前記プリズムを介した光が、前記検出板の裏面側から、前記検出板において全反射条件を満たす条件で照射されるように配置され、前記光検出部により前記光信号を検出することを特徴とする光学的検出装置。
（２）前記光照射部からの光が、前記検出板の表面に平行に、前記プリズムの前記複数の光入射面に入射することを特徴とする前記（１）記載の光学的検出装置。
（３）前記１つ以上の光照射部から照射される光が、前記プリズムの少なくとも２つの前記光入射面から入射することを特徴とする前記（１）または（２）記載の光学的検出装置。
（４）前記プリズムの少なくとも２つの前記光入射面から入射した前記１つ以上の光照射部から照射される光が、前記検出板の表面上の同一の検出領域を照明することを特徴とする前記（１）から（３）までのいずれか１項に記載の光学的検出装置。
（５）前記プリズムは、少なくとも２つの底角が異なる、三角形または台形プリズムであることを特徴とする前記（１）から（４）までのいずれか１項に記載の光学的検出装置。
（６）前記プリズムは、少なくとも２つの異なる底角を持つ多角錐プリズムまたは多角錐台プリズムであることを特徴とする前記（１）から（４）までのいずれか１項に記載の光学的検出装置。
（７）１つの光照射部からの光がプリズムの複数の光入射面に入射可能となるように、前記光照射部に対して前記プリズムの光入射面を相対的に回転可能とする回転機構を備えることを特徴とする前記（１）から（６）までのいずれか１項に記載の光学的検出装置。
（８）前記光透過性誘電体層は、１種類以上の誘電体材料の積層からなることを特徴とする前記（１）記載の光学的検出装置。
（９）裏面から表面に向けて、光透過性基板、金属層又は半導体層、光透過性誘電体層の順で積層された積層構造を備える検出板の裏面側に光学的に密着され、かつ光入射面のうちの少なくとも２つが、前記光入射面と前記検出板の表面とのなす角度である入射面角度がそれぞれ異なる複数の光入射面を有するプリズムを用い、光を、前記検出板の表面に対して固定された一の角度で、前記プリズムの複数の光入射面に入射し、尚且つ、前記光が前記プリズムを介して、前記検出板の裏面側から、前記検出板において全反射条件を満たす条件で照射し、検出板表面の一の検出領域における試料から、前記入射面角度の異なるそれぞれの前記光入射面に依存した異なる波長特性を持つ増強電場を用いて、光信号を検出することを特徴とする光学的検出方法。
（１０）前記光信号の内の少なくとも１つは、標的物質が発する光信号であることを特徴とする前記（９）記載の光学的検出方法。
（１１）前記光信号の内の少なくとも１つは、標的物質に結合した標識が発する光信号であることを特徴とする前記（９）記載の光学的検出方法。

本発明の光学的検出装置によれば、任意の２つ以上の波長における増強電場を得ることができる。波長特性の異なる増強電場を用いて標的物質を観測することにより、より鮮明、より迅速、かつより正確な光学的検出を実現することができる。また、本発明によれば、任意の２つ以上の波長における増強電場を得ることができるので、生物学等で用いられる複数の異なる蛍光色素を用い、複数の異なる励起波長を用いて蛍光観測を行う多重染色法に、非常に適する。さらには、本発明によれば、任意の２つ以上の波長における増強電場を用いて、標的物質を光学的に検出するに際して標識や夾雑物の非特異吸着によるノイズの影響を排除し、より高感度に、標的物質の検出ができる。

本発明では、光入射面と検出板の表面とのなす角度である入射面角度が異なる角度となる底角の組み合わせを持つプリズムを用いることにより、各光入射面から光を入射したとき、検出板表面にある同一の検出領域に、複数波長の増強電場を励起可能である。

本発明では、プリズムの底角の組み合わせを適切に選択することにより、同一の検出領域に励起される増強電場の波長を任意の組み合わせに設計可能である。

また、光照射部からプリズムに入射する際の光の照射方向を、検出板の表面に水平に入射する場合は、ゴニオメーター等の角度精密調整機構が不要となり、製造が容易となる。

本発明の基本的な光学的検出装置を示す模式図である。 本発明の第１の実施形態で説明する光学的検出装置の変形例を示す模式図である。 第１の実施形態の光学的検出装置に用いられるプリズムと検出板との関係を説明する斜視図である。 図２Ａのａ−ａ’線における断面図である。 第１の実施形態の光学的検出装置における、光照射部とプリズムと検出板の配置関係を説明する図である。 第１の実施形態の光学的検出装置に用いられるプリズムの形状の例を示す図である。 第１の実施形態の光学的検出装置に用いられるプリズムの形状の例を示す図である。 第１の実施形態の光学的検出装置に用いられるプリズムの形状の例を示す図である。 第１の実施形態の光学的検出装置の変形例におけるプリズムの回転機構を説明する図である。 第２の実施形態における光学的検出方法を説明する図である。 第３の実施形態における光学的検出方法を説明する図である。 第３の実施形態における、異なる波長のうちの１つの蛍光色素による蛍光観察像である。 第３の実施形態における、異なる波長のうちの他の１つの蛍光色素による蛍光観察像である。 第３の実施形態における、２つの蛍光色素による蛍光が同一箇所から観察された範囲を示す図である。 第４の実施形態における光学的検出方法を説明する図である。 第４の実施形態における、電場増強度と距離の関係を示す図である。 従来技術であるクレッチマン配置を用いた導波モード励起機構の光学配置の例を示す説明図である。 導波モード励起によって生じる増強電場の電場強度と入射波長の関係を示す図である。

本発明の実施の形態について以下説明する。

本発明者は、導波モード励起によって、任意の２つ以上の波長における増強電場を発生させることに着目して鋭意研究開発を行い、波長特性の異なる増強電場を用いて標的物質を観測することにより、より鮮明、より迅速、かつより正確な標的物質の検出を実現するという新たな発想を得るに到ったものである。ここで、標的物質の検出とは、標的物質の有無の確認、定量、蛍光観測、２次画像の取得、動画の取得等をいう。

本発明の光学的検出装置では、従来技術とは異なり、波長の異なる増強電場を用いることを実現するために、検出板の裏面側に光学的に密着されるプリズムを、光入射面のうちの少なくとも２つが、前記光入射面と前記検出板の表面とのなす角度である入射面角度がそれぞれ異なる複数の光入射面を有するプリズムとしたものである。ここで光入射面とは、プリズム上に形成された複数の面のうち、光照射部から照射される光が入射する面をいう。

本発明の光学的検出方法では、従来技術とは異なり、波長の異なる増強電場を用いることを実現するために、検出板の裏面側に光学的に密着されるプリズムとして、光入射面のうちの少なくとも２つが、前記光入射面と前記検出板の表面とのなす角度である入射面角度がそれぞれ異なる複数の光入射面を有するプリズムを用いる。該プリズムを用い、かつ、光照射部からの光を、前記検出板の表面に対して固定された一の角度で、前記プリズムの複数の光入射面に入射し、前記プリズムを介して、前記検出板の裏面側から、前記検出板において全反射条件を満たす条件で照射し、検出板表面の一の検出領域における試料から、前記入射面角度の異なるそれぞれの前記光入射面に依存した異なる波長特性を持つ増強電場を用いて、異なる波長特性を持つ光信号を検出する。

ここで、検出板の表面に対して「固定された一の角度で」入射するとは、１つ以上の照射部からプリズムの複数の光入射面に入射する光の角度が、検出板の表面に対して同一の角度であることをいう。

（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態の光学的検出装置について、図を参照して説明する。

本実施形態の光学的検出装置は、試料中に存在する標的物質を光信号により検出する光学的検出装置である。ここで、光信号とは、蛍光及び散乱光のことを指す。図１Ａに、本実施形態の光学的検出装置の基本形態を示す。光学的検出装置は、第１の光照射部１と、第２の光照射部２と、プリズム３と、検出板４と、試料保持部と、光検出部７とを少なくとも有する。本図では、試料保持部は検出板４とカバーガラス６とで構成されている。カバーガラス６は、標的物質を含む試料５を、検出板４とで挟む態様で、試料５を検出板４表面上に保持するように配される。プリズム３は光入射面（第１の光入射面３１、第２の光入射面３２）を有する。第１光照射部１と、第２光照射部２は、光を検出板の表面に対して固定された一の角度で出射し、それぞれプリズムの第１の光入射面３１と第２の光入射面３２に照射する。第１光照射部１と、第２光照射部２から照射された光は、それぞれ、検出板４の裏面に光学的に貼り合わせたプリズム３を介して、全反射条件で検出板４の裏面側から検出板４表面の検出領域に照射される。光検出部７は、検出板４の表面側に配され、表面上の領域を検出領域とし、第１の光照射部１及び第２の光照射部２からの光の照射に伴い標的物質又は標識から発せられる光信号を検出する。

本発明の実施形態では、第１及び第２の光照射によって生じる検出領域からの光信号の差分を用いて標的物質の検出を行うことができる。図１では、検出板４は、試料５の下方となるように記載されているが、これは、検出板４が試料５の上方、または側方になるように配置されてもよい。

本実施形態の光学的検出装置の変形例として、図１Ｂに示すように、第１光照射部１と、第２光照射部２は、光を検出板の表面と平行に出射するように設定してもよい。図１Ａの装置の、「検出板の表面に対して固定された一の角度で出射」する当該角度が０度である場合に相当する。本変形例では、第１の光照射部１及び第２の光照射部２からの光は、前記検出板の表面に平行に、プリズム３の第１の光入射面３１、第２の光入射面３２にそれぞれ入射する。光を検出板の表面と平行になるように入射する利点としては、装置の組み立て易さが挙げられる。実際に本実施形態の光学的検出装置を作製する際、光照射部からプリズムに照射される光の角度は、設計時に決めた値でなければならない。もしこの角度がずれてしまうと、光の検出板表面への入射角にずれが生じてしまい、意図した波長とは異なる波長で増強電場が発生してしまうことになる。平行以外の特定の決まった角度で光を入射する場合には、角度調節を行うためにゴニオメーターなどの特殊な装置が必要となり、角度調整が煩雑になってしまう。一方、照射する光を検出板の表面と平行になるように光照射部を設置し、固定する場合には、複雑な角度調整機構が不要であり、容易に設定可能である。

以下、本実施形態の光学的検出装置について、より具体的に説明する。

［試料保持部］
試料保持部は、検出板が配され、かつ、導入される標的物質を含む試料及び試料に添加され、標的物質と結合して結合体を形成する標識を検出板の表面上に保持するものである。試料保持部は、標的物質を含む試料を検出板に接する形で保持できるものであれば、どのような構造であってもよい。例えば、試料が液体の場合には、公知の液体セルや公知の液体流路を検出領域に対応するサイズに対応させたものを用いることができる。試料がゲル状である場合や、細胞のようなソフトマテリアルである場合、つまり、試料の流動性が低い場合には、試料保持部は検出板そのもので構成してもよく、試料をカバーガラス等の光透過性部材と検出板とで挟み、試料を検出板表面上に保持する構成でもよい。試料保持部の構成は、試料の導入部が形成されるとともに、検出板と検出板の被覆部とで少なくとも検出板表面上の増強電場形成領域を含む空間を画成する中空部で構成され、かつ、少なくとも検出板表面上の検出領域及び光検出部の間に配される部位が、光透過性を有する構成が好ましい。このような中空部を有する構成とすると、導入部から中空部内に試料を導入し易く、また、検出領域は検出板表面上近傍の僅かな領域であるため、中空部の容量設定に伴い試料の量を安定して低減させることが可能となる。なお、試料保持部としては、試料を保持する領域を複数分画して設けることで、マルチチャンネル化させてもよい。

［試料］
試料としては、例えば血液、唾液、尿、薬品、環境水、上下水、細胞、ゲルなどが挙げられる。標的物質としては、例えば、試料中に含まれる細胞、菌、ウイルス、タンパク質、汚染物質、細胞中に含まれるタンパク質などが挙げられる。試料は、光学的検出装置における測定の対象となりうるものであればよく、例示したものに限定されない。また、標的物質は、試料に含まれてその存在が検知可能であるもの、又は含有量を測定できるもの、又は画像として観測できるものであれば、特に限定はされない。

［検出板］
検出板は、試料が表面上に導入されるとともに、裏面側から全反射条件で照射される光により、検出板表面上の検出領域に導波モードによる増強電場を形成可能であればよい。検出板の構成は、導波モードを励起するための積層体構造であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の導波モード（リーキーモード、漏洩モードを含む）を用いる検出板を採用することができる。即ち、裏面から表面に向けて、光透過性基板と、金属又は半導体層と、誘電体層とが、この順で積層された構造であればよい。光透過性基板上に形成する半導体層には、シリコンやゲルマニウムまたはその混合材料を用いることが有効である。また、誘電体層を複数の屈折率の異なる誘電体を積層することで構成することもできる。検出板表面は全反射が生じるように光学的に平坦な面であることが好ましい。光透過性基板の形成材料は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ガラスやプラスチック等、公知の光透過性誘電体から適宜選択することができる。「光透過性」とは、例えば、使用する波長の光透過率が０．５％以上であればよい。例えば、可視光透過率が０．５％以上であれば好ましい。

［プリズム］
本実施形態のプリズムは、光照射部から照射される光が入射される面（光入射面）を、少なくとも２つ以上有する。プリズムは、検出板の裏面側に光学的に密着して配される。プリズムの光入射面と検出板の表面とのなす角度を、入射面角度と呼ぶ。また、プリズムの光入射面とプリズムが検出板と接する面とのなす角度を、プリズムの底角と呼ぶ。

本実施形態では、入射面角度が異なるように、プリズムの光入射面が形成されている必要がある。図２は、本実施形態の光学的検出装置に用いるプリズム３と検出板４との関係を説明する図である。図２Ａは、台形プリズム３上に検出板４が配されている様子を示した斜視図であり、図２Ｂは、図２Ａにおける線ａ−ａ’における断面図である。この例では、プリズム３は、第１の光入射面３１と第２の光入射面３２の２つの入射面を有する。図２Ｂ中、第１の光入射面３１と検出板の表面Ｓがなす角度（第１の入射面角度）が、θ１であり、第２の光入射面３２と検出板の表面がなす角度（第２の入射面角度）が、θ２である。検出板４が平行平板である場合には、台形プリズム３の第１の光入射面３１の底角θ３、及び第２の光入射面３２の底角θ４を、それぞれθ３＝θ１、θ４＝θ２とすることによって、対応するそれぞれの入射面角度をθ１、θ２とすることができる。即ち、検出板が平行平板である場合は、「プリズム底角」＝「入射面角度」となる。一方、検出板の表面と裏面が平行でない場合、「プリズム底角」と「入射面角度」は違う値になる。検出板４が平行平板ではなく、傾きを持った板である場合、その傾きを考慮して、それぞれの入射面角度が所望のθ１、θ２となるように、プリズム３の底角θ３、θ４を設定する。本発明では、第１の入射面角度θ１と第２の入射面角度θ２が異なる値となるプリズム３を用いる。

図３は、本実施形態の光学的検出装置における、光照射部（１、２）とプリズム３と検出板４の配置関係を説明する図である。本図に示した光学的検出装置は、２つの光照射部（第１の光照射部１、第２の光照射部２）を有する。検出板４は平行平板である。プリズム３は台形プリズムで２つの光入射面（３１、３２）を有し、第１の光入射面３１の底角θ３及び第２の光入射面３２の底角θ４は、それぞれθ１、θ２であり、θ１とθ２は異なる。検出板４が平行平板であることから、第１の入射面角度及び第２の入射面角度は、それぞれθ１、θ２となる。本図に示すように、光照射部（１、２）からの光は検出板の表面Ｓと平行に出射され、光入射面（３１、３２）に照射されるように設定される。本図に示すように、第１の光入射面３１に照射された光は、空気とプリズム３との屈折率差によって回折を生じて、光路を変えた後、検出板４に入射角α１で入射することになる。第２の光入射面３２に照射された光は、空気とプリズム３との屈折率差によって回折を生じて、光路を変えた後、検出板４に入射角α２で入射することになる。θ１とθ２が異なることから、α１及びα２も異なる値の角度となる。ここで、検出板表面への光の入射角α１、α２は、いずれも、検出板表面で光の全反射が生じるように、臨界角以上である必要がある。

プリズム及び検出板基板の屈折率がｎであるとき、図３のθｉ，αｉ（ｉ＝１，２）の関係は次の（数１）の式で表される。なお、プリズムの周囲は空気であり、屈折率は１とする。

（数１）の関係式から、使用するプリズムの屈折率ｎと利用したい波長に対応した入射角αｉが決まれば、必要な入射面角度θｉは一意に定まる。なお、（数１）の式は、図３に示すような、光照射部からの光が、検出板の表面に平行に、プリズムの光入射面に入射する場合の関係式である。光照射部からの光が、検出板の表面に平行でない固定された一の角度でプリズムの光入射面に入射する場合、前記固定された一の角度及び使用するプリズムの屈折率ｎと利用したい波長に対応した入射角αｉが決まれば、必要な入射面角度θｉは一意に定まる。

導波モードの励起によって増強電場が得られる光の波長は、検出板の基板の屈折率、各層の複素屈折率及び厚さ、入射光の入射角及び入射光の偏光方向によって決定される。つまり、検出板の構造が同じでも、入射角を変化させて入射すれば、それぞれ、異なる波長での増強電場を得られることになる。図３に示す通り、第１の光照射部１と第２の光照射部２とからそれぞれ白色光を照射した場合、それぞれの光照射部から照射された光は、異なる入射角で検出板に入射することから、それぞれ、異なる波長での増強電場を発生させることとなる。よって、所望の２つの波長λ１およびλ２で増強電場を発生させたい場合、例えば、λ１で増強電場が発生するような入射角α１となるように、第１の入射面角度θ１を設定し、λ２で増強電場が発生するような入射角α２となるように、第２の入射面角度θ２を設定すれば、前記所望の２つの波長での増強電場を得ることができる。

２つの波長での増強電場を得る場合の、検出板及びプリズムの具体例を説明する。検出板は、シリカガラス基板上に、半導体層としてＳｉ層２５ｎｍ、光透過性誘電体層としてＳｉＯ_２層３６０ｎｍを積層した構造を例として説明する。また、検出板は厚みが一定の平らな板である。プリズムは、図３に示す台形プリズムとし、底角θ３は３２°、底角θ４は３５°とする。この時、第１の入射面角度θ１は３２°となり、第２の入射面角度θ２は３５°となる。第１の光入射面３１に対し、底面に平行にＳ偏光の白色光を照射すると、波長６５０ｎｍで増強電場を得ることができる。一方、第２の光入射面３２に対し、底面に平行にＳ偏光の白色光を照射すると、波長５９０ｎｍで増強電場を得ることができる。同一範囲の検出領域に、同時に２つの光入射面から光を入射することにより、それぞれの波長を励起波長とする蛍光色素の蛍光を同時に励起することができる。また、同時ではなく、一方ずつ順番に光を入射すれば、それぞれの波長を励起波長とする蛍光色素の蛍光を順番に励起することができる。

２つの入射面角度、例えば、図３におけるθ１とθ２は、第１の光入射面及び第２の光入射面から入射した光で、それぞれどの波長で増強電場を得たいかによって決まる。また、導波モードの励起によって増強電場が得られる光の波長は、検出板の基板の屈折率、各層の複素屈折率及び厚さ、入射光の偏光方向にも依存するので、これらのパラメータを考慮して決定される。

図２Ａ、Ｂ及び図３では、プリズムとして、左右の底角が異なる台形プリズムを示したが、これに換えて、他の形状のプリズムでもよい。図４に、本発明の光学的検出装置に適するプリズムの形状の例を示す。いずれのプリズムにおいても、上面（図中、灰色部）で、検出板の裏面と光学的に密着させる。例えば、図４Ａに示すような、左右の底角が異なる三角プリズムでも良い。また、３つ以上の波長で増強電場を発生させたい場合には、多角錐プリズムや多角錐台プリズム等の３つ以上の光入射面を持つプリズムを用いるのが良い。例えば、図４Ｂに示すような三角錐プリズム、三角錐台プリズム、図４Ｃに示すような四角錐プリズム、四角錐台プリズムなどが挙げられる。どのような多角形の底面を用いるかは、目的に応じて適宜選択することができる。図４Ｂ、Ｃの三角形、四角形以外に、五角形、六角形等でもよい。また、多角錐プリズムや多角錐台プリズム等の３つ以上の光入射面を持つプリズムを用いた場合、全ての入射面角度が異なるようにする必要はなく、少なくとも２つの入射面角度が異なっていればよい。例えば、四角錐台プリズムを、３つの波長で増強電場を発生させる光学的検出装置に用いても良く、その場合、四角錐台プリズムでは最大４つの光入射面が形成可能であるが、その内の３つの光入射面における入射面角度が異なるようにしておけばよい。

本発明では、少なくとも２つの入射面角度が異なっていれば良いが、その差がどれくらいに設定すればよいかの例を、図３を参照しながら説明する。光照射部（１、２）は、可視光領域の白色光を、検出板の表面Ｓに平行に、プリズム３の光入射面（３１、３２）に照射する。検出板に、シリカガラス基板上にＳｉからなる２５ｎｍの半導体層とＳｉＯ_２からなる３６０ｎｍの誘電体層とを有する検出板を用いた場合、第一の入射面角度θ１が４５．２°のとき、中心波長４００ｎｍ、半値幅４．３ｎｍの増強電場が形成される。つまり、波長領域３９７．８ｎｍから４０２．２ｎｍまでの波長帯域で効率的な信号光の励起が可能である。一方、第２の入射面角度θ２が４４．８°の時、中心波長４０４．４ｎｍ、半値幅４．２ｎｍの増強電場が形成される。つまり、波長領域４０２．３ｎｍから４０６．５ｎｍまでの波長帯域で効率的な信号光の励起が可能である。この場合、θ２の値をこれ以上θ１の値に近づけても、それぞれで有効な信号光の励起が可能な波長領域が重なってしまい、無駄となってしまう。よって、この場合、θ１とθ２の差は、０．４°以上とすることが好ましい。

同じ光照射部（１、２）を用い、同じように白色光を照射し、同じ検出板を使用した場合で、第一の入射面角度θ１が３５．１４°のときには、中心波長５５０ｎｍ、半値幅１０ｎｍの増強電場が形成される。つまり、波長領域５４５ｎｍから５５５ｎｍまでの波長帯域で効率的な信号光の励起が可能である。この時、第２の入射面角度θ２が３４．６°の場合、中心波長５６０．４ｎｍ、半値幅１０．８ｎｍの増強電場が形成される。つまり、波長領域５５５ｎｍから５６５．８ｎｍまでの波長帯域で効率的な信号光の励起が可能である。この場合、θ２の値をこれ以上θ１の値に近づけても、それぞれで有効な信号光の励起が可能な波長領域が重なってしまい、無駄となってしまう。よって、この場合、θ１とθ２の差は、０．５４°以上とすることが好ましい。

同じ光照射部（１、２）を用い、同じように白色光を照射し、同じ検出板を使用した場合で、第一の入射面角度θ１が２９．６２°のときには、中心波長７００ｎｍ、半値幅２７．６ｎｍの増強電場が形成される。つまり、波長領域６８６．２ｎｍから７１３．８ｎｍまでの波長帯域で効率的な信号光の励起が可能である。この時、第２の入射面角度θ２が２９．１°の場合、中心波長７２８ｎｍ、半値幅２８．２ｎｍの増強電場が形成される。つまり、波長領域７１３．９ｎｍから７４２．１ｎｍまでの波長帯域で効率的な信号光の励起が可能である。この場合、θ２の値をこれ以上θ１の値に近づけても、それぞれで有効な信号光の励起が可能な波長領域が重なってしまい、無駄となってしまう。よって、この場合、θ１とθ２の差は、０．５２°以上とすることが好ましい。

このように、θ１とθ２の差の好ましい最小値は、光照射部からの光がプリズムの光入射面に入射される角度や、検出板に用いられる各種材料によって異なるが、少なくとも０．４°以上となるように設定しておけば、それぞれの光入射面からの光入射によって、広帯域での効率的な信号光の励起が可能となり、好ましい。

光照射部からの光を、検出板の表面に平行に、プリズムの光入射面に照射する場合、入射面角度が９０°以上になると、入射面で屈折した光が、検出板の方向に進まず、検出板に光が届かなくなる。一方、入射面角度が３０°以下では検出板への光の入射角が臨界角を下回り全反射が起こらなくなる場合が出てくるため、２つの入射面角度の差は、このような平行入射の場合、６０°以下であることが好ましい。

照射部からの光を、検出板の表面に対して固定された一の角度で、プリズムの光入射面に照射する場合、入射面角度が９０°以上になった場合でも、前記一の角度を適切に設定すれば、入射面で屈折した光を検出板に照射することが可能である。しかしこの場合、検出板への光の入射角が臨界角を下回らないような条件を満たす入射面角度も同時に大きくなる。よって、２つの入射面角度の差は、このような一の角度で光を照射した場合でも、６０°以下であることが好ましい。

プリズムの材料としては、検出板の光透過性基板と屈折率が同じ材料を用いることが好ましい。プリズムの材料として最も好ましいものは、光透過性基板と同じ材料である。プリズム形成に光透過性基板と同じ形成材料が選択される場合には、検出板とプリズムとが一体成型されたものを用いることもできる。

［光照射部］
光照射部は、光を検出板の表面に対して固定された一の角度で出射し、プリズムの光入射面に照射する。プリズムに入射した光は、検出板の裏面側から、検出板において全反射条件を満たす条件で、検出領域に対して照射される。検出板における導波モード励起条件を満たす条件下では、照射された光により、導波モードが励起され、検出板表面に導波モードによる増強電場が形成される。このように、光照射部は、増強電場を得たい波長の光を含んだ光を、検出板の表面に対して固定された一の角度で出射してプリズムの入射面に照射可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、プリズムの少なくとも２つの光入射面から入射した１つ以上の光照射部から照射される光が、検出板の表面上の同一の検出領域を照明するように、光照射部が配置されることが好ましい。

光照射部の光源としては、例えば、所望の波長の光を含んだ光を出射可能な公知のランプ、ＬＥＤ、レーザ等が挙げられる。ランプやＬＥＤのような白色光源を用いる場合は、光学フィルタや回折格子等を用いて単色化した光を検出板に照射してもよい。特に蛍光色素を励起する場合には、不要な長波長側の光は光学フィルタで除去した後に照射した方がよい。これは、蛍光色素は励起帯よりも長い波長で発光するが、励起光に長波長成分が含まれていると、この長波長成分による散乱光が、蛍光観察を邪魔してしまう恐れがあるからである。光源の波長帯は、紫外〜赤外光領域の範囲内が望ましい。

なお、ランプ、ＬＥＤ等の放射光源を用いる場合には、照射光の照射方向を特定の方位に規制するコリメートレンズ等の案内部を用いてもよい。光源から光ファイバなどによって光を導いてプリズムに照射する場合には、光ファバイの出射端にコリメートレンズを備え、光ファイバからの出射光を平行光にすることも有効である。

［プリズムの相対的回転機構］
光照射部の数は、増強電場を発生させたい波長の数と同数用意すれば十分である。しかし、光照射部の数が増強電場を発生させたい波長の数より少ない場合には、光照射部に対してプリズムを回転させるか、またはプリズムに対して光照射部を回転させればよい。

図５は、本実施形態の変形例である、プリズムを回転する回転機構を説明する図である。図５の上面の灰色部に検出板が光学的に密着される。図５に示すように、光照射部に対して、四角錐台プリズムを回転させて、４つの波長で増強電場を得る方法について説明する。増強電場を得たい波長は４つであり、それぞれλ１、λ２、λ３、λ４とする。この時の波長はλ１＜λ２＜λ３＜λ４とする。それぞれの波長に対応する光入射面は、それぞれ第１の光入射面、第２の光入射面、第３の光入射面、第４の光入射面とする。光照射部はこれら４つの波長の光を全て含む光を照射可能であるとする。図５に示すように、まず、第１の光入射面に光を入射すると、波長λ１の増強電場が得られる。プリズムを回転して、第２の光入射面に光を入射すると波長λ２で、第３の光入射面に光を入射すると波長λ３で、第４の光入射面に光を入射すると波長λ４で、それぞれ増強電場が得られることとなる。前述のように、蛍光色素による蛍光を励起する場合には、不要な長波長側の光は光学フィルタで除去した後に照射した方がよい。よって、これらの各波長での増強電場で蛍光信号を得る場合には、光入射面の前に蛍光信号の波長と同程度かそれより長い波長の光をカットする光学フィルタを配置するとよい。ここでは、プリズムを回転する場合について説明したが、光照射部の方がプリズムの周りを回るようにしてもよい。また、光照射部の数は光入射面の数を最大として、それ以下であれば、いくつでもよい。

［光検出部］
光検出部は、検出板の表面側に配され、表面上の特定範囲を検出領域とし、光の照射に伴い標的物質から発せられる光信号を検出可能とする。光検出部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のフォトダイオード、光電子増倍管等の光検出器を用いることができる。光信号の情報を２次元画像情報として取得することができると、光点として現れる２次元画像情報における光信号の位置情報や、２次元画像上で観察されるサイズ情報、光点における光信号強度の増減情報を時系列で観察することができる。これらの情報を観察することにより、その光点が標的物質によるものであるか若しくは標的物質に関与する情報を示すものであるか、又は、夾雑物、光源出力の揺らぎ、検出板表面のキズ等の標的物質に関与しない情報を示すものであるかを区別することが可能となる。また、細胞の多重蛍光染色観察等、２次元画像情報の取得を目的とする検出に用いることも可能となる。このような２次元画像情報の取得を可能とするには、光検出部として撮像デバイスを選択すればよい。撮像デバイスは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサ等のイメージセンサを用いることができる。なお、標的物質からの蛍光を検出する場合には、励起光の検出板表面での散乱などによって蛍光検出が邪魔される恐れがあるため、光検出部の前に励起光を除去する光学フィルタを設置することが好ましい。

［標識］
本実施形態では、標的物質に、導波モードによる増強電場により蛍光又は散乱光などの光信号を発する標識を結合させて用いてもよい。標識は、標的物質そのものによる光信号が微弱で検出が困難な場合に特に有効であり、標的物質に代わって、強い光信号を発する役目を果たす。標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば公知の蛍光物質や、光を散乱する物質を用いることができる。蛍光物質としては、例えば蛍光色素や量子ドットなど公知の蛍光物質が挙げられる。光を散乱する物質としては、ナノ粒子、例えばポリスチレンビーズや金ナノ粒子、磁性粒子などが挙げられる。

標識と標的物質との結合は、物理的又は化学的にこの両者を結合させる手法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、物理吸着、抗原−抗体反応、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン−アビジン結合、キレート結合、アミノ結合などを用いることができる。また、標識に色素を用いた場合、標的物質の色素による染色も、標識と標的物質とを結合させる有効な手段である。

物理吸着では、例えば水素結合などの静電的な結合力を利用して、標識と標的物質とを結合させる。物理吸着では、特段、標識に何か処理を施す必要がないため、簡単に実施することができるという利点がある。しかし、標識は、標的物質のみと特異的に吸着するのではないため、一般に選択性が低い。つまり、標識は試料中に含まれる標的物質以外の夾雑物とも結合する恐れがあり、夾雑物が光信号を発し、ノイズとなる可能性がある。

一方、抗原−抗体反応などの特異性の高い反応を用いて標識と標的物質とを結合させると、標識は、標的物質のみと選択的に結合することから、夾雑物と標的物質とを区別して検出できるという利点がある。但し、この場合には、例えば、標的物質がウイルスなどの抗原の場合、そのウイルスに対する抗体を事前に標識に結合させておく必要がある。

異なる２種以上の標識を標的物質に結合して検出に供する場合、これらの結合のいずれか１つは、標的物質との特異的な反応による結合であることが好ましい。なぜなら、すべての結合がいずれも非特異的に生じるものである場合、標的物質と夾雑物とを見分けることができなくなってしまう恐れがあるからである。また、異なる２種以上の標識はそれぞれ異なる波長特性を持つ光信号を発することが好ましい。なぜなら、光信号の違いを検知することによって、どの標識からの光信号かを区別することができるからである。

一般に、標識は、溶液中に分散されて保管されているか、粉末状で保管されており、使用時に試料と混合される。混合の方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）試料を試料保持部に入れた後に標識を混合する方法、（２）標識を試料保持部に入れた後に試料を試料保持部に注入する方法、（３）試料と標識とを混合した後に試料保持部に入れる方法、などの手法を用いることができる。

抗体固相化等の手段を用いて、試料中の標的物質または結合体を特異的に捕捉する表面を検出板表面に形成した場合、混合後の溶液を試料保持部から排出し、洗浄を行うことにより、余剰の標識を取り除き、バックグラウンドの信号を抑制することが可能となる。その結果、結合体を形成していない標識を効率的に除去することが可能となり、より高精度で高感度な検出が実施可能となり好ましい。

［検出板の表面処理］
検出板の表面には、結合体を構成する標識の非特異的な吸着を抑制する化学的な表面処理を施しておいてもよい。前記表面処理により、結合体を形成していない余剰の標識が、検出板の表面に非特異的に吸着することなく、洗浄により検出板の表面から容易に除去され好ましい。特に、試料中の標的物質または結合体を特異的に捕捉する表面を用いる場合、前記表面処理を合わせて施すことでＳＮ比の向上が期待できる。表面処理の方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、タンパク質などの吸着を抑制する各種ブロッキング法を用いることができる。ブロッキング法の例としては、ポリエチレングリコールを用いる手法、エタノールアミンを用いる方法、スキムミルクを用いる方法などが挙げられる。

検出板の表面に標的物質の吸着を促進する化学的な表面処理を施しておくと、検出板の表面に標的物質を効率的に接着することが可能となる。例えば、標的物質として細胞を用いる蛍光染色観察を行う場合には、３−アミノプロピルトリエトキシシラン等公知の組織接着用表面処理剤を検出板表面に作用させることで、細胞組織の接着に適した表面を形成可能である。

（第２の実施形態）
本実施形態では、第１の実施形態で示した光学的検出装置を用いて検出する光学的検出方法について、図６を参照して説明する。図６は光学的検出方法を説明する図である。本実施形態では、特に標的物質が大きく、複数の蛍光色素結合抗体を結合させることができる場合について説明する。本実施形態は、図１の装置を用いて検出する方法である。図６では、図示しないが、全反射条件で検出板４の裏面側から照射された光が形成する導波モードによる増強電場が、検出板４表面に発生している。

図６では、第１の標識の例として、蛍光色素１結合抗体を図中Ａの符号（Ｙに黒丸）で説明し、第２の標識の例として、蛍光色素２で直接蛍光染色された標的物質を図中Ｂの符号（斜線楕円）で説明する。蛍光色素１は、第１の光照射部１からの光照射による増強電場で励起される。蛍光色素２は、第２の光照射部２からの光照射による増強電場で励起される。蛍光色素１と蛍光色素２とは、波長特性の異なる蛍光（光信号）を示す。

検出板４上の増強電場内で、蛍光色素１結合抗体や、直接蛍光染色された標的物質から、蛍光が発生する。標的物質には複数の蛍光色素１結合抗体が付いている為、第１の光照射部１からの光照射により、標的物質に結合していない蛍光色素１結合抗体１つ１つよりも大きな蛍光信号が標的物質から得られる。第２の光照射部２からの光照射により、直接蛍光染色された標的物質からの蛍光信号が、標的物質に結合した複数の蛍光色素１結合抗体による蛍光信号と同じ位置から得られる。２種類の蛍光の組み合わせにより、同じ位置から双方の蛍光信号を検出できたものを検出成功の基準とすることで、片方の蛍光を使うだけでは誤検知していたものを排除し、検出の正確性を高めることができる。

例えば、標的物質と特異的に結合する蛍光標識抗体を、蛍光色素１として用い、標的物質を直接染色可能なＤＡＰＩ等の蛍光色素を、蛍光色素２として用いるときは、次のような方法で、特異性の高い蛍光標識抗体と特異性の低い染色の組み合わせにより検出の正確性を高めることができる。ＤＡＰＩは生体膜を透過し、ＤＮＡを蛍光染色することができるため、様々な細胞やＤＮＡを持つウイルスを無差別に染色することになる。このため、ＤＡＰＩだけを標識として用いた場合、多くの細胞やウイルスの中から、特定の種類の細胞やウイルスを検出することは出来ない。また、例えば特定のウイルスに特異的に結合する蛍光標識抗体を標識として用いる場合は、ウイルスが光学顕微鏡では見えないほど小さいため、ウイルスに結合した蛍光標識抗体と、ウイルスに結合していない蛍光標識抗体との区別が困難になる。そこで、例えばＤＡＰＩと蛍光標識抗体を両方用いることにより、ウイルスのＤＮＡを染色したＤＡＰＩの蛍光と、ウイルスに結合した蛍光標識抗体の蛍光双方が検出できる位置を２次元画像情報として取得することができる。その結果、片方の蛍光色素だけを使う場合に発生する恐れのある誤検知を防ぎ、検出板表面近傍に存在するウイルスの検出を行うことが可能となる。

また、本実施形態の応用として、細胞組織等の観察において、異なる組織をそれぞれ蛍光染色する多重染色２次元画像情報を、増強蛍光観察により取得することができる。例えば、標的物質として細胞を用い、ＤＡＰＩ等の核酸染色用蛍光色素により核酸を染色し、抗チューブリン蛍光標識抗体により、細胞骨格を染色する多重蛍光染色を行った試料を用いて、細胞の増強蛍光観察像の撮影を行うことが可能となる。

（第３の実施形態）
本実施形態では、第１の実施形態で示した光学的検出装置を用いて検出する光学的検出方法について、図７を参照して説明する。図７は、第２の実施形態とは異なる光学的検出方法を説明する図である。本実施形態では、標的物質が蛍光色素１結合抗体と蛍光色素２結合抗体でサンドイッチされる構造をとる場合について説明する。本実施形態は、図１の装置を用いて検出する方法である。図７では、図示しないが、全反射条件で検出板４の裏面側から照射された光が形成する導波モードによる増強電場が、検出板４表面に発生している。

図７では、第１の標識の例として、蛍光色素１結合抗体を図中Ａの符号（Ｙに黒丸）で説明し、標的物質を図中Ｃの符号（斜線矩形）で説明し、第２の標識の例として、蛍光色素２結合抗体を図中Ｄの符号（Ｙに白丸）で説明する。蛍光色素１結合抗体は、第１の光照射部１からの光照射による増強電場で励起される。蛍光色素２結合抗体は、第２の光照射部２からの光照射による増強電場で励起される。蛍光色素１と蛍光色素２とは、波長特性の異なる蛍光（光信号）を示す。

図７は、標的物質を蛍光色素１結合抗体と蛍光色素２結合抗体とでサンドイッチし、重力沈降によって検出板近傍に濃縮した状況を示している。この時、増強電場で検出板４上の、蛍光色素１結合抗体と蛍光色素２結合抗体から、蛍光が発生する。標的物質がサンドイッチ構造になっているので、第１の光照射部１からの光照射により、標的物質の位置で、蛍光色素１結合抗体からの蛍光信号が得られ、第２の光照射部２からの光照射により、標的物質の位置で、蛍光色素２結合抗体からの蛍光信号が得られる。

図７に示すように、標的物質に対して特異的に結合する物質を２種類用いる場合は、それぞれに異なる蛍光物質を結合させることで、２種の蛍光が同時に観測できる点のみに注目することにより、検出の正確性を高めることができる。例えば特定のウイルスに特異的な蛍光標識抗体を用いる場合は、ウイルスが光学顕微鏡では見えないほど小さいため、ウイルスに結合した蛍光標識抗体と、ウイルスに結合していない蛍光標識抗体との区別が困難になる。そこで、例えば、同じウイルスの異なる部位に結合する２種類の抗体に対し、それぞれ異なる蛍光色素を結合させた２種の蛍光標識抗体（以下、第１の標識抗体、第２の標識抗体という。）を用いることにより、ウイルスに結合した第１の標識抗体及び第２の標識抗体の双方の蛍光が検出できる位置を２次元画像情報によって取得することができる。その結果、「第１の標識抗体−ウイルス−第２の標識抗体」結合体の発する光信号（蛍光）のみを識別することができ、片方の蛍光色素だけを使う場合に発生する恐れのある誤検知を防ぎ、検出板表面近傍に存在するウイルスの検出を行うことが可能となる。

本実施形態を実際に実施した例について、より具体的に述べる。抗原抗体反応を利用するため、測定対象に特異的な抗体２種（抗マウス−ウサギＩｇＧ、抗マウス−ロバＩｇＧ）を用意し、抗マウス−ウサギＩｇＧに蛍光色素１としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（励起波長６５０ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍ）を結合させ、抗マウス−ロバＩｇＧに蛍光色素２としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（励起波長５９０ｎｍ、蛍光波長６１７ｎｍ）を結合させた。検出板は、シリカガラス基板上に、半導体層としてＳｉ層２５ｎｍ、光透過性誘電体層としてＳｉＯ_２層３６０ｎｍを積層した構造であり、厚みが一定の平らな板である。プリズムは、図３に示す台形プリズムとし、底角θ３は３２°、底角θ４は３５°とした。この時、第１の入射面角度θ１は３２°となり、第２の入射面角度θ２は３５°となる。第１の光入射面３１に対し、底面に平行にＳ偏光の白色光を照射すると、波長６５０ｎｍで増強電場を得ることができる。一方、第２の光入射面３２に対し、底面に平行にＳ偏光の白色光を照射すると、波長５９０ｎｍで増強電場を得ることができる。前記２種の蛍光色素結合抗体と抗原となる正常マウスＩｇＧを混合し、１０μｌの混合液を、この光学系の基板表面に導入した。光源には、波長可変光源ＳＭ−１０ＹＮ（波長域３００−１１００ｎｍ、半値幅１０ｎｍ、Ｘｅランプ１５０Ｗ、分光計器製）を用い、第１の光入射面３１には中心波長６５０ｎｍの単色光を入射し、第２の光入射面３２には中心波長５９０ｎｍの単色光を入射した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４は、各色素の励起波長域の増強電場内でそれぞれ蛍光を発する。各蛍光色素の蛍光波長に対応した光学フィルタを用いて励起光を遮断し、冷却ＣＭＯＳカメラＣＳ−５１Ｍ（１３０万画素、ビットラン製）で基板表面を観察すると、２種の蛍光を観察することができた。双方の蛍光観察で蛍光が確認できる点はサンドイッチされた抗原がある場所である。図８は、６７０ｎｍのバンドパスフィルタ（半値幅１０ｎｍ、朝日分光製）を介した蛍光観察像であり、図９は６２０ｎｍのバンドパスフィルタ（半値幅１０ｎｍ、朝日分光製）を介した蛍光観察像である。双方で白地に黒くなっている部分で蛍光が観察できており、増強電場によるそれぞれの蛍光色素の励起を確認できた。図１０はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４両者の蛍光が検出された部位を白地に黒で示している。このように、増強電場による二種類の蛍光色素からの蛍光を観察することにより、サンドイッチされた抗原がある場所を検出できる。

（第４の実施形態）
本実施形態では、第１の実施形態で示した光学的検出装置を用いて検出する光学的検出方法について、図１１を参照して説明する。図１１は、第２や第３の実施形態とは異なる光学的検出方法を説明する図である。本実施形態は、特に標的物質が大きく、標的物質の散乱光を利用することができる場合について説明する。本実施形態は、図１の装置を用いて検出する方法である。図１１では、全反射条件で検出板４の裏面側から照射された光が形成する導波モードによる増強電場が、検出板４表面に発生しており、第１の光照射部１からの光と第２の光照射部２からの光とで染み出し高さが異なっている。

図１１では、第１の標識の例として、蛍光色素１結合抗体を図中Ａの符号（Ｙに黒丸）で説明し、標的物質の例として、検出領域内で散乱光を生じる標的物質を図中Ｅの符号（斜線楕円）で説明し、標的物質と同様に検出領域内で散乱光を生じる光応答性夾雑物を図中Ｆの符号（白丸）で説明する。蛍光色素１結合抗体は、第１の光照射部１からの光照射による増強電場で励起される。標的物質及び夾雑物は、第１の光照射部１及び第２の光照射部２からの光照射による増強電場で散乱光を生じる。第１の光照射部１からの光の増強電場は、図中線１の位置まで染み出し、第２の光照射部２からの光の増強電場は、図中線２の位置まで染み出すものである。

第１の光照射部１からの光照射による増強電場内で、蛍光色素１結合抗体や、標的物質及び夾雑物から、蛍光或いは散乱光が発生する。標的物質には複数の蛍光色素１結合抗体が付いている為、標的物質からは、第１の光照射部１からの光照射により、標的物質に結合していない蛍光色素１結合抗体１つ１つよりも大きな蛍光信号が得られる。この時、標的物質からは散乱光信号も得られる。これに対し、第１の光照射部１からの光照射によって、線１まで染み出している増強電場内の夾雑物は散乱光のみを生じる。第２の光照射部２からの光照射により、線２まで染み出している増強電場内にある標的物質及び夾雑物からは散乱光信号のみが得られる。これらの散乱光と蛍光の差分を用いて検出板表面に吸着している標的物質の信号を排除し、線２から線１までの高さの検出板表面近傍にあって、試料中を自由に動くことのできる標的物質のみを観察することが可能となる。また、観察開始時に差分を用いて、検出板表面近傍にあって、試料中を自由に動くことのできる標的物質の光点を特定して、その標的物質による第１の光照射部１からの光の散乱光を継続的に捕捉することにより、標的物質の連続的な経時観察が可能となる。

図１２に、電場増強度と検出板表面からの距離の関係を示す。図１２は、検出板として、シリカガラス基板上にＳｉからなる２５ｎｍの半導体層とＳｉＯ_２からなる３６０ｎｍの誘電体層とを有する検出板を用い、表面修飾としてタンパク質を２０ｎｍ堆積させたときの、検出板表面からの距離ｚ（ｎｍ）と電場増強度（入射光強度を１としたときの増強倍率）の関係である。シリカガラス基板は平行平板である。光照射部からの光は、前記検出板の表面に平行に、プリズムの光入射面に入射する。入射面角度３２°では、６４０〜６５０ｎｍの波長域の光が導波モード励起により増強され、誘電体層表面から１１００ｎｍ程度先まで入射光と同等以上の電場が染み出す（図１２中の実線、λ＝６４５ｎｍ）。入射面角度３５°では、５７０〜５８０ｎｍの波長域の光が導波モード励起により増強され、誘電体層表面から７５０ｎｍ程度先まで入射光と同等以上の電場が染み出す（図１２中の点線、λ＝５７５ｎｍ）。入射面角度４７°では、３９０〜３９５ｎｍの波長域の光が導波モード励起により増強され、誘電体層表面から２４０ｎｍ程度先まで入射光と同等以上の電場が染み出す（図１２中の破線、λ＝３９３ｎｍ）。異なる励起波長の蛍光を２次元画像情報として取得して、次のような検出が可能である。例えば、３９０〜３９５ｎｍで励起可能な蛍光物質（例：量子ドット）と、６４０〜６５０ｎｍで励起可能な蛍光物質（例：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）との蛍光観察像の差分により、両方の蛍光色素と結合した物質が、検出板表面近傍にあるのか、検出板表面から２４０ｎｍ程度以上離れた位置にあるのかを、両方の蛍光色素の蛍光が検出できるか、６４０〜６５０ｎｍで励起可能な蛍光物質の蛍光だけが検出できるかによって、区別することができる。これを利用して、１μｍ程度の厚みを持つ試料中の標的物質（例：細胞中の組織等）がどの程度の高さに分布しているかを検出することができる。

なお、上記実施の形態等で示した例は、発明を理解しやすくするために記載したものであり、この形態に限定されるものではない。

本発明の光学的検出装置及び方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細菌等の生体関連物質を初めとして、微小物質の蛍光観測・２次元イメージング等に広く適用でき、産業上有用である。

１ 第１の光照射部
２ 第２の光照射部
３ プリズム
４ 検出板
５ 試料
６ カバーガラス
７ 光検出部
９ 光透過性基板
１０ 金属層又は半導体層
１１ 光透過性誘電体層
３１ 第１の光入射面
３２ 第２の光入射面
Ａ 蛍光色素１結合抗体
Ｂ 直接蛍光染色された標的物質
Ｃ 標的物質
Ｄ 蛍光色素２結合抗体
Ｅ 検出領域内で散乱光を生じる標的物質
Ｆ 光応答性夾雑物
Ｓ 検出板の表面

Claims (11)

1. １つ以上の光照射部と、
   裏面から表面に向けて、光透過性基板、金属層又は半導体層、光透過性誘電体層の順で積層された積層構造を備える検出板と、
   前記検出板の裏面側に光学的に密着され、かつ光入射面のうちの少なくとも２つが、前記光入射面と前記検出板の表面とのなす角度である入射面角度がそれぞれ異なる複数の光入射面を有するプリズムと、
   前記検出板の前記表面上に標的物質を含む試料を保持可能な試料保持部と、
   前記検出板の前記表面側に配され、前記試料の検出領域からの光信号を検出する光検出部とを備え、
   前記光照射部からの光が、前記検出板の表面に対して固定された一の角度で、前記プリズムの前記複数の光入射面に入射し、前記プリズムを介した光が、前記検出板の裏面側から、前記検出板において全反射条件を満たす条件で照射されるように配置され、前記光検出部により前記光信号を検出することを特徴とする光学的検出装置。
2. 前記光照射部からの光が、前記検出板の表面に平行に、前記プリズムの前記複数の光入射面に入射することを特徴とする請求項１記載の光学的検出装置。
3. 前記１つ以上の光照射部から照射される光が、前記プリズムの少なくとも２つの前記光入射面から入射することを特徴とする請求項１または２記載の光学的検出装置。
4. 前記プリズムの少なくとも２つの前記光入射面から入射した前記１つ以上の光照射部から照射される光が、前記検出板の表面上の同一の検出領域を照明することを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の光学的検出装置。
5. 前記プリズムは、少なくとも２つの底角が異なる、三角形または台形プリズムであることを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項に記載の光学的検出装置。
6. 前記プリズムは、少なくとも２つの異なる底角を持つ多角錐プリズムまたは多角錐台プリズムであることを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項に記載の光学的検出装置。
7. １つの光照射部からの光がプリズムの複数の光入射面に入射可能となるように、前記光照射部に対して前記プリズムの光入射面を相対的に回転可能とする回転機構を備えることを特徴とする請求項１から６までのいずれか１項に記載の光学的検出装置。
8. 前記光透過性誘電体層は、１種類以上の誘電体材料の積層からなることを特徴とする請求項１記載の光学的検出装置。
9. 裏面から表面に向けて、光透過性基板、金属層又は半導体層、光透過性誘電体層の順で積層された積層構造を備える検出板の裏面側に光学的に密着され、かつ光入射面のうちの少なくとも２つが、前記光入射面と前記検出板の表面とのなす角度である入射面角度がそれぞれ異なる複数の光入射面を有するプリズムを用い、
   光を、前記検出板の表面に対して固定された一の角度で、前記プリズムの複数の光入射面に入射し、尚且つ、前記光が前記プリズムを介して、前記検出板の裏面側から、前記検出板において全反射条件を満たす条件で照射し、検出板表面の一の検出領域における試料から、前記入射面角度の異なるそれぞれの前記光入射面に依存した異なる波長特性を持つ増強電場を用いて、光信号を検出することを特徴とする光学的検出方法。
10. 前記光信号の内の少なくとも１つは、標的物質が発する光信号であることを特徴とする請求項９記載の光学的検出方法。
11. 前記光信号の内の少なくとも１つは、標的物質に結合した標識が発する光信号であることを特徴とする請求項９記載の光学的検出方法。
    
    

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