JP7008334B2 - 光学的検出方法及び光学的検出装置 - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 「電気学会研究会資料 センサ・マイクロマシン部門総合研究会」（ＣＤ－ＲＯＭ），ケミカルセンサ研究会ｐｐ．４９－５２，一般社団法人電気学会

本発明は、光の全反射に伴って生成される近接場を利用して、液体中に存在する標的物質を光学的に検出する光学的検出方法及び光学的検出装置に関する。

近年、溶液中に存在する微小物質、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細菌等の生体関連物質を検出・定量する方法が開発されている。該方法として、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イムノアッセイ法、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）などが挙げられる。

表面プラズモン共鳴イムノアッセイ法は、抗原抗体反応の特異的選択性と高感度な屈折率計である表面プラズモン共鳴センサを組み合わせた手法であり、全反射面の金薄膜表面に生じる増強電場内の抗原・抗体結合をリアルタイムに高精度で検出・定量することができる（非特許文献１参照）。

全反射照明蛍光顕微鏡は、試料とカバーガラス或いはスライドガラスとの界面で入射光を全反射させ、これによって生じるエバネッセント場を励起光として利用し、ノイズとなるバックグラウンド光が少ない蛍光観察を行う技術である（特許文献１参照）。該技術は、超解像を実現可能な技術であり、単分子観察を可能とする。

表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法は、クレッチマン配置と呼ばれる光学配置を用いて、プリズムに接したガラス表面の金薄膜層と液体試料との界面での入射光の全反射によって、金薄膜上に表面プラズモン共鳴を励起し、金薄膜表面に増強電場を形成することを特徴とする。表面プラズモン共鳴によって金薄膜表面近傍において増強された光を励起光として、増強電場内に存在する蛍光分子を励起し、強い蛍光を生じさせ、バックグラウンド光が少ない蛍光観察を行う技術である（特許文献２参照）。

光の全反射によって電場増強を生じさせ、増強電場を得る方法としては、例えば、非特許文献２乃至８に記載されているような公知のものがある。本発明者は、シリカガラス基板上にシリコン層とＳｉＯ_２層をこの順で積層した検出板をシリカガラス製の台形プリズム上に設置して、プリズムを介して検出板表面における全反射条件で光を照射し、増強電場を得る方法について非特許文献２において報告した。

非特許文献３では、クレッチマン配置を用いて表面プラズモン共鳴を発生させ、増強電場を得る方法が開示されている。非特許文献４では、クレッチマン配置におけるプリズムにドーブプリズムを用いて光を入射して表面プラズモン共鳴を発生させ、増強電場を得る方法が開示されている。非特許文献５及び非特許文献６では、レゾナントミラーを用いた増強電場を得る方法が開示されている。非特許文献７では、プリズム上に金属層と透明な誘電体層をこの順で積層して、リーキーモードセンサーと呼ばれる構造を形成し、プリズムを介して光を照射して、前記誘電体層表面で増強電場を得る方法が開示されている。非特許文献８では、プリズム上に金属層を形成し、その上に屈折率の異なる２種類の透明な誘電体層をそれぞれ１層ずつ積層して、リーキーモードセンサー構造よりもさらに強い増強電場を得る方法が開示されている。

さらに、特許文献３、４では、流路に表面プラズモン共鳴を発生させるプリズム形状が付与され、流路の底面または側面に表面プラズモン共鳴を発生させ、増強電場を得る方法が開示されている。

本願に関連した先行技術文献調査によれば、標的物質の検出面への吸着または近接を促進し、短時間での測定を実現するために、磁性粒子を標識に用いた方法が知られている（特許文献５、６）。特許文献５、６は、磁性標識と光応答性標識物質と標的物質との結合体を、磁場を印加することにより局所領域に引き寄せ、この局所領域を含む所定領域にのみ励起光を照射することにより、標的物質と磁性標識との結合体を形成していない光応答性標識の信号を排除した検出を行う技術である。

特開２００２－２３６２５８号公報 国際公開２０１５／１９４６６３号 特開２０１３－２４６０６号公報 特開２０１０－１４５４０８号公報 特開２０１１－３３４５４号公報 特開２００５－７７３３８号公報

Sensors and Actuators B 121 (2007) 158-177 M. Fujimaki et al. Optics Express, Vol. 23 (2015) pp.10925 - 10937 C. Nylander et al. Sensors and Actuators, Vol. 3 (1982/83) pp. 79 - 88 O.R.Bolduc et al. Talanta, Vol. 77 (2009) pp. 1680 - 1687 R. Cush et al. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 8 (1993) pp. 347 - 353 P.E. Buckle et al. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 8 (1993) pp. 355 - 363 R.P. Podgorsek et al. Sensors and Actuators, B 38 - 39 (1997) pp. 349 - 352 S. Hayashi et al. Applied Physics Express Vol. 8, 022201 (2015)

従来の、近接場を用いて標的物質を検出する方法において、磁性粒子による標的物質の検出面への濃縮を用いる手法では、非特異的に検出面に吸着してしまう標識物質や磁性粒子による光信号がノイズとなり、検出感度の低下が生じていた。このように、標識物質や磁性粒子によるノイズに起因する検出感度の劣化が問題であった。また、検出板の表面の汚れやキズによる散乱光、検出チップの材料からの自家蛍光、夾雑物の検出板の表面への非特異吸着などもノイズの原因となり、検出感度低下を生じていた。
また、磁性粒子を用いて、標的物質の検出板表面への濃縮を促進しても、同時に、検出板表面に未結合の磁性粒子も濃縮してしまい、その結果ノイズ源も増えてしまう結果となっていた。

本発明は、これらの問題を解決しようとするものであり、本発明は、近接場を用いて標的物質を光学的に検出する方法及び装置において、検出板の表面に非特異的に吸着してしまう標識物質や磁性粒子によるノイズ、前記表面の汚れやキズによるノイズ、検出板の自家蛍光によるノイズ、夾雑物の前記表面への非特異吸着によるノイズの影響を排除し、より高感度かつ高速に標的物質の検出が可能となる光学的検出方法及び装置を提供することを目的とする。

本発明は、前記目的を達成するために、以下の特徴を有するものである。

（１）近接場を用いて検出板の表面上の標的物質を含む結合体による蛍光又は散乱光を光信号として検出する標的物質の光学的検出方法であって、前記結合体は少なくとも前記標的物質と磁性粒子の結合によって形成され、前記検出板の裏面側に配される磁場印加部からの第２の磁場の印加により前記結合体を前記表面上に引き寄せるとともに前記第２の磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記検出板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記近接場内に存在する前記結合体を前記近接場内又は前記近接場外に前記結合体を移動させる第２の結合体移動工程で実施される結合体移動工程によって生じる前記光信号の低減又は移動を計測して、前記標的物質を検出し、かつ、前記表面は、前記結合体の吸着を抑制する化学的な処理が施されるとともに印加磁場に応じて前記近接場内に存在する前記結合体を前記近接場外まで移動可能な面とされることを特徴とする、光学的検出方法。
（２）前記結合体は、前記標的物質に前記磁性粒子が２個以上結合していることを特徴とする前記（１）記載の光学的検出方法。
（３）前記結合体は、前記標的物質に、前記近接場による蛍光又は散乱光を発する標識物質が結合していることを特徴とする前記（１）乃至（２）のいずれか１項記載の光学的検出方法。
（４）裏面側から全反射条件で照射される光により表面上に近接場を形成可能な検出板を備え、かつ、標的物質を含む液体の試料及び前記標的物質と結合体を形成する磁性粒子を前記検出板の前記表面上に保持可能な液体保持部と、前記全反射条件で前記検出板の前記裏面側から光を照射する光照射部と、前記検出板の前記表面側に配され、前記表面上の領域を検出領域とし前記近接場により前記結合体から発せられる蛍光又は散乱光を検出する光検出部と、前記検出板の前記裏面側に配されるとともに前記検出板の前記表面上に導入された前記試料中の前記結合体を磁場の印加により前記検出板の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で前記検出板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされ、その移動に追従させて前記近接場内に存在する前記結合体を前記近接場内又は前記近接場外に移動可能とされる第２の磁場印加部で形成される磁場印加部とを備え、前記表面は、前記結合体の吸着を抑制する表面であるとともに印加磁場に応じて前記近接場内に存在する前記結合体を前記近接場外まで移動可能とされる面とされることを特徴とする、光学的検出装置。
（５）前記光検出部が、前記蛍光又は散乱光を含む検出領域の様子を２次元画像として取得する装置であることを特徴とする前記（４）に記載の光学的検出装置。
（６）前記検出板が、裏面から表面に向けて、光透過性基板、表面プラズモン共鳴を発生する金属層の順で積層された積層構造を備えることを特徴とする前記（４）乃至（５）のいずれか１項記載の光学的検出装置。
（７）前記検出板が、裏面から表面に向けて、光透過性基板、金属層又は半導体層、光透過性誘電材料で形成される誘電体層の順で積層された積層構造を備えることを特徴とする前記（４）乃至（５）のいずれか１項記載の光学的検出装置。

本発明によれば、検出板の表面に非特異的に吸着してしまう標識物質や磁性粒子によるノイズ、前記表面の汚れやキズによるノイズ、検出板の自家蛍光によるノイズ、夾雑物の前記表面への非特異吸着によるノイズ等と、標的物質を含む結合体による光信号とを明確に区別することができるようになり、検出感度が格段に向上する。また、磁場の印加を含む外力により、前記結合体を変動させることができるので、検出時間の短時間化が図れる。

本発明の第１の磁場の印加と共に、その前段階として引き寄せ磁場を印加する場合や、引き寄せ磁場と第１の磁場印加を交互に印加する場合は、より高感度で、より高速な検出が可能となる。

本発明の実施形態の基本的な、磁場印加手段を備える光学的検出装置を示す模式図である。 本発明の実施形態における、磁場印加手段を備える光学的検出装置の変形例を示す模式図である。 本発明の第１の実施形態における、引き寄せ磁場印加または重力沈降時の作用を説明する図である。 本発明の第１の実施形態における、遠ざけ磁場印加時の作用を説明する図である。 本発明の第２の実施形態における、引き寄せ磁場印加または重力沈降時の作用を説明する図である。 本発明の第２の実施形態における、遠ざけ磁場印加時の作用を説明する図である。 本発明の第３の実施形態における、引き寄せ磁場印加または重力沈降時の作用を説明する図である。 本発明の第３の実施形態における、遠ざけ磁場印加時の作用を説明する図である。 本発明の光学的検出装置における、検出板表面からの距離と増強電場の電場強度の関係を示す図である。 第４の実施形態に係る光学的検出装置の説明図である。 結合体変動工程前における、検出板５２の表面上の様子を示す図（１）である。 結合体変動工程後における、検出板５２の表面上の様子を示す図（１）である。 結合体変動工程前における、検出板５２の表面上の様子を示す図（２）である。 結合体変動工程後における、検出板５２の表面上の様子を示す図（２）である。 本発明の実施例１における、遠ざけ磁場印加前を説明する図である。 本発明の実施例１における、遠ざけ磁場印加後を説明する図である。 本発明の実施例２における、遠ざけ磁場印加時の変化を説明する図である。 本発明の実施例２における、遠ざけ磁場印加時の変化を説明する図である。 本発明の実施例２における、遠ざけ磁場印加時の変化を説明する図である。

本発明の実施の形態について以下説明する。

本発明者は、検出板の表面における近接場を用いて微小物質を光学的に検出する技術において、微小物質を操作するための磁性粒子を利用する技術に着目して鋭意研究開発を行い、磁性粒子と結合した標的物質を近接場外に移動させることによって生じる光信号の低減（消滅を含む）を検知することによって標的物質を検出する、という新たな発想を得るに到ったものである。また、磁性粒子と結合した標的物質を近接場外に移動させるのではなく、近接場内で移動させた場合であっても、生じる光信号の低減又は移動を検知することによって標的物質を検出する、更に、磁性粒子と結合した標的物質の姿勢変化を検知することによって標的物質を検出する、ということについても、新たな発想を得るに到ったものである。

本発明の光学的検出方法では、近接場を用いて検出板の表面上の標的物質を含む結合体による蛍光又は散乱光を光信号として検出する標的物質の光学的検出方法において、結合体として、少なくとも前記標的物質と磁性粒子の結合体を用い、結合体を前記表面に平行な方向又は前記表面から遠ざける方向に移動させるか或いは前記結合体の姿勢を変化させる第１の磁場を印加する第１の結合体変動工程及び前記検出板の裏面側に配される磁場印加部からの第２の磁場の印加により前記結合体を前記表面上に引き寄せるとともに前記第２の磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記検出板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させるか又は前記結合体の姿勢を変化させる第２の結合体変動工程のいずれかで実施される結合体変動工程によって生じる前記光信号の低減または変動を計測して、前記標的物質を検出する。
なお、本明細書において、「光信号の変動」とは、前記結合体の移動に伴う光信号の移動と、前記結合体の姿勢変化に伴う光信号の変化とを含む概念である。また、「結合体の変動」とは、前記結合体の移動と、前記結合体の姿勢変化とを含む概念である。

本発明の光学的検出装置は、液体保持部と、光照射部と、光検出部と、磁場印加部とを有する。

（液体保持部）
前記液体保持部は、検出板が配され、かつ、導入される標的物質を含む液体の試料及び前記試料に添加され、前記標的物質と結合して結合体を形成する磁性粒子を前記検出板の表面上に保持するものである。

試料としては、例えば、血液、唾液、尿、薬品、環境水、上下水、などが挙げられる。標的物質としては、例えば、DNA、RNA、タンパク質、ウイルス、菌、汚染物質、などが挙げられる。試料は、液体であれば光学的検出装置における測定の対象となりうるものであればよく、例示したものに限定されない。また、標的物質は、試料に含まれてその存在が検知可能であり、または含有量を測定できるものであれば、特に限定はされない。

検出板は、試料が表面上に導入されるとともに裏面側から全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場を形成可能であればよい。検出板の構成としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができ、単層で構成されてもよく、電場増強を目的とした積層体で構成してもよい。検出板の全反射面を構成する面としては、全反射が生じるように光学的に平坦な面であることが好ましい。

検出板を単層で構成する場合、単層の表面を全反射面として照射光を全反射させると、表面近傍にエバネッセント場が生じることとなる。このような現象は、照射される光が前記単層を透過する程度に光透過性を有する材料であれば、材料に依存することなく一般に生じる現象であるため、前記単層の形成材料としては、特に制限はなく、公知の光透過性を有する検出板形成材料から適宜選択することができる。

検出板を積層体で構成する場合、積層体としては特に制限はなく、例えば特許文献２乃至５及び非特許文献２乃至８に記載されるような、電場増強を目的とした公知の検出板を採用することができる。

検出板を、裏面から表面に向けて、光透過性基板と表面プラズモン共鳴を発生する金属層とが、この順で積層されるように構成すると、検出板裏面側から照射される光によって金属層表面に表面プラズモン共鳴が励起され、検出板の表面近傍に増強電場が得られ、その結果、標的物質を含む結合体から発せられる光信号の強度を高め、より一層感度を向上させることができる。表面プラズモン共鳴を励起するための積層体の構造や形成材料は、特に制限はなく、例えば非特許文献３又は４に記載されているような公知のものが適応可能である。

検出板を、裏面から表面に向けて、光透過性基板と、金属材料又は半導体材料で形成される金属層又は半導体層と、光透過性誘電材料で形成される誘電体層とが、この順で積層されるように構成すると、検出板裏面側から照射される光によって前記誘電体層内に導波モードが励起され、検出板の表面近傍に増強電場が得られ、その結果、標的物質から発せられる光信号の強度を高め、より一層感度を向上させることができる。

導波モードを励起するための積層体の構造や形成材料は、特に制限はなく、例えば非特許文献２に記載されているような公知のものが適応可能である。

なお、本明細書において「近接場」とは、エバネッセント場及び増強電場のいずれかを示す。これらエバネッセント場及び増強電場は、いずれも検出板の表面近傍のみに形成され、検出板表面から遠ざかるにつれて急激に減衰する性質を有する。

光透過性基板の形成材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ガラスやプラスチック等、公知の光透過性誘電体から適宜選択することができる。

液体保持部の構成としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検出板そのもので構成されてもよく、また、試料を、カバーガラス等の光透過性部材と検出板とで挟み、試料の液層を検出板表面上に保持する構成でもよい。また、液体保持部の構成としては、公知の液体セル、公知の液体流路を検出板の表面上に配して構成されてもよい。

また、液体保持部の構成としては、試料の導入部が形成されるとともに検出板と検出板の被覆部とで少なくとも検出板表面上の近接場形成領域を含む空間を画成する中空部で構成され、かつ、少なくとも検出板表面上の検出領域及び光検出部の間に配される部位が光透過性を有する構成が好ましい。このような中空部を有する構成とすると、導入部から中空部内に試料を引き込むように導入し易く、また、中空部の容量設定に伴い試料の量を安定して導入させることが可能となる。

なお、液体保持部としては、試料を保持する領域を複数分画して設けることでマルチチャンネル化させてもよい。

（光照射部）
光照射部は、全反射条件で検出板の裏面側から光を照射可能とされる。
光照射部の光源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のランプ、ＬＥＤ、レーザー等が挙げられる。本発明では、検出板の裏面側から全反射条件で光を照射することで表面近傍に形成される近接場が標的物質を含む結合体から蛍光や散乱光を発生させることを検出原理とする。そのため光照射部に求められる役割としては、検出板の裏面側から全反射条件で光を照射することのみであり、このような役割を担うものであれば光源の選択に制限がない。

ランプ、ＬＥＤ等の放射光源を用いる場合には、検出板の表面側からの照射光の漏れ出しを避けるため、放射される光のうち検出板の裏面側に照射される全ての方位における光が全反射条件を満たす必要がある。こうしたことから、放射光源を用いる場合には、照射光の照射方向を特定の方位に規制するコリメートレンズ等の案内部を用いてもよい。
また、光信号として、標的物質を含む結合体による蛍光を用いる場合は、蛍光を励起可能な波長を持つ単色光源を用いるか、または、ランプ、ＬＥＤ等の広い波長帯域を持つ光源からの光をバンドパスフィルタ等の光学フィルタを透過させて単色化し、蛍光を励起可能な波長のみを取り出した後に検出板の裏面側から照射することが好ましい。

ここで、検出板が表面と裏面とが平行な板である場合、裏面側から照射された光は、表面上に液体が存在すると全反射されない。よって、このような場合には、検出板の裏面部分に回折格子を形成することにより、回折格子に特定の角度で光を照射したときに、光が回折格子で回折されて検出板内に導入されるとともに、検出板内に導入された光が全反射条件で表面に照射されて表面近傍に近接場が形成されるように、検出板を構成してもよい。または、表面と裏面とが平行にならないように形成してもよい。或いは、光源から照射される光を公知のプリズムを介して検出板の裏面に照射することとしてもよい。プリズムは、検出板の裏面に屈折率調整オイル又は光学用接着剤等により光学的に貼り合せて用いることができる。また、プリズムの形成材料として、光透過性基板又は単層の検出板の形成材料と同じ形成材料が選択される場合には、検出板とプリズムとが一体成型されたものを用いることもできる。また、特許文献３、４で開示されているような、液体流路に対してプリズムとして働く構造を付与したものを用いることもできる。

（光検出部）
光検出部は、検出板の表面側に配され、表面上の領域を検出領域とし光の照射に伴い標的物質を含む結合体から発せられる光信号を検出可能とされる。光検出部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のフォトダイオード、光電子増倍管等の光検出器を用いることができる。光信号の情報を２次元画像情報として取得することができると、光点として現れる２次元画像情報における光信号の位置情報や、２次元上で観察されるサイズ情報、光点における光信号強度の増減情報を時系列で観察することにより、その光点が、標的物質によるものであるか若しくは標的物質に関与する情報を示すものであるか、又は、夾雑物、光源出力の揺らぎ、検出板表面のキズ等の標的物質に関与しない情報を示すものであるかを区別することが可能となる。このような２次元画像情報の取得を可能とするには、光検出部として撮像デバイスを選択すればよい。撮像デバイスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサ等のイメージセンサを用いることができる。

（磁場印加部）
磁場印加部は、第１の磁場印加部及び第２の磁場印加部のいずれかで形成される。

＜第１の磁場印加部＞
第１の磁場印加部は、結合体を検出板表面に平行な方向又は前記表面から遠ざける方向に移動させるか或いは前記結合体の姿勢を変化させる部であり、検出板の表面から、標的物質と磁性粒子との結合体を遠ざける遠ざけ磁場、または、表面近傍で表面に平行に移動させる方向に磁力を作用させる平行移動用磁場を、印加可能である。結合体は、近接場内においてのみ、蛍光または光散乱による光信号を発生する。また、近接場の電場強度は検出板の表面から遠ざかるにつれて減衰する。その為、遠ざけ磁場の印加によって結合体が表面から遠ざけられると光信号が減衰し、さらに、結合体が、近接場の電場強度がゼロとみなせる程度までの距離以上に表面から遠ざけられると、結合体の光信号が消滅することとなる。また、光検出部に撮像デバイスを用い、２次元画像情報を取得できる場合には、第１の磁場の印加によって表面近傍で変動した結合体の発する光信号は、光信号の変動として経時的に計測することが可能となる。本発明では、このような光信号の減衰（消滅を含む）または変動（減衰、消滅を伴いうる）を検知して、標的物質を検知する。第１の磁場印加部は、結合体を検出板の表面から遠ざける、または表面近傍で変動させることができる磁場の発生が可能であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の電磁石及び永久磁石のいずれか１つ以上を用いることができる。なお、第１の磁場が印加される方向も、前記結合体を前記検出板の前記表面から遠ざける、または前記表面近傍で平行に移動させる、または姿勢を変化させることが可能であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜設定することができる。

＜第２の磁場印加部＞
第２の磁場印加部は、前記検出板の裏面側に配されるとともに前記検出板の前記表面上に導入された前記試料中の前記結合体を磁場の印加により前記検出板の前記表面側に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で前記結合体を前記検出板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させるか又は前記結合体の姿勢を変化させる部である。
前記第２の磁場印加部としては、このような部材であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の電磁石及び永久磁石を用いて構成することができる。例えば、スライド部材上に前記電磁石又は前記永久磁石を保持し、前記検出板の前記裏面側における前記光照射部からの前記光が照射される領域（検出領域）の近傍に前記電磁石又は前記永久磁石を位置させる初期状態と、前記検出板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に向けて前記電磁石又は前記永久磁石を移動させた状態との間で移動制御させることで構成することができる。なお、前記電磁石を用いる場合、前記移動制御中、連続的或いは断続的に励磁させた状態とする。また、前記移動制御中に励磁の強度を変化させてもよい。
また、複数の前記電磁石又は永久磁石を配置し、各部材における前記磁場の印加状態を制御することによっても、前記スライド部材上に前記電磁石又は前記永久磁石を保持して前記移動制御を行う構成と同等の効果を得ることができる。
また、前記第２の磁場印加部としては、特に制限はないが、貫通孔が形成されている、或いはＵ字型などの不完全な環状、或いは複数の部材が環状乃至不完全な環状に配置された構成であってもよい。

（磁性粒子）
磁性粒子は、標的物質と結合して結合体を形成し、磁場印加部による磁力によって、標的物質を検出板の表面から遠ざける、または表面近傍で変動させる作用を持つ。磁性粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば公知の磁気ビーズなどを用いることができる。

磁性粒子と標的物質との結合は、物理的又は化学的にこの両者を結合させる手法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、物理吸着、抗原－抗体反応、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン－アビジン結合、キレート結合、アミノ結合などを用いることができる。物理吸着では、例えば水素結合などの静電的な結合力を利用して、磁性粒子と標的物質とを結合させる。

物理吸着では、特段、磁性粒子に何か処理を施す必要がないため、簡単に実施することができるという利点がある。しかし、磁性粒子は、標的物質のみと特異的に吸着するのではないため、一般に選択性が低い。つまり、磁性粒子は試料中に含まれる標的物質以外の夾雑物とも結合する恐れがあり、夾雑物が標的物質と同様の光信号を発する場合、区別ができなくなるという欠点がある。

一方、抗原－抗体反応などの特異性の高い反応を用いて磁性粒子と標的物質とを結合させると、磁性粒子は、標的物質のみと選択的に結合することから、夾雑物と標的物質とを区別して検出できるという利点がある。但し、この場合には、例えば、標的物質がウイルスなどの抗原の場合、そのウイルスに対する抗体を事前に磁性粒子に結合させておく必要がある。

（標識物質）
本発明では、標的物質に、近接場により蛍光又は散乱光などの光信号を発する標識物質を結合させて用いてもよい。標識物質は、標的物質そのものによる光信号が微弱で検出が困難な場合に特に有効であり、標的物質に代わって、強い光信号を発する役目を果たす。標識物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば公知の蛍光物質、光を散乱する物質を用いることができる。蛍光物質としては、例えば蛍光色素や量子ドットなど公知の蛍光物質が挙げられる。光を散乱する物質としては、ナノ粒子、例えばポリスチレンビーズや金ナノ粒子などが挙げられる。

標識物質と標的物質との結合は、物理的又は化学的にこの両者を結合させる手法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、物理吸着、抗原－抗体反応、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン－アビジン結合、キレート結合、アミノ結合などを用いることができる。また、標識物質に色素を用いた場合、前記標的物質の前記色素による染色も、前記標識物質と前記標的物質とを結合させる有効な手段である。

物理吸着では、例えば水素結合などの静電的な結合力を利用して、標識物質と標的物質とを結合させる。物理吸着では、特段、標識物質に何か処理を施す必要がないため、簡単に実施することができるという利点がある。しかし、標識物質は、標的物質のみと特異的に吸着するのではないため、一般に選択性が低い。つまり、標識物質は試料中に含まれる標的物質以外の夾雑物とも結合する恐れがあり、夾雑物が光信号を発し、ノイズとなる可能性がある。

一方、抗原－抗体反応などの特異性の高い反応を用いて標識物質と標的物質とを結合さると、標識物質は、標的物質のみと選択的に結合することから、夾雑物と標的物質とを区別して検出できるという利点がある。但し、この場合には、例えば、標的物質がウイルスなどの抗原の場合、そのウイルスに対する抗体を事前に標識物質に結合させておく必要がある。

磁性粒子及び標識物質の両方を標的物質に結合して検出に供する場合、これらの結合のいずれか一方は、標的物質との特異的な反応による結合であることが好ましい。なぜなら、両方の結合がいずれも非特異的に生じるものである場合、磁性粒子及び標識物質の両方が試料中に含まれる夾雑物と同時に結合する可能性があり、その為、標的物質と夾雑物とを見分けることができなくなってしまう恐れがあるからである。

磁性粒子が蛍光又は散乱光などの光信号を発する場合、磁性粒子に標識物質として役割も兼ねさせると、標識物質を結合させる手順を省略でき、好ましい。この場合、磁性粒子と標的物質との結合は、この両者間で特異的な結合であることが好ましい。なぜなら、両者間の結合が非特異的に生じるものである場合、磁性粒子が試料中に含まれる夾雑物とも結合し、尚且つ光信号を発することとなってしまい、よって、標的物質と夾雑物とを見分けることができなくなってしまう恐れがあるからである。

（検出板表面への引き寄せ磁場、又は重力沈降）
本発明では、近接場を用いて検出板の表面上の標的物質を含む結合体による蛍光又は散乱光を光信号として検出して標的物質を検出するに際し、前記結合体を前記表面から遠ざける方向、または前記表面近傍で前記表面と平行な方向に移動させるか又は前記結合体の姿勢を変化させる第１の磁場を印加する第１の結合体変動工程及び前記検出板の裏面側に配される磁場印加部からの第２の磁場の印加により前記結合体を前記表面上に引き寄せるとともに前記第２の磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記検出板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させるか又は前記結合体の姿勢を変化させる第２の結合体変動工程のいずれかで実施される結合体変動工程によって生じる光信号の低減または変動を計測して、標的物質を検出する。つまり、結合体が、第１の磁場によって、検出板の表面から遠ざかることまたは表面近傍で前記表面と平行な方向に移動すること又は姿勢を変化させること、及び、第２の磁場を印加する磁場印加部によって、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させるか又は前記結合体の姿勢を変化させることのいずれかを以て、前記結合体の検出を行う。この検出機構においては、結合体は、前記結合体変動工程の実施前には、近接場が発生している領域内に存在していなくてはならない。

一般にＤＮＡやタンパク質、ウイルスなどの微小物質は溶液中に均一に分散している。一方、近接場が発生している領域は、検出板の表面から数１００ｎｍから数μｍ程度離れた位置までであるため、液体保持部に導入される試料の厚みがこの領域より厚いと、第１の磁場の印加を実施する前に、近接場内に存在する結合体の数は、導入された試料中に含まれる結合体の総数の極一部に限定されてしまう。その為、第１の磁場の印加を実施する前に、結合体をなるべく多く、近接場が発生している領域内に入れるべく、検出板の表面に近づけておくことが好ましい。このように結合体を検出板の表面に近づけるために、本発明では、重力沈降による結合体の沈降、及び引き寄せ磁場の印加による結合体の検出板の表面への引き寄せのいずれか１つ以上を利用する。

検出板の表面を液体保持部の底面として光学的検出装置を構成する場合、結合体が重力沈降を示す程度に十分に重い場合、一定時間を置くと、結合体は検出板の表面に重力沈降によって引き寄せられる。その為、液体保持部に試料を注入し、一定時間が経過した後に第１の磁場を印加することによって、より多くの結合体が検出に関与することとなり、より大きな光信号の低減またはより多くの光信号の変動が観測される。よって、より高感度に標的物質を検知することができることになる。ここで、前記一定時間は、結合体の大きさや重さに依存するために特定の値に決定することは困難であるが、迅速な検出を実現可能とする観点からは、１時間以内とすることが好ましい。

結合体が軽い場合、重力沈降に時間が掛かってしまうことがある。そのような場合には、結合体に、重りとなる重り物質を結合させ、重力沈降速度を速めることも好ましい。重り物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば公知の金ナノ粒子などを用いることができる。結合体と重り物質との結合は、物理的又は化学的にこの両者を結合させる手法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、物理吸着、抗原－抗体反応、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン－アビジン結合、キレート結合、アミノ結合などを用いることができる。

光学的検出装置は、検出板の表面に結合体を引き寄せる方向に磁力が働く、引き寄せ磁場を印加可能な引き寄せ磁場印加部をさらに備えることも有効である。この場合、引き寄せ磁場印加部によって、結合体を構成する磁性粒子が検出板の表面に引き寄せられることを利用するため、新たに結合体に、結合体を検出板の表面に近づける為の物質を結合させる必要がないため、好ましい。引き寄せ磁場を印加した後に、遠ざけ磁場等の第１の磁場を印加することによって、より多くの前記結合体が検出に関与することとなり、より大きな光信号の低減またはより多くの光信号の変動が観測されることとなる。

引き寄せ磁場の印加及び前記第１の磁場の印加（前記第１の結合体変動工程）は、交互に繰り返して複数回行うこと（以下、「交互磁場印加」という。）としてもよい。交互磁場印加によって、結合体が、近接場が発生している領域から出たり入ったりすることを繰り返すことから、光信号の減少と増加が繰り返し観測される。よって、検出の精度を向上することができる。さらには、交互磁場印加を周期的に実施し、その周波数に対して公知のロックイン増幅器を適用することによって、信号を増幅することも可能であり、感度向上を図ることができる。

（試料の混合）
光学的検出装置による標的物質の測定に際して、試料には磁性粒子が添加される。また、必要に応じて標識物質及び重り物質が添加される。一般に、磁性粒子、標識物質及び重り物質は、溶液中に分散されて保管されているか、粉末状で保管されており、使用時に試料と混合される。混合の方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）試料を液体保持部に注入した後に磁性粒子、標識物質及び重り物質を混合する方法、（２）磁性粒子、標識物質及び重り物質を液体保持部に注入した後に試料を液体保持部に注入する方法、（３）試料と磁性粒子、標識物質及び重り物質とを混合（以下、「事前混合」という。）した後に液体保持部に注入する方法、などの手法を用いることができる。事前混合を採用した場合、磁性粒子を容器越しに磁石で集めながら、容器内を洗浄することによって、容易に磁性粒子及び結合体以外の物質を取り除くことができると共に、結合体の濃縮を行うことができる。その結果、より高精度で高感度な検出が実施可能となり好ましい。

（検出板の表面処理）
検出板の表面には、結合体を構成する標的物質、磁性粒子、標識物質及び重り物質の吸着を抑制する化学的な表面処理を施しておいてもよい。前記表面処理により、結合体が、検出板の表面に捕捉されることなく、遠ざけ磁場等の第１の磁場印加により検出板の表面から遠ざかる、または表面近傍で移動することが容易となるので好ましい。表面処理の方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、タンパク質などの吸着を抑制する各種ブロッキング法を用いることができる。ブロッキング法の例としては、ポリエチレングリコールを用いる手法、エタノールアミンを用いる方法、スキムミルクを用いる方法などが挙げられる。表面処理によって結合体の検出板表面への吸着を抑制すれば、安定した正確な検出が可能となる。

光学的検出装置及び光学的検出方法の例を図面を参照しつつ、より詳細に説明する。
図１は、本発明の実施形態で用いる光学的検出装置の基本例である。光学的検出装置１は、検出板２と、カバーガラス４と、光源５と、光検出部６と、第１の磁場印加部８とで構成される。カバーガラス４は、標的物質を含む試料、磁性粒子、標識物質、重り物質の混合溶液３（必ずしも標識物質、重り物質を含むものではない）を、検出板２とで挟む態様で、混合溶液３の液層を検出板２表面上に保持するように配される。光源５（「光照射部」ともいう。）は、検出板２の裏面に光学的に貼り合せたプリズム１１を介して全反射条件で検出板２の裏面側から光Ｌを照射するように配される。光検出部６は、検出板２の表面側に配され、表面上の領域を検出領域とし光Ｌの照射に伴い結合体から発せられる光信号Ｓを検出する。第１の磁場印加部８は、検出板２の表面から結合体を遠ざける方向、または前記表面近傍で平行移動させる方向の、遠ざけ磁場又は平行移動用磁場を印加する。検出板２とカバーガラス４とで、液体保持部が構成される。図１に示す光学的検出装置１では、全反射条件で検出板２の裏面側から光Ｌを照射する目的でプリズム１１を配する構成としているが、同じ目的から裏面に回折格子が形成された検出板を用いることにより、プリズム１１に代えることもできる。

本発明の実施形態では、第１の磁場印加部８によって、結合体を検出板の表面から遠ざけ又は表面近傍で平行移動させる又は姿勢を変化させることによって生じる光信号Ｓの減少（消滅を含む）または変動を検知することにより、標的物質の検出を行う。ここで、標的物質の検出とは、標的物質の有無の確認、定量測定、実時間観察等をいう。

図１では、検出板２は、混合溶液３の下方となるように記載されているが、これは、検出板２が混合溶液３の上方、または側方になるように配置されてもよい。しかし重力沈降を用いた結合体の検出板の表面への引き寄せを利用する場合には、検出板２は混合溶液３の下方に配置される必要がある。一方、検出板２を混合溶液３の上方や側方に配置した場合は、重力沈降による標的物質以外の物質の非特異的な検出板表面への吸着を低減することができる。

図２は、本発明の実施形態で用いる光学的検出装置の変形例を示す。図２の光学的検出装置１は、結合体を検出板２の表面に引き寄せるための引き寄せ磁場印加部９を設けたものであり、その他の構成は図１と同様である。光学的検出装置１では、引き寄せ磁場の印加によって検出板２の表面付近に結合体を引き寄せた後に、第１の磁場の印加を行う。引き寄せ磁場によって短時間に多くの結合体が、検出板２の表面付近に引き寄せられるため、その後の遠ざけ磁場等の第１の磁場の印加によって、より大きな光信号の低減またはより多くの光信号の変動が観測され、より高感度に標的物質を検知することができる。結合体が重力沈降しにくい場合や、検出に掛かる時間を大幅に短縮したい場合や、検出板２を混合溶液３の上方や側方に配置した場合に特に有効である。

（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態を、図３及び４を参照して説明する。本実施形態では、標的物質自身が光信号を発する場合について説明する。試料中の標的物質には、１つ以上の磁性粒子が結合可能である。図３及び図４では、標的物質１つに対して複数の磁性粒子が結合して結合体を形成している場合について図示したものである。図３及び図４では、図示しないが全反射条件で検出板２の裏面側から照射された光が形成する近接場が、検出板表面に発生している。結合体は、図１または図２に記載の装置を用いて検出される。また、図３及び４では、磁性粒子の例として抗体付き磁性ビーズ１６で説明し、標的物質の例として抗原１５で説明する。

図３は、重力沈降及び引き寄せ磁場の印加の片方又は両方が作用して結合体が検出板２の表面に引き寄せられている状況を説明する図である。この時、図３に示すように、結合体を形成しなかった抗体付き磁性ビーズ１６単体も、検出板２の表面に引き寄せられる。図４は、遠ざけ磁場を印加した後の状況を説明する図である。図３の状態で引き寄せ磁場が印加されている場合は、該引き寄せ磁場の印加を中止した後、遠ざけ磁場を印加する。図４のように、結合体及び抗体付き磁性ビーズ１６単体は、遠ざけ磁場によって検出板２の表面から遠ざかる。

検出板２の表面に、平行移動用磁場を印加する場合については、図示しないが、結合体及び抗体付き磁性ビーズ１６単体は、前記平行移動用磁場によって検出板２の表面近傍で表面に平行に移動させるまたは姿勢を変化させることができる。
図３に示される状況下では、検出板２表面上で近接場内の抗原１５から光信号が発生する。次に検出板２の表面に対して遠ざけ磁場又は平行移動用磁場を印加すると、結合体は検出板２の表面から遠ざかる、または前記表面近傍で移動するまたは姿勢が変化することから、前記抗原１５による光信号は減衰又は消滅又は変動する。前記光信号の減衰又は消滅又は変動を検出することによって、抗原１５を検知することができる。

光信号の減衰及び消滅を観測する手法としては、検出板２の表面のある一定領域から発せられる光信号の総量を観測する手法が挙げられる。この場合、光検出器としてはフォトダイオードや光電子増倍管などを用いることができる。前記一定領域から発せられる光信号の総量の、遠ざけ磁場又は平行移動用磁場印加前と該磁場印加の一定時間後での差を測定したり、遠ざけ磁場又は平行移動用磁場を印加しながら、経時的に光信号の総量を取得してその経時変化を測定したりする方法が適用可能である。

また、光信号の減衰及び消滅及び変動を観測する手法としては、光信号を２次元的に画像として観測しておき、画像として光信号の減衰及び消滅及び変動を観測手法でもよい。この場合、光検出器としてはＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサ等のイメージセンサを用いることができる。例えば、光信号を発する点において観測される光信号が、遠ざけ磁場又は平行移動用磁場の印加によって減衰又は消滅又は変動した場合、光信号の減衰又は消滅又は変動が生じた点の数を計数することによって、標的物質を検出することができる。

（第２の実施形態）
本発明の第２の実施形態を、図５及び６を参照して説明する。本実施形態では、標的物質自身が発する光信号が微弱であるか、または光信号を発しない場合で、磁性粒子が発する光信号を検知して、試料中の標的物質を検知する。この場合においては、磁性粒子は蛍光又は散乱光を発する粒子である。本実施形態では、標的物質には２つ以上の磁性粒子が結合して結合体を形成することが好ましい。

図５及び図６は、標的物質１つに対して２つ以上の磁性粒子が結合して結合体を形成している場合について図示したものである。図５及び図６では図示しないが、全反射条件で検出板２の裏面側から照射された光が形成する近接場が、検出板表面に発生している。結合体は、図１または図２に記載の装置を用いて検出される。また、図５及び６では、磁性粒子の例として、抗体付き磁性ビーズ１６で説明し、標的物質の例として抗原１５で説明する。

図５は、重力沈降及び引き寄せ磁場の印加の片方又は両方が作用して、磁性粒子と標的物質の結合体が検出板２の表面に引き寄せられている状況を説明する図である。この時、図５に示すように、結合体を形成しなかった抗体付き磁性ビーズ１６単体も、検出板２の表面に引き寄せられる。図６は、遠ざけ磁場を印加した後の状況を説明する図である。図５の状態で引き寄せ磁場が印加されている場合は、該引き寄せ磁場の印加を中止した後、遠ざけ磁場を印加する。図６のように、結合体及び抗体付き磁性ビーズ１６単体は、遠ざけ磁場によって検出板２の表面から遠ざかる。

検出板２の表面に、平行移動用磁場を印加する場合については、図示しないが、結合体及び抗体付き磁性ビーズ１６単体は、前記平行移動用磁場によって検出板２の表面近傍で表面と平行な方向に移動させるまたは姿勢を変化させることができる。

図５に示される状況下では、検出板２表面上で近接場内の結合体及び抗体付き磁性ビーズ１６単体から光信号が発生する。次に、図６に示すように、検出板２の表面に対して遠ざけ磁場又は平行移動用磁場を印加すると、結合体及び抗体付き磁性ビーズ１６単体は検出板２の表面から遠ざかる、または前記表面近傍で変動することから、前記結合体及び前記抗体付き磁性ビーズ１６単体による光信号は減衰又は消滅又は変動する。この時、結合体には２つ以上の抗体付き磁性ビーズ１６が結合していることから、結合体からは抗体付き磁性ビーズ１６単体よりも大きな光信号が発せられる。よって、図５において光信号を２次元的に画像として観測しておき、その際、抗体付き磁性ビーズ１６単体が発する光信号の強度を測定しておく。抗体付き磁性ビーズ１６単体が発する光信号の強度よりも大きい光信号を発する点が存在し、尚且つ、遠ざけ磁場や平行移動用磁場の印加によってその光信号強度が減衰又は消滅又は変動した場合、このような現象は、結合体が遠ざけ磁場や平行移動用磁場の印加によって、検出板２の表面から遠ざかった、または表面近傍で変動したことによって生じたものであるので、このような光信号の減衰又は消滅又は変動を検知することによって、抗原１５を検出することができる。

第２の実施形態では、第１の実施形態で示した、検出板２の表面のある一定領域から発せられる光信号の総量を観測することによって検出を実施する手法は使用できない。なぜなら、第２の実施形態の場合、検出板２の表面のある一定領域において、遠ざけ磁場や平行移動用磁場の印加によって減衰または消滅する光信号の総量は抗体付き磁性ビーズ１６の総量に依存し、抗原１５の有無及び量には依存しないからである。

（第３の実施形態）
本発明の第３の実施形態を、図７及び８を参照して説明する。本実施形態では、試料中で、標的物質に磁性粒子と標識物質を結合させる場合について説明する。標識物質が色素であって、標的物質自体に蛍光信号を発する機能を付与する場合も、本実施形態で説明することができるが、ここでは、標的物質を磁性粒子と標識物質とで挟み込んで、所謂サンドイッチ構造をとる場合を例に説明を行う。

図７及び８では、標的物質１つに対して１つの磁性粒子と１つの標識物質が結合して結合体を形成している場合について図示したものである。磁性粒子と標識物質はそれぞれ複数個標的物質と結合して結合体を形成してもよい。図７及び図８では、図示しないが、全反射条件で検出板２の裏面側から照射された光が形成する近接場が、検出板２表面に発生している。結合体は、図１または図２に記載の装置を用いて検出される。また、図７及び８では、磁性粒子の例として、抗体付き磁性ビーズ１６で説明し、標識物質の例として、抗体付き標識物質（「抗体付き非磁性ビーズ１７」ともいう。）で説明し、標的物質の例として抗原１５で説明する。抗原１５と抗体付き磁性ビーズ１６と抗体付き非磁性ビーズ１７を混合した際、以下のような複数種類の結合体の形成が生じると考えられる。抗原１５と抗体付き磁性ビーズ１６と抗体付き非磁性ビーズ１７との結合体Ｍ１、抗原１５と抗体付き磁性ビーズ１６（抗体付き非磁性ビーズ１７が結合していない）との結合体Ｍ２、抗原１５と抗体付き非磁性ビーズ１７（抗体付き磁性ビーズ１６が結合していない）との結合体Ｎ、また、結合体を形成しなかった抗体付き磁性ビーズ１６単体、結合体を形成しなかった抗体付き非磁性ビーズ１７単体も試料中に存在する可能性がある。

図７は、重力沈降及び引き寄せ磁場の印加の片方又は両方が作用して結合体Ｍ１が検出板２の表面に引き寄せられている状況を説明する図である。この時、図７に示すように、前記結合体Ｍ２や抗体付き磁性ビーズ１６単体も、検出板２の表面に引き寄せられる。またこの時、前記結合体Ｎや抗体付き非磁性ビーズ１７単体も、重力沈降や検出板２の表面との非特異吸着によって検出板２の表面近傍に存在している可能性がある。図８は、遠ざけ磁場を印加した後の状況を説明する図である。図７の状態で、引き寄せ磁場が印加されている場合は、該引き寄せ磁場の印加を中止した後、遠ざけ磁場を印加する。図８のように、結合体Ｍ１、結合体Ｍ２及び抗体付き磁性ビーズ１６単体は、遠ざけ磁場によって検出板２の表面から遠ざかる。一方、結合体Ｎ及び抗体付き非磁性ビーズ１７単体は、そのまま検出板２の表面近傍に残り、変動しない。

検出板２の表面に、平行移動用磁場を印加する場合については、図示しないが、結合体Ｍ１、結合体Ｍ２及び抗体付き磁性ビーズ１６単体は、前記平行移動用磁場によって検出板２の、表面近傍で表面と平行な方向に移動させるまたは姿勢を変化させることができる。

図７に示される状況下では、検出板２表面上で近接場内の抗体付き非磁性ビーズ１７から光信号が発生する。次に、図８に示すように、検出板２の表面に対して遠ざけ磁場又は平行移動用磁場を印加すると、結合体Ｍ１が検出板２の表面から遠ざかる、または前記表面近傍で変動することから、結合体Ｍ１に結合している抗体付き非磁性ビーズ１７による光信号は減衰又は消滅又は変動する。よって、光信号の減衰又は消滅又は変動を検出することによって、抗原１５を検知することができる。この時、結合体Ｍ２及び結合体Ｎに結合している抗原１５は検知されない。しかし、抗体付き磁性ビーズ１６、抗体付き非磁性ビーズ１７に用いられている抗体に、抗原１５と高い結合力を持つ抗体を用いれば、結合体Ｍ２や結合体Ｎの数を減らし、結合体Ｍ１の数を増やすことができ、より多くの抗原１５を検知可能となる。

信号の減衰及び消滅を観測する手法としては、第１の実施形態で説明したものと同様の手法を用いることができる。

第１、第２及び第３の実施形態で、引き寄せ磁場の印加がなされている場合は、引き寄せ磁場の印加を中止した後に、遠ざけ磁場又は平行移動用磁場を印加した。しかし、遠ざけ磁場及び平行移動用磁場が、引き寄せ磁場が印加されている状態でも、磁性粒子と結合している標的物質の結合体を検出板２の表面から遠ざける、または変動させることが可能であれば、引き寄せ磁場は印加したままでも良い。例えば、これは、遠ざけ磁場や平行移動用磁場を引き寄せ磁場よりも十分に強くすることにより、可能である。

（近接場について）
第１乃至３の実施形態の前提となる近接場について、検出板にＳｉＯ_２基板を用いた場合の具体例を示す。図９に、ＳｉＯ_２ガラスを検出板として用い、その表面に水を載せ、その裏面にＳｉＯ_２ガラス製のプリズムを光学的に密着させて配し、入射角６７°で３７５ｎｍのｐ偏光の単色光を入射した場合のエバネッセント場の電場強度分布の計算結果を示す。横軸ｚは検出板の表面からの距離（ｎｍ）を示す。ｚ＝０が検出板の表面を示す。図９から分かるように検出板の表面では、入射光の強度を１としたとき、強度約４．５の電場が形成されている。前記エバネッセント場の電場強度は、前記検出板の表面から離れるにつれて弱くなり、前記検出板の表面からの２０００ｎｍ離れるとほぼ０になる。遠ざけ磁場の印加によって、前記検出板の表面から結合体を遠ざけると、図９に示すような電場強度の減衰又は消滅によって、光信号の減衰又は消滅が起きることとなる。

（測定原理の検証）
次に、本発明の実施形態の測定原理の検証の為の実験例を示す。ここでは、磁性粒子そのものによる散乱光を光信号と見立て、前記磁性粒子が検出板表面から遠ざけられることによって、前記光信号が消滅する様子を観測した。実験には図１に記載の装置を用いた。検出板２には、厚さ０．７５ｍｍのＳｉＯ_２基板を用いた。光源５には白色ＬＥＤ光源（Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、型番ＭＷＷＨＦ２）を用いた。検出板２の裏面にはＳｉＯ_２ガラス製のプリズム１１を光学的に密着させて配し、検出板２の表面に対して入射角６７°で光源５からの白色光を入射した。磁性粒子には、直径１μｍの磁性ビーズを用いた。前記磁性粒子の濃度は５μｇ／ｍｌとした。前記磁性粒子を含んだ液体試料をＳｉＯ_２基板に１０μｌ滴下した後、５分静置し、重力沈降により前記磁性粒子を検出板２の表面上に沈降させた。白色光の照射によって検出板２の表面に近接場を形成し、光信号の測定を行った。前記光信号は、１０倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、冷却ＣＭＯＳカメラ（ＢＩＴＲＡＮ社、型番ＣＳ－５１Ｍ）にて観測した。つまり、光検出器６として、１０倍の対物レンズを備えたＣＭＯＳカメラを用いたこととなる。遠ざけ磁場を印加する前には、前記近接場によって、前記重力沈降した磁性粒子から発した散乱光による光信号と、夾雑物によるノイズ信号が同時に観測され、この時点では前記磁性粒子と前記夾雑物とを区別できなかった。次に、第１の磁場印加部８の１例である遠ざけ磁場印加部として永久磁石を用いて遠ざけ磁場を印加し、磁性粒子を検出板２の表面から遠ざけると、磁場印加前に前記ＣＭＯＳカメラにて観測された光点の内の幾つかが消滅したことが観測された。このように、前記遠ざけ磁場の印加によって、前記磁性粒子が前記検出板の表面から遠ざかり、その結果、光信号の消滅が生じることから、前記磁性粒子を夾雑物と分けて検出することができた。

（第４の実施形態）
次に、本発明の第４の実施形態に係る光学的検出装置を図１０を参照しつつ説明する。なお、図１０は、第４の実施形態に係る光学的検出装置の説明図である。
図１０に示すように、第４の実施形態に係る標的物質検出装置５０は、公知の表面プラズモン共鳴センサに準じて構成され、プリズム５１と、検出板５２と、カバーガラス５４と、光源５５と、光検出部５６と、第２の磁場印加部５８とで構成される。なお、図中の符号５３は、標的物質を含む試料、磁性粒子、標識物質、重り物質の混合溶液（必ずしも標識物質、重り物質を含むものではない）を示している。
プリズム５１、検出板５２、カバーガラス５４、光源５５及び光検出部５６は、図１を用いて説明した、光学的検出装置１におけるプリズム１１、検出板２、カバーガラス４、光源５及び光検出部６と同様に構成することができ、第４の実施形態に係る光学的検出装置５０は、第１の磁場印加部８に代えて第２の磁場印加部５８が配される点で光学的検出装置１と相違する。以下、相違点について説明する。

第２の磁場印加部５８は、検出板５２の前記裏面側に配されるとともに検出板５２の前記表面上に導入された混合溶液５３中の前記結合体を磁場の印加により検出板５２の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で検出板５２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる。ここで、第２の磁場印加部５８は、永久磁石と前記永久磁石をＸ_１又はＸ_２の方向にスライド移動させるスライド移動部材（不図示）とで形成される。
前記結合体の変動は、第２の磁場印加部５８を磁場印加部として、第２の磁場印加部５８からの前記磁場の印加により検出板５２の前記表面上に導入された混合溶液５３中の前記結合体を検出板５２の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で第２の磁場印加部５８を検出板５２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、第２の磁場印加部５８の移動に追従させて前記結合体を移動させるか又は前記結合体の姿勢を変化させることにより行う（結合体変動工程）。なお、第２の磁場印加部５８を、環状に配置された複数の部材により構成した場合、各部材毎に磁場印加状態を制御することでスライド移動部材を用いずに前記結合体変動工程を行うことも可能である。
第２の磁場印加部５８を用いる場合、前記磁場の印加により混合溶液５３中の前記結合体の全部又は一部を検出板５２の表面上に引き寄せるため、検出板５２の前記表面上に混合溶液５３を導入後、混合溶液５３の液層中を浮遊する前記結合体が検出板５２の前記表面上に重力沈降することを待つ必要がない。

このように構成される光学的検出装置５０では、前記結合体変動工程の実施前後における光信号（２次元画像）が、図１１，１２のように得られ、前記標的物質に基づく光信号ａを、検出板５２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号ｂと明確に区別して検出することができる。なお、図１１が前記結合体変動工程前における、検出板５２の前記表面上の様子を示す図であり、図１２が前記結合体変動工程後における、検出板５２の前記表面上の様子を示す図である。
また、光信号の形状（前記結合体の形状）に異方性が確認できる場合、前記結合体変動工程の実施前後における光信号（２次元画像）を、図１３，１４のように得ることもでき、前記標的物質に基づく光信号ｃを、検出板５２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号ｄと明確に区別して検出することができる。なお、図１３が前記結合体変動工程前における、検出板５２の前記表面上の様子を示す図であり、図１４が前記結合体変動工程後における、検出板５２の前記表面上の様子を示す図である。

このように光学的検出装置５０では、前記結合体変動工程の実施前後において、前記結合体の移動に伴い前記光信号が移動することに加え、前記結合体の姿勢変化に伴い前記光信号が変化することを利用して、前記標的物質に基づく信号を前記ノイズ信号と明確に区別して検出することができる。
なお、図１に示す光学的検出装置１について、第１の磁場印加部８による磁場の印加が前記結合体を検出板２から遠ざけるように実施される例を図示して説明をしたが（第１～第３の実施形態参照）、第１の磁場印加部８による磁場の印加が、前記結合体を検出板２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させるように実施されることで、光学的検出装置５０と同様に、前記結合体の移動に伴って前記光信号が検出板２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動することを利用した前記標的物質の検出を行うことができる。
また、前記光信号の形状（前記結合体の形状）に異方性が確認できる場合も、光学的検出装置５０と同様に、前記結合体の姿勢変化に伴う前記光信号の変化を利用した前記標的物質の検出を行うことができる。

（実施例１）
実施例について述べる。本実施例には、図１に記載の光学的検出装置１を用いた。検出板２には、厚さ０．７５ｍｍのＳｉＯ_２基板を用いた。光源５には白色ＬＥＤ光源（Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、型番ＭＷＷＨＦ２）を用い、出射端にコリメートレンズを装着した６００μｍコア径の光ファイバを用いた。検出板２の裏面にはＳｉＯ_２ガラス製のプリズム１１を光学的に密着させて配し、検出板２の表面に対して入射角６７°で光源５からの白色光を、Ｓ偏光が検出板２に入射するように偏光フィルタを介してプリズム１１へ入射した。

本実施例の検出方法は第３の実施形態に対応する。標的物質として、正常マウスＩｇＧを選択した。磁性粒子としては、２５ｎｍ径の磁性標識ビーズに抗マウスＩｇＧ－ロバ抗体を結合させた粒子を用いた。標識物質としては、５００ｎｍ径のポリスチレンビーズに抗マウスＩｇＧ－ウサギ抗体を結合させた粒子を用いた。前記標的物質を含む溶液に、前記磁性粒子と前記標識物質を混合して混合溶液を作製した後、前記混合溶液１０μｌを検出板２上の液体保持部に導入した。混合溶液を１０分間静置して重力沈降により前記磁性粒子を検出板２の表面上に沈降させた。この状態で、前記白色光の照射によって検出板２の表面に近接場を形成し、光信号の測定を行った。前記光信号は、１０倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、冷却ＣＭＯＳカメラ（ＢＩＴＲＡＮ社、型番ＣＳ－５１Ｍ）にて観測した。つまり、光検出器６として、１０倍の対物レンズを備えたＣＭＯＳカメラを用いたこととなる。

観測された画像を図１５Ａに示す。図１５Ａは、白黒反転処理により、バックグラウンドを白、光信号検出位置を黒とした上で２値化している。同図の視野は大凡３００μｍ×２２５μｍである。同図では、視野全体に数十から百程度の個別の光点が黒点として確認できる。次に、第１の磁場印加部８として永久磁石を用いて遠ざけ磁場を印加した後に観測された画像を図１５Ｂに示す。同図は、図１５Ａと同様の画像処理をしたものである。同図の視野は図１５Ａのものと同一である。図１５Ａ，Ｂの各図中の実線の丸、点線の丸、二重丸は、説明の便宜のために付加したものである。前記遠ざけ磁場の印加により磁性粒子を検出板２の表面から遠ざけ、移動させると、磁場印加前に前記ＣＭＯＳカメラにて観測された図１５Ａ中の光点の内の少なくとも５点（図中、実線の丸で囲んだ中に存在する）が、図１５Ｂでは消滅し（図中、点線の丸で囲んだ中に存在しない）、少なくとも２点（図１５Ａ，Ｂの各図中で二重丸で囲んだ中に存在する）が磁場印加後も光点が確認できる範囲に移動したことが分かる。ここで、消滅・移動した光点は、前記標的物質、前記磁性粒子、及び前記標識物質の結合体が前記遠ざけ磁場によって検出板２の表面から遠ざけられ、或は移動したことによる。本実施例においては、磁場印加後の観察は前記遠ざけ磁場の印加を終了してから行っており、よって検出板２の表面から一旦遠ざけられた結合体が重力沈降により検出板表面に再び近接して観測され得る。本実施例にて観測された結合体の移動は、このようにして観測されたものと考えられる。

このように、前記磁場印加の前後の光信号の差分を取ることで、前記結合体のみが検出可能であることを利用し、誤検知を抑制した前記標的物質の検出が実施できる。

（実施例２）
図１に示す光学的検出装置１の構成にしたがって、実施例２に係る光学的検出装置を次のように製造した。先ず、実施例２に係る検出板２は、光透過性基板を厚み０．７５ｍｍのＳｉＯ_２層で構成し、厚みが３６ｎｍのＳｉ層、厚みが３６５ｎｍのＳｉＯ_２層をこの順番で積層する形で製造した。更に、メトキシオリゴエチレングリコール－シラン化合物により、検出板２の表面に自己組織化単分子膜を形成し、結合体や夾雑物の吸着を抑制する表面処理を行った。

光源５としては、波長精度±１ｎｍ、半値幅１０ｎｍ、照射波長領域３００～１，１００ｎｍの波長可変光源（ＳＭ－１０ＹＮ、分光計器株式会社）を用い、出射端にコリメートレンズを装着した６００μｍコア径の光ファイバを用い、Ｓ偏光が検出板２に入射するように偏光フィルタを介してプリズム１１へ波長６４４ｎｍの単色光を導入した。検出板２の裏面から照射される光の入射角度は、検出板の厚み方向に対して６７．６°傾斜する角度として設定した。この条件で光を照射すると、検出板２を構成するＳｉＯ_２層中に導波モードが励起され、検出板２の表面に増強電場が形成される。なお、この光学系の全反射条件を律する最小の角度であり検出板２の厚み方向に対する傾斜角として表される臨界角は、６６．１°である。光検出部６としては、実施例１と同様の１０倍の対物レンズを備えたＣＭＯＳカメラを用いた。

実施例２に係る光学的検出装置を用いて、次の通り、標的物質の検出試験を行った。本実施例の検出方法は、第３の実施形態に対応する。先ず、検出板２の表面に、実施例１で使用したものと同様の抗マウスＩｇＧ－ロバ抗体付き２５ｎｍ径磁性標識ビーズ（磁性粒子）と抗マウスＩｇＧ－ウサギ抗体付き５００ｎｍ径ポリスチレンビーズ（標識物質）と正常マウスＩｇＧ（標的物質）とを混合して混合溶液を作製し、混合後３０分おいてから、前記混合溶液１０μｌを検出板２上の液体保持部に導入した。次に、光源５から検出板２の裏面に波長６４４ｎｍの単色光を照射した。次に、光検出部６によって検出板２の表面上の検出領域の様子を露光時間１００ｍｓで２次元画像として取得しながら、第１の磁場印加部８としての永久磁石を検出板２の表面に近づけることで磁場を印加した。

本実施例における観察開始時点から1秒おきに取得した２次元画像を図１６Ａ，Ｂ，Ｃに示す。図１６Ａ，Ｂ，Ｃは、白黒反転処理により、バックグラウンドを白、光信号検出位置を黒とした上で２値化している。同図の視野は大凡４５０μｍ×３６０μｍである。各図中の実線の丸、点線の丸、楕円は、説明の便宜のために付加したものである。図１６Ａ，Ｂ，Ｃの画面左下に大きな気泡による散乱光（図中、楕円で囲んだ領域内）が観測されているが、２次元画像情報を取得しているため、検出上はこの領域からの信号を標的物質からの信号と区別することができる。図１６Ａ，Ｂ，Ｃでは、視野全体に数個の個別の光点が黒点として確認できるが、これは、前記５００ｎｍ径ポリスチレンビーズから発せられる散乱光によるものである。前記抗マウスＩｇＧ－ロバ抗体付き２５ｎｍ径磁性標識ビーズと前記抗マウスＩｇＧ－ウサギ抗体付き５００ｎｍ径ポリスチレンビーズと正常マウスＩｇＧの結合体（以下、「結合体Ａ」という。第３の実施形態における結合体Ｍ１に対応する。）が磁場の印加によって移動すると、前記光点の消失又は移動として観測される。

図１６Ａ，Ｂ，Ｃを通して、３つの光点（各図中、実線の丸で囲んだ中に存在する）が磁場印加の影響を受けておらず、結合体Ａを形成していない抗マウスＩｇＧ－ウサギ抗体付き５００ｎｍ径ポリスチレンビーズであることが分かる。実施例１の際と異なり、メトキシオリゴエチレングリコール－シラン化合物による表面修飾を行ったことで、磁場印加によって動かない５００ｎｍ径ポリスチレンビーズの光点が視野中に殆ど存在しておらず、表面修飾の効果により、検出板表面への非特異吸着が抑えられ、ノイズが抑制できたことを示している。

図１６Ａ，Ｂ，Ｃにおいて、各図中２～３個の光点（各図中、点線の丸で囲んで表示）が消失または移動しており、結合体Ａを形成している抗マウスＩｇＧ－ウサギ抗体付き５００ｎｍ径ポリスチレンビーズによる散乱光であることが分かる。このように、前記磁場印加中の経時的な光信号の消失または移動を観測することで、結合体Ａを検出可能であり、誤検知を抑制した前記標的物質の検出が実施できる。

なお、上記実施の形態等で示した例は、発明を理解しやすくするために記載したものであり、この形態に限定されるものではない。

本発明の光学的検出装置及び方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細菌等の生体関連物質を初めとして、微小物質の検出・定量に広く適用でき、産業上有用である。

１，５０ 光学的検出装置
２，５２ 検出板
３，５３ 混合溶液
４，５４ カバーガラス
５，５５ 光源
６，５６ 光検出部
８ 第１の磁場印加部
９ 引き寄せ磁場印加部
１１，５１ プリズム
５８ 第２の磁場印加部
Ｓ 光信号
Ｌ 光
Ｍ１ 標的物質と磁性粒子と標識物質（非磁性）との結合体
Ｍ２ 標的物質と磁性粒子との結合体
Ｎ 標的物質と標識物質（非磁性）との結合体

Claims (7)

1. 近接場を用いて検出板の表面上の標的物質を含む結合体による蛍光又は散乱光を光信号として検出する標的物質の光学的検出方法であって、
   前記結合体は少なくとも前記標的物質と磁性粒子の結合によって形成され、前記検出板の裏面側に配される磁場印加部からの第２の磁場の印加により前記結合体を前記表面上に引き寄せるとともに前記第２の磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記検出板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記近接場内に存在する前記結合体を前記近接場内又は前記近接場外に移動させる第２の結合体移動工程で実施される結合体移動工程によって生じる前記光信号の低減又は移動を計測して、前記標的物質を検出し、かつ、前記表面は、前記結合体の吸着を抑制する化学的な処理が施されるとともに印加磁場に応じて前記近接場内に存在する前記結合体を前記近接場外まで移動可能な面とされることを特徴とする、光学的検出方法。
2. 前記結合体は、前記標的物質に前記磁性粒子が２個以上結合していることを特徴とする請求項１記載の光学的検出方法。
3. 前記結合体は、前記標的物質に、前記近接場による蛍光又は散乱光を発する標識物質が結合していることを特徴とする請求項１乃至２のいずれか１項記載の光学的検出方法。
4. 裏面側から全反射条件で照射される光により表面上に近接場を形成可能な検出板を備え、かつ、標的物質を含む液体の試料及び前記標的物質と結合体を形成する磁性粒子を前記検出板の前記表面上に保持可能な液体保持部と、
   前記全反射条件で前記検出板の前記裏面側から光を照射する光照射部と、
   前記検出板の前記表面側に配され、前記表面上の領域を検出領域とし前記近接場により前記結合体から発せられる蛍光又は散乱光を検出する光検出部と、
   前記検出板の前記裏面側に配されるとともに前記検出板の前記表面上に導入された前記試料中の前記結合体を磁場の印加により前記検出板の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で前記検出板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされ、その移動に追従させて前記近接場内に存在する前記結合体を前記近接場内又は前記近接場外に移動可能とされる第２の磁場印加部で形成される磁場印加部とを
   備え、
   前記表面は、前記結合体の吸着を抑制する表面であるとともに印加磁場に応じて前記近接場内に存在する前記結合体を前記近接場外まで移動可能とされる面とされることを特徴とする、光学的検出装置。
5. 前記光検出部が、前記蛍光又は散乱光を含む検出領域の様子を２次元画像として取得する装置であることを特徴とする請求項４記載の光学的検出装置。
6. 前記検出板が、裏面から表面に向けて、光透過性基板、表面プラズモン共鳴を発生する金属層の順で積層された積層構造を備えることを特徴とする請求項４乃至５のいずれか１項記載の光学的検出装置。
7. 前記検出板が、裏面から表面に向けて、光透過性基板、金属層又は半導体層、光透過性誘電材料で形成される誘電体層の順で積層された積層構造を備えることを特徴とする請求項４乃至５のいずれか１項記載の光学的検出装置。

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