WO2021002185A1 - 検出装置及び検出方法 - Google Patents

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WO2021002185A1
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fluorescence
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light
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PCT/JP2020/023438
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英治 武田
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パナソニックＩｐマネジメント株式会社
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    • G01N33/56983—Viruses

Definitions

  • the present disclosure relates to a detection device and a detection method for detecting a substance to be detected in a sample.
  • Patent Document 1 As a technique for detecting a substance to be detected in a sample, a surface-enhanced fluorescence method that enhances fluorescence by the action of localized surface plasmon resonance of metal fine particles is widely known.
  • Patent Document 1 by using a detection antibody in which metal fine particles and a phosphor are integrated, fluorescence emitted from the phosphor is enhanced by plasmon resonance due to the metal fine particles, so that a trace amount of a substance to be detected is used.
  • a trace amount of a substance to be detected is used.
  • the present disclosure requires a detection device and a detection method capable of accurately detecting a substance to be detected in a sample.
  • the detection device includes a metal body modified with a first substance having a property of specifically binding to a substance to be detected, and a second substance having a property of specifically binding to the substance to be detected.
  • a detection device that detects the substance to be detected by using a phosphor modified with (1), a light source that irradiates light that excites the phosphor, and a predetermined device after stopping the irradiation of the light by the light source.
  • the metal body, the substance to be detected, and the phosphor are bonded to each other based on the light detector that detects the fluorescence emitted by the phosphor over time during the period of 1 and the attenuation characteristic of the fluorescence in the predetermined period.
  • a processing device for detecting the substance to be detected in the complex is provided.
  • Computer-readable recording media include non-volatile recording media such as CD-ROMs (Compact Disc-Read Only Memory).
  • the substance to be detected in the sample can be detected with high accuracy. Further advantages and effects in one aspect of the present disclosure will be apparent from the specification and drawings. Such advantages and / or effects are provided by some embodiments and features described in the specification and drawings, respectively, but not all need to be provided in order to obtain one or more identical features. There is no.
  • FIG. 1A is a diagram showing the relationship between the particle size of the phosphor and its distribution ratio.
  • FIG. 1B is a diagram showing the relationship between the fluorescence intensity of the phosphor and its distribution ratio, and the relationship between the surface-enhanced fluorescence intensity and its distribution ratio, with respect to the phosphor having the particle size distribution of FIG. 1A.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a phenomenon that can occur in the surface-enhanced fluorescence method.
  • FIG. 3 is a schematic configuration diagram showing an example of the detection device according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a perspective view showing an example of the metal body according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view taken along the line VV of FIG. FIG.
  • FIG. 6 is a flowchart showing an example of the operation of the detection device according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of the detailed processing flow of step S6004 of FIG.
  • FIG. 8 is a flowchart showing another example of the detailed processing flow of step S6004 of FIG.
  • FIG. 9 is a flowchart showing another example of the operation of the detection device according to the first embodiment.
  • FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing an example of the detection device according to the second embodiment.
  • FIG. 11 is a schematic configuration diagram showing an example of a detection device according to a modified example of the second embodiment.
  • FIG. 12 is a diagram schematically showing the positional relationship between the metal body and the phosphor in Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
  • FIG. 13 is a diagram showing the attenuation characteristics of the fluorescence intensity of the phosphors of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
  • FIG. 14 is a diagram showing the attenuation characteristics of the fluorescence intensity of the phosphors of Example 1 and Comparative Example 1.
  • the fluorescence method is widely used as a technique for detecting a trace amount of a substance to be detected in a sample.
  • the substance to be detected is labeled with a fluorescent substance (hereinafter, fluorescent substance), the phosphor is irradiated with excitation light, and the fluorescence generated at this time is detected to detect the substance to be detected.
  • a method using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS: Surface Plasmon field-enhanced Fluorescence Spectroscopy), a so-called surface-enhanced fluorescence method, is known. ..
  • SPFS Surface Plasmon field-enhanced Fluorescence Spectroscopy
  • a so-called surface-enhanced fluorescence method is known. ..
  • a fluorescent substance is excited by surface plasmon resonance light generated by surface plasmon resonance (SPR: Surface Plasmon Resonance) to generate fluorescence, and surface plasmon excitation enhanced fluorescence (hereinafter referred to as surface enhanced fluorescence), which is the fluorescence, is generated.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • surface enhanced fluorescence surface enhanced fluorescence
  • the substance to be detected is detected. Since the surface-enhanced fluorescence method exhibits an intensity about 1 to 3 orders of magnitude higher than that of the ordinary fluorescence method, it is possible to
  • the surface-enhanced fluorescence method is a fluorescence detection method with higher sensitivity than the ordinary fluorescence method, but the fluorescence enhanced by the variation in the particle size of the phosphor, the aggregation, and the detection position, and the localized surface plasmon resonance It cannot be detected separately from the fluorescence enhanced by the action of.
  • FIG. 1A is a diagram showing the relationship between the particle size of the phosphor and its distribution ratio.
  • the particle size (also called particle size) of particulate matter is always distributed within a predetermined range. This particle size distribution includes not only the particle size of a single particulate matter but also the particle size of an agglomerate in which a plurality of particulate matter are aggregated.
  • the particle size of the phosphor is distributed in a predetermined range. Further, in general, the larger the particle size of the phosphor, the greater the intensity of fluorescence emitted by the phosphor. Therefore, for the phosphor having the particle size distribution of FIG. 1A, the relationship between the intensity of fluorescence emitted by the phosphor and the distribution ratio thereof is shown by the solid line of FIG. 1B. When the fluorescence of the phosphor exhibiting such a distribution is enhanced by the localized surface plasmon resonance, the fluorescence intensity shifts toward increasing as shown by the broken line in FIG. 1B.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a phenomenon that can occur in the surface-enhanced fluorescence method.
  • FIG. 2 shows an example of using a plasmonic substrate 210 having a metal microstructure in which metal microprojections 201 are periodically arranged on the base material 200.
  • the first metal fine protrusion 210 1 and the second metal fine protrusion 210 2 are adjacent to each other.
  • the electric field strength increases from the gap vicinity portion (gap opening 221) between the metal fine protrusions 201 to the gap, and on the top side (convex portion) of the gap opening between the metal fine protrusions 201.
  • the electric field strength becomes smaller.
  • the first substance 105 which is immobilized on the surface of the metal fine protrusion 201 and has a property of specifically binding to the detection target substance 103, the detection target substance 103, and the phosphor 107 are further labeled.
  • the second substance 109 which has a property of specifically binding to the substance to be detected 103, is shown.
  • the first substance 105 fixed to the metal fine protrusion 201, the substance to be detected 103, and the second substance 109 labeled with the phosphor 107 are sandwich-bonded. Detect the complex.
  • the fluorescence emitted by the phosphor 107 is enhanced depending on the position where the complex is formed and the position of the free phosphor 107.
  • the degree is also different.
  • the phosphor 107 in the complex located in the gap of the metal microprojection 201 shown in the lower right of FIG. 2 radiates the fluorescence 110a enhanced by the locally enhanced electric field.
  • the phosphor 107 in the complex in the vicinity of the gap shown near the center of the figure also emits the fluorescence 110b enhanced by the locally enhanced electric field.
  • the phosphor 107 in the complex located at the top of the metal microprojections 201 also emits fluorescence 110c enhanced by a locally enhanced electric field. Since the electric field intensity in the gap is much larger than the electric field intensity at the opening between the metal fine protrusions 201 and the top of the metal fine protrusions 201, the fluorescence 110a becomes high-luminance fluorescence. As described above, the increasing intensity of the fluorescence emitted by the phosphor 107 differs depending on the difference in the bonding position with the metal fine protrusion 201.
  • the free-state phosphor 107 that is not bound to the metal fine protrusion 201 may also be affected by the localized plasmon resonance depending on the position and distance with respect to the metal fine protrusion 201.
  • the free state phosphor 107 on the left side of the figure is located at the opening of the gap between the adjacent metal microprojections 201, and therefore emits the fluorescence 110e enhanced by the locally enhanced electric field. This fluorescence 110e may also be detected as surface-enhanced fluorescence.
  • the fluorescence emitted by the fluorescence 107 is the original fluorescence of the phosphor 107. ..
  • the fluorescence intensity increases due to aggregation of the phosphor 107 or the like, so that it may be erroneously detected as surface-enhanced fluorescence.
  • the aggregate of the phosphor 107 in the upper left of the figure has a larger particle size than the phosphor 107 alone, and therefore emits fluorescence 112b having a high fluorescence intensity.
  • the fluorescence of the phosphor 107 bonded to the metal fine protrusion 201 may be enhanced by non-specific adsorption without the intervention of the first substance 105.
  • the fluorescence of the phosphor 107 not forming the complex is surface-enhanced. It may be erroneously detected as fluorescence. Therefore, in the conventional fluorescence method, it is necessary to perform a treatment for removing the fluorescent substance 107 in a free state and a treatment for reducing nonspecific adsorption to the metal fine protrusion 201. However, even if these treatments are performed, it is difficult to prevent false detection of surface-enhanced fluorescence. Therefore, it is difficult to accurately detect the substance to be detected 103 by the conventional detection method based on the fluorescence intensity.
  • the inventor of the present application has found that the fluorescence emitted by the phosphor in the complex can be detected based on the fluorescence lifetime peculiar to the phosphor (hereinafter, fluorescence attenuation characteristic).
  • the fluorescence lifetime of a phosphor is unique to that phosphor and is not affected by variations in particle size, aggregation, and detection position of the phosphor.
  • the fluorescence lifetime of a phosphor depends on the ambient environment of the phosphor.
  • the substance labeled by the phosphor (second substance 109 in the above example) itself changes, or the substance labeled by the phosphor is another substance (in the above example, the substance to be detected 103, or the substance to be detected 103, or When it is combined with the metal fine protrusion 201), it becomes shorter because the radiant transition ratio or the non-radiative transition ratio increases.
  • the detection device has a metal body modified with a first substance having a property of specifically binding to the substance to be detected, and a first substance having a property of specifically binding to the substance to be detected. It is a detection device that detects the substance to be detected by using a phosphor modified with two substances, and stops the irradiation of the light by the light source and the light that excites the phosphor. A light detector that detects the fluorescence emitted by the phosphor over time for a predetermined period, and the metal body, the substance to be detected, and the phosphor based on the attenuation characteristics of the fluorescence in the predetermined period. A processing device for detecting the substance to be detected in the bound complex is provided.
  • each phosphor Since each phosphor has a unique fluorescence lifetime, it is possible to derive the fluorescence attenuation characteristic according to the phosphor used. Since the fluorescence lifetime (fluorescence attenuation characteristic) changes depending on the binding state of the phosphor, it is possible to distinguish between the fluorescence lifetime of the phosphor in the complex and the fluorescence lifetime of the fluorescent substance in the free state. Therefore, according to the above configuration, the fluorescence of the phosphor in the complex can be detected based on the derived fluorescence attenuation characteristic, so that the detection accuracy of the substance to be detected is improved.
  • the fluorescence attenuation characteristic is obtained from the time when the light source stops irradiating the light until the intensity of the fluorescence emitted by the phosphor is attenuated to a predetermined intensity.
  • the processor may detect the substance to be detected in the complex when the time is equal to or less than the threshold time.
  • the specific fluorescence lifetime of the phosphor used can be derived as the time until the fluorescence of the phosphor decays to a predetermined intensity (hereinafter, also referred to as attenuation time). Further, in the fluorescence enhanced by the localized surface plasmon resonance, the time until the fluorescence is attenuated to a predetermined intensity is shorter than the attenuation time peculiar to the phosphor. Therefore, if a time shorter than the decay time peculiar to the phosphor is used as the threshold time, the fluorescence of the phosphor in the complex can be detected by detecting the fluorescence that decays in the time equal to or less than the threshold time. Therefore, according to one aspect of the present disclosure, the detection accuracy of the substance to be detected is improved.
  • the fluorescence attenuation characteristic is the said with respect to the maximum value of the fluorescence intensity in the period from when the light source stops irradiating the light to when a predetermined time elapses. It is represented by the attenuation rate, which is the ratio of the attenuation amount of the fluorescence intensity, and the processor may detect the detection target substance in the complex when the value of the attenuation rate is equal to or more than a threshold value.
  • the specific fluorescence lifetime of the phosphor used can be derived as the attenuation rate of the fluorescence of the phosphor. Further, in the fluorescence enhanced by the localized surface plasmon resonance, the attenuation rate of the fluorescence is larger than the attenuation rate of the fluorescence peculiar to the phosphor. Therefore, if an attenuation rate larger than the fluorescence attenuation rate peculiar to the phosphor is used as the threshold value, the fluorescence of the phosphor in the complex can be detected by detecting the fluorescence attenuated at the attenuation rate equal to or higher than the threshold value. .. Therefore, according to one aspect of the present disclosure, the detection accuracy of the substance to be detected is improved.
  • the processor determines whether or not the fluorescence intensity detected by the detector is equal to or higher than the threshold value, and when the fluorescence intensity is equal to or higher than the threshold value.
  • the substance to be detected in the complex may be detected based on the fluorescence attenuation characteristic.
  • the influence of fluorescence due to non-specific adsorption of the phosphor can be reduced. Therefore, the detection accuracy of the substance to be detected is improved.
  • the metal body may be in the form of particles.
  • the solution containing the complex is subjected to, for example, flow cytometry or an external force-assisted near-field illumination (EFA-NI: External Force-Assisted Near-field Illumination) biosensor, etc., in the complex in units of one.
  • ESA-NI External Force-Assisted Near-field Illumination
  • the fluorescence of the phosphor can be detected.
  • the metal body may be a metal microstructure provided on a substrate.
  • the surface area of the metal body is increased, so that the metal body and the substance to be detected are easily bonded. Therefore, the complex is easily formed, and the detection accuracy is improved.
  • the metal body contains, as a main component, a metal that causes localized surface plasmon resonance corresponding to the frequency of light emitted by the light source or the fluorescence frequency of the phosphor. It may be.
  • the fluorescence emitted by the phosphor in the complex is enhanced by the localized surface plasmon resonance generated by the metal body in the complex, and is detected as fluorescence with high fluorescence intensity (so-called surface-enhanced fluorescence).
  • the fluorescence emitted by the phosphor is not enhanced by the localized surface plasmon resonance emitted by the metal body, and is not enhanced in the complex.
  • the fluorescence intensity is very low compared to the fluorescence emitted by the phosphor. Therefore, according to the above configuration, the detection sensitivity of the substance to be detected can be improved.
  • the detection method has a metal body modified with a first substance having a property of specifically binding to a substance to be detected, and a first substance having a property of specifically binding to the substance to be detected. It is a detection method for detecting the substance to be detected by using a phosphor modified with two substances, in which light that excites the phosphor is irradiated, and irradiation of the light by the light source is stopped and then predetermined.
  • the fluorescence emitted by the phosphor is detected over time, and based on the attenuation characteristics of the fluorescence in the predetermined period, the complex in which the metal body, the substance to be detected, and the phosphor are bonded The substance to be detected is detected.
  • each phosphor Since each phosphor has a unique fluorescence lifetime, it is possible to derive the fluorescence attenuation characteristic according to the phosphor used. Since the fluorescence lifetime (fluorescence attenuation characteristic) changes depending on the binding state of the phosphor, it is possible to distinguish between the fluorescence lifetime of the phosphor in the complex and the fluorescence lifetime of the fluorescent substance in the free state. Therefore, according to the above configuration, the fluorescence of the phosphor in the complex can be detected based on the derived fluorescence attenuation characteristic, so that the detection accuracy of the substance to be detected is improved.
  • to detect a substance to be detected means to find out the substance to be detected and confirm the existence of the substance to be detected, and to measure the amount (for example, number or concentration) of the substance to be detected or its range. Including that.
  • FIG. 3 is a schematic configuration diagram showing an example of the detection device 100a according to the first embodiment. Note that FIG. 3 also shows a configuration for specifically explaining an example of the fluorescence method used in the detection device 100a.
  • the detection device 100a has a metal body 50a (see FIG. 4) modified with the first substance 5 having a property of specifically binding to the detection target substance 3, and a third substance having a property of specifically binding to the detection target substance 3.
  • the detection target substance 3 is detected by using the phosphor 7 modified with the two substances 9. More specifically, the detection device 100a excites the phosphor 7 with the light 1 emitted from the light source 10, stops the irradiation of the light 1 from the light source 10, and then the fluorescence 11 of the phosphor 7 for a predetermined period.
  • Fluorescence 12 and Fluorescence 13 are detected over time, and based on the attenuation characteristics of fluorescence 11 to 13 in a predetermined period, a complex in which the metal body 50a, the substance 3 to be detected, and the phosphor 7 are bonded. Is detected.
  • the detection device 100a detects the detection object 30. That is, when the detection device 100a detects the complex, the detection device 100a determines that the detection target object 30 has been detected.
  • the substance to be detected 3 is, for example, a protein, a lipid, a sugar, a nucleic acid, or the like.
  • the substance to be detected 3 may be a protein or nucleic acid constituting the virus, or may be a phospholipid or a sugar chain which is a component of the cell membrane of the virus.
  • These substances are not limited to substances derived from viruses, and may be substances derived from bacteria, molds, animals, plants, insects and the like. For example, it may be an allergen such as pollen.
  • the first substance 5 has a property of specifically binding to the substance to be detected 3.
  • the first substance 5 is fixed to the metal body 50a.
  • the substance to be detected 3 is a protein constituting a virus
  • the first substance 5 is an antibody having the protein as an antigen.
  • the metal body 50a captures the substance to be detected 3 via the first substance 5.
  • the metal body 50a may be arranged on the entire main surface of the sensor substrate 60, or may be arranged on a part of the main surface. It suffices if the metal body 50a can be specifically bound to and captured by the substance to be detected 3.
  • the metal body 50a may be in the form of particles or may be a metal microstructure provided on the substrate. In the present embodiment, the metal body 50a is a metal microstructure provided on the substrate. The specific configuration of the metal body 50a will be described later with reference to FIGS. 4 and 5.
  • the metal body 50a may contain a metal as a main component, which is excited by the light emitted by the light source 10 to cause localized surface plasmon resonance.
  • the metal is, for example, gold, silver, aluminum, or an alloy containing any of these metals as a main component.
  • the surface plasmon is excited in the metal particles constituting the metal body 50a by the light emitted from the light source 10, and localized surface plasmon resonance can be generated in the metal body 50a.
  • the wavelength range in which the localized surface plasmon resonance occurs and the wavelength range in which the phosphor 7 is excited overlap, the fluorescence emitted by the phosphor 7 in the vicinity of the metal body 50a is due to the action of the localized surface plasmon resonance.
  • the excitation energy of the phosphor 7 excites the surface plasmons corresponding to the fluorescence frequency of the phosphor 7 by the energy transfer to the metal body 50a, and the excited surface plasmons are converted into light by Bragg scattering or the like. Also in the phenomenon, fluorescence is enhanced. Fluorescence enhanced by these effects is referred to as surface-enhanced fluorescence. As described above, since the fluorescence of the phosphor 7 is enhanced by the localized surface plasmon resonance, the detection sensitivity of the substance to be detected 3 is improved.
  • the second substance 9 has a property of specifically binding to the substance to be detected 3.
  • the second substance 9 is labeled with the phosphor 7.
  • the second substance 9 is an antibody having the protein as an antigen.
  • the first substance 5 and the second substance 9 each bind to different sites of the detection target substance 3. More specifically, the first substance 5 and the second substance 9 are bound so as to sandwich the detection target substance 3 between these substances (so-called sandwich bond).
  • the first substance 5 and the second substance 9 may be any substance having a property of specifically binding to the detection target substance 3, and the molecular structure thereof is not limited.
  • the first substance 5 and the second substance 9 may be the same kind of molecule or a different kind of molecule as the first substance 5 and the second substance 9. Further, the first substance 5 and the second substance 9 do not bind to each other and exist as separate substances.
  • the phosphor 7 fluoresces when irradiated with excitation light having a predetermined wavelength.
  • the phosphor 7 is composed of, for example, an inorganic ceramic containing a rare earth element or a transition metal element as an activator, an organic fluorescent molecule, a semiconductor quantum dot, or the like.
  • the surface of the phosphor 7 may be surface-modified with a hydrophilic group in order to improve the dispersibility in water, and the surface of the phosphor 7 may be surface-modified with a resin or the like containing a fluorescence inactivation inhibitor in order to reduce the photobleaching of fluorescence. It may be covered.
  • FIG. 4 is a perspective view showing an example of the sensor substrate 60.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view taken along the line VV of FIG.
  • the detection device 100a includes a light source 10, a photodetector 20, a processor 30, and a sensor cell 40.
  • the light source 10 irradiates the light 1 that excites the phosphor 7.
  • the light source 10 irradiates the irradiation region with light 1 having a predetermined wavelength, for example.
  • the irradiation region is an example of a predetermined region, and is a part of the region in the sensor cell 40. That is, the light source 10 irradiates a part of the mixed solution 45 in the sensor cell 40 with the light 1 that excites the phosphor 7.
  • the predetermined wavelength a wavelength capable of exciting the phosphor 7 and inducing surface plasmon resonance in the metal body 50a arranged on the sensor substrate 60 is used.
  • the mixed solution 45 is a solution containing the substance to be detected 3 and the phosphor 7 modified with the second substance 9.
  • the photodetector 20 detects the fluorescence emitted by the phosphor 7 over time for a predetermined period after the irradiation of light by the light source 10 is stopped.
  • the photodetector 20 receives the fluorescence emitted from the phosphor 7 in the irradiation region of the light 1 that excites the phosphor 7, and outputs an electric signal according to the intensity of the fluorescence.
  • the photodetector 20 receives the fluorescence through an optical system 22 composed of a primary optical lens, an optical filter, and a secondary optical lens.
  • the primary optical lens converts the light from the irradiation region in the sensor cell 40 into substantially parallel light.
  • the light from the irradiation region includes scattered light and the like in addition to fluorescence 11 (surface-enhanced fluorescence), fluorescence 12 and fluorescence 13.
  • the optical filter blocks the light 1 that excites the phosphor 7 and allows the wavelength components of fluorescence 11, fluorescence 12, and fluorescence 13 to pass through.
  • the configuration of the secondary optical lens is not limited to the optical filter and the configuration of the secondary optical lens.
  • the processor 30 detects the detection target substance 3 in the complex 6a (see FIG. 5) in which the metal body 50a, the detection target substance 3 and the phosphor 7 are bonded, based on the fluorescence attenuation characteristic in a predetermined period. ..
  • the fluorescence attenuation characteristic is represented by the time from when the light source 10 stops irradiating the light 1 until the intensity of the fluorescence emitted by the phosphor 7 is attenuated to a predetermined intensity.
  • the processor 30 derives the time until the fluorescence intensity emitted by the phosphor 7 is attenuated to a predetermined intensity based on the change amount of the output signal of the photodetector 20 (that is, the change amount of the fluorescence intensity). ..
  • the processor 30 detects the substance to be detected 3 in the complex 6a when the time is equal to or less than the threshold time.
  • the fluorescence attenuation characteristic is represented by the attenuation rate, which is the ratio of the amount of fluorescence intensity attenuation to the maximum value of fluorescence intensity in the period from when the light source 10 stops irradiating light 1 until a predetermined time elapses. May be done.
  • the processor 30 detects the substance to be detected 3 in the complex 6a when the value of the attenuation factor is equal to or greater than the threshold value.
  • the processing device 30 determines whether or not the fluorescence intensity detected by the photodetector 20 is equal to or higher than the threshold value, and when the fluorescence intensity is equal to or higher than the threshold value, the complex is based on the fluorescence attenuation characteristic.
  • the detection target substance 3 in 6a may be detected.
  • the sensor cell 40 contains a mixed solution 45 containing the substance to be detected 3 and the phosphor 7 modified with the second substance 9.
  • a sensor substrate 60 is arranged at the bottom of the sensor cell 40.
  • the sensor cell 40 is a substantially rectangular parallelepiped container and has at least one transparent surface for transmitting excitation light and fluorescence.
  • the sensor cell 40 shown in FIG. 3 is an optical cell whose all surfaces are transparent. In FIG. 3, light 1 that excites the phosphor 7 is incident from the left surface of the sensor cell 40, and fluorescence is emitted from the upper surface.
  • the sensor substrate 60 is a substrate for capturing the detection target substance 3 on the surface, binding the phosphor 7 to the captured detection target substance 3, and optically detecting the detection target substance 3.
  • a plurality of first substances 5 are fixed to the surface of the sensor substrate 60. As described above, the first substance 5 has a property of specifically binding to the substance to be detected 3. Therefore, the sensor substrate 60 can capture the detection target substance 3 in the mixed solution 45 via the first substance 5.
  • the sensor substrate 60 includes a metal body 50a modified with the first substance 5.
  • the sensor substrate 60 includes one or more metal bodies 50a on the main surface on the side in contact with the mixed solution (Z-axis plus side). Therefore, the sensor substrate 60 captures the substance to be detected 3 in the mixed solution 45 via the first substance 5 that modifies the metal body 50a (in other words, is bonded to the metal body 50a).
  • the metal body 50a is a metal microstructure composed of a plurality of fine convex structures 541.
  • the metal body 50a includes a base material 52 having a plurality of protrusions 521 on at least a part of one main surface, and a metal film 54 covering at least the plurality of protrusions 521 on the base material 52.
  • a plurality of fine convex structures 541 corresponding to each of the plurality of protrusions 521 are formed.
  • a plurality of fine convex structures 541 may be formed by forming a metal film on a base material having no protrusion 521 and directly microfabricating the metal film.
  • the plurality of fine convex structures 541 are referred to as metal microstructures.
  • FIG. 6 is a flowchart showing an example of the operation of the detection device 100a according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of the detailed processing flow of step S6004 of FIG.
  • FIG. 8 is a flowchart showing another example of the detailed processing flow of step S6004 of FIG.
  • the first substance 5 is immobilized on the surface of the metal body 50a by bringing the surface of the sensor substrate 60 having the metal body 50a into contact with the solution containing the first substance 5 under predetermined conditions. Then, the excess first substance 5 is washed away with a washing liquid.
  • the sensor cell 40 houses the pre-prepared mixed solution 45 (step S6001).
  • the mixed solution 45 is prepared by mixing, for example, a sample solution that may contain the substance to be detected 3 and a solution that contains the phosphor 7 modified with the second substance 9.
  • the light source 10 irradiates a predetermined region in the sensor cell 40 with light 1 that excites the phosphor 7. (Step S6002).
  • the light source 10 may be a light source that is driven by a pulsed or rectangular voltage or current and emits light corresponding thereto.
  • the photodetector 20 detects fluorescence over time for a predetermined period after the light source 10 stops irradiating the light 1 (step S6003).
  • the predetermined period may be the time until the fluorescence intensity of the phosphor 7 reaches 1 / e (e: the base of the natural logarithm) of the peak value, or the time until it becomes 1/2. Good.
  • the processor 30 detects the substance to be detected 3 in the complex 6a based on the fluorescence attenuation characteristic in a predetermined period (step S6004).
  • the fluorescence attenuation characteristic may be expressed by the time from when the light source 10 stops irradiating the light 1 until the intensity of the fluorescence emitted by the phosphor 7 is attenuated to a predetermined intensity.
  • the predetermined intensity may be 1 / e of the peak value or 1/2 of the intensity.
  • the processor 30 derives the time until the fluorescence intensity decays to a predetermined intensity (step S7001).
  • the processor 30 determines whether or not the derived time is equal to or less than the threshold time (step S7002).
  • step S7002 When the derived time is equal to or less than the threshold time (Yes in step S7002), the processor 30 detects the substance to be detected 3 in the complex 6a (step S7003). On the other hand, when the derived time is longer than the threshold time (No in step S7002), the processor 30 ends the process.
  • the fluorescence attenuation characteristic is represented by the attenuation rate, which is the ratio of the amount of fluorescence intensity attenuation to the maximum value of fluorescence intensity in the period from when the light source 10 stops irradiating light 1 until a predetermined time elapses. May be done.
  • the processor 30 attenuates the fluorescence intensity with respect to the maximum value of the fluorescence intensity in the period from when the irradiation of the excitation light is stopped until the predetermined time elapses.
  • the ratio (attenuation rate) is derived (step S8001).
  • the processor 30 determines whether or not the value of the attenuation rate of the derived fluorescence intensity is equal to or greater than the threshold value (step S8002).
  • the processor 30 detects the substance to be detected 3 in the complex 6a (step S8003).
  • the processor 30 ends the process when the value of the attenuation rate of the derived fluorescence intensity is smaller than the threshold value (No in step S8002).
  • the threshold value can be set according to the phosphor to be used. Further, since the fluorescence lifetime (fluorescence attenuation characteristic) changes depending on the bonding state of the phosphor 7, the fluorescence lifetime of the phosphor 7 in the composite 6a and the fluorescence lifetime of the free phosphor 7 are detected separately. be able to. Therefore, according to the above method, the fluorescence of the phosphor 7 in the composite 6a can be detected based on the fluorescence attenuation characteristic, so that the detection accuracy of the substance 3 to be detected is improved.
  • FIG. 9 is a flowchart showing another example of the operation of the detection device 100a according to the first embodiment. Since steps 9001 to S9003 in FIG. 9 have the same processing flow as steps S6001 to S6003 in FIG. 6, the description thereof will be omitted here.
  • the processor 30 determines whether or not the fluorescence intensity detected by the photodetector 20 is equal to or greater than the threshold value (step S9004).
  • the processor 30 detects the substance 3 to be detected in the complex 6a based on the identification of the fluorescence attenuation in a predetermined period. Detect (step S9005).
  • the processor 30 ends the process. Since the detailed flow of step S9005 is the same as the processing flow described with reference to FIGS. 7 and 8, the description thereof will be omitted here.
  • the influence of fluorescence due to non-specific adsorption of the phosphor 7 can be reduced. Therefore, the detection accuracy of the substance 3 to be detected is improved.
  • the detection device 100a has a metal body 50a modified with the first substance 5 having a property of specifically binding to the detection target substance 3 and a property of specifically binding to the detection target substance 3.
  • a detection device that detects the substance 3 to be detected by using the phosphor 7 modified with the second substance 9, the light source 10 that irradiates the light 1 that excites the phosphor 7, and the light 1 by the light source 10.
  • a light detector 20 that detects the fluorescence emitted by the phosphor 7 over time for a predetermined period after the irradiation is stopped, and a metal body 50a, a substance to be detected 3, and fluorescence based on the fluorescence attenuation characteristics during the predetermined period.
  • a processing device 30 for detecting the substance to be detected 3 in the complex 6a to which the body 7 is bound is provided.
  • each phosphor Since each phosphor has a unique fluorescence lifetime, it is possible to derive the fluorescence attenuation characteristic according to the phosphor used. Since the fluorescence lifetime (fluorescence attenuation characteristic) changes depending on the binding state of the phosphor 7, it is possible to distinguish between the fluorescence lifetime of the phosphor 7 in the composite 6a and the fluorescence lifetime of the fluorescent substance 7 in the free state. Therefore, according to the above configuration, the fluorescence of the phosphor 7 in the composite 6a can be detected based on the derived fluorescence attenuation characteristic, so that the detection accuracy of the detection target substance 3 is improved.
  • the fluorescence attenuation characteristic is represented by the time from when the light source 10 stops irradiating the light 1 until the intensity of the fluorescence emitted by the phosphor 7 is attenuated to a predetermined intensity.
  • 30 may detect the detection target substance 3 in the complex 6a when the time is equal to or less than the threshold time.
  • the specific fluorescence lifetime of the phosphor used can be derived as the time until the fluorescence of the phosphor decays to a predetermined intensity (hereinafter, also referred to as attenuation time). Further, in the fluorescence enhanced by the localized surface plasmon resonance, the time until the fluorescence is attenuated to a predetermined intensity is shorter than the attenuation time of the fluorescence peculiar to the phosphor. Therefore, the fluorescence of the phosphor 7 in the complex 6a can be detected by detecting the fluorescence that attenuates the fluorescence that is shorter than the fluorescence decay time peculiar to the phosphor in a time equal to or less than the threshold time. Therefore, the detection accuracy of the substance to be detected is improved.
  • the fluorescence attenuation characteristic is the amount of attenuation of the fluorescence intensity with respect to the maximum value of the fluorescence intensity in the period from when the light source 10 stops irradiating the light 1 until a predetermined time elapses. It is represented by an attenuation rate which is a ratio, and the processor 30 may detect the detection target substance 3 in the complex 6a when the value of the attenuation rate is equal to or more than the threshold value.
  • the specific fluorescence lifetime of the phosphor used can be derived as the attenuation rate of the fluorescence of the phosphor. Further, in the fluorescence enhanced by the localized surface plasmon resonance, the attenuation rate of the fluorescence is larger than the attenuation rate of the fluorescence peculiar to the phosphor. Therefore, if an attenuation rate larger than the fluorescence attenuation rate peculiar to the phosphor is used as the threshold value, the fluorescence of the phosphor 7 in the composite 6a can be detected by detecting the fluorescence that is attenuated at the attenuation rate equal to or higher than the threshold value. Can be done. Therefore, the detection accuracy of the substance to be detected 3 is improved.
  • the processor 30 determines whether or not the fluorescence intensity detected by the detector 20 is equal to or higher than the threshold value, and when the fluorescence intensity is equal to or higher than the threshold value, the fluorescence attenuation characteristic.
  • the detection target substance 3 in the complex 6a may be detected based on the above.
  • the metal body 50a is a metal microstructure provided on the sensor substrate 60.
  • the surface area of the metal body 50a is increased, so that the metal body 50a and the detection target substance 3 are easily bonded. Therefore, the complex 6a is easily formed, and the detection accuracy of the detection target substance 3 is improved.
  • the metal body 50a may contain a metal that causes localized surface plasmon resonance corresponding to the frequency of the light 1 irradiated by the light source 10 or the fluorescence frequency of the phosphor 7 as a main component.
  • the fluorescence emitted by the phosphor 7 in the complex 6a is enhanced by the localized surface plasmon resonance generated by the metal body 50a in the complex 6a, and is detected as fluorescence with high fluorescence intensity (so-called surface-enhanced fluorescence).
  • the fluorescence emitted by the phosphor 7 is not enhanced by the localized surface plasmon resonance emitted by the metal body 50a.
  • the fluorescence intensity is much lower than the fluorescence emitted by the phosphor 7 in the complex 6a. Therefore, according to the above configuration, the detection sensitivity of the substance to be detected 3 can be improved.
  • FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing an example of the detection device 100b according to the second embodiment.
  • the same components as those of the detection device 100a according to the first embodiment are designated by the same reference numerals, and the description thereof will be omitted.
  • the points different from those of the first embodiment will be mainly described.
  • the sensor cell 40 includes the sensor substrate 60 at the bottom, but the detection device 100b according to the second embodiment does not include the sensor substrate 60.
  • the sensor substrate 60 includes the metal body 50a, which is a metal microstructure, on the main surface on the side in contact with the mixed solution 45 containing the substance to be detected 3 and the phosphor 7, but the second embodiment. Then, the metal body 50b is in the form of particles.
  • the composite body 6b can be easily obtained by adding the metal body 50b to the mixed solution 45 and mixing the mixture.
  • the metal body 50a arranged on the substrate needs to be cleaned in the process of forming the composite body 6a.
  • the composite body 6b can be easily formed in that the cleaning step can be omitted.
  • the sensor cell 40 also includes a free-state phosphor 7 that does not form the complex 6b, and a phosphor 7 that is non-specifically adsorbed on the metal body 50b. Since the metal body 50b is in the form of particles, these phosphors having different bonding forms can be detected as points of light.
  • the metal body 50b may contain a metal that causes localized surface plasmon resonance corresponding to the frequency of the light 1 irradiated by the light source 10 or the fluorescence frequency of the phosphor 7 as a main component. As a result, the metal body 50b can effectively generate localized surface plasmon resonance.
  • the fluorescence 11 emitted by the phosphor 7 in the composite 6b is enhanced by localized surface plasmon resonance. (So-called surface-enhanced fluorescence). Further, the fluorescence 12 emitted by the free state phosphor 7 that does not form the complex 6b is not affected by the localized surface plasmon resonance. Further, the fluorescence 13 emitted by the phosphor 7 non-specifically adsorbed on the metal body 50b has a low fluorescence intensity and a short fluorescence lifetime because the excitation energy of the phosphor 7 moves to the metal body 50b.
  • the metal that causes localized surface plasmon resonance is, for example, gold, silver, aluminum, or an alloy containing any of these metals as a main component.
  • the quench phenomenon is a fluorescence quenching phenomenon in which energy is directly transferred from the phosphor 7 to the metal body 50b and the energy is dissipated.
  • the distance between the phosphor 7 and the surface of the metal body 50b becomes small, so that fluorescence quenching due to the quench phenomenon becomes remarkable.
  • the metal body 50b is composed of gold, silver, aluminum, or an alloy containing any of these metals as a main component, non-specific adsorption can be suppressed, so that the substance to be detected can be detected more accurately. It will be possible.
  • the metal body 50b when the metal body 50b is made of gold, it becomes easy to apply a coating having various functions to the surface of the metal body 50b. For example, if the surface of the metal body 50b is coated with a non-specific adsorption prevention coating, it is possible to reduce the non-specific adsorption of the second substance 9 labeled with the phosphor 7 on the surface of the metal body 50b. As a result, it is possible to reduce the occurrence of false positive and false negative detection results.
  • the sensor cell 40 may be a flow path through which a solution that may contain a complex flows.
  • the fluorescence of the phosphor in the complex can be detected in units of one by subjecting a solution containing the complex to, for example, flow cytometry. Further, for a light spot having a brightness higher than a predetermined brightness, the fluorescence emitted by the phosphor 7 in the composite 6b can be detected based on the fluorescence attenuation characteristic of the phosphor 7, so that the detection target can be more accurately performed. Substance 3 can be detected.
  • FIG. 11 is a schematic configuration diagram showing an example of the detection device 100c according to the modified example of the second embodiment.
  • the same components as those of the detection device 100b according to the second embodiment are designated by the same reference numerals, and the description thereof will be omitted.
  • the points different from those of the second embodiment will be mainly described.
  • the metal body 50c is composed of, for example, a magnetic material having paramagnetism.
  • Paramagnetism refers to magnetism that has no magnetization when there is no external magnetic field and is weakly magnetized in that direction when a magnetic field is applied.
  • the magnetic material having paramagnetism may be, for example, ferrite whose main raw material is iron oxide.
  • the magnetic material is not limited to ferrite, and may be, for example, iron, sodium, aluminum, platinum, or the like.
  • the metal body 50c may contain as a main component a metal that causes localized surface plasmon resonance corresponding to the frequency of the light 1 irradiated by the light source 10 or the fluorescence frequency of the phosphor 7.
  • the metal body 50c has an inner core portion (not shown) composed of the above magnetic material and an outer shell portion (not shown) composed of a non-magnetic metal material that covers the inner core portion and causes localized surface plasmon resonance. (Not shown) and may have.
  • the metal body 50c is magnetized in that direction when an external magnetic field is applied, and localized surface plasmon resonance can be generated by the light 1 emitted from the light source 10.
  • the detection device 100b includes a light introduction unit 46, a sensor cell 42 including a detection plate 44, a first magnetic field application unit 48, and a second magnetic field application unit 49. Different from.
  • the sensor cell 42 is provided with a detection plate 44 at the bottom.
  • the detection plate 44 is in contact with the light introduction unit 46 on the surface opposite to the sensor cell 42 side (hereinafter referred to as the back surface). It is preferable that the back surface of the detection plate 44 and the light introduction portion 46 are in close contact with each other so that the loss of the light 1 emitted from the light source 10 is not generated as much as possible. It comes into contact with the light introduction unit 46.
  • the detection plate 44 and the light introduction portion 46 may be joined by an adhesive layer.
  • the detection plate 44 is a plate-shaped member having light transmission.
  • the detection plate 44 may be composed of a single layer, or may be a laminated body of a plurality of layers having different refractive indexes.
  • the light introduction unit 46 guides the light 1 emitted from the light source 10 to the back surface of the detection plate 44, and the light 1 incident on the detection plate 44 from the back surface is totally reflected on the front surface of the detection plate 44. At this time, an evanescent field or a proximity field such as an augmented electric field is formed on the surface of the detection plate 44 on the side opposite to the side where the light 1 is reflected.
  • the proximity field is formed only near the surface of the detection plate 44.
  • the proximity field is an example of excitation light existing in a limited region near the surface of the detection plate 44.
  • the light introduction unit 46 is realized by, for example, a known prism or the like.
  • the first magnetic field application unit 48 generates a magnetic field gradient in the first direction (hereinafter referred to as the first magnetic field gradient) toward the negative side in the Z-axis direction in the drawing, and attracts the metal body 50c in the sensor cell 42 in the first direction. As a result, the metal body 50c in the sensor cell 42 moves to the surface of the detection plate 44.
  • the first magnetic field application unit 48 may be composed of, for example, a permanent magnet such as a neodymium magnet, a ferrite magnet containing iron oxide or the like as a main component, or an alnico magnet containing aluminum, nickel, cobalt or the like as a main component. Etc. may be configured.
  • the second magnetic field application unit 49 generates a magnetic field gradient in the second direction (hereinafter referred to as the second magnetic field gradient) toward the negative side in the X-axis direction in the drawing, and secondly moves the metal body 50c moved to the surface of the detection plate 44. Pull in the direction. As a result, the metal body 50c moves in the second direction along the surface of the detection plate 44.
  • the second magnetic field application unit 49 may be composed of a permanent magnet such as a neodymium magnet, or may be composed of a ferrite magnet, an alnico magnet, or the like.
  • the movement of the metal body 50c means that the position of the metal body 50c changes along the direction of the applied magnetic field gradient. Further, the position of the bonded body including the metal body 50c also changes along the direction of the applied magnetic field gradient.
  • the metal body 50c is attracted to the surface of the detection plate 44 where the proximity field is generated, and the metal body 50c is further moved along the surface of the detection plate 44.
  • the photodetector 20 can detect the phosphor 7 in the composite 6c as the movement of the light spot in units of one.
  • the phosphor 7 non-specifically adsorbed on the metal body 50c is also detected as the movement of the light spot, but as described above, the quench phenomenon is likely to occur, so that the fluorescence quenching becomes remarkable. Therefore, the brightness is negligibly lower than the brightness of the phosphor 7 in the composite 6c.
  • the fluorescence emitted by the phosphor 7 in the composite 6c can be detected based on the fluorescence attenuation characteristic of the phosphor 7, so that the detection target can be more accurately performed.
  • Substance 3 can be detected.
  • Example 1 the following sensor substrate, phosphor, excitation light and photodetector were used.
  • a substrate provided with a metal microstructure (hereinafter, metal body 50d) composed of a two-dimensional grating having a period of about 750 nm was used.
  • the metallic material of the metal microstructure is gold.
  • phosphor 17 silicon quantum dots (hereinafter, phosphor 17) having a fluorescence wavelength peak in the vicinity of about 850 nm were used.
  • Nd The pulse width of the YAG laser is 5 nsec, and the repetition period is 20 Hz.
  • Photodetector As a photodetector, an infrared photomultiplier tube equipped with InP / InGaAs on the photoelectric surface was used, and the fluorescence intensity at a wavelength of 850 nm and its response time were measured by a spectroscope.
  • FIG. 12 is a diagram schematically showing the positional relationship between the metal body 50d and the phosphor 17 in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 1 As shown in FIG. 12A, in Example 1, a transparent film (not shown) serving as a spacer was arranged on the sensor substrate provided with the metal body 50d. Then, a predetermined amount of the phosphor 17 was placed on the transparent film. The film thickness of the transparent film serving as a spacer was adjusted so that the distance D from the metal body 50d to the phosphor 17 was about 100 nm. This distance is about the same as the distance between the phosphor and the metal body when the sandwich-bonded complex is formed.
  • the conditions for irradiating the metal body 50d and the phosphor 17 with excitation light and detecting the fluorescence emitted by the phosphor 17 are as described above.
  • the detection results of the fluorescence emitted by the phosphor 17 are shown in FIGS. 13 and 14. The results will be described later.
  • Comparative Example 1 The same as in Example 1 except for the height of the spacer. As shown in FIG. 12B, in Comparative Example 1, the height of the spacer was adjusted so that the distance D from the metal body 50d to the phosphor 17 was larger than 1 ⁇ m. This distance can be regarded as sufficiently large that the interaction between the phosphor and the metal body hardly occurs in the near field.
  • the detection results of the fluorescence emitted by the phosphor 17 are shown in FIGS. 13 and 14. The results will be described later.
  • Comparative Example 2 As shown in FIG. 12 (c), in Comparative Example 2, a predetermined amount of the phosphor 17 was placed directly on the sensor substrate provided with the metal body 50d. This assumes a state of contact or very close proximity due to non-specific adsorption between the phosphor and the metal body.
  • FIG. 13 shows the detection result of the fluorescence emitted by the phosphor 17. The results will be described later.
  • FIG. 13 is a diagram showing the attenuation characteristics of the fluorescence intensity of the phosphors of Examples 1 and Comparative Examples 1 and 2. Specifically, FIG. 13 is a graph showing the relationship between the normalized fluorescence intensity of the fluorescence of the phosphor and time.
  • the normalized fluorescence intensity indicates a value normalized by the fluorescence intensity of Comparative Example 1 when the time is 0 msec. The time is 0 msec when the irradiation of the excitation light is stopped, and indicates the elapsed time thereafter.
  • Example 1 the fluorescence intensity of the phosphor 17 when the irradiation of the excitation light was stopped was twice the fluorescence intensity of Comparative Example 1. However, the fluorescence decay time was shorter than the fluorescence decay time of Comparative Example 1.
  • Example 1 the fluorescence of the phosphor 17 was enhanced because the localized surface plasmon resonance occurred in the metal body 50d in Example 1. That is, the interaction between the phosphor 17 and the surface plasmon increases the radiative transition ratio of the phosphor 17, so that the fluorescence intensity of the phosphor 17 increases and the fluorescence decay time becomes shorter.
  • the fluorescence intensity of the quantum dots 17 when the irradiation of the excitation light was stopped was about 1/5 of that of Example 1, and 1 of Comparative Example 1. It was about / 10.
  • the excitation energy of the phosphor 17 is consumed as heat dissipation in the metal at a very large rate. Therefore, the non-radiative transition ratio of the phosphor 17 increased, the fluorescence intensity of the phosphor 17 decreased, and the fluorescence decay time became shorter.
  • Comparative Example 2 the phosphor 17 fluoresces slightly, but as described in the findings leading to the present disclosure, it may not fluoresce at all depending on the degree of the quench phenomenon. Weak fluorescence as in Comparative Example 2 is often excluded from the detection target.
  • FIG. 14 is a diagram showing the fluorescence attenuation characteristics of Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 14 shows the relationship between the normalized fluorescence intensity and the time, which are normalized by setting the fluorescence intensity of each of Example 1 and Comparative Example 1 to 1 when the time is 0 msec.
  • FIG. 14 in addition to the plots of the normalized fluorescence intensity of Example 1 and Comparative Example 1, the results of fitting with an exponential function are shown by solid lines. Since the data acquired from the detector (hereinafter, also referred to as detection data) contains noise, if the fluorescence decay time is calculated using the acquired data as it is, the variation becomes large. Therefore, by fitting the acquired data with an exponential function or the like, the fluorescence decay time can be calculated accurately.
  • the results of fitting the detection data of Example 1 and Comparative Example 1 with the stretched exponential function are shown by a solid line.
  • the fluorescence decay time was calculated from the detection data after fitting. For the fluorescence decay time, the time for the fluorescence intensity to decay to 1 / e of the maximum value was calculated when the base of the natural logarithm is e.
  • the threshold time is set based on the original fluorescence lifetime of the phosphor (here, Comparative Example 1) and the time until the fluorescence intensity of the phosphor decays to a predetermined intensity is equal to or less than the threshold time, the composite is used. It was also confirmed that the substance to be detected in the body could be detected.
  • the fluorescence emitted by the phosphor is the localized surface plasmon resonance in which the metal body is generated and the metal body, as in Examples 1 and 1 and 2, depending on the distance from the metal body. It was confirmed that not only the fluorescence intensity changes but also the fluorescence decay time changes due to the influence of thermal energy transition and the like.
  • the fluorescence intensity of the fluorescence emitted by the phosphor changes depending on the particle size distribution, aggregation, and detection position of the phosphor itself. However, in this case, the decay time of fluorescence emitted by the phosphor (so-called fluorescence lifetime) does not change because it is not affected by disturbances such as localized plasmon resonance.
  • the fluorescence of the non-specifically adsorbed phosphor (Comparative Example 2) is first eliminated by the magnitude of the fluorescence intensity, and the complex is obtained by the fluorescence decay time. It was confirmed that the fluorescence emitted by the fluorescent substance inside and the fluorescence emitted by the fluorescent substance in the free state can be detected separately. Further, in the case of a fluorescent substance non-specifically adsorbed on a metal body as in Comparative Example 2, since a quenching phenomenon occurs, it can be detected separately from surface-enhanced fluorescence in actual detection.
  • the fluorescence of the phosphor in the complex can be detected separately from the fluorescence of the free phosphor by setting only the threshold value of the fluorescence decay time.
  • the threshold value of the fluorescence attenuation rate may be set.
  • Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 a sensor substrate provided with a metal microstructure was used as the metal body 50d, but the metal body may be metal fine particles. It is considered that the same result as above can be obtained by using surface plasmon resonance caused by metal fine particles.
  • the components included in the detection device may be composed of one system LSI (Large Scale Integration: large-scale integrated circuit).
  • the detection device may be composed of a system LSI including a light source, a photodetector, and a processor.
  • the system LSI does not have to include a light source.
  • a system LSI is an ultra-multifunctional LSI manufactured by integrating a plurality of components on a single chip. Specifically, a microprocessor, a ROM (Read Only Memory), a RAM (Random Access Memory), etc. It is a computer system configured to include. A computer program is stored in the ROM. The system LSI achieves its function by operating the microprocessor according to the computer program.
  • system LSI Although it is referred to as a system LSI here, it may be referred to as an IC, an LSI, a super LSI, or an ultra LSI due to the difference in the degree of integration. Further, the method of making an integrated circuit is not limited to LSI, and may be realized by a dedicated circuit or a general-purpose processor. An FPGA (Field Programmable Gate Array) that can be programmed after the LSI is manufactured, or a reconfigurable processor that can reconfigure the connection and settings of the circuit cells inside the LSI may be used.
  • FPGA Field Programmable Gate Array
  • one aspect of the present disclosure may be not only such a detection device but also a detection method in which a characteristic component included in the device is a step. Further, one aspect of the present disclosure may be a computer program that causes a computer to execute each characteristic step included in the detection method. Further, one aspect of the present disclosure may be a non-temporary recording medium that can be read by a computer on which such a computer program is recorded.
  • the present disclosure can be used as a detection device that accurately detects a substance to be detected in a sample based on a change in the fluorescence lifetime of the phosphor.

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Abstract

検出装置（１００ａ）は、検出対象物質（３）と特異的に結合する性質を有する第１物質（５）で修飾された金属体（５０ａ）と、検出対象物質（３）と特異的に結合する性質を有する第２物質（９）で修飾された蛍光体（７）とを用いて、検出対象物質（３）を検出する検出装置であって、蛍光体（７）を励起させる光（１）を照射する光源（１０）と、光源（１０）による光（１）の照射を停止してから所定の期間、蛍光体（７）が発する蛍光を経時的に検出する光検出器（２０）と、所定の期間における蛍光の減衰特性に基づいて、金属体（５０ａ）と検出対象物質（３）と蛍光体（７）とが結合した複合体（６ａ）中の検出対象物質（３）を検出する処理器（３０）と、を備える。

Description

検出装置及び検出方法
　本開示は、試料中の検出対象物質を検出する検出装置及び検出方法に関する。
　従来、試料中の検出対象物質を検出する技術として、金属微粒子の局在表面プラズモン共鳴の作用によって蛍光を増強する表面増強蛍光法が広く知られている。例えば、特許文献１は、金属微粒子と蛍光体とが一体化された検出抗体を用いることにより、蛍光体から発せられた蛍光が金属微粒子によるプラズモン共鳴で増強されるため、微量の検出対象物質を高感度に検出することができることを開示する。
特開２００８－２１６０４６号公報
　しかしながら、特許文献１に記載の従来技術では、蛍光体の粒径のばらつき、凝集、及び、検出位置により増強された蛍光と、局在表面プラズモン共鳴の作用により増強された蛍光とを区別して検出することができない。そのため、特許文献１に記載の従来技術では、試料中の検出対象物質を精度良く検出できるとは言い難い。
　そこで、本開示は、試料中の検出対象物質を精度良く検出することができる検出装置及び検出方法を提要する。
　本開示の一態様に係る検出装置は、検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第１物質で修飾された金属体と、前記検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第２物質で修飾された蛍光体とを用いて、前記検出対象物質を検出する検出装置であって、前記蛍光体を励起させる光を照射する光源と、前記光源による前記光の照射を停止してから所定の期間、前記蛍光体が発する蛍光を経時的に検出する光検出器と、前記所定の期間における前記蛍光の減衰特性に基づいて、前記金属体と前記検出対象物質と前記蛍光体とが結合した複合体中の前記検出対象物質を検出する処理器と、を備える。
　なお、この包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータで読み取り可能な記録媒体で実現されてもよく、装置、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、例えばＣＤ－ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ　Ｄｉｓｃ－Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）などの不揮発性の記録媒体を含む。
　本開示によれば、試料中の検出対象物質を精度良く検出することができる。本開示の一態様における更なる利点および効果は、明細書および図面から明らかにされる。かかる利点および／または効果は、いくつかの実施形態並びに明細書および図面に記載された特徴によってそれぞれ提供されるが、１つまたはそれ以上の同一の特徴を得るために必ずしも全てが提供される必要はない。
図１Ａは、蛍光体の粒径とその分布割合との関係を示す図 図１Ｂは、図１Ａの粒径分布を有する蛍光体について、蛍光体の蛍光の強度とその分布割合との関係、および表面増強蛍光の強度とその分布割合との関係を示す図 図２は、表面増強蛍光法で生じ得る現象を模式的に示す図 図３は、実施の形態１に係る検出装置の一例を示す概略構成図 図４は、実施の形態１における金属体の一例を示す斜視図 図５は、図４のＶ－Ｖ線における概略断面図 図６は、実施の形態１に係る検出装置の動作の一例を示すフローチャート 図７は、図６のステップＳ６００４の詳細な処理フローの一例を示すフローチャート 図８は、図６のステップＳ６００４の詳細な処理フローの他の例を示すフローチャート 図９は、実施の形態１に係る検出装置の動作の他の例を示すフローチャート 図１０は、実施の形態２に係る検出装置の一例を示す概略構成図 図１１は、実施の形態２の変形例に係る検出装置の一例を示す概略構成図 図１２は、実施例１、比較例１及び比較例２における金属体と蛍光体との位置関係を模式的に示す図 図１３は、実施例１、比較例１及び比較例２の蛍光体の蛍光強度の減衰特性を示す図 図１４は、実施例１及び比較例１の蛍光体の蛍光強度の減衰特性を示す図
　（本開示の基礎となった知見）
　試料中の微量の検出対象物質を検出する技術としては、蛍光法が広く用いられている。この蛍光法では、検出対象物質を蛍光物質（以下、蛍光体）で標識して、蛍光体に励起光を照射し、このとき発生する蛍光を検出することにより、検出対象物質を検出する。
　このような蛍光法において、検出感度を向上させるために、例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光（ＳＰＦＳ：Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　ｆｉｅｌｄ－ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を利用する方法、いわゆる、表面増強蛍光法が知られている。かかる方法では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって発生する表面プラズモン共鳴光により蛍光物質を励起して蛍光を発生させ、その蛍光である表面プラズモン励起増強蛍光（以下、表面増強蛍光）を検出することにより、検出対象物質を検出する。表面増強蛍光法は、通常の蛍光法よりも１～３桁ほど高い強度を示すため、通常の蛍光法では検出できない低濃度の検出対象物質も検出できる。
　しかしながら、表面増強蛍光法は、通常の蛍光法よりも高感度の蛍光検出法であるが、蛍光体の粒径のばらつき、凝集、及び、検出位置により増強された蛍光と、局在表面プラズモン共鳴の作用により増強された蛍光とを区別して検出することができない。
　図１Ａは、蛍光体の粒径とその分布割合との関係を示す図である。
　蛍光体に限らず、粒子状物質の粒径（粒度ともいう）は、必ず、所定の範囲に分布する。この粒径分布には、粒子状物質の単体の粒径だけではなく、複数の粒子状物質が凝集した凝集体の粒径も含まれる。
　図１Ａに示されるように、蛍光体の粒径は、所定の範囲に分布している。また、一般に、蛍光体の粒径が大きくなるほど、蛍光体が発する蛍光の強度は大きくなる。ゆえに、図１Ａの粒径分布を有する蛍光体について、蛍光体が発する蛍光の強度とその分布割合との関係は、図１Ｂの実線で示される。このような分布を示す蛍光体の蛍光が局在表面プラズモン共鳴により増強されると、図１Ｂの破線で示すように、蛍光強度が高くなる方向にシフトする。このとき、増強前の蛍光の強度と増強後の蛍光の強度とが重なる部分が生じる（図１Ｂ中の網掛け部分）。そのため、この重複部分に当たる大粒径又は凝集蛍光体が発する蛍光を、表面増強蛍光と区別して検出することができない。
　図２は、表面増強蛍光法で生じ得る現象を模式的に示す図である。図２では、基材２００上に金属微細突起部２０１が周期的に配置された金属微細構造体を有するプラズモニック基板２１０を用いる例を示している。図２では第１の金属微細突起部２１０１と第２の金属微細突起部２１０２が隣接している。
　局在表面プラズモン共鳴では、照射される光の波長より小さいサイズの微細構造を有する金属微細突起部２０１表面の自由電子が、照射される光の電磁場と共鳴して振動し、局所的に非常に強い電場、すなわち、局所増強電場が生じる。この局所増強電場は、金属表面から離れると急激に減少する。図２に示す様に金属微細突起部２０１１と金属微細突起部２０１２が隣接している場合は、隣接する金属微細突起部２０１１と金属微細突起部２０１２間の隙間２２０に最も強い電場が生じ、当該隙間２２０の幅が狭いほど、その電場は大きくなる。つまり、金属微細突起部２０１間の隙間近傍部位（隙間の開口部２２１）から隙間にかけて、電場強度は大きくなり、金属微細突起部２０１間の隙間の開口部よりも頂部側（凸部）では、電場強度は小さくなる。
　図２では、さらに、金属微細突起部２０１の表面に固定化され、検出対象物質１０３と特異的に結合する性質を有する第１物質１０５と、検出対象物質１０３と、蛍光体１０７に標識され、検出対象物質１０３と特異的に結合する性質を有する第２物質１０９と、を示している。ここでは、局在表面プラズモン共鳴を利用して、金属微細突起部２０１に固定された第１物質１０５と、検出対象物質１０３と、蛍光体１０７で標識された第２物質１０９とがサンドイッチ結合した複合体を検出する。
　上述したように、局在表面プラズモン共鳴による局所増強電場の強度は、位置により変化するため、複合体が形成される位置及び遊離状態の蛍光体１０７の位置により、蛍光体１０７が発する蛍光の増強度合いも異なる。
　例えば、図２の右下に示す金属微細突起部２０１の隙間に位置する複合体中の蛍光体１０７は、局所増強電場により増強された蛍光１１０ａを放射する。また、図の中央付近に示す隙間近傍部の複合体中の蛍光体１０７も、局所増強電場により増強された蛍光１１０ｂを放射する。また、金属微細突起部２０１の頂部に位置する複合体中の蛍光体１０７も、局所増強電場により増強された蛍光１１０ｃを放射する。なお、隙間における電場強度は、金属微細突起部２０１間の開口部及び金属微細突起部２０１の頂部における電場強度よりも非常に大きいため、蛍光１１０ａは高輝度の蛍光となる。このように、金属微細突起部２０１との結合位置の違いにより、蛍光体１０７が発する蛍光の増強度が異なる。
　また、金属微細突起部２０１と結合していない遊離状態の蛍光体１０７も、金属微細突起部２０１に対する位置及び距離によっては、局在プラズモン共鳴の影響を受ける場合がある。例えば、図の左側の遊離状態の蛍光体１０７は、隣接する金属微細突起部２０１間の隙間の開口部に位置するため、局所増強電場により増強された蛍光１１０ｅを放射する。この蛍光１１０ｅも、表面増強蛍光として検出される場合がある。しかしながら、例えば、蛍光１１２ａのように、遊離状態の蛍光体１０７が局在表面プラズモン共鳴の影響を受けない位置に存在するときは、蛍光体１０７が発する蛍光は、蛍光体１０７本来の蛍光である。
　また、局在表面プラズモン共鳴の影響を受けなくても、蛍光体１０７の凝集などによっても、蛍光強度が大きくなるため、表面増強蛍光として誤検出される場合がある。例えば、図の左上の蛍光体１０７の凝集体は、蛍光体１０７単体よりも粒径が大きくなるため、蛍光強度の大きい蛍光１１２ｂを放射する。
　また、蛍光１１０ｄ及び蛍光１１３のように、第１物質１０５を介さず、非特異吸着によって金属微細突起部２０１に結合した蛍光体１０７の蛍光が増強される場合もある。
　以上のように、従来の蛍光法では、蛍光強度に基づいて複合体中の蛍光体１０７の蛍光（表面増強蛍光）を検出するため、複合体を形成していない蛍光体１０７の蛍光を表面増強蛍光として誤検出する場合がある。そのため、従来の蛍光法では、遊離状態の蛍光体１０７を除去するための処理、及び、金属微細突起部２０１への非特異吸着を低減するための処理を行う必要がある。しかしながら、これらの処理を実行しても、表面増強蛍光の誤検出を防ぐことが難しい。したがって、従来の蛍光強度に基づく検出方法では、検出対象物質１０３を精度良く検出することが難しい。
　そこで、本願発明者は、上記課題を鑑み鋭意検討した結果、蛍光体特有の蛍光寿命（以下、蛍光の減衰特性）に基づいて、複合体中の蛍光体が発する蛍光を検出できることを見出した。蛍光体の蛍光寿命は、その蛍光体特有のものであり、蛍光体の粒径のばらつき、凝集、及び、検出位置に影響されない。蛍光体の蛍光寿命は、蛍光体の周囲環境に依存する。例えば、蛍光体が標識する物質（上記の例では、第２物質１０９）自身が変化する場合、又は、蛍光体が標識する物質が他の物質（上記の例では、検出対象物質１０３、又は、金属微細突起部２０１）と結合する場合、輻射的遷移割合又は非輻射的遷移割合が増加するため短くなる。
　（本開示の概要）
　そこで、本開示の一態様に係る検出装置は、検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第１物質で修飾された金属体と、前記検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第２物質で修飾された蛍光体とを用いて、前記検出対象物質を検出する検出装置であって、前記蛍光体を励起させる光を照射する光源と、前記光源による前記光の照射を停止してから所定の期間、前記蛍光体が発する蛍光を経時的に検出する光検出器と、前記所定の期間における前記蛍光の減衰特性に基づいて、前記金属体と前記検出対象物質と前記蛍光体とが結合した複合体中の前記検出対象物質を検出する処理器と、を備える。
　蛍光体はそれぞれ固有の蛍光寿命を有するため、使用する蛍光体に応じて蛍光の減衰特性を導出することができる。蛍光寿命（蛍光の減衰特性）は、蛍光体の結合状態によって変化するため、複合体中の蛍光体の蛍光寿命と遊離状態の蛍光体の蛍光寿命とを区別することができる。したがって、上記構成によれば、導出した蛍光の減衰特性に基づいて、複合体中の蛍光体の蛍光を検出することができるため、検出対象物質の検出精度が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る検出装置では、前記蛍光の減衰特性は、前記光源が前記光の照射を停止してから、前記蛍光体が発する前記蛍光の強度が所定の強度に減衰するまでの時間で表され、前記処理器は、前記時間が閾値時間以下である場合に、前記複合体中の前記検出対象物質を検出してもよい。
　上述のように、使用する蛍光体の固有の蛍光寿命は、蛍光体の蛍光が所定の強度に減衰するまでの時間（以下、減衰時間ともいう）として導出することができる。また、局在表面プラズモン共鳴により増強された蛍光では、所定の強度に減衰するまでの時間が蛍光体固有の減衰時間よりも短い。したがって、蛍光体固有の減衰時間よりも短い時間を閾値時間として用いれば、閾値時間以下の時間で減衰する蛍光を検出することにより、複合体中の蛍光体の蛍光を検出することができる。したがって、本開示の一態様によれば、検出対象物質の検出精度が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る検出装置では、前記蛍光の減衰特性は、前記光源が前記光の照射を停止してから所定時間経過するまでの期間における、前記蛍光の強度の最大値に対する前記蛍光の強度の減衰量の比率である減衰率で表され、前記処理器は、前記減衰率の値が閾値以上である場合に、前記複合体中の前記検出対象物質を検出してもよい。
　上述のように、使用する蛍光体の固有の蛍光寿命は、蛍光体の蛍光の減衰率として導出することができる。また、局在表面プラズモン共鳴により増強された蛍光では、蛍光の減衰率が蛍光体固有の蛍光の減衰率よりも大きい。したがって、蛍光体固有の蛍光の減衰率よりも大きい減衰率を閾値として用いれば、閾値以上の減衰率で減衰する蛍光を検出することにより、複合体中の蛍光体の蛍光を検出することができる。したがって、本開示の一態様によれば、検出対象物質の検出精度が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る検出装置では、前記処理器は、前記検出器が検出した前記蛍光の強度が閾値以上であるか否かを判定し、前記蛍光の強度が閾値強度以上の場合に、前記蛍光の減衰特性に基づいて、前記複合体中の前記検出対象物質を検出してもよい。
　このように、蛍光の強度が閾値以上であるか否かを判定することにより、蛍光体の非特異吸着による蛍光の影響を低減することができる。そのため、検出対象物質の検出精度が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る検出装置では、前記金属体は、粒子状であってもよい。
　これにより、複合体を含む溶液を、例えばフローサイトメトリー又は外力支援型近接場照明（ＥＦＡ－ＮＩ：Ｅｘｔｅｒｎａｌ　Ｆｏｒｃｅ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｎｅａｒ－ｆｉｅｌｄ　Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）バイオセンサなどに供して、１個単位で複合体中の蛍光体の蛍光を検出することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る検出装置では、前記金属体は、基板上に設けられた金属微細構造体であってもよい。
　これにより、金属体の表面積が大きくなるため、金属体と検出対象物質とが結合しやすくなる。そのため、複合体が形成されやすくなり、検出精度が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る検出装置では、前記金属体は、前記光源が照射する光の周波数、又は前記蛍光体の蛍光周波数に対応した局在表面プラズモン共鳴を生じる金属を主成分として含んでもよい。
　これにより、複合体中の蛍光体が発する蛍光は、複合体中の金属体が生じる局在表面プラズモン共鳴によって増強され、蛍光強度の高い蛍光（いわゆる、表面増強蛍光）として検出される。一方、複合体を形成していない蛍光体は、金属体と空間的に接近していないため、蛍光体が発する蛍光は、金属体が発する局在表面プラズモン共鳴によって増強されず、複合体中の蛍光体が発する蛍光に比べて蛍光強度が非常に低い。したがって、上記構成によれば、検出対象物質の検出感度を向上することができる。
　また、本開示の一態様に係る検出方法は、検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第１物質で修飾された金属体と、前記検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第２物質で修飾された蛍光体とを用いて、前記検出対象物質を検出する検出方法であって、前記蛍光体を励起させる光を照射し、前記光源による前記光の照射を停止してから所定の期間、前記蛍光体が発する蛍光を経時的に検出し、前記所定の期間における前記蛍光の減衰特性に基づいて、前記金属体と前記検出対象物質と前記蛍光体とが結合した複合体中の前記検出対象物質を検出する。
　蛍光体はそれぞれ固有の蛍光寿命を有するため、使用する蛍光体に応じて蛍光の減衰特性を導出することができる。蛍光寿命（蛍光の減衰特性）は、蛍光体の結合状態によって変化するため、複合体中の蛍光体の蛍光寿命と遊離状態の蛍光体の蛍光寿命とを区別することができる。したがって、上記構成によれば、導出した蛍光の減衰特性に基づいて、複合体中の蛍光体の蛍光を検出することができるため、検出対象物質の検出精度が向上する。
　なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータで読み取り可能なＣＤ－ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
　以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。また、各図は、必ずしも厳密に図示されたものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。
　また、以下において、平行及び垂直などの要素間の関係性を示す用語、及び、円筒形状などの要素の形状を示す用語、並びに、数値範囲は、厳格な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば、数％程度の誤差をも含むことを意味する。
　また、以下において、検出対象物質を検出するとは、検出対象物質を見つけ出して検出対象物質の存在を確認することに加えて、検出対象物質の量（例えば、数又は濃度）又はその範囲を計測することを含む。
　（実施の形態１）
　［検出装置の概要］
　まず、実施の形態１に係る検出装置の概要について説明する。図３は、実施の形態１に係る検出装置１００ａの一例を示す概略構成図である。なお、図３には、検出装置１００ａで使用される蛍光法の一例を具体的に説明するための構成も図示されている。
　検出装置１００ａは、検出対象物質３と特異的に結合する性質を有する第１物質５で修飾された金属体５０ａ（図４参照）と、検出対象物質３と特異的に結合する性質を有する第２物質９で修飾された蛍光体７とを用いて、検出対象物質３を検出する。より具体的には、検出装置１００ａは、光源１０から照射された光１で蛍光体７を励起させ、光源１０からの光１の照射を停止してから所定の期間、蛍光体７の蛍光１１、蛍光１２、及び、蛍光１３を経時的に検出した結果から、所定の期間における蛍光１１～１３の減衰特性に基づいて、金属体５０ａと検出対象物質３と蛍光体７とが結合した複合体を検出する。これにより検出装置１００ａは、検出対象物３０を検出する。つまり、検出装置１００ａが複合体を検出した場合、検出装置１００ａは検出対象物３０を検出したと決定する。
　検出対象物質３は、例えば、タンパク質、脂質、糖、核酸等である。例えば、検出対象物質３は、ウイルスを構成するタンパク質又は核酸などであってもよく、ウイルスの細胞膜の構成成分であるリン脂質又は糖鎖であってもよい。これらの物質は、ウイルス由来の物質に限られず、細菌、カビ類、動物、植物又は昆虫などに由来する物質であってもよい。例えば、花粉などのアレルゲンであってもよい。
　第１物質５は、検出対象物質３と特異的に結合する性質を有する。第１物質５は、金属体５０ａに固定される。例えば、検出対象物質３がウイルスを構成するタンパク質である場合、第１物質５は、当該タンパク質を抗原とする抗体である。
　金属体５０ａ（図４参照）は、第１物質５を介して検出対象物質３を捕捉する。金属体５０ａは、センサ基板６０の主面の全体に配置されてもよく、当該主面の一部に配置されてもよい。金属体５０ａは、検出対象物質３と特異的に結合して捕捉することができればよい。金属体５０ａは、粒子状であってもよく、基板上に設けられた金属微細構造体であってもよい。本実施の形態では、金属体５０ａは、基板上に設けられた金属微細構造体である。なお、金属体５０ａの具体的な構成については、図４及び図５を参照しながら後述する。
　金属体５０ａは、光源１０が照射する光により励起されて局在表面プラズモン共鳴を生じる金属を主成分として含んでもよい。当該金属は、例えば、金、銀、アルミニウム、又は、これらのいずれかの金属を主成分として含有する合金である。これにより、光源１０から照射される光により、金属体５０ａを構成する金属粒子内に表面プラズモンが励起されて、金属体５０ａに局在表面プラズモン共鳴を生じさせることができる。このとき、この局在表面プラズモン共鳴が生じる波長域と、蛍光体７を励起する波長域が重なるため、金属体５０ａの近傍にある蛍光体７が発する蛍光は、局在表面プラズモン共鳴の作用により増強される。また、蛍光体７の励起エネルギーが、金属体５０ａへのエネルギー移動により蛍光体７の蛍光周波数に対応する表面プラズモンを励起し、その励起された表面プラズモンがブラッグ散乱などにより光へと変換される現象においても、蛍光が増強される。これらの効果で増強された蛍光を表面増強蛍光と称する。このように、蛍光体７の蛍光が局在表面プラズモン共鳴により増強されるため、検出対象物質３の検出感度が向上する。
　第２物質９は、検出対象物質３と特異的に結合する性質を有する。第２物質９は、蛍光体７で標識されている。例えば、検出対象物質３がウイルスを構成するタンパク質である場合、第２物質９は、当該タンパク質を抗原とする抗体である。
　図３に示されるように、第１物質５及び第２物質９は、それぞれ、検出対象物質３の異なる部位と結合する。より具体的には、第１物質５及び第２物質９は、検出対象物質３をこれらの物質の間に挟むように結合（いわゆる、サンドイッチ結合）する。
　第１物質５及び第２物質９は、検出対象物質３と特異的に結合する性質を有する物質であればよく、その分子構造は限定されない。第１物質５と第２物質９とは、第１物質５と第２物質９とは、同種分子であってもよく、異種分子であってもよい。また、第１物質５と第２物質９とは、結合することなく、それぞれ別個の物質として存在する。
　蛍光体７は、所定の波長を有する励起光の照射により蛍光を発する。蛍光体７は、例えば、希土類元素又は遷移金属元素などを賦活剤とした無機セラミック、有機蛍光分子又は半導体量子ドット等を含んで構成される。蛍光体７は、例えば、水中での分散性を高めるために、親水基で表面修飾されてもよく、蛍光の光退色を低減するために、蛍光の失活防止剤を含む樹脂等で表面を覆われてもよい。
　［検出装置の構成］
　続いて、検出装置１００ａの構成について図３から図５を参照しながら説明する。図４は、センサ基板６０の一例を示す斜視図である。図５は、図４のＶ－Ｖ線における概略断面図である。
　図３に示されるように、検出装置１００ａは、光源１０と、光検出器２０と、処理器３０と、センサセル４０と、を備える。
　光源１０は、蛍光体７を励起させる光１を照射する。光源１０は、例えば、照射領域に所定の波長を有する光１を照射する。照射領域は、所定領域の一例であり、センサセル４０内の領域の一部分である。つまり、光源１０は、センサセル４０内の混合溶液４５の一部に、蛍光体７を励起させる光１を照射する。所定の波長としては、蛍光体７を励起するとともに、センサ基板６０上に配置されている金属体５０ａでの表面プラズモン共鳴を誘起することができる波長が用いられる。なお、混合溶液４５は、検出対象物質３と、第２物質９で修飾された蛍光体７とを含む溶液である。
　光検出器２０は、光源１０による光の照射を停止してから所定の期間、蛍光体７が発する蛍光を経時的に検出する。光検出器２０は、蛍光体７を励起する光１の照射領域において蛍光体７から発せられた蛍光を受光し、蛍光の強度に応じた電気信号を出力する。光検出器２０は、当該蛍光を一次光学レンズ、光学フィルタ及び二次光学レンズから構成される光学系２２を介して受光する。
　一次光学レンズは、センサセル４０内の照射領域からの光を略平行光に変換する。ここでは、照射領域からの光には、蛍光１１（表面増強蛍光）、蛍光１２及び蛍光１３に加えて、散乱光などが含まれる。光学フィルタは、蛍光体７を励起させる光１を遮断し、蛍光１１、蛍光１２及び蛍光１３の波長成分を通過させる。二次光学レンズは、光学フィルタ、及び、二次光学レンズの構成は、これに限られない。
　処理器３０は、所定の期間における蛍光の減衰特性に基づいて、金属体５０ａと検出対象物質３と蛍光体７とが結合した複合体６ａ（図５参照）中の検出対象物質３を検出する。蛍光の減衰特性は、光源１０が光１の照射を停止してから、蛍光体７が発する蛍光の強度が所定の強度に減衰するまでの時間で表される。処理器３０は、光検出器２０の出力信号の変化量（つまり、蛍光の強度の変化量）に基づいて、蛍光体７が発する蛍光の強度が所定の強度に減衰するまでの時間を導出する。処理器３０は、当該時間が閾値時間以下である場合に、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出する。また、蛍光の減衰特性は、光源１０が光１の照射を停止してから所定時間経過するまでの期間における、蛍光の強度の最大値に対する蛍光の強度の減衰量の比率である減衰率で表されてもよい。このとき、処理器３０は、減衰率の値が閾値以上である場合に、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出する。
　なお、処理器３０は、光検出器２０が検出した蛍光の強度が閾値以上であるか否かを判定し、蛍光の強度が閾値強度以上の場合に、蛍光の減衰特性に基づいて、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出してもよい。
　センサセル４０は、検出対象物質３と、第２物質９で修飾された蛍光体７とを含む混合溶液４５を収容する。センサセル４０の底部には、センサ基板６０が配置されている。例えば、センサセル４０は、略直方体の容器であり、励起光と蛍光を透過させるための透明な面を少なくとも１つ有する。図３に示すセンサセル４０は、全ての面が透明な光学セルである。図３では、センサセル４０の左面から蛍光体７を励起する光１が入射し、上面から蛍光が出射している。
　センサ基板６０は、検出対象物質３を表面に捕捉して、捕捉した検出対象物質３に蛍光体７を結合させて、検出対象物質３を光学的に検出するための基板である。センサ基板６０は、表面に複数の第１物質５が固定されている。上述したように、第１物質５は、検出対象物質３と特異的に結合する性質を有する。そのため、センサ基板６０は、第１物質５を介して、混合溶液４５中の検出対象物質３を捕捉することができる。
　センサ基板６０は、第１物質５で修飾された金属体５０ａを備える。例えば、図４に示されるように、センサ基板６０は、混合溶液と接する側（Ｚ軸プラス側）の主面上に１以上の金属体５０ａを備える。そのため、センサ基板６０は、金属体５０ａを修飾している（言い換えると、金属体５０ａと結合している）第１物質５を介して、混合溶液４５中の検出対象物質３を捕捉する。
　また、図４及び図５に示されるように、金属体５０ａは、複数の微細凸状構造体５４１から構成される金属微細構造体である。金属体５０ａは、一方の主面の少なくとも一部に複数の突起部５２１を有する基材５２と、基材５２上の少なくとも複数の突起部５２１を被覆する金属膜５４とを備える。これにより、複数の突起部５２１のそれぞれに対応した複数の微細凸状構造体５４１が形成される。また、突起部５２１を有しない基材上に金属膜を形成し、この金属膜を直接微細加工することで、複数の微細凸状構造体５４１を形成してもよい。この複数の微細凸状構造体５４１を、金属微細構造体と呼ぶ。
　［検出装置の動作］
　続いて、検出装置１００ａの動作について図６～図８を参照しながら説明する。図６は、実施の形態１に係る検出装置１００ａの動作の一例を示すフローチャートである。図７は、図６のステップＳ６００４の詳細な処理フローの一例を示すフローチャートである。図８は、図６のステップＳ６００４の詳細な処理フローの他の例を示すフローチャートである。
　図６のフローを説明する前に、まず、センサ基板６０への第１物質５の固定化について説明する。センサ基板６０の金属体５０ａを備える面を、第１物質５を含む溶液に所定の条件で接触させることにより、金属体５０ａの表面に第１物質５を固定化する。その後、余分な第１物質５を洗浄液で洗い流すことで洗浄する。
　続いて、センサセル４０は、予め調整された混合溶液４５を収容する（ステップＳ６００１）。混合溶液４５は、例えば、検出対象物質３を含み得る試料溶液、及び、第２物質９で修飾された蛍光体７を含む溶液を混合して調製される。
　次いで、光源１０は、センサセル４０内の所定領域に蛍光体７を励起させる光１を照射する（ステップＳ６００２）。光源１０は、パルス又は矩形の電圧又は電流で駆動され、それに対応した光を発する光源であってもよい。
　次いで、光検出器２０は、光源１０が光１の照射を停止してから、所定の期間、蛍光を経時的に検出する（ステップＳ６００３）。所定の期間とは、蛍光体７の蛍光強度がピーク値の１／ｅ（ｅ：自然対数の底）となるまでの時間であってもよく、１／２となるまでの時間であってもよい。
　次いで、処理器３０は、所定の期間における蛍光の減衰特性に基づいて、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出する（ステップＳ６００４）。例えば、蛍光の減衰特性は、光源１０が光１の照射を停止してから、蛍光体７が発する蛍光の強度が所定の強度に減衰するまでの時間で表されてもよい。所定の強度は、ピーク値の１／ｅの強度であってもよく、１／２の強度であってもよい。この場合、処理器３０は、図７に示されるように、上記の蛍光の強度が所定の強度に減衰するまでの時間を導出する（ステップＳ７００１）。次いで、処理器３０は、導出した時間が閾値時間以下であるか否かを判定する（ステップＳ７００２）。処理器３０は、導出した時間が閾値時間以下である場合（ステップＳ７００２でＹｅｓ）、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出する（ステップＳ７００３）。一方、処理器３０は、導出した時間が閾値時間より長い場合（ステップＳ７００２でＮｏ）、処理を終了する。
　また、蛍光の減衰特性は、光源１０が光１の照射を停止してから所定時間経過するまでの期間における、蛍光の強度の最大値に対する蛍光の強度の減衰量の比率である減衰率で表されてもよい。この場合、処理器３０は、図８に示されるように、励起光の照射を停止してから所定時間経過達するまでの期間における、上記の蛍光の強度の最大値に対する蛍光の強度の減衰量の比率（減衰率）を導出する（ステップＳ８００１）。次いで、処理器３０は、導出した蛍光の強度の減衰率の値が閾値以上であるか否かを判定する（ステップＳ８００２）。処理器３０は、導出した蛍光の強度の減衰率の値が閾値以上である場合（ステップＳ６００２でＹｅｓ）、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出する（ステップＳ８００３）。一方、処理器３０は、導出した蛍光の強度の減衰率の値が閾値よりも小さい場合（ステップＳ８００２でＮｏ）、処理を終了する。
　上記の方法によれば、蛍光体の固有の蛍光寿命に基づいて蛍光の減衰特性を導出することができるため、使用する蛍光体に応じて閾値を設定することができる。また、蛍光寿命（蛍光の減衰特性）は、蛍光体７の結合状態によって変化するため、複合体６ａ中の蛍光体７の蛍光寿命と遊離状態の蛍光体７の蛍光寿命とを区別して検出することができる。したがって、上記方法によれば、蛍光の減衰特性に基づいて、複合体６ａ中の蛍光体７の蛍光を検出することができるため、検出対象物質３の検出精度が向上する。
　また、検出装置１００ａは、以下の処理フローを実行してもよい。図９は、実施の形態１に係る検出装置１００ａの動作の他の例を示すフローチャートである。図９のステップ９００１～ステップＳ９００３は、それぞれ、図６のステップＳ６００１～ステップＳ６００３と同じ処理フローであるため、ここでの説明を省略する。
　処理器３０は、光検出器２０が検出した蛍光の強度が閾値以上であるか否かを判定する（ステップＳ９００４）。処理器３０は、光検出器２０が検出した蛍光の強度が閾値以上である場合（ステップＳ９００４でＹｅｓ）、所定の期間における蛍光の減衰特定に基づいて、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出する（ステップＳ９００５）。一方、処理器３０は、光検出器２０が検出した蛍光の強度が閾値よりも小さい場合（ステップＳ９００４でＮｏ）、処理を終了する。なお、ステップＳ９００５の詳細フローについては、図７及び図８で説明した処理フローと同じであるため、ここでの説明を省略する。
　このように、蛍光の強度が閾値以上であるか否かを判定することにより、蛍光体７の非特異吸着による蛍光の影響を低減することができる。そのため、検出対象物質３の検出精度が向上する。
　［効果等］
　実施の形態１に係る検出装置１００ａは、検出対象物質３と特異的に結合する性質を有する第１物質５で修飾された金属体５０ａと、検出対象物質３と特異的に結合する性質を有する第２物質９で修飾された蛍光体７とを用いて、検出対象物質３を検出する検出装置であって、蛍光体７を励起させる光１を照射する光源１０と、光源１０による光１の照射を停止してから所定の期間、蛍光体７が発する蛍光を経時的に検出する光検出器２０と、所定の期間における蛍光の減衰特性に基づいて、金属体５０ａと検出対象物質３と蛍光体７とが結合した複合体６ａ中の検出対象物質３を検出する処理器３０と、を備える。
　蛍光体はそれぞれ固有の蛍光寿命を有するため、使用する蛍光体に応じて蛍光の減衰特性を導出することができる。蛍光寿命（蛍光の減衰特性）は、蛍光体７の結合状態によって変化するため、複合体６ａ中の蛍光体７の蛍光寿命と遊離状態の蛍光体７の蛍光寿命とを区別することができる。したがって、上記構成によれば、導出した蛍光の減衰特性に基づいて、複合体６ａ中の蛍光体７の蛍光を検出することができるため、検出対象物質３の検出精度が向上する。
　例えば、検出装置１００ａでは、蛍光の減衰特性は、光源１０が光１の照射を停止してから、蛍光体７が発する蛍光の強度が所定の強度に減衰するまでの時間で表され、処理器３０は、時間が閾値時間以下である場合に、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出してもよい。
　上述のように、使用する蛍光体の固有の蛍光寿命は、蛍光体の蛍光が所定の強度に減衰するまでの時間（以下、減衰時間ともいう）として導出することができる。また、局在表面プラズモン共鳴により増強された蛍光では、所定の強度に減衰するまでの時間が蛍光体固有の蛍光の減衰時間よりも短い。したがって、蛍光体固有の蛍光の減衰時間よりも短い時間を閾値時間以下の時間で減衰する蛍光を検出することにより、複合体６ａ中の蛍光体７の蛍光を検出することができる。したがって、検出対象物質の検出精度が向上する。
　また、例えば、検出装置１００ａでは、蛍光の減衰特性は、光源１０が光１の照射を停止してから所定時間経過するまでの期間における、蛍光の強度の最大値に対する蛍光の強度の減衰量の比率である減衰率で表され、処理器３０は、減衰率の値が閾値以上である場合に、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出してもよい。
　上述のように、使用する蛍光体の固有の蛍光寿命は、蛍光体の蛍光の減衰率として導出することができる。また、局在表面プラズモン共鳴により増強された蛍光では、蛍光の減衰率が蛍光体固有の蛍光の減衰率よりも大きい。したがって、蛍光体固有の蛍光の減衰率よりも大きい減衰率を閾値として用いれば、閾値以上の減衰率で減衰する蛍光を検出することにより、複合体６ａ中の蛍光体７の蛍光を検出することができる。したがって、検出対象物質３の検出精度が向上する。
　また、例えば、検出装置１００ａでは、処理器３０は、検出器２０が検出した蛍光の強度が閾値以上であるか否かを判定し、蛍光の強度が閾値強度以上の場合に、蛍光の減衰特性に基づいて、複合体６ａ中の検出対象物質３を検出してもよい。
　このように、蛍光の強度が閾値以上であるか否かを判定することにより、非特異吸着による蛍光の影響を低減することができる。そのため、検出対象物質３の検出精度が向上する。
　検出装置１００ａでは、金属体５０ａは、センサ基板６０上に設けられた金属微細構造体である。
　これにより、金属体５０ａの表面積が大きくなるため、金属体５０ａと検出対象物質３とが結合しやすくなる。そのため、複合体６ａが形成されやすくなり、検出対象物質３の検出精度が向上する。
　例えば、検出装置１００ａでは、金属体５０ａは、光源１０が照射する光１の周波数又は蛍光体７の蛍光周波数に対応した局在表面プラズモン共鳴を生じる金属を主成分として含んでもよい。
　これにより、複合体６ａ中の蛍光体７が発する蛍光は、複合体６ａ中の金属体５０ａが生じる局在表面プラズモン共鳴によって増強され、蛍光強度の高い蛍光（いわゆる、表面増強蛍光）として検出される。一方、複合体６ａを形成していない蛍光体７は、金属体５０ａと空間的に接近していないため、蛍光体７が発する蛍光は、金属体５０ａが発する局在表面プラズモン共鳴によって増強されず、複合体６ａ中の蛍光体７が発する蛍光に比べて蛍光強度が非常に低い。したがって、上記構成によれば、検出対象物質３の検出感度を向上することができる。
　（実施の形態２）
　続いて、実施の形態２に係る検出装置について図１０を参照しながら説明する。図１０は、実施の形態２に係る検出装置１００ｂの一例を示す概略構成図である。なお、実施の形態１に係る検出装置１００ａと同じ構成については同じ符号を付し、説明を省略する。以下、実施の形態１と異なる点を中心に説明する。
　実施の形態１に係る検出装置１００ａでは、センサセル４０は、底部にセンサ基板６０を備えるが、実施の形態２に係る検出装置１００ｂは、センサ基板６０を備えない。また、実施の形態１では、センサ基板６０は、検出対象物質３及び蛍光体７を含む混合溶液４５と接する側の主面に金属微細構造体である金属体５０ａを備えるが、実施の形態２では、金属体５０ｂは粒子状である。
　実施の形態２では、金属体５０ｂが粒子状であるため、混合溶液４５に金属体５０ｂを添加して混合することにより、容易に複合体６ｂを得ることができる。基板上に配置された金属体５０ａでは、複合体６ａを形成する過程で、洗浄する必要がある。金属体５０ｂが粒子状である場合、洗浄工程を省ける点で、容易に複合体６ｂを形成することができる。このとき、センサセル４０内には、複合体６ｂの他に、複合体６ｂを形成していない遊離状態の蛍光体７、及び、金属体５０ｂに非特異吸着した蛍光体７も含まれる。金属体５０ｂが粒子状であるため、これらの結合形態の異なる蛍光体を光の点として検出することができる。
　金属体５０ｂは、光源１０が照射する光１の周波数又は蛍光体７の蛍光周波数に対応した局在表面プラズモン共鳴を生じる金属を主成分として含んでもよい。これにより、金属体５０ｂは、効果的に局在表面プラズモン共鳴を生じさせることができる。
　例えば、図１０に示されるように、光源１０から蛍光体７を励起させる光１が照射されると、複合体６ｂ中の蛍光体７が発する蛍光１１は、局在表面プラズモン共鳴により増強される（いわゆる、表面増強蛍光）。また、複合体６ｂを形成していない遊離状態の蛍光体７が発する蛍光１２は、局在表面プラズモン共鳴の影響を受けない。また、金属体５０ｂに非特異吸着した蛍光体７が発する蛍光１３は、蛍光体７の励起エネルギーが金属体５０ｂに移動するため、蛍光強度が低く、蛍光寿命も短い。
　局在表面プラズモン共鳴を生じる金属は、例えば、金、銀、アルミニウム、又は、これらのいずれかの金属を主成分として含有する合金である。このとき、蛍光体７で標識された第２物質９が金属体５０ｂの表面に非特異吸着すると、当該蛍光体７からの蛍光が検出されなくなる、いわゆるクエンチ現象が発生しやすくなる。クエンチ現象とは、蛍光体７から金属体５０ｂへ直接エネルギーが移動し、そのエネルギーが熱散逸することによる蛍光消光現象である。非特異吸着では、蛍光体７と金属体５０ｂの表面との距離が小さくなるため、クエンチ現象による蛍光消光が顕著となる。金属体５０ｂが金、銀、アルミニウム又はこれらのいずれかの金属を主成分として含む合金から構成される場合、非特異吸着を抑制することができるため、より正確に検出対象物質を検出することが可能となる。
　例えば、金属体５０ｂが金で構成される場合、金属体５０ｂの表面に各種機能を有するコーティングを施しやすくなる。例えば、金属体５０ｂの表面に非特異吸着防止コーティングが施されれば、蛍光体７で標識された第２物質９が金属体５０ｂの表面に吸着する非特異吸着を低減することができる。その結果、偽陽性及び偽陰性の検出結果が発生することを低減することができる。
　なお、センサセル４０は、複合体を含み得る溶液が流れる流路であってもよい。実施の形態２では、金属体５０ｂが粒子状であるため、複合体を含む溶液を、例えばフローサイトメトリーに供して、１個単位で複合体中の蛍光体の蛍光を検出することができる。さらに、所定の輝度よりも高い輝度の光点について、蛍光体７の蛍光の減衰特性に基づいて、複合体６ｂ中の蛍光体７が発する蛍光を検出することができるため、より精度良く検出対象物質３を検出することができる。
　（変形例）
　続いて、実施の形態２の変形例に係る検出装置について図１１を参照しながら説明する。図１１は、実施の形態２の変形例に係る検出装置１００ｃの一例を示す概略構成図である。なお、実施の形態２に係る検出装置１００ｂと同じ構成については同じ符号を付し、説明を省略する。以下、実施の形態２と異なる点を中心に説明する。
　金属体５０ｃは、例えば、常磁性を有する磁性材料を含んで構成される。常磁性とは、外部磁場が無いときには磁化を持たず、磁場を印加するとその方向に弱く磁化する磁性を指す。常磁性を有する磁性材料は、例えば、酸化鉄を主原料にしたフェライトであってもよい。なお、磁性材料はフェライトに限られず、例えば、鉄、ナトリウム、アルミニウム又は白金などであってもよい。
　また、金属体５０ｃは、光源１０が照射する光１の周波数又は蛍光体７の蛍光周波数に対応した局在表面プラズモン共鳴を生じる金属を主成分として含んでもよい。この場合、金属体５０ｃは、上記の磁性材料から構成される内核部（不図示）と、内核部を被覆し、局在表面プラズモン共鳴を生じる非磁性の金属材料から構成される外殻部（不図示）と、を有してもよい。これにより、金属体５０ｃは、外部磁場が印加されるとその方向に磁化され、かつ、光源１０から照射される光１により局在表面プラズモン共鳴を生じさせることができる。
　続いて、検出装置１００ｃの構成について説明する。検出装置１００ｃは、光導入部４６と、検出板４４を備えるセンサセル４２と、第１磁場印加部４８と、第２磁場印加部４９と、を備える点で、実施の形態２に係る検出装置１００ｂと異なる。
　センサセル４２は、底部に検出板４４を備える。検出板４４は、センサセル４２側と反対側の面（以下、裏面）において光導入部４６に接触している。検出板４４の裏面と光導入部４６とは、光源１０から照射される光１の損失が極力生じないように密着されているとよく、例えば、屈折率マッチングオイルを介して、検出板４４と光導入部４６とが接触する。なお、検出板４４と光導入部４６とは、接着層により接合されてもよい。検出板４４は、光透過性を有する板状部材である。検出板４４は、単層で構成されてもよく、異なる屈折率を有する複数層の積層体であってもよい。
　光導入部４６は、光源１０から照射された光１を検出板４４の裏面へと導光し、当該裏面から検出板４４に入射した光１が検出板４４の表面で全反射される。このとき、検出板４４の表面において光１が反射される側と反対側にエバネセント場、又は、増強電場等の近接場が形成される。近接場は、検出板４４の表面近傍にのみ形成される。近接場は、検出板４４の表面近傍における限られた領域に存在する励起光の一例である。光導入部４６は、例えば、公知のプリズム等により実現される。
　第１磁場印加部４８は、図中のＺ軸方向マイナス側に向かう第１方向の磁場勾配（以下、第１磁場勾配）を発生し、センサセル４２内の金属体５０ｃを第１方向に引き寄せる。これにより、センサセル４２内の金属体５０ｃは、検出板４４の表面に移動する。第１磁場印加部４８は、例えば、ネオジム磁石等の永久磁石で構成されてもよく、酸化鉄等を主成分とするフェライト磁石、又は、アルミニウム、ニッケル、及びコバルト等を主成分とするアルニコ磁石等で構成されてもよい。
　第２磁場印加部４９は、図中のＸ軸方向マイナス側に向かう第２方向の磁場勾配（以下、第２磁場勾配）を発生し、検出板４４の表面に移動した金属体５０ｃを第２方向に引き寄せる。これにより、金属体５０ｃは、検出板４４の表面に沿って第２方向に移動する。第２磁場印加部４９は、第１磁場印加部４８と同様に、ネオジム磁石等の永久磁石で構成されてもよく、フェライト磁石又はアルニコ磁石等で構成されてもよい。
　ここで、金属体５０ｃの移動とは、印加される磁場勾配の方向に沿って金属体５０ｃの位置が変化することをいう。また、金属体５０ｃを含む結合体も同様に印加される磁場勾配の方向に沿って結合体の位置が変化する。
　このように、本変形例に係る検出装置１００ｃによれば、金属体５０ｃを近接場が生じる検出板４４の表面に引き寄せ、さらに、検出板４４の表面に沿って金属体５０ｃを移動させることにより、光検出器２０は、複合体６ｃ中の蛍光体７を１個単位で光点の動きとして検出することができる。このとき、金属体５０ｃに非特異吸着した蛍光体７も光点の動きとして検出されるが、上述したように、クエンチ現象が起こりやすいため、蛍光消光が顕著となる。そのため、複合体６ｃ中の蛍光体７の輝度と比べて無視できるほど低い輝度となる。さらに、所定の輝度よりも高い輝度の光点について、蛍光体７の蛍光の減衰特性に基づいて、複合体６ｃ中の蛍光体７が発する蛍光を検出することができるため、より精度良く検出対象物質３を検出することができる。
　以下、実施例にて本開示の検出装置を具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
　なお、実施例１及び比較例１～２では、以下のセンサ基板、蛍光体、励起光及び光検出器を使用した。
　［センサ基板］
　約７５０ｎｍの周期を持つ２次元グレーティングで構成された金属微細構造体（以下、金属体５０ｄ）を備える基板を使用した。金属微細構造体の金属材料は、金である。
　［蛍光体］
　蛍光体として、約８５０ｎｍ付近に蛍光波長ピークを有するシリコン量子ドット（以下、蛍光体１７）を使用した。
　［励起光］
　Ｎｄ：ＹＡＧレーザの三倍高調波（３５５ｎｍ）を励起光とした光パラメトリック発振器からの発振光４８８ｎｍを使用した。
　Ｎｄ：ＹＡＧレーザのパルス幅は５ｎ秒、繰り返し周期は２０Ｈｚである。
　［光検出器］
　光検出器として、ＩｎＰ／ＩｎＧａＡｓを光電面に備えた赤外用光電子増倍管を用い、分光器により波長８５０ｎｍでの蛍光強度とその応答時間とを測定した。
　（実施例１）
　図１２は、実施例１及び比較例１～２における金属体５０ｄと蛍光体１７との位置関係を模式的に示す図である。
　図１２の（ａ）に示されるように、実施例１では、金属体５０ｄを備えるセンサ基板上に、スペーサとなる透明膜（不図示）を配置した。そして、その透明膜上に所定量の蛍光体１７を配置した。金属体５０ｄから蛍光体１７までの距離Ｄが１００ｎｍ程度になるように、スペーサとなる透明膜の膜厚を調整した。この距離は、サンドイッチ結合した複合体を形成した場合の、蛍光体と金属体間距離と同等程度のものである。
　金属体５０ｄ及び蛍光体１７への励起光の照射、及び、蛍光体１７が発する蛍光の検出条件については、上述したとおりである。蛍光体１７が発する蛍光の検出結果を、図１３及び図１４に示す。結果については、後述する。
　（比較例１）
　スペーサの高さ以外は、実施例１と同様である。図１２の（ｂ）に示されるように、比較例１では、金属体５０ｄから蛍光体１７までの距離Ｄが１μｍよりも大きくなるように、スペーサの高さを調整した。この距離は、蛍光体と金属体との間で、近接場における相互作用がほとんど発生しないほど十分離れていると見なせるものである。
　蛍光体１７が発する蛍光の検出結果を、図１３及び図１４に示す。結果については、後述する。
　（比較例２）
　図１２の（ｃ）に示されるように、比較例２では、金属体５０ｄを備えるセンサ基板上に、直接、所定量の蛍光体１７を配置した。これは、蛍光体と金属体との非特異吸着等により、接触又は非常に近接している状態を想定している。
　蛍光体１７が発する蛍光の検出結果を、図１３に示す。結果については、後述する。
　（結果）
　図１３は、実施例１、及び、比較例１～２の蛍光体の蛍光強度の減衰特性を示す図である。具体的には、図１３は、蛍光体の蛍光の規格化蛍光強度と時間との関係を示すグラフである。規格化蛍光強度は、時間が０ｍｓｅｃであるときの比較例１の蛍光強度で規格化した値を示している。時間は、励起光の照射を停止したときを０ｍｓｅｃとし、その後の経過時間を示している。
　図１３の▲で示されるように、実施例１では、励起光の照射を停止したときの蛍光体１７の蛍光強度は、比較例１の蛍光強度の２倍であった。しかしながら、蛍光の減衰時間が比較例１の蛍光の減衰時間よりも短かった。
　以上の結果から、実施例１では、実施例１では、金属体５０ｄにおいて局在表面プラズモン共鳴が発生したため、蛍光体１７の蛍光が増強されたことが分かる。つまり、蛍光体１７と表面プラズモンとの相互作用により、蛍光体１７の輻射的遷移割合が増加するため、蛍光体１７の蛍光強度は増加し、蛍光の減衰時間は短くなった。
　また、図１３の■で示されるように、比較例１では、蛍光体１７と金属体５０ｄとが十分に離れており、局在表面プラズモン共鳴による影響を受けにくくなるため、蛍光体１７は、その蛍光体１７固有の蛍光寿命（蛍光の減衰時間）を示した。
　また、図１３の▼で示されるように、比較例２では、励起光の照射を停止したときの量子ドット１７の蛍光強度は、実施例１の１／５程度であり、比較例１の１／１０程度であった。比較例２のように、蛍光体１７と金属体５０ｄとが接触している場合、蛍光体１７の励起エネルギーは、金属内での熱散逸として消費される割合が非常に多くなる。そのため、蛍光体１７の非輻射的遷移割合が増加し、蛍光体１７の蛍光強度は低下し、蛍光の減衰時間は短くなった。
　比較例２では、蛍光体１７は僅かに蛍光を発したが、本開示に至った知見で述べたように、クエンチ現象の程度によっては、全く蛍光を発光しない場合もある。比較例２のような微弱な蛍光は、検出対象から除外されることが多い。
　続いて、実施例１及び比較例１について、蛍光の減衰特性（ここでは、減衰時間）を比較した。図１４は、実施例１及び比較例１の蛍光の減衰特性を示す図である。図１４では、時間０ｍｓｅｃのときの、実施例１及び比較例１それぞれの蛍光強度をそれぞれ１として規格化した規格化蛍光強度と時間との関係を示す。
　図１４では、実施例１及び比較例１の規格化蛍光強度のプロットの他に、指数関数でフィッティングした結果をそれぞれ実線で示している。検出器から取得したデータ（以下、検出データともいう）には、ノイズが含まれるため、取得したデータをそのまま使用して蛍光の減衰時間を算出すると、バラツキが大きくなる。そのため、取得したデータを指数関数などでフィッティングすることで、蛍光の減衰時間を精度よく算出することができる。図１４には、実施例１及び比較例１の検出データをｓｔｒｅｔｃｈｅｄ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ関数でフィッティングした結果を実線で示している。ここでは、実施例１及び比較例１について、フィッティング後の検出データからから蛍光の減衰時間を算出した。蛍光の減衰時間は、自然対数の底をｅとした場合に、蛍光強度が最大値の１／ｅに減衰する時間を算出した。
　その結果、蛍光の減衰時間は、実施例１では、４７．７μｓｅｃとなり、比較例１では、８２．４μｓｅｃとなり、明確な差が表れた。
　また、蛍光体本来の蛍光寿命（ここでは、比較例１）に基づいて閾値時間を設定し、蛍光体の蛍光強度が所定の強度に減衰するまでの時間が閾値時間以下である場合に、複合体中の検出対象物質を検出することができることも確認できた。
　以上の結果から、蛍光体が発する蛍光は、実施例１、及び、比較例１～２のように、金属体との距離に応じて、金属体が生じる局在表面プラズモン共鳴及び金属体への熱的なエネルギー遷移などの影響を受けて、蛍光強度が変化するだけでなく、蛍光の減衰時間も変化することが確認できた。なお、蛍光体が発する蛍光は、蛍光体自身の粒径分布、凝集、及び、検出位置によっても蛍光強度が変化する。しかしながら、この場合、蛍光体が発する蛍光の減衰時間（いわゆる、蛍光寿命）は、局在プラズモン共鳴などの外乱の影響を受けないため変化しない。
　したがって、蛍光強度と蛍光の減衰時間との閾値を設定することにより、まず蛍光強度の大きさで非特異吸着した蛍光体（比較例２）の蛍光を排除して、蛍光の減衰時間で複合体中の蛍光体が発する蛍光と、遊離状態の蛍光体が発する蛍光とを区別して検出できることが確認できた。また、比較例２のように金属体に非特異吸着した蛍光体の場合、クエンチ現象が生じるため、実際の検出では表面増強蛍光と区別して検出され得る。そのため、蛍光の減衰時間の閾値のみを設定することにより、複合体中の蛍光体の蛍光を遊離状態の蛍光体の蛍光と区別して検出することができると考えられる。なお、ここでは、蛍光の減衰時間を例に検証したが、蛍光の減衰率の閾値を設定してもよい。
　実施例１及び比較例１～２では、金属体５０ｄとして金属微細構造体を備えるセンサ基板を使用したが、金属体は、金属微粒子であってもよい。金属微粒子による表面プラズモン共鳴を利用した場合も、上記と同様の結果が得られると考えられる。
　（他の実施の形態）
　以上、本開示の１つ又は複数の態様に係る検出装置及び検出方法について、上記の実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構成される形態も、本開示の１つ又は複数の態様の範囲内に含まれてもよい。
　例えば、上記実施の形態における検出装置が備える構成要素の一部又は全部は、１個のシステムＬＳＩ（Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：大規模集積回路）から構成されているとしてもよい。例えば、検出装置は、光源と、光検出器と、処理器と、を有するシステムＬＳＩから構成されてもよい。なお、システムＬＳＩは、光源を含んでいなくてもよい。
　システムＬＳＩは、複数の構成部を１個のチップ上に集積して製造された超多機能ＬＳＩであり、具体的には、マイクロプロセッサ、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）などを含んで構成されるコンピュータシステムである。ＲＯＭには、コンピュータプログラムが記憶されている。マイクロプロセッサが、コンピュータプログラムに従って動作することにより、システムＬＳＩは、その機能を達成する。
　なお、ここでは、システムＬＳＩとしたが、集積度の違いにより、ＩＣ、ＬＳＩ、スーパーＬＳＩ、ウルトラＬＳＩと呼称されることもある。また、集積回路化の手法は、ＬＳＩに限るものではなく、専用回路又は汎用プロセッサで実現してもよい。ＬＳＩ製造後に、プログラムすることが可能なＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｇａｔｅ　Ａｒｒａｙ）、あるいは、ＬＳＩ内部の回路セルの接続や設定を再構成可能なリコンフィギュラブル・プロセッサを利用してもよい。
　さらには、半導体技術の進歩又は派生する別技術によりＬＳＩに置き換わる集積回路化の技術が登場すれば、当然、その技術を用いて機能ブロックの集積化を行ってもよい。バイオ技術の適用等が可能性としてあり得る。
　また、本開示の一態様は、このような検出装置だけではなく、当該装置に含まれる特徴的な構成部をステップとする検出方法であってもよい。また、本開示の一態様は、検出方法に含まれる特徴的な各ステップをコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであってもよい。また、本開示の一態様は、そのようなコンピュータプログラムが記録されたコンピュータで読み取り可能な非一時的な記録媒体であってもよい。
　本開示は、試料中の検出対象物質を蛍光体の蛍光寿命の変化に基づいて精度良く検出する検出装置として利用可能である。
　１　光
　３、１０３　検出対象物質
　５、１０５　第１物質
　６ａ、６ｂ、６ｃ　複合体
　７、１０７　蛍光体
　９、１０９　第２物質
　１０　光源
　１１、１２、１３、１１０ａ、１１０ｂ、１１０ｃ、１１０ｄ、１１０ｅ、１１２ａ、１１２ｂ、１１３　蛍光
　１７　量子ドット
　２０　光検出器
　２２　光学系
　３０　処理器
　４０、４２　センサセル
　４４　検出板
　４５　混合溶液
　４６　光導入部
　４８　第１磁場印加部
　４９　第２磁場印加部
　５０ａ、５０ｂ、５０ｃ　金属体
　５０ｄ　金属微細構造体
　５２　基材
　５４１　微細凸状構造体
　６０　センサ基板
　１００ａ、１００ｂ、１００ｃ　検出装置
　２００　基材
　２０１　金属微細突起部
　２１０　プラズモニック基板

Claims (9)

  1. 　検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第１物質で修飾された金属体と、前記検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第２物質で修飾された蛍光体とを用いて、前記検出対象物質を検出する検出装置であって、
    　前記蛍光体を励起させる光を照射する光源と、
    　前記光源による前記光の照射を停止してから所定の期間、前記蛍光体が発する蛍光を経時的に検出する光検出器と、
    　前記所定の期間における前記蛍光の減衰特性に基づいて、前記金属体と前記検出対象物質と前記蛍光体とが結合した複合体中の前記検出対象物質を検出する処理器と、
    　を備える、
    　検出装置。
  2. 　前記蛍光の減衰特性は、前記光源が前記光の照射を停止してから、前記蛍光体が発する前記蛍光の強度の最大値に対する前記蛍光の強度の比率が所定の比率に減衰するまでの時間で表され、
    　前記処理器は、前記時間が閾値時間以下である場合に、前記複合体中の前記検出対象物質を検出する、
    　請求項１に記載の検出装置。
  3. 　前記蛍光の減衰特性は、前記光源が前記光の照射を停止してから所定時間経過するまでの期間における、前記蛍光の強度の最大値に対する、前記蛍光の強度の減衰量の比率である減衰率で表され、
    　前記処理器は、前記減衰率の値が閾値以上である場合に、前記複合体中の前記検出対象物質を検出する、
    　請求項１に記載の検出装置。
  4. 　前記処理器は、前記光検出器が検出した前記蛍光の強度が閾値以上であるか否かを判定し、前記蛍光の強度が閾値強度以上の場合に、前記蛍光の減衰特性に基づいて、前記複合体中の前記検出対象物質を検出する、
    　請求項１～３のいずれか一項に記載の検出装置。
  5. 　前記金属体は、粒子状である、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の検出装置。
  6. 　前記金属体は、基板上に設けられた金属微細構造体である、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の検出装置。
  7. 　前記金属体は、前記光源が照射する光の周波数又は前記蛍光体の蛍光周波数に対応した局在表面プラズモン共鳴を生じる金属を主成分として含む、
    　請求項１～６のいずれか一項に記載の検出装置。
  8. 　検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第１物質で修飾された金属体と、前記検出対象物質と特異的に結合する性質を有する第２物質で修飾された蛍光体とを用いて、前記検出対象物質を検出する検出方法であって、
    　前記蛍光体を励起させる光を照射し、
    　前記光源による前記光の照射を停止してから所定の期間、前記蛍光体が発する蛍光を経時的に検出し、
    　前記所定の期間における前記蛍光の減衰特性に基づいて、前記金属体と前記検出対象物質と前記蛍光体とが結合した複合体中の前記検出対象物質を検出する、
    　検出方法。
  9. 　第２物質で修飾された蛍光体を含むサンプル液に光を照射する光源と、
    　前記光の照射を停止後、前記光によって励起された前記蛍光体が発する蛍光の強度を所定期間検出する光検出器と、
    　前記検出した強度に基づいて、前記サンプル液が検出対象物質を含むか否かを決定する処理器を含み、
    　前記検出対象物質は前記第２物質と直接結合し、前記検出対象物質は第１物質を介して金属物質と結合する
    　検出装置。
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