JP2020193868A - 検出方法及び検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】表面増強蛍光法を用いて標的物質の検出感度の向上を実現できる検出方法等を提供する。【解決手段】磁性を有する金属粒子に固定された第１物質及び蛍光体で標識された第２物質を標的物質と結合することにより複合体を形成し（Ｓ１０１）、蛍光体に蛍光を放射させ、かつ、金属粒子に局在化表面プラズモン共鳴を生じさせる所定の波長を有する励起光を所定領域に照射し（Ｓ１０２）、磁場勾配を印加して、複合体を所定領域に侵入及び／又は所定領域から離脱させ（Ｓ１０３、Ｓ１０５）、所定領域からの蛍光を経時的に検出し（Ｓ１０４、Ｓ１０６）、検出された蛍光の強度の変化量に基づいて標的物質を検出し（Ｓ１０７）、所定領域において、蛍光体が放射する蛍光は、金属粒子が生じる局在化表面プラズモン共鳴によって増強される。【選択図】図６

Description

本開示は、液体中に存在する標的物質を光学的に検出する検出方法及び検出装置に関する。特に、金属ナノ微粒子の局在化表面プラズモン共鳴の作用によって蛍光を増強する表面増強蛍光法（Surface Enhanced Fluorescence Spectroscopy）を利用した検出方法及び検出装置に関する。

近年、病原体による感染症の拡大や新規病原体の出現等の問題から、これらの病原体を検出できる装置の開発が急がれている。検出対象物（つまり標的物質）としては、病原性タンパク質等の分子、ウイルス（外殻タンパク質等）、細菌（多糖等）などが知られている。これらの標的物質に対する、表面増強蛍光法を利用した高感度なセンサも開示されている。

例えば、特許文献１では、金属微粒子と蛍光体とが一体化された検出抗体が用いられる。これにより、蛍光体から放射された蛍光は金属微粒子によるプラズモン共鳴で増強されるため、微量の標的物質を検出することができる。

特開２００８−２１６０４６号公報 特開昭６２−３８３６３号公報 特開２００１−１３３４５５号公報 特開２０１０−１９７６５号公報 特許第４３８１７５２号公報

Michael E. Jolley et al. Clinical Chemistry, vol.27, No7(1981) Kathryn L. Kellar et al. Experimental Hematology 30 1227-1237(2002) AimPlex_Multiplex_Immunoassay_User_Manual Rev 1.3.24 Anger, P.; Bharadwaj, P.; Novotny, L. PhysRevLett.96.113002 (2006)

しかしながら、上述の特許文献１のセンサでは、標的物質に結合していない遊離状態の検出抗体から放射された蛍光もプラズモン共鳴によって増強されてしまう。つまり、背景光が上昇するため、検出の感度が低下してしまう。遊離状態の検出抗体を除去することで検出感度を向上させる方法も考えられ得るが、操作が複雑になり、検出に要する時間も増加する。

そこで本開示は、表面増強蛍光法を用いた標的物質の検出感度の向上を実現できる検出方法等を提供する。

本開示の一態様に係る検出方法は、磁性を有する金属粒子に固定された第１物質及び蛍光体で標識された第２物質を標的物質に結合させることにより複合体を形成し、前記蛍光体に蛍光を放射させ、かつ、前記金属粒子に局在化表面プラズモン共鳴を生じさせる所定の波長を有する励起光を所定領域に照射し、磁場勾配を印加して、前記複合体を前記所定領域に侵入及び／又は前記所定領域から離脱させ、前記所定領域からの蛍光を経時的に検出し、検出された前記蛍光の強度の変化量に基づいて前記標的物質を検出し、前記所定領域において、前記蛍光体が放射する蛍光は、前記金属粒子が生じる局在化表面プラズモン共鳴によって増強される。

なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、装置、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。

本開示の一態様に係る検出方法は、表面増強蛍光法を用いた標的物質の検出感度の向上を実現できる。

実施の形態１における複合体の構成図 実施の形態１における金属粒子の断面図 実施の形態１における増強現象を説明するための図 実施の形態１に係る検出装置の構成図 実施の形態１における光検出器の出力信号の時系列を示すグラフ 実施の形態１に係る検出装置の処理を示すフローチャート 実施の形態２に係る検出装置の構成図 実施の形態２における光検出器の出力信号の時系列を示すグラフ 実施の形態２の変形例に係る検出装置の処理を示すフローチャート 実施の形態２の変形例における光検出器の出力信号の時系列を示すグラフ 実施の形態３に係る検出装置の構成図 実施の形態３における光検出器の出力信号の時系列を示すグラフ 実施例１における金属粒子と蛍光体との位置関係を示す図 実施例１及び２におけるシミュレーションモデルを説明するための図 実施例１における金属粒子付近の電場強度の波長依存性を示すグラフ 実施例１における蛍光体の消光スペクトル及び蛍光スペクトルを示すグラフ 実施例２における金属粒子と蛍光体との位置関係を示す図 実施例２における金属粒子付近の電場強度の波長依存性を示すグラフ 実施例１及び２における金属粒子付近の電場強度の距離依存性を示すグラフ

（本開示の基礎となった知見）
液体中に存在するタンパク質等の分子、ウイルス、細菌を検出する技術としては、蛍光を利用する方法（以下、蛍光法という）が広く用いられている。蛍光法では、標的物質と蛍光体で標識された抗体（以下、蛍光標識抗体という）とを抗原抗体反応により結合させる。そして、蛍光体を励起できる光を、標的物質と結合した標識抗体に照射することにより蛍光を発生させる。このように発生した蛍光を検出することにより、標的物質を検出することができる。

［蛍光偏光免疫測定法］
蛍光法の一例としては、蛍光偏光免疫測定法（Fluorescence Polarization Immunoassay）がある。この方法では、蛍光標識抗体を含む溶液に、標的物質である抗原を含む被検溶液を混合する。その結果、抗原抗体反応によって複合体が形成される。このとき、複合体の形成前後の蛍光の偏光度の差に基づいて抗原の濃度が計測される。ここでは、複合体が蛍光標識抗体単体よりも大きく、回転運動が抑制されるため、偏光度が増加する現象が利用されている（例えば特許文献２及び非特許文献１を参照）。

［免疫クロマトグラフ法］
蛍光法の他の一例としては、免疫クロマトグラフ法がある。この方法では、ニトロセルロース膜などを基材として有する平板状の基板が用いられる。基板には、標的物質と特異的に結合する抗体が固定化される。この基板に、標的物質と蛍光標識抗体とを含むサンプル溶液が滴下されると、蛍光標識抗体と結合した標的物質が、基板に固定化された抗体（以下、固定化抗体という）に捕捉される。ここに、光を照射すると、標的物質の濃度に応じた強度の蛍光が放射される。この蛍光を検出することで標的物質の濃度を計測することができる（例えば特許文献３を参照）。

［免疫クロマトグラフ法に表面増強蛍光を利用］
免疫クロマトグラフ法を高感度化するために、表面増強蛍光を利用する技術もある。この技術では、溶液を流す流路内に金属ナノ構造が形成された領域が設けられ、この金属ナノ構造上に標的物質と結合する抗体が固定化される。この流路に、標的物質と蛍光標識抗体とを含むサンプル溶液が滴下されると、蛍光標識抗体と結合した標的物質が固定化抗体に捕捉される。ここに、金属ナノ構造が局在化表面プラズモン共鳴を起こす波長の光が照射されると、蛍光標識抗体から放射された蛍光が増強される。このとき、局在化表面プラズモン共鳴で増強された蛍光（以下、表面増強蛍光という）の強度は、標的物質の濃度に応じて増加する。蛍光の増強の程度（以下、増強度という）は１０〜１０００倍程度なので、表面増強蛍光は、通常の蛍光よりも１０〜１０００倍程度高い強度を有する。したがって、表面増強蛍光を利用すれば、通常の蛍光では計測できないような低濃度の標的物質も計測できる（例えば特許文献４を参照）。

［免疫クロマトグラフ法にエバネセント波を利用］
また、透明な基板の裏側から励起光を照射する裏面照射系を利用する方法がある。この方法では、基板の裏面から励起光が照射されエバネセント波が誘起される。誘起されたエバネセント波は、基板の表面にある固定化抗体に補捉された蛍光標識抗体に照射され、蛍光標識抗体に蛍光を放射させる。このとき、エバネセント波は、基板表面から数百ｎｍの領域のみを照射するので、表面から照射する場合と比べて、標的物質と結合していない蛍光標識抗体（以下、Ｆｒｅｅ成分という）に照射される励起光の量を低減することができる。Ｆｒｅｅ成分が放射する蛍光は、標的物質の濃度が反映されないノイズ成分である。つまり、Ｆｒｅｅ成分が放射する蛍光は、標的物質と結合している蛍光標識抗体（以下、Ｂｉｎｄ成分という）が放射する蛍光の計測を妨害して計測精度を低下させる。したがって、エバネセント波を利用して照射領域を制限してＦｒｅｅ成分が放射する蛍光を抑制することは有効である（例えば特許文献１を参照）。

［フローサイトメトリー］
粒子及び標的物質の検出方法としてフローサイトメトリーと呼ばれる方法がある。フローサイトメトリーでは、透明な細管（フローセル）中を１個毎に流れる細胞等の粒子にレーザ光などが照射され、散乱光及び／又は蛍光が発生する。このように発生した散乱光及び／又は蛍光を検出して、粒子が特定され計数される。

タンパク質等の標的物質を検出する場合は、次のように検出処理が行われる。まず、標的物質と特異的に結合する２種類の抗体を準備する。一方の抗体は捕捉用ビーズに固定化され、もう一方の抗体は蛍光体で標識される。これらの２種類の抗体を、標的物質と抗原抗体反応させて、標的物質を挟んで特異結合（サンドイッチ結合）させて、捕捉用ビーズ−標的物質−蛍光標識抗体の複合体が形成される。そして、複合体を含む溶液から未結合の蛍光標識抗体を取り除いた後に、溶液をフローセルに流す。このとき、複合体で発生した蛍光を検出して、標的物質を特定して計数する（例えば、非特許文献２及び３を参照）。

［均一系で磁性粒子及び近接場を利用］
また、抗体を基板等に固定化する代わりに、抗体を磁性粒子に固定化して均一な溶液中に分散させて標的物質と結合させる方法もある。この方法は、基板の裏面から励起光を照射して近接場を誘起して、基板の近傍にある蛍光標識抗体に近接場を照射して蛍光を発生させている。基板の表面に向かう磁場勾配を溶液に印加すると、磁性粒子−標的物質−蛍光標識抗体から形成された複合体が基板の表面へ引き寄せられる。このように磁場勾配を溶液に印加した際の蛍光強度と、磁場勾配を印加しなかった際の蛍光強度との差は、標的物質と結合している蛍光標識抗体（Ｂｉｎｄ成分）の数と、標的物質と結合していない蛍光標識抗体（Ｆｒｅｅ成分）の数との差に相当する。したがって、磁場勾配の印加有無によって生じる蛍光強度の差を計測することで、Ｆｒｅｅ成分の影響を排除できる（特許文献５参照）。

しかしながら、上述した各方法では、以下のような課題がある。

蛍光偏光免疫測定法では、偏光度の違いを計測するために、偏光子の回転機構が必要になり装置が複雑になる。また偏光度の違いは抗原抗体複合体の形成前後の大きさの違いを反映しているので、蛍光標識抗体と比べて小さい分子を検出する場合は、偏光度の違いが小さいので、検出精度が低下する。さらに、被検溶液中に散乱性の物質が存在すると、偏光解消により、偏光度の違いを検出できない等の課題がある。

免疫クロマトグラフ法、又は、これに表面増強蛍光若しくはエバネセント波を利用した方法では、基板に、標的物質と結合していない蛍光標識抗体及び蛍光を放射する共存物質が非特異吸着する場合がある。この場合、非特異吸着した蛍光標識抗体及び共存物質から放射された蛍光によって検出精度が低下するという課題がある。

また、フローサイトメトリーでは、未結合の蛍光標識抗体を除去する工程が必要になり、計測時間がかかる。

さらに、均一系で磁性粒子及び近接場を利用する場合は、次の理由から定量範囲に課題がある。複合体だけでなく未結合の蛍光標識抗体も、近接場の照射領域に存在して蛍光を放射する。そのため、未結合の蛍光標識抗体が増加すると、複合体が基板の表面近傍に引き寄せられていないときの蛍光の強度が増加し、蛍光を検出する光検出器のダイナミックレンジを圧縮する。これを防ぐためには、未結合の蛍光標識抗体の数を抑制する必要があり、被検溶液と混ぜる蛍光標識抗体の数を制限しなければならない。定量可能な標的物質の数は蛍光標識抗体の数よりも小さくなるので、被検溶液と混ぜる蛍光標識抗体の数を制限することで、定量範囲が制限される。このように、光検出器のダイナミックレンジを確保するためには、蛍光標識抗体の数を抑制せざるを得ず、結果として標的物質の定量範囲が制限される。

（本開示の概要）
そこで、本開示の一態様に係る検出方法は、磁性を有する金属粒子に固定された第１物質及び蛍光体で標識された第２物質を標的物質に結合させることにより複合体を形成し、前記蛍光体に蛍光を放射させ、かつ、前記金属粒子に局在化表面プラズモン共鳴を生じさせる所定の波長を有する励起光を所定領域に照射し、磁場勾配を印加して、前記複合体を前記所定領域に侵入及び／又は前記所定領域から離脱させ、前記所定領域からの蛍光を経時的に検出し、検出された前記蛍光の強度の変化量に基づいて前記標的物質を検出し、前記所定領域において、前記蛍光体が放射する蛍光は、前記金属粒子が生じる局在化表面プラズモン共鳴によって増強される。

これにより、複合体に含まれる第２物質を標識する蛍光体から放射される蛍光は、当該複合体に含まれる第１物質が固定された金属粒子が生じる局在化表面プラズモン共鳴によって増強される。一方で、複合体に含まれない第２物質（すなわち遊離状態の第２物質）を標識する蛍光体は、金属粒子に空間的に近接していないため、当該蛍光体が放射する蛍光は局在化表面プラズモン共鳴によってほとんど増強されない。したがって、複合体に含まれない第２物質を標識する蛍光体から放射される蛍光の強度は、複合体に含まれる第２物質を標識する蛍光体から放射される蛍光の強度よりも小さい。さらに、磁場勾配の印加によって、遊離状態の第２物質は移動しないが、金属粒子を含む複合体は励起光が照射される所定領域に侵入及び／又は所定領域から離脱する。よって、遊離状態の第２物質を除去しなくても、励起光が照射される所定領域における蛍光の強度の変化に基づいて複合体を検出することができる。つまり、高速かつ簡便な表面増強蛍光法を用いて、標的物質の検出感度の向上を実現できる。

また、偏光を利用しなくても標的物質を検出できるため、装置構成が簡単にできる。さらに、複合体の形成前後の分子の大きさの違いによる影響を低減することができ、標的物質の適用範囲を広げることができる。

なお、所定領域に侵入及び／又は所定領域から離脱するとは、（i）所定領域に侵入する、（ii）所定領域から離脱する、又は、（iii）所定領域に侵入し、その後、当該所定領域から離脱すること（つまり、所定領域を通過すること）を意味する。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法において、前記励起光の照射では、前記励起光を基板に照射することにより、前記所定領域に前記励起光の近接場を照射し、前記所定領域は、前記基板の表面近傍の領域であってもよい。

これにより、基板の表面近傍の領域に近接場を照射することができる。近接場の照射領域は、基板の表面の非常に近い領域に限定される。したがって、近接場の照射領域外に配置された複合体が照射領域に侵入するための移動距離を低減することができる。その結果、磁場勾配を印加する時間を削減することができ、短時間での検出を実現することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法において、前記磁場勾配の印加では、前記複合体を前記基板の表面から引き離す第１磁場勾配と、前記複合体を前記基板の表面に引き寄せる第２磁場勾配とを交互に繰り返し印加し、前記標的物質の検出では、前記第１磁場勾配の印加中又は印加後における前記蛍光の強度と、前記第２磁場勾配の印加中又は印加後における前記蛍光の強度との間の差異に基づいて、前記標的物質を検出してもよい。

これにより、複合体に、励起光の近接場が照射される所定領域への侵入及び当該所定領域からの離脱を交互に繰り返させることができ、蛍光の強度の変化量の偶発的な誤差による検出精度の低下を抑制することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法において、前記磁場勾配の印加では、前記第１磁場勾配と、前記第２磁場勾配とを交互に一定周期で印加し、前記標的物質の検出では、前記蛍光の強度の時系列を示す信号のうち前記一定周期と同期する成分に基づいて前記標的物質を検出してもよい。

これにより、蛍光の強度の時系列を示す信号のうち第１磁場勾配及び第２磁場勾配の印加と同期する成分に基づいて、標的物質を検出することができる。したがって、当該信号の信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）が高い場合でも、表面増強蛍光による信号を高感度で検出することができ、標的物質の検出感度の向上を実現することができる。

例えば、本開示の一態様に係る検出方法において、前記磁場勾配の印加では、検出された前記蛍光の強度が極小値になったときに、前記第１磁場勾配から前記第２磁場勾配に切り替え、検出された前記蛍光の強度が極大値になったときに、前記第２磁場勾配から前記第１磁場勾配に切り替えてもよい。

これにより、蛍光の強度の時系列を示す信号の極大値及び極小値に基づいて第１磁場勾配及び第２磁場勾配を切り替えることができる。したがって、励起光の近接場が照射される所定領域への複合体の侵入及び当該所定領域からの複合体の離脱を最低限の時間で確実に行うことができ、検出時間の短縮を図ることができる。

なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、装置、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。

以下、実施の形態について、図面を参照しながら説明する。

なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。

また、以下において、平行及び垂直などの要素間の関係性を示す用語、及び、円筒形状などの要素の形状を示す用語、並びに、数値範囲は、厳格な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば数％程度の差異をも含むことを意味する。

また、以下において、標的物質を検出するとは、標的物質を見つけ出して標的物質の存在を確認することに加えて、標的物質の量（例えば数又は濃度等）又はその範囲を計測することを含む。

（実施の形態１）
実施の形態１に関して図１〜図６を参照しながら説明する。

［複合体の構造］
まず、複合体６の構造について図１を参照しながら具体的に説明する。図１は、実施の形態１における複合体６の構成図である。図１に示すように、複合体６は、標的物質１と、金属粒子２に固定された第１物質３と、蛍光体４で標識された第２物質５と、を含む。

標的物質１は、検出の対象となる分子であり、例えばタンパク質等である。

金属粒子２は、磁性を有し、所定の波長を有する励起光の照射によって局在化表面プラズモン共鳴を生じさせる。金属粒子２の内部構造については、図３を用いて後述する。

第１物質３は、標的物質１と特異的に結合する抗体である。第１物質３は、金属粒子２の表面に固定されている。なお、図１では、複数の第１物質３が金属粒子２に固定されているが、これに限定されない。例えば、１つの第１物質のみが金属粒子２に固定されてもよい。

蛍光体４は、所定の波長を有する励起光の照射によって蛍光を放射する。蛍光体４は、例えば有機分子又は量子ドット等からなる。

第２物質５は、標的物質１と特異的に結合する抗体であり、蛍光体４で標識されている。つまり、第２物質５は、蛍光標識抗体である。なお、図１では、第２物質５は、１つの蛍光体４で標識されているが、複数の蛍光体で標識されてもよい。

ここでは、第１物質３と第２物質５とは異なっている。第１物質３と第２物質５とが異なるとは、蛍光体４が固定された第１物質３と、金属粒子２に固定された第２物質５とに共有化される箇所がなく、それぞれが別個の物質として存在することを意味する。なお、第１物質３及び第２物質５の各々は、標的物質１と特異的に結合する性質を有すればよく、その分子構造は限定されない。第１物質３と第２物質５とは、異種分子であってもよく、同種分子であってもよい。

また、第１物質３と第２物質５とは、標的物質１の異なる部位と結合する。したがって、図１に示すように、第１物質３と第２物質５とは、標的物質１を挟んで結合（サンドイッチ結合）して複合体６を形成する。

なお、蛍光体４の代わりに蛍光粒子が用いられてもよい。蛍光粒子は、有機蛍光分子、無機蛍光体又は量子ドット等を組込んだ樹脂（例えばポリスチレン又はアクリル等）又はガラスからなる。蛍光粒子の直径は、数十ｎｍから数百ｎｍである。蛍光粒子には、蛍光体４単体では実現が難しい特性を付与することができる。例えば、蛍光粒子を構成する樹脂又はガラスに蛍光の失活防止剤を含ませることで、蛍光粒子は光退色を低減できる。また、蛍光粒子には、アミノ基及びカルボキシル基をはじめ多様な表面修飾を施すことができる。また、蛍光粒子は、蛍光体４よりも水中での分散性を上げることができる。

［金属粒子の内部構造］
ここで、金属粒子２の内部構造について図２を参照しながら具体的に説明する。図２は、実施の形態１における金属粒子２の断面図である。図３に示すように、金属粒子２は、内核部２ａと外殻部２ｂとを有する。

内核部２ａは、磁性材料からなる。磁性材料としては、常磁性体を含むのが好ましい。常磁性とは、外部磁場が無いときには磁化を持たず、磁場を印加するとその磁場の方向に弱く磁化する磁性を意味する。つまり、内核部２ａは、磁場勾配の印加によって磁場勾配の方向に移動する。

本実施の形態では、常磁性を有する磁性材料が用いられ、具体的には酸化鉄を主原料にしたフェライトが用いられる。なお、磁性材料は、酸化鉄を主原料にしたフェライトに限定されない。磁性材料として、例えば鉄が用いられてもよい。

外殻部２ｂは、内核部２ａを被覆し、局在化表面プラズモン共鳴を生じる非磁性の金属材料からなる。非磁性の金属材料は反磁性体を含む。従って、金や銀は反磁性体と称されることもあるが、ここでは非磁性体と記す。

非磁性の金属材料として、金、銀、又は、アルミニウムを用いることができる。また例えば、非磁性の金属材料として、金、銀及びアルミニウムのいずれかを主成分として有する合金を用いることもできる。

金属粒子２の直径は、数ｎｍ〜数百ｎｍ程度である。このような金属粒子２に所定の波長の光を照射することで局在化表面プラズモン共鳴を生じさせることができる。この局在化表面プラズモン共鳴が生じる波長域と、蛍光体４を励起する波長域及び／又は蛍光体４が放射する蛍光の波長域とが重なれば、金属粒子２の近傍にある蛍光体４が放射する蛍光は、局在化表面プラズモン共鳴の作用により増強される。この増強された蛍光を表面増強蛍光と称する。

［局在化表面プラズモン共鳴による蛍光の増強現象］
本実施の形態に係る検出装置では、局在化表面プラズモン共鳴による増強現象が利用されている。増強現象の概要を図３を参照しながら説明する。

図３は、実施の形態１における増強現象を説明するための図である。

図３には、図１に示す複合体６及び第２物質５を含む混合溶液（すなわち試料）が表されている。この混合溶液に、所定の波長を有する励起光７が照射されると、金属粒子２で局在化表面プラズモン共鳴が生じ、かつ、蛍光体４で蛍光が放射される。

このとき、複合体６に含まれる第２物質５に結合された蛍光体４が放射した蛍光は、金属粒子２で生じた局在化表面プラズモン共鳴の作用で増強され、表面増強蛍光８として放射される。

一方、複合体６に含まれていない遊離状態の第２物質５に結合された蛍光体４は、金属粒子２から離れているので、局在化表面プラズモン共鳴の作用を受けることができない。したがって、この蛍光体４が放射した蛍光は、増強されず、通常の蛍光９として放射される。

［検出装置の構成］
次に、以上のような増強現象をともなう複合体６（つまり、標的物質１）を検出する検出装置１００の構成について図４を参照しながら説明する。

図４は、実施の形態１に係る検出装置１００の構成図である。検出装置１００は、試料収容部１１０と、光源１２０と、第１磁場印加部１３１と、第２磁場印加部１３２と、光検出器１４０と、制御部１５０と、を備える。以下に、検出装置１００の各構成要素について順に説明する。

試料収容部１１０は、複合体６と、金属粒子２に固定された第１物質３と、蛍光体４で標識された第２物質５とを含む混合溶液２２を収容する。例えば、試料収容部１１０は、略直方体の容器であり、少なくとも２つの透明な面を有する。図４に示す試料収容部１１０は、全ての面が透明な光学セルである。図４では、試料収容部１１０の左面から励起光２１が入射し、上面から蛍光が出射している。

光源１２０は、照射領域に所定の波長を有する励起光２１を照射する。照射領域は、所定領域の一例であり、試料収容部１１０内の領域の一部分である。つまり、光源１２０は、試料収容部１１０内の混合溶液２２の一部に励起光２１を照射する。所定の波長としては、金属粒子２で局在化表面プラズモン共鳴を励起すると共に蛍光体４で蛍光を励起することができる波長が用いられる。

第１磁場印加部１３１は、混合溶液２２中に第１方向（図４では上向き）の第１磁場勾配を印加する。この第１磁場勾配により、混合溶液２２中の金属粒子２が第１方向に移動する。その結果、混合溶液２２中に存在する複合体６及び第１物質３は、励起光２１の照射領域の外（図４では上面近傍）に集められる。

第２磁場印加部１３２は、混合溶液２２中に第１方向と逆の第２方向（図４では下向き）に第２磁場勾配を印加する。この第２磁場勾配により、混合溶液２２中の金属粒子２は、第２方向に移動する。その結果、混合溶液２２中に存在する複合体６及び第１物質３は、励起光２１の照射領域に侵入し、その後、当該照射領域から離脱する。

第１磁場印加部１３１及び第２磁場印加部１３２としては、電磁石又は永久磁石等を用いることができる。電磁石が用いられる場合、制御部１５０は、第１磁場印加部１３１及び第２磁場印加部１３２の各々への電流の供給を制御することによって、磁場勾配の印加及び非印加を切り替えることができる。また、永久磁石が用いられる場合、制御部１５０は、第１磁場印加部１３１及び第２磁場印加部１３２の各々を移動させることによって磁場勾配の印加及び非印加を切り替えることができる。

光検出器１４０は、励起光２１の照射領域において蛍光体４から放射された蛍光を、光学レンズ１４１、ロングパスフィルタ１４２及び光学レンズ１４３を介して受光し、蛍光の強度に応じた電気信号を出力する。

光学レンズ１４１は、試料収容部１１０内の照射領域からの光２３を略平行光に変換する。ここでは、光２３には、表面増強蛍光８及び蛍光９に加えて、散乱光等が含まれる。

ロングパスフィルタ１４２は、励起光２１の波長成分を遮断し、蛍光（表面増強蛍光８及び蛍光９）の波長成分を通過させる。つまり、ロングパスフィルタ１４２は、励起光２１の波長と蛍光の波長との間に遮断波長を有する。

光学レンズ１４３は、ロングパスフィルタ１４２を通過した光を光検出器１４０に集光する。

なお、これらの光学レンズ１４１、ロングパスフィルタ１４２及び光学レンズ１４３の構成及び配置は、図４に示す構成及び配置に限定されない。例えば、ロングパスフィルタ１４２は、光学レンズ１４３と光検出器１４０との間に配置されてもよい。また、光学レンズ１４１、ロングパスフィルタ１４２及び光学レンズ１４３は、光検出器１４０に内蔵されてもよく、検出装置１００に含まれなくてもよい。

制御部１５０は、光検出器１４０の出力信号の変化量（つまり、蛍光の強度の変化量）に基づいて標的物質１を検出する。また、制御部１５０は、光源１２０、第１磁場印加部１３１及び第２磁場印加部１３２を制御する。制御部１５０は、例えばプロセッサ及びメモリを備えるコンピュータによって実現される。プロセッサは、メモリに格納されたインストラクション又はソフトウェアプログラムを実行することにより各種機能をすることができる。また、制御部１５０は、専用の電子回路によって実現されてもよい。

［光検出器の出力信号］
ここで、図５を参照しながら光検出器１４０の出力信号について説明する。図５は、実施の形態１における光検出器１４０の出力信号の時系列を示すグラフである。図５において、横軸は、第２磁場勾配の印加開始からの経過時間を示し、縦軸は、光検出器１４０の出力信号の大きさ（つまり蛍光の強度）を示す。

ライン３１は、混合溶液２２に標的物質１が含まれていない場合における出力信号の時系列を示す。ライン３２は、混合溶液２２に低濃度で標的物質１が含まれる場合における出力信号の時系列を示す。ライン３３は、混合溶液２２に高濃度で標的物質１が含まれる場合における出力信号の時系列を示す。

混合溶液２２に標的物質１が含まれていない場合、複合体６が形成されない。したがって、励起光２１の照射領域には、複合体６が存在し得ず、遊離状態の第２物質５等が存在し得る。このとき、照射領域において遊離状態の第２物質５に励起光２１が照射されれば、第２物質５に結合された蛍光体４から蛍光が放射される。しかしながら、このように放射された蛍光は、局在化表面プラズモン共鳴による増強を受けない。さらに、遊離状態の第２物質５は、第２磁場勾配によって移動しない。したがって、遊離状態の第２物質５に結合された蛍光体４から放射された蛍光の強度は小さく、その変化も小さい。その結果、ライン４１に示されるように、混合溶液２２に標的物質１が含まれていない場合、出力信号のレベルは変化せず低いまま維持される。

一方、混合溶液２２に標的物質１が含まれている場合、複合体６が形成される。したがって、励起光２１の照射領域には、遊離状態の第２物質５に加えて複合体６が存在し得る。このとき、照射領域において励起光２１が複合体６に照射されれば、複合体６に含まれる蛍光体４から蛍光が放射される。このように放射された蛍光は、金属粒子２で生じた局在化表面プラズモン共鳴の作用で増強される。さらに、複合体６は、第２磁場勾配によって移動する。したがって、複合体６に含まれる蛍光体４から放射される蛍光の強度は、複合体６の照射領域への侵入及び照射領域からの離脱により変化する。その結果、ライン３２及びライン３３に示すように、出力信号のレベルは、第２磁場勾配の印加によって増加した後に第１磁場勾配の印加によって減少する。

また、標的物質１の濃度が増加するほど、複合体６の濃度も増加して、光検出器１４０の出力信号のレベルも高くなる。つまり、出力信号のレベルの増加量は標的物質１の濃度に依存する。制御部１５０は、このような出力信号のレベルの増加量と標的物質１の濃度との関係を利用して、光検出器１４０の出力信号に基づいて標的物質１の濃度を求める。つまり、制御部１５０は、第１磁場勾配の印加中又は印加後における照射領域からの蛍光の強度（例えば蛍光の強度の最小値）と、第２磁場勾配の印加中又は印加後における照射領域からの蛍光の強度（例えば蛍光の強度の極大値）との間の差異に基づいて、標的物質１を検出する。なお、出力信号のレベルの増加量と標的物質１の濃度との関係は、標的物質１の濃度が既知の混合溶液を用いてあらかじめ定めることができる。

［検出装置の動作］
以上のように構成された検出装置１００の動作について図６を参照しながら説明する。図６は、実施の形態１に係る検出装置１００の処理を示すフローチャートである。

まず、試料収容部１１０は、あらかじめ調製された混合溶液２２を収容する（Ｓ１０１）。なお、混合溶液２２の調製は、標的物質１を含む溶液、蛍光体４で標識された第２物質５を含む溶液、及び、金属粒子２に固定された第１物質３を含む溶液の順不同な混合により行われる。

次に、光源１２０は、試料収容部１１０内の所定領域に励起光２１を照射する（Ｓ１０２）。これにより、混合溶液２２の一部に励起光２１が照射される。なお、励起光２１の照射は、検出処理が終了するまで継続的に行われる。

第１磁場印加部１３１は、混合溶液２２に対して第１方向（図４では上向き）に第１磁場勾配を印加する（Ｓ１０３）。これにより、混合溶液２２中の複合体６は、第１方向に移動して励起光２１の照射領域外に配置される。なお、第１磁場勾配の印加は所定の期間行われる。所定の期間とは、混合溶液２２中に分散した複合体６が照射領域外に移動するために十分な長さを有する期間である。所定の期間の長さは、混合溶液２２中の粒子の分散性及び磁性の度合い、第１磁場勾配の強度に応じて設定される。

次に、光検出器１４０は、蛍光の検出を開始する（Ｓ１０４）。続いて、第２磁場印加部１３２は、混合溶液２２に対して第１方向とは逆向きの第２方向（図４では下向き）に第２磁場勾配を印加する（Ｓ１０５）。これにより、混合溶液２２中の複合体６は、第２方向に移動する。その結果、複合体６は、励起光２１の照射領域に侵入し、当該照射領域から離脱する。第２磁場勾配の印加は、励起光２１が照射されている間に行われる。

光検出器１４０は、蛍光の検出を終了する（Ｓ１０６）。

制御部１５０は、光検出器１４０の出力信号を解析して、出力信号の極大値から標的物質１の濃度を算出して出力する（Ｓ１０６）。なお、標的物質１の濃度の算出では、出力信号の極大値の代わりに積分値が用いられてもよい。

なお、図６に示すステップの順番は、例示であり、これに限定されない。例えば、ステップＳ１０２における励起光２１の照射は、ステップＳ１０３における第１磁場勾配の印加の後に開始されてもよく、ステップＳ１０１における混合溶液２２の収容の前に開始されてもよい。また、ステップＳ１０３における第１磁場勾配の印加と、ステップＳ１０５における第２磁場勾配の印加とは、順番が入れ替えられてもよい。

［効果等］
以上のように、本実施の形態では、複合体６に含まれる第２物質５を標識する蛍光体４から放射される蛍光は、当該複合体６に含まれる第１物質３が固定された金属粒子２が生じる局在化表面プラズモン共鳴によって増強される。一方で、複合体６に含まれない第２物質５（すなわち遊離状態の第２物質５）を標識する蛍光体４は、金属粒子２に空間的に近接していないため、当該蛍光体４が放射する蛍光は局在化表面プラズモン共鳴によってほとんど増強されない。したがって、複合体６に含まれない第２物質５を標識する蛍光体４から放射される蛍光の強度は、複合体６に含まれる第２物質５を標識する蛍光体４から放射される蛍光の強度よりも小さい。さらに、第２磁場勾配の印加によって、遊離状態の第２物質５は移動しないが、金属粒子２を含む複合体６は励起光２１の照射領域に侵入及び／又は照射領域から離脱する。よって、遊離状態の第２物質を除去しなくても、励起光２１の照射領域における蛍光の強度の変化に基づいて複合体６を検出することができる。つまり、高速かつ簡便な表面増強蛍光法を用いて、標的物質１の検出感度の向上を実現できる。

また、偏光を利用しなくても標的物質１を検出できるため、装置構成が簡単にできる。さらに、複合体の形成前後の分子の大きさの違いによる影響を低減することができ、標的物質１の適用範囲を広げることができる。

また、金属粒子２において、磁性を有する磁性材料からなる内核部２ａを非磁性の金属材料からなる外殻部２ｂで覆うことができる。したがって、磁性材料の残留磁化によって金属粒子２が凝集することを抑制することができる。その結果、複数の２次元画像における光点の輝度及び移動速度のばらつきを抑制することができ、検出精度を向上させることができる。

また、金属粒子２は、局在化表面プラズモン共鳴を生じる金属材料で当該金属粒子の表面を覆うことができるので、表面の一部が金属材料で構成される場合よりも、金属粒子２の周方向における増強度のばらつきを抑制することができる。

また、金、銀、アルミニウム、又はいずれかを主成分として有する合金を外殻部２ｂに用いることができ、金属粒子２において効果的に局在化表面プラズモン共鳴を生じさせることができる。さらに、外殻部２ｂが金からなる場合、金属粒子２の表面に各種機能を有するコーティングを施しやすくなる。例えば、外殻部２ｂに非特異吸着防止コーティングが施されれば、蛍光体４で標識された第２物質５が金属粒子２の表面に吸着する非特異吸着を低減することができ、検出結果として偽陽性及び偽陰性が発生することを低減することができる。

（実施の形態２）
次に、実施の形態２について説明する。本実施の形態では、近接場を利用する点が上記実施の形態１と異なる。以下に、本実施の形態に係る検出装置について、上記実施の形態１と異なる点を中心に図７及び図８を参照しながら説明する。

［検出装置の構成］
図７は、実施の形態２に係る検出装置２００の構成図である。図７に示すように、検出装置２００は、試料収容部２１０と、光源２２０と、第１磁場印加部１３１と、第２磁場印加部１３２と、光検出器１４０と、制御部１５０と、を備える。

試料収容部２１０は、実施の形態１と同様に、複合体６と、蛍光体４で標識された第２物質５と、金属粒子２に固定された第１物質３とを含む混合溶液２２を収容する。本実施の形態では、試料収容部２１０は、励起光２４の照射により近接場を形成可能な基板２１１及びプリズム２１２を備える。具体的には、基板２１１は、プリズム２１２の表面上に配置され、基板２１１の裏面２１１ｂは、プリズム２１２の表面に光学的に貼り合せられる。これにより、基板２１１は、表面２１１ａに近接場を形成可能な基板として機能する。

近接場とは、物体の表面近傍に生じる薄い光の膜である。近接場は、例えば、屈折率の高い媒質から屈折率が低い媒質に進む光をその境界面で全反射させたときに屈折率の低い媒質ににじみ出るごく薄い光の膜である。したがって、本実施の形態では、近接場は、基板２１１の表面２１１ａ近傍の領域を照射する。なお、近接場は、近接場光と呼ばれる場合もある。

試料収容部２１０は、さらに、混合溶液２２を覆う透明なカバーガラス２１３を備える。混合溶液２２は、基板２１１とカバーガラス２１３との間に保持される。なお、試料収容部２１０は、混合溶液２２を囲う側壁（図示せず）を備えてもよい。側壁は、基板２１１からカバーガラス２１３に向かって延びる。

光源２２０は、プリズム２１２を介して基板２１１の裏面２１１ｂに所定の波長を有する励起光２４を照射する。所定の波長としては、実施の形態１の励起光２１と同一の波長を用いることができる。本実施の形態では、励起光２４は、混合溶液２２と基板２１１との界面において全反射する。その結果、基板２１１の表面２１１ａに近接場が形成される。近接場は、表面２１１ａ近傍の領域のみに形成され、基板２１１の表面２１１ａから遠ざかるにつれて急激に減衰する。多くの場合、近接場が及ぶ距離は励起光２４の波長程度である。したがって、励起光２４の近接場は、基板２１１の表面２１１ａ近傍の領域に存在する混合溶液２２にのみ照射される。つまり、本実施の形態では、基板２１１の表面２１１ａ近傍の領域が、励起光２４が照射される所定領域に相当する。

なお、基板２１１の構成としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。例えば、基板２１１は、単層で構成されてもよく、電場増強を目的とした積層体で構成されてもよい。

［光検出器の出力信号］
ここで、図８を参照しながら光検出器１４０の出力信号について説明する。図８は、実施の形態２における光検出器１４０の出力信号の時系列を示すグラフである。図８において、横軸は、第２磁場勾配の印加開始からの経過時間を示し、縦軸は、光検出器１４０の出力信号の大きさ（つまり蛍光の強度）を示す。

ライン４１は、混合溶液２２に標的物質１が含まれていない場合における出力信号の時系列を示す。ライン４２は、混合溶液２２に低濃度で標的物質１が含まれる場合における出力信号の時系列を示す。ライン４３は、混合溶液２２に高濃度で標的物質１が含まれる場合における出力信号の時系列を示す。

混合溶液２２に標的物質１が含まれない場合、複合体６が形成されない。したがって、励起光２４の近接場の照射領域には、複合体６が存在することはなく、遊離状態の第２物質５等が存在する。このとき、励起光２４の近接場が遊離状態の第２物質５に照射されれば、第２物質５に結合された蛍光体４から蛍光が放射される。しかしながら、このような蛍光体４から放射された蛍光は、局在化表面プラズモン共鳴による増強を受けない。さらに、遊離状態の第２物質５は、第２磁場勾配によって移動しない。したがって、複合体６に含まれない蛍光体４から放射された蛍光の強度は小さく、その変化も小さい。その結果、ライン３１に示されるように、混合溶液２２に標的物質１が含まれない場合、出力信号のレベルは変化せず低いまま維持される。

一方、混合溶液２２に標的物質１が含まれる場合、複合体６が形成される。したがって、励起光２４の近接場の照射領域には、遊離状態の第２物質５に加えて複合体６が存在し得る。このとき、励起光２４の近接場が複合体６に照射されれば、蛍光体４から放射された蛍光は、金属粒子２で生じた局在化表面プラズモン共鳴の作用で増強される。さらに、複合体６は、第２磁場勾配によって基板２１１の表面２１１ａに向かって移動する。これにより、励起光２４の近接場の照射領域内の複合体６が増加し、ライン４２及びライン４３に示されるように蛍光の強度も増加する。また、標的物質１の濃度が増加するほど、照射領域内の複合体６も増加して、光検出器１４０の出力信号のレベルも高くなる。

このように、出力信号のレベルの増加量は標的物質１の濃度に依存する。そこで、制御部１５０は、このような出力信号のレベルの増加量と標的物質１の濃度との関係を利用して、光検出器１４０の出力信号に基づいて標的物質１の濃度を求める。つまり、制御部１５０は、第１磁場勾配の印加中又は印加後における照射領域からの蛍光の強度（例えば蛍光の強度の極小値）と、第２磁場勾配の印加中又は印加後における照射領域からの蛍光の強度（例えば蛍光の強度の極大値）との間の差異に基づいて、標的物質１を検出する。なお、出力信号のレベルの増加量と標的物質１の濃度との関係は、標的物質１の濃度が既知の混合溶液を用いて、あらかじめ定めることができる。

なお、検出装置２００の動作については、実施の形態１に係る検出装置１００の動作と同様であるので図示及び説明を省略する。

［効果等］
以上のように、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、励起光２４の近接場を混合溶液２２の一部に照射することができる。近接場の照射領域は、基板２１１の表面２１１ａに非常に近い領域に限定される。したがって、近接場の照射領域外に配置された複合体６が照射領域内に侵入するための移動距離を低減することができる。その結果、磁場勾配を印加する時間を削減することができ、短時間での検出を実現することができる。

（実施の形態２の変形例）
次に、実施の形態２の変形例について説明する。本変形例では、第１磁場勾配及び第２磁場勾配が交互に繰り返し印加される点が上記実施の形態２と異なる。以下に、上記実施の形態２と異なる点を中心に本変形例について図９及び図１０を参照しながら説明する。

なお、本変形例に係る検出装置２００の構成については、上記実施の形態２と同様であるので図示及び説明を省略する。

［検出装置の動作］
本変形例に係る検出装置２００の動作について図９を参照しながら説明する。図９は、実施の形態２の変形例に係る検出装置２００の処理を示すフローチャートである。

本変形例では、ステップＳ１０４において蛍光の検出が開始された後、第２磁場印加部１３２は、第２方向（図７では下向き）に第２磁場勾配を印加する（Ｓ３０１）。具体的には、第２磁場印加部１３２は、例えば光検出器１４０の出力信号から極大値が検出されるまで第２磁場勾配を印加する。これにより、混合溶液２２に含まれる複合体６は、近接場の照射領域に侵入する。

第１磁場印加部１３１は、第１方向（図７では上向き）に第１磁場勾配を印加する（Ｓ３０２）。具体的には、第１磁場印加部１３１は、例えば光検出器１４０の出力信号から極小値が検出されるまで第１磁場勾配を印加する。これにより、混合溶液２２に含まれる複合体６は、近接場の照射領域から離脱する。

その後、制御部１５０は、磁場勾配の印加を終了するか否かを判定する（Ｓ３０３）。例えば、制御部１５０は、第１磁場勾配及び第２磁場勾配の印加回数が閾値回数以上である場合に磁場勾配の印加を終了すると判定し、そうでない場合に磁場勾配の印加を継続すると判定する。なお、ここでの判定方法は、特に限定される必要はなく、例えば光検出器１４０の出力信号の再現性に基づいて判定が行われてもよい。

ここで、磁場勾配の印加を終了すると判定された場合（Ｓ３０３のＹｅｓ）、光検出器１４０は、蛍光の検出を終了する（Ｓ１０６）。一方、磁場勾配の印加を継続すると判定された場合（Ｓ３０３のＮｏ）、第２磁場印加部１３２は、第２方向に第２磁場勾配を印加する（Ｓ１０５）。これにより、混合溶液２２に含まれる複合体６は、近接場の照射領域に再侵入する。

［光検出器の出力信号］
ここで、図１０を参照しながら光検出器１４０の出力信号について説明する。図１０は、実施の形態２の変形例における光検出器１４０の出力信号の時系列を示すグラフである。図１０において、横軸は、第２磁場勾配の印加開始からの経過時間を示し、縦軸は、光検出器１４０の出力信号の大きさ（つまり蛍光の強度）を示す。

ライン４４は、混合溶液２２に標的物質１が含まれていない場合における出力信号の時系列を示す。ライン４５は、混合溶液２２に低濃度で標的物質１が含まれる場合における出力信号の時系列を示す。ライン４６は、混合溶液２２に高濃度で標的物質１が含まれる場合における出力信号の時系列を示す。

図１０に示すように、本変形例では、混合溶液２２に標的物質１が含まれている場合に、光検出器１４０の出力信号から複数の極大値及び複数の極小値を得ることができる。

［効果等］
以上のように、本変形例に係る検出装置２００によれば、複合体６に、励起光２４の近接場の照射領域への侵入及び当該照射領域からの離脱を交互に繰り返させることができ、光検出器１４０の出力信号から複数の極大値及び複数の極小値を得ることができる。したがって、複数の極大値及び複数の極小値を用いて蛍光の強度の変化量を求めることができ、偶発的な誤差による検出精度の低下を抑制することができる。

さらに、本変形例に係る検出装置２００によれば、光検出器１４０の出力信号の極大値及び極小値に基づいて第１磁場勾配及び第２磁場勾配を切り替えることができる。したがって、近接場の照射領域への複合体６の侵入及び照射領域からの複合体６の離脱を最低限の時間で確実に行うことができ、検出時間の短縮を図ることができる。

（実施の形態３）
次に、実施の形態３について説明する。本実施の形態では、第１磁場勾配及び第２磁場勾配が一定周期で交互に印加され、光検出器の出力信号のうち第１磁場勾配及び第２磁場勾配の印加と同期する成分に基づいて標的物質が検出される点が上記実施の形態２及びその変形例と異なる。以下に、上記実施の形態２及びその変形例と異なる点を中心に本実施の形態について図１１及び図１２を参照しながら説明する。

［検出装置の構成］
図１１は、実施の形態３に係る検出装置３００の構成図である。図１１に示すように、検出装置３００は、試料収容部２１０と、光源２２０と、第１磁場印加部１３１と、第２磁場印加部１３２と、光検出器１４０と、制御部３５０と、信号発生器３５１と、ロックインアンプ３５２と、を備える。

信号発生器３５１は、一定の周期性を有する信号を生成する。例えば、信号発生器３５１は、一定周期の矩形波を生成する。生成された信号は、制御部３５０及びロックインアンプ３５２に出力される。

制御部３５０は、信号発生器３５１から入力された一定周期の信号に基づいて、第１磁場印加部１３１による第１磁場勾配の印加及び第２磁場印加部１３２による第２磁場勾配の印加を切り替える。これにより、第１磁場勾配及び第２磁場勾配が一定周期で交互に印加される。

ロックインアンプ３５２は、信号発生器３５１から入力された一定周期の信号に基づいて、光検出器１４０の出力信号から一定周期の信号と同期する成分を抽出する。具体的には、ロックインアンプ３５２は、位相敏感検波（Phase Sensitive Detection）により、一定周期と同期する成分の振幅に比例する直流信号を出力する。なお、本実施の形態では、位相敏感検波が用いられているが、これに限定されない。

本実施の形態に係る検出装置３００の動作については、光検出器１４０の出力信号に対する信号処理を除いて、実施の形態２の変形例と同様であるので、図示及び説明を省略する。

［光検出器の出力信号］
ここで、図１２を参照しながら光検出器１４０の出力信号について説明する。図１２は、実施の形態３における光検出器１４０の出力信号の時系列を示すグラフである。図１２において、横軸は、第２磁場勾配の印加開始からの経過時間を示し、縦軸は、光検出器１４０の出力信号の大きさ（つまり蛍光の強度）を示す。

ライン４７は、混合溶液２２に標的物質１が含まれていない場合における出力信号の時系列を示す。ライン４８は、混合溶液２２に低濃度で標的物質１が含まれる場合における出力信号の時系列を示す。

図１２に示すように、標的物質１の濃度が低い場合、光検出器１４０の出力信号にノイズが目立ち、ＳＮ比が低下する。このような光検出器１４０の出力信号に対して位相敏感検波を利用することで、表面増強蛍光による信号を高感度に検出することができる。

［効果等］
以上のように、本実施の形態に係る検出装置３００によれば、光検出器１４０の出力信号のうち第１磁場勾配及び第２磁場勾配の印加と同期する成分に基づいて、標的物質１を検出することができる。したがって、光検出器１４０の出力信号の信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）が高い場合でも、表面増強蛍光による信号を高感度で検出することができ、標的物質１の検出感度の向上を実現することができる。

（実施例１）
［シミュレーションモデル及びシミュレーション結果］
次に、金属粒子２で生じる局在化表面プラズモン共鳴による増強度のシミュレーションを実施例１として図１３〜図１６を参照しながら説明する。

本実施例では、標的物質１として１０ｎｍ程度のサイズを有する血清アルブミンを用いた。また、金属粒子２としては、直径が１３．６ｎｍの酸化鉄フェライトの内核部２ａと金の外殻部２ｂとを有するコアシェル型の粒子を用いた。金属粒子２の直径は５０ｎｍであった。蛍光体４としては、１ｎｍ以下の有機シアニン系蛍光分子であるＣｙａｎｉｎｅ ３（Ｃｙ３、分子量：７１４、励起波長：（５１２）；５５０、蛍光波長：５７０；（６１５）、量子収率ＱＹ：０．１５）を用いた。第１物質３及び第２物質５としては、１５ｎｍ程度のサイズを有するモノクローナルＩｇＧ抗体を用いた。

これらが複合体６を形成した場合、金属粒子２の表面と蛍光体４との距離は、第２物質５が標的物質１と結合する位置（結合部位）によって異なる。図１３は、実施例１における金属粒子２と蛍光体４との位置関係を示す図である。図１３の（ａ）は、実施例１における金属粒子２の表面と蛍光体４との距離の最大値（３５ｎｍ程度）を示す。一方、図１３の（ｂ）は、実施例１における金属粒子２の表面と蛍光体４との距離の最小値（１０ｎｍ程度）を示す。

ここで、金属粒子２の周辺の電場強度をＦＤＴＤ法（Finite-difference time-domain method）を用いてシミュレーションした。図１４は、実施例１及び２におけるシミュレーションモデルを説明するための図である。図１４に示すように、本実施例では、水中に存在する直径が５０ｎｍのコアシェル型の金属粒子２にｚ軸の負の向きに伝搬する平面波を照射した。この平面波は、ｘ軸に沿って直線偏光しており、平面波の電場強度は、１［Ｖ／ｍ］であった。このようなシミュレーションモデルにおいて、金属粒子２の表面からΔｘだけ離間した計測位置における電場強度を計算した。

図１５は、実施例１における金属粒子付近の電場強度の波長依存性を示すグラフである。図１５には、シミュレーションの結果が示されている。図１５において、横軸は励起光の波長を示し、縦軸は電場強度の２乗（（Ｖ／ｍ）^２）を示す。データポイント５１は、金属粒子２の表面より１０ｎｍ離れた計測位置（図１４におけるΔｘ＝１０ｎｍ）の電場強度の２乗の値を示す。データポイント５２は、金属粒子２の表面より３５ｎｍ離れた計測位置（図１４におけるΔｘ＝３５ｎｍ）の電場強度の２乗の値を示す。電場強度の２乗は、増強度に相当する。図１５から明らかなように、約５００〜６００ｎｍの波長域で局在化表面プラズモン共鳴が生じている。

次に、蛍光体４として用いられたＣｙ３の消光スペクトル及び蛍光スペクトルについて説明する。図１６は、実施例１における蛍光体４の消光スペクトル及び蛍光スペクトルを示すグラフである。図１６において、横軸は波長を示し、縦軸は消光度及び蛍光強度の各々の相対値を示す。ここでは、相対値は、消光スペクトル及び蛍光スペクトルの値の範囲を０から１の範囲で正規化して得られた値である。データポイント５３は、消光スペクトルを示し、データポイント５４は蛍光スペクトルを示す。

図１５及び図１６から、直径が５０ｎｍの金属粒子２で生じる局在化表面プラズモン共鳴の波長域と、Ｃｙ３を励起するための波長域及びＣｙ３が放射する蛍光の波長域とが重なっていることがわかる。したがって、Ｃｙ３に入射する励起光及びＣｙ３が放射する蛍光は、局在化表面プラズモン共鳴の作用により増強される。

［励起光及び蛍光に対する増強度］
ここで、図１５を参照しながら、５３２ｎｍの波長を有する励起光に対する増強度について説明する。図１５より、図１３の（ａ）及び（ｂ）に示す蛍光体４の位置での励起光に対する増強度は、以下のとおりである。

ＥＦ（５３２、３５）＝１．３

ＥＦ（５３２、１０）＝８．０

ここで、ＥＦ（λ、Δｘ）は、Δｘの位置における波長λを有する光に対する増強度（電場強度の２乗）を表す。したがって、ＥＦ（５３２、３５）が図１３の（ａ）の蛍光体４の位置（Δｘ＝３５）での励起光に対する増強度を表し、ＥＦ（５３２、１０）が図１３の（ｂ）の蛍光体４の位置（Δｘ＝１０）での励起光に対する増強度を表す。

これより、図１３の（ａ）及び（ｂ）に示す蛍光体４の位置では、励起光は、金属粒子２が存在しない場合よりも、それぞれ、１．３倍及び８倍に増強されることがわかる。この励起増強は、局在化表面プラズモン共鳴により励起光が金属粒子２の周辺に集められることで発生する。

次に、このような励起光によって蛍光体４が放射する蛍光に対する増強度について説明する。５３２ｎｍの波長を有する励起光で励起されたＣｙ３は、５７０ｎｍのピーク波長を有する分光スペクトルを有する蛍光を放射する（図１６の蛍光スペクトルを参照）。図１５より、５７０ｎｍの波長を有する蛍光に対する増強度は以下のとおりである。

ＥＦ（５７０、３５）＝２．４

ＥＦ（５７０、１０）＝１３

これより、図１３の（ａ）及び（ｂ）に示す蛍光体４の位置では、Ｃｙ３から放射された蛍光は、金属粒子２が存在しない場合よりも、それぞれ、２．４倍及び１３倍に増強されることがわかる。この放射増強は、局在化表面プラズモン共鳴により、金属粒子２の周辺の蛍光体４の量子収率が増加することで発生する。

Ｃｙ３の量子収率は、通常（周辺に金属粒子２が存在しない場合）は、０．１５である。量子収率の最大値は１であるので、Ｃｙ３に対する放射増強の最大値は、１／０．１５≒６．７である。したがって、増強度ＥＦ（５７０、Δｘ）の最大値は、６．７におさえられるので、ＥＦ（５７０、１０）は以下の値に置き換えられる。

ＥＦ（５７０、１０）＝６．７

［表面増強蛍光の増強度］
表面増強蛍光は、励起増強と放射増強とにより発生するので、表面増強蛍光の増強度は、励起増強の増強度と放射増強の増強度との積で求められる。したがって、Ｃｙ３の表面増強蛍光の増強度は以下のように求められる。

ＳＥＦ（３５）＝ＥＦ（５３２、３５）×ＥＦ（５７０、３５）＝１．３×２．４＝３．１

ＳＥＦ（１０）＝ＥＦ（５３２、１０）×ＥＦ（５７０、１０）＝８×６．７≒５４

ここで、ＳＥＦ（Δｘ）は、Δｘの位置における表面増強蛍光の増強度を示す。

以上のように、本実施例では、複合体６に含まれる蛍光体４（Ｃｙ３）が放射する蛍光は、複合体６に含まれない蛍光体４（Ｃｙ３）が放射する蛍光と比べて、３．１〜５４倍に増強された。

（実施例２）
次に、実施例１における抗体よりも小さい抗体を用いた場合における金属粒子２で生じる局在化表面プラズモン共鳴による増強度のシミュレーション結果を実施例２として説明する。実施例２では、実施例１と異なる点を中心に図１７〜図１９を参照しながら説明する。

［シミュレーションモデル及びシミュレーション結果］
本実施例では、実施例１で示したＩｇＧ抗体よりも小型の抗体であるフラグメント抗体Ｆ（ａｂ’）２を第１物質３ｂ及び第２物質５ｂとして用いた。このフラグメント抗体（Ｆ（ａｂ’）２）は、ＩｇＧ抗体を断片化した抗体であり、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素であるペプシンで分解して得られる。Ｆ（ａｂ’）２には、ＩｇＧ抗体のＮ末端側のヒンジ部位が含まれており、２個の抗体結合部がヒンジ部位で結合している。Ｆ（ａｂ’）２の大きさは、ＩｇＧ抗体の半分程度であり、７ｎｍ程度である。

このＦ（ａｂ’）２を用いて複合体６ｂを形成した場合、金属粒子２の表面と蛍光体４との距離は、第２物質５ｂが標的物質１と結合する位置（結合部位）によって異なる。図１７は、実施例２における金属粒子２と蛍光体４との位置関係を示す図である。図１７の（ａ）は、金属粒子２の表面と蛍光体４との距離の最大値（３５ｎｍ程度）を示す。一方、図１７の（ｂ）は、金属粒子２の表面と蛍光体４との距離の最小値（１０ｎｍ程度）を示す。

このＦ（ａｂ’）２を用いて複合体６ｂが形成された場合、金属粒子２の表面と蛍光体４との距離は、第２物質５ｂが標的物質１と結合する位置（結合部位）によって異なる。図１７は、実施例２における金属粒子２と蛍光体４との位置関係を示す図である。図１７の（ａ）は、金属粒子２の表面と蛍光体４との距離の最大値（２５ｎｍ程度）を示す。一方、図１７の（ｂ）は、金属粒子２の表面と蛍光体４との距離の最小値（７ｎｍ程度）を示す。

ここで、金属粒子２の周辺の電場強度を実施例１と同様にＦＤＴＤ法を用いてシミュレーションした。このシミュレーションのモデルは、実施例１と同様であるので図示及び説明を省略する。

図１８は、実施例２における金属粒子付近の電場強度の波長依存性を示すグラフである。図１８には、シミュレーションの結果が示されている。図１８において、横軸は励起光の波長を示し、縦軸は電場強度の２乗（（Ｖ／ｍ）^２）を示す。データポイント６１は、金属粒子２の表面より７ｎｍ離れた計測位置（図１４におけるΔｘ＝７ｎｍ）の電場強度の２乗の値を示す。また、データポイント６２は、金属粒子２の表面より２５ｎｍ離れた計測位置（図１４におけるΔｘ＝２５ｎｍ）の電場強度の２乗の値である。図１６及び図１８から、実施例１と同様に、局在化表面プラズモン共鳴の波長域と、Ｃｙ３を励起するための波長域及びＣｙ３が放射する蛍光の波長域とが重なっていることがわかる。したがって、Ｃｙ３に入射する励起光及びＣｙ３が放射する蛍光は、局在化表面プラズモン共鳴の作用により増強される。

［励起光及び蛍光に対する増強度］
ここで、図１８を参照しながら、５３２ｎｍの波長を有する励起光に対する増強度について説明する。図１８より、図１７の（ａ）及び（ｂ）に示す蛍光体４の位置での励起光に対する増強度は、以下のとおりである。

ＥＦ（５３２、２５）＝２．０

ＥＦ（５３２、７）＝１３

これより、図１７の（ａ）及び（ｂ）に示す蛍光体４の位置では、Ｃｙ３から放射された蛍光は、金属粒子２が存在しない場合よりも、それぞれ、２倍及び１３倍に増強されることがわかる。

次に、このような励起光によって蛍光体４が放射する蛍光に対する増強度について説明する。５３２ｎｍの波長を有する励起光で励起されたＣｙ３は、５７０ｎｍのピーク波長を有する分光スペクトルを有する蛍光を放射する（図１６の蛍光スペクトルを参照）。図１８より、５７０ｎｍの波長を有する蛍光に対する増強度は以下のとおりである。

ＥＦ（５７０、２５）＝３．７

ＥＦ（５７０、７）＝２０

これより、図１７の（ａ）及び（ｂ）に示す蛍光体４の位置では、Ｃｙ３から放射された蛍光は、金属粒子２が存在しない場合よりも、それぞれ、３．７倍及び２０倍、に増強されることがわかる。この放射増強は、局在化表面プラズモン共鳴により、金属粒子２の周辺の蛍光体４の量子収率が増加することで発生する。

実施例１と同様に、Ｃｙ３の量子収率の最大値（＝１）の制限により、Ｃｙ３に対する放射増強の最大値は、１／０．１５≒６．７である。したがって、増強度ＥＦ（５７０、１０）は、６．７におさえられるので、ＥＦ（５７０、１０）は、実施例１と同様に以下の値に置き換えられる。

ＥＦ（５７０、７）＝６．７

［表面増強蛍光の増強度］
表面増強蛍光は、励起増強と放射増強とにより発生するので、表面増強蛍光の増強度は、励起増強の増強度と放射増強の増強度との積で求められる。したがって、Ｃｙ３の表面増強蛍光の増強度ＳＥＦ（Δｘ）は以下のように求められる。

ＳＥＦ（２５）＝ＥＦ（５３２、２５）×ＥＦ（５７０、２５）＝２．０×３．７＝７．４

ＳＥＦ（７）＝ＥＦ（５３２、７）×ＥＦ（５７０、７）＝１３×６．７≒８７

以上のように、本実施例では、複合体６ｂに含まれる蛍光体４（Ｃｙ３）が放射する蛍光は、複合体６ｂ含まれない蛍光体４（Ｃｙ３）が放射する蛍光と比べて、７．４〜８７倍に増強された。

［増強度の距離依存性］
実施例１及び実施例２から明らかなように、励起光及び蛍光に対する増強度は、金属粒子２からの距離によって変化する。そこで、励起光及び蛍光に対する増強度の距離依存性のＦＤＴＤシミュレーション結果について図１９を参照しながら説明する。

図１９は、実施例１及び２における金属粒子２付近の電場強度の距離依存性を示すグラフである。図１９において、横軸は金属粒子２からの距離Δｘを示し、縦軸は増強度を示す。データポイント７１は、５３２ｎｍの波長を有する励起光の増強度を示す。また、データポイント７２は、５７０ｎｍの波長を有する蛍光の増強度を示す。

図１９に示すように、Δｘが減少すれば増強度が増加するので、Δｘが小さくなるように抗体のサイズ及び結合部位を選択することで、表面増強蛍光の増強度を増大することができる。ただし、蛍光体４と金属粒子２との距離Δｘが５ｎｍよりも小さくなると、蛍光体４から金属粒子２へ直接エネルギーが移動することによる蛍光消光（クエンチ）現象が発生するので、Δｘが５ｎｍ未満になることは好ましくない（例えば非特許文献５を参照）。

以上のように、実施例１及び実施例２では、光源１２０として、実用性が高い広く普及している半導体励起固体（DPSS：Diode Pumped Solid State）レーザが用いることができ、実用的である。

また、実施例２では、実施例１よりも小型の抗体を利用することで、実施例１よりも更に表面増強蛍光の増強度を増大することができ、標的物質１をより高感度に検出することができる。

なお、実施例１及び実施例２のどちらの抗体でも、上述した各実施の形態において効果をもたらすことができる。

（変形例）
以上、本開示の１つまたは複数の態様に係る検出装置について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、本開示の１つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。

例えば、上記各実施の形態において、第１物質及び第２物質は、実施例１及び２で示したＩｇＧ抗体及びフラグメント抗体（Ｆ（ａｂ’）２）に限定されない。例えば、Ｆ（ａｂ’）２の代わりに、１個だけの結合部を有するＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等のフラグメント抗体が用いられてもよい。また、ラクダ科動物（ラマ、アルパカ等）から得られる重鎖のみで構成される抗体（重鎖抗体）の可変領域の断片であるＶＨＨ（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗体（ナノボディ）が用いられてもよい。さらに、第１物質及び第２物質は、標的物質と特異的に結合する物質であれば抗体に限定されず、核酸分子、又は、ペプチドであるアプタマーであってもよい。

本開示は、簡単、高速、高精度に標的物質を検出するセンサデバイスに用いられる。

１ 標的物質
２ 金属粒子
３、３ｂ 第１物質
４ 蛍光体
５、５ｂ 第２物質
６、６ｂ 複合体
７、２１、２４ 励起光
８ 表面増強蛍光
９ 蛍光
２２ 混合溶液
２３、２５ 光
１００、２００、３００ 検出装置
１１０、２１０ 試料収容部
２１１ 基板
２１１ａ 表面
２１１ｂ 裏面
２１２ プリズム
２１３ カバーガラス
１２０、２２０ 光源
１３１ 第１磁場印加部
１３２ 第２磁場印加部
１４０ 光検出器
１４１、１４３ 光学レンズ
１４２ ロングパスフィルタ
１５０、３５０ 制御部
３５１ 信号発生器
３５２ ロックインアンプ

Claims (10)

1. 磁性を有する金属粒子に固定された第１物質及び蛍光体で標識された第２物質を標的物質に結合させることにより複合体を形成し、
   前記蛍光体に蛍光を放射させ、かつ、前記金属粒子に局在化表面プラズモン共鳴を生じさせる所定の波長を有する励起光を所定領域に照射し、
   磁場勾配を印加して、前記複合体を前記所定領域に侵入及び／又は前記所定領域から離脱させ、
   前記所定領域からの蛍光を経時的に検出し、
   検出された前記蛍光の強度の変化量に基づいて前記標的物質を検出し、
   前記所定領域において、前記蛍光体が放射する蛍光は、前記金属粒子が生じる局在化表面プラズモン共鳴によって増強される、
   検出方法。
2. 前記励起光の照射では、前記励起光を基板に照射することにより、前記所定領域に前記励起光の近接場を照射し、
   前記所定領域は、前記基板の表面近傍の領域である、
   請求項１に記載の検出方法。
3. 前記磁場勾配の印加では、前記複合体を前記基板の表面から引き離す第１磁場勾配と、前記複合体を前記基板の表面に引き寄せる第２磁場勾配とを交互に繰り返し印加し、
   前記標的物質の検出では、前記第１磁場勾配の印加中又は印加後における前記蛍光の強度と、前記第２磁場勾配の印加中又は印加後における前記蛍光の強度との間の差異に基づいて、前記標的物質を検出する、
   請求項２に記載の検出方法。
4. 前記磁場勾配の印加では、前記第１磁場勾配と、前記第２磁場勾配とを交互に一定周期で印加し、
   前記標的物質の検出では、前記蛍光の強度の時系列を示す信号のうち前記一定周期と同期する成分に基づいて前記標的物質を検出する、
   請求項３に記載の検出方法。
5. 前記磁場勾配の印加では、検出された前記蛍光の強度が極小値になったときに、前記第１磁場勾配から前記第２磁場勾配に切り替え、検出された前記蛍光の強度が極大値になったときに、前記第２磁場勾配から前記第１磁場勾配に切り替える、
   請求項３に記載の検出方法。
6. 磁性を有する金属粒子に固定された第１物質及び蛍光体で標識された第２物質を標的物質に結合させた複合体を含む試料を収容する試料収容部と、
   前記試料収容部内の所定領域に、前記蛍光体に蛍光を放射させ、かつ、前記金属粒子に局在化表面プラズモン共鳴を生じさせる所定の波長を有する励起光を照射する光源と、
   磁場勾配を印加して、前記複合体を前記所定領域に侵入及び／又は前記所定領域から離脱させる磁場印加部と、
   前記所定領域からの蛍光を経時的に検出する光検出器と、
   検出された前記蛍光の強度の変化量に基づいて前記標的物質を検出する制御部と、を備え、
   前記所定領域において、前記蛍光体が放射する蛍光は、前記金属粒子が生じる局在化表面プラズモン共鳴によって増強される、
   検出装置。
7. 前記試料収容部は、前記励起光の照射により近接場を形成可能な基板を備え、
   前記光源は、前記基板に前記励起光を照射することにより、前記所定領域に前記励起光の近接場を照射し、
   前記所定領域は、前記基板の表面近傍の領域である、
   請求項６に記載の検出装置。
8. 前記磁場印加部は、
   前記複合体を前記基板の表面から引き離す第１磁場勾配を前記試料に印加する第１磁場印加部と、
   前記複合体を前記基板の表面に引き寄せる第２磁場勾配を前記試料に印加する第２磁場印加部と、を有し、
   前記第１磁場印加部及び前記第２磁場印加部は、前記第１磁場勾配及び前記第２磁場勾配を交互に繰り返し印加し、
   前記制御部は、前記第１磁場勾配の印加中又は印加後における前記蛍光の強度と、前記第２磁場勾配の印加中又は印加後における前記蛍光の強度との間の差異に基づいて、前記標的物質を検出する、
   請求項７に記載の検出装置。
9. 前記第１磁場印加部及び前記第２磁場印加部は、
   検出された前記蛍光の強度が極小値になったときに、前記第１磁場勾配から前記第２磁場勾配に切り替え、
   検出された前記蛍光の強度が極大値になったときに、前記第２磁場勾配から前記第１磁場勾配に切り替える、
   請求項８に記載の検出装置。
10. 前記第１磁場印加部及び前記第２磁場印加部は、前記第１磁場勾配と前記第２磁場勾配とを交互に一定周期で印加し、
    前記制御部は、前記蛍光の強度の時系列を示す信号のうち前記一定周期と同期する成分に基づいて、前記標的物質を検出する、
    請求項８に記載の検出装置。

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