JP5315381B2 - 蛍光検出装置、蛍光検出用の試料セルおよび蛍光検出方法 - Google Patents
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Description
また、本発明は蛍光検出装置に用いられる蛍光検出用の試料セル、さらには、実用性に富んだ蛍光検出方法を提供することを目的とするものである。
該励起光を受ける位置に配された、入射面から入射した該励起光を透過させる材料からなる基板、該基板の前記入射面とは異なる一面に形成された、開口径が前記励起光の波長以下である微小開口を有する微小開口金属薄膜と、該微小開口金属薄膜に蛍光標識を含む試料液を接触させるように該試料液を保持する試料保持部と、
前記入射面から前記基板を透過して前記微小開口金属薄膜に前記励起光が入射されたとき前記微小開口に生じる近接場光および該近接場光により前記微小開口金属薄膜に誘起された表面プラズモン共鳴によって励起された前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する光検出器とを備え、
前記蛍光標識が、前記励起光および前記蛍光を透過する透光性明誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であることを特徴とするものである。
前記微小開口金属薄膜上に、被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質が固定された検出部が設けられており、
前記流路の前記検出部より上流側に、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、および前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質のいずれか一方の結合物質に蛍光標識が付与されてなる標識結合物質が付加された標識結合物質付加部が設けられており、
前記蛍光標識が、該蛍光標識の蛍光および該蛍光を励起する励起光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であることを特徴とするものである。
前記試料セルの前記微小開口金属薄膜に、蛍光標識が付与されてなる標識結合物質を含む試料液を接触させ、
前記微小開口の開口径より大きい波長の励起光を、前記基板の前記一面とは異なる入射面から入射させ、
該励起光の入射により前記微小開口に生じる近接場光および該近接場光により前記微小開口金属薄膜に誘起された表面プラズモン共鳴によって励起された前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
前記蛍光標識として前記励起光および前記蛍光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子を用いることを特徴とする。
図1は、被検出物質としての抗原Aを含む試料液Sから、抗原抗体反応を利用して抗原Aを検出する場合に用いる、本実施形態による蛍光検出装置1を示す概略側面図である。図示の通り、この蛍光検出装置1は、所定波長の励起光L0を発する光源32と、この励起光L0を片面(入射面)から入射させるように配された、励起光L0を透過させる材料からなる平板状の基板11、この基板11の他面に成膜された、径が励起光L0の波長以下である微小開口12aを有する微小開口金属薄膜12および微小開口金属薄膜12に試料液Sが接するように試料液Sを保持する試料保持部13からなる試料セル10と、試料保持部13の外側から試料液中の蛍光標識からの蛍光Lfを検出可能な位置に配された光検出器30とを備えてなるものである。ここで、蛍光標識は、励起光L0および蛍光Lfを透過する透光性誘電体材料16中に複数の蛍光色素分子15を内包してなる蛍光粒子Fである。
また、試料液S中には、蛍光標識である蛍光粒子Fと、この蛍光粒子Fに標識され抗原Aに対する特異的結合性を有する二次抗体B2からなる標識結合物質20が含まれている。
0.1MのNHSと0.4MのEDCとを等体積混合した溶液を30ul加え、30分間室温静置する。
NHS:N-hydrooxysuccinimide
EDC:1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
(2)一次抗体の固定化
PBSバッフア(pH7.4)で5回洗浄後、一次抗体溶液(500ug/ml)を30ul加え、30〜60分間室温静置する。
(3)未反応の−COOH基をブロッキング
PBSバッフア(pH7.4)で5回洗浄後、1Mのエタノールアミン(pH8.5)を30ul加え、20分間室温静置する。さらにPBSバッフア(pH7.4)で5回洗浄する。
蛍光強度を稼ぐ観点からでは、微小開口金属薄膜12の開口率はある程度大きい方が望ましい。しかしながら、開口率50%を超える微小開口金属薄膜12は、安定かつ密着性の良い薄膜の作製と良質かつ均一性の良い微小開口の作製との両立が困難となる場合があるため、微小開口金属薄膜12の開口率の上限を50%にするのが望ましい。
金属薄膜12上には、抗原Aと特異的に結合する一次抗体B1が固定化されている。そして試料保持部13の中に試料液Sが注入され、試料液中の抗原Aは一次抗体B1に結合し固定される。次いで同様に、抗原Aと特異的に結合し一次抗体B1とは少なくともエピトープが異なる二次抗体B2と蛍光粒子Fとからなる標識結合物質20が流され、一次抗体B1に固定された抗原Aに結合し固定され、所謂サンドイッチを形成する。
図3に示す蛍光検出装置2は、本発明の一実施形態の試料セル50と、試料セル50の所定領域に励起光L0を照射させる光源32と、蛍光Lfを検出する光検出器30とを備えている。
試料セル50は、基板51と、該基板51上に試料液Sを保持し、試料液Sの流路52を形成するスペーサ53と、試料液Sを注入する注入口54aおよび流路52を流下した試料液Sを排出する排出口となる空気孔54bを備えたガラス板からなる上板54とを備えている。また、注入口54aから流路52に至る箇所にはメンブレンフィルター55が備えられ、流路52下流の空気孔54bに接続する部分には廃液だめ56が形成されている。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液(全血)を試料セル50の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図5を参照して説明する。
step2:全血Soはメンブレンフィルター55により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
step3:メンブレンフィルター55で血球分離された血液(血漿)Sが毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔54bにポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図5中において血漿Sは斜線領域で示している。
step4:流路52に染み出した血漿Sと2次抗体B2が修飾された蛍光粒子Fとが混ぜ合わされ、血漿中の抗原Aが2次抗体B2と結合する。
step5:血漿Sは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、2次抗体B2と結合した抗原Aが、検出部58上に固定されている1次抗体B1と結合し、抗原Aが1次抗体B1と2次抗体B2で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
step6:抗原Aと結合しなかった2次抗体B2の一部は参照部59上に固定されている1次抗体B0と結合する。さらに抗原Aまたは1次抗体B0と結合しなかった2次抗体が修飾されている蛍光粒子Fが検出部上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着しているものを洗い流す。
10 試料セル
11 基板
12 微小開口金属薄膜
12a 微小開口
13 試料保持部
14 検出部
15 蛍光色素分子
16 透光性誘電体材料
20 標識結合物質
30 光検出器
32 光源
42 検出部
50 試料セル
51 基板
52 流路
53 スペーサ
54 上板
54a 注入口
54b 空気孔
55 メンブレンフィルター
57 標識結合物質吸着エリア
58 検出部
59 参照部
A 抗原(被検出物質)
B1 一次抗体(第1の結合物質)
B2 二次抗体(第2の結合物質)
F 蛍光粒子
Claims (4)
- 励起光を発する光源と、
該励起光を受ける位置に配された、入射面から入射した該励起光を透過させる材料からなる基板、該基板の前記入射面とは異なる一面に形成された、開口径が前記励起光の波長以下である微小開口を有する微小開口金属薄膜、および該微小開口金属薄膜に蛍光標識を含む試料液を接触させるように該試料を保持する試料保持部を備えてなる試料セルと、
前記入射面から前記基板を透過して前記微小開口金属薄膜に前記励起光が入射されたとき前記微小開口に生じる近接場光および該近接場光により前記微小開口金属薄膜に誘起された表面プラズモン共鳴によって励起された前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する光検出器とを備え、
前記蛍光標識が、前記励起光および前記蛍光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であり、該蛍光粒子の粒子径が前記励起光の波長よりも小さいことを特徴とする蛍光検出装置。 - 前記蛍光粒子の粒子径φが、φ≦200nm
であることを特徴とする請求項1記載の蛍光検出装置。 - 請求項1または2記載の蛍光検出装置の試料セルであって、
前記基板と前記試料保持部により、前記試料液が流下される流路が構成されてなり、
前記微小開口金属薄膜上に、被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質が固定された検出部が設けられており、
前記流路の前記検出部より上流側に、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、および前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質のいずれか一方の結合物質に蛍光標識が付与されてなる標識結合物質が付加された標識結合物質付加部が設けられており、
前記蛍光標識が、該蛍光標識の蛍光および該蛍光を励起する励起光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であり、該蛍光粒子の粒子径が前記励起光の波長よりも小さいことを特徴とする試料セル。 - 基板と、該基板の一面に形成された、微小開口を有する微小開口金属薄膜と、該微小開口金属薄膜に、試料液を接触させるように該試料液を保持する試料保持部とからなる試料セルを用い、
前記試料セルの前記微小開口金属薄膜に、蛍光標識が付与されてなる標識結合物質を含む試料液を接触させ、
前記微小開口の開口径より大きい波長の励起光を、前記基板の前記一面とは異なる入射面から入射させ、
該励起光の入射により前記微小開口に生じる近接場光および該近接場光により前記微小開口金属薄膜に誘起された表面プラズモン共鳴によって励起された前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
前記蛍光標識として前記励起光および前記蛍光を透過する透光性誘電体材料中に複数の蛍光色素分子を内包してなる蛍光粒子であって、粒子径が前記励起光の波長よりも小さい蛍光粒子を用いることを特徴とする蛍光検出方法。
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