JP2010190880A - 光信号検出方法、光信号検出装置、光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】誘電体プレート11および該プレート11の一面の所定領域に設けられた金属層12を備えたセンサ部14を有するセンサチップ10を用意し、該センサチップ10のセンサ部に試料Sを接触させることにより、該センサ部14に被検出物質の量に応じた量の光応答性標識物質Fを結合させ、所定領域に対して励起光L0を照射し、該励起光の照射により金属層12上に生じた電場増強場内において生じる光応答性標識物質Fからの光を検出することにより、被検出物質の量を求める光信号検出方法において、光応答性標識物質Fとして、光応答物質15を、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料16により、該光応答物質15が金属層12に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、包含されてなるものを用いる。
【選択図】図1
Description
該センサチップの前記センサ部に試料を接触させることにより、該センサ部に、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の光応答性標識物質が付与された結合物質を結合させ、
前記所定領域に対して励起光を照射し、該励起光の照射により前記金属層上に生じた電場増強場内において生じる前記光応答性標識物質からの光を検出することにより、前記被検出物質の量を求める光信号検出方法において、
前記光応答性標識物質として、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、包含されてなるものを用いたことを特徴とするものである。
ここで、「異なる複数の時刻」とは、一定時間間隔の複数の時刻であってもよいし、異なる時間間隔の複数の時刻であってもよく、連続的であってもよい。複数の時刻は2以上の時刻であればよいが、測定精度向上の点からは、より多くの時刻で検出を行うことが好ましい。
また、前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものである場合、前記光応答性標識物質の表面に前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていてもよい。
前記所定領域に対して励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記センサ部に試料を接触させた際に、該センサ部に、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、光応答性標識物質が付与された結合物質が結合された場合に、前記センサチップへの前記励起光の照射により前記金属層上に生じた電場増強場内において生じる前記光応答性標識物質からの光を検出する蛍光信号検出手段とを備え、
前記光応答性標識物質が、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように包含されてなるものであることを特徴とするものである。
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートおよび該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属層からなるセンサチップ部と、
前記金属層上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質と、
前記流路内の、前記センサチップ部より上流側に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、または前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質が修飾された光応答性標識物質を備えてなることを特徴とするものである。
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流に流すための空気孔と、前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートおよび該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属層からなるセンサチップ部と、前記金属層上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質とを備えた試料セル、および
光信号検出を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、または前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質が修飾された光応答性標識物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とするものである。
また、前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものである場合、光応答性標識物質の表面に前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていてもよい。
図面を参照して、本発明の第1実施形態に係る光信号検出方法およびそれに用いられる光信号検出装置について説明する。図1は装置の全体図である。各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
励起光照射光学系20により励起光L0が誘電体プレート11と金属膜12との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上12の試料S中にエバネッセント波Ewが滲み出し、このエバネッセント波Ewによって金属膜12中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜12表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。このとき、エバネッセント波Ewの滲み出し領域において光応答性標識物質である蛍光標識物質Fが存在する場合、その蛍光標識物質Fが励起されて蛍光が発生する。ここで、エバネッセント波の染み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。なお、エバネッセント波Ewの滲み出し領域外の蛍光標識物質Fは励起されず蛍光を発しない。光検出器(特にここでは、蛍光検出器)30は、この増強された蛍光を検出する。
一方、光応答物質は、表面プラズモンによって増強された、金属膜表面に染み出したエバネッセント波によって励起される。エバネッセント波の到達範囲(金属膜表面からの距離)は励起光の波長λ程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。光応答物質を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と光応答物質との距離を100nmより小さくすることが望ましい。
本実施形態の蛍光標識物質Fを用いれば、蛍光色素分子15は光透過材料16で覆われていることから直接金属膜に触れることはなく、また、蛍光標識物質中には複数の蛍光色素分子が内包されていることから、金属膜から10〜100nmの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができ、金属消光を防止するための既述のSAM膜およびCMD膜などを設ける複雑な作業を行う必要がない。
まず、センサチップ10の金属膜12を備えたセンサ部14に検査対象となる試料Sを接触させる。ここでは、一例として、試料Sに含まれる被測定物質として抗原Aを検出する場合について説明する。金属膜12上には抗原Aと特異的に結合する第1の結合物質として1次抗体B1が修飾されている。試料保持部13中に試料Sが流され、次いで同様に抗原Aと特異的に結合する第2の結合物質である2次抗体B2が表面に修飾された蛍光標識物質Fが流される。この場合、金属膜12に表面修飾される1次抗体B1と蛍光標識物質Fに表面修飾される2次抗体B2とは、被検出物質である抗体Aに対して互いに別の部位に結合するものが用いられる。その後、誘電体プレート11の所定領域に向けて励起光照射光学系20から励起光L0が照射され、蛍光検出器30により蛍光検出がなされる。このとき、蛍光検出器30によって所定の蛍光が検出されたなら、上記2次抗体B2と抗原Aとの結合、すなわち試料中における抗原Aの存在を確認できることになる。
まず、ポリスチレン粒子(Estapor社、φ500nm、10%solid、カルボキシル基、製品番号K1―050)を調液して0.1%solid in phosphate(ポリスチレン溶液:pH7.0)を作製する。
次に、蛍光色素(MolecularProbes社、BODIPY―FL―SE、製品番号D2184)0.3mgの酢酸エチル溶液(1mL)を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離(15000rpm、4℃、20分を2回)を行い、上清を除去する。以上の工程により、金属消光を防止する機能を有するポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる蛍光標識物質Fを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光標識物質Fの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一(上記例ではφ500nm)となる。
第2の実施形態の光信号検出方法および装置を図2から図4を参照して説明する。ここでは、第1実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
図2に示す蛍光信号検出装置2は、該光検出装置2における光信号検出方法に使用される本発明の一実施形態の試料セル50と、試料セル50の所定領域に励起光L0を照射させる励起光照射光学20と、光Lfを検出する光検出器30とを備えている。
試料セル50は、基台51と、該基台51上に液体試料Sを保持し、液体試料Sの流路52を形成するスペーサ53と、試料Sを注入する注入口54aおよび流路52を流下した試料を排出する排出口となる空気孔54bを備えたガラス板からなる上板54とを備えている。また、注入口54aから流路52に至る箇所にはメンブレンフィルター55が備えられ、流路52下流の空気孔54bに接続する部分には廃液だめ56が形成されている。なお、本実施形態では、スペーサ53により構成された流路を上部に有する基台51は誘電体プレートで構成されており、センサチップ部の誘電体プレートを兼ねている。基台はセンサチップ部となる一部のみ誘電体プレートで構成されたものであってもよい。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液(全血)を試料セル50の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図4を参照して説明する。
step1:注入口54aから検査対象である血液(全血)Soを注入する。ここでは、この血液So中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図4中において全血Soは網掛け領域で示している。
step2:全血Soはメンブレンフィルター55により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
step3:メンブレンフィルター55で血球分離された血液(血漿)Sが毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔54bにポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図4中において血漿Sは斜線領域で示している。
step4:流路52に染み出した血漿Sと2次抗体B2が修飾された蛍光標識物質Fとが混ぜ合わされ、血漿中の抗原Aが2次抗体B2と結合する。
step5:血漿Sは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、2次抗体B2と結合した抗原Aが、第1の測定エリア58上に固定されている1次抗体B1と結合し、抗原Aが1次抗体B1と2次抗体B2で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
step6:抗原Aと結合しなかった2次抗体B2の一部は第2の測定エリア59上に固定されている1次抗体B0と結合する。さらに抗原Aまたは1次抗体B0と結合しなかった2次抗体が修飾されている蛍光標識物質Fが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着しているものを洗い流す。
τ=h2/D ・・・(1)
ここで、h:拡散距離、D:拡散定数である。
ここで、KB:ボルツマン定数、T:絶対温度、η:溶媒の粘性、d:流体力学半径である。
既述のように、光応答性標識物質の光透過材料には水溶媒より屈折率の高いポリスチレンやガラスを用いている。例えばポリスチレンの屈折率n=1.59〜1.6である。このような高屈折率の光応答性標識物質が金属膜近傍に位置することによって表面プラズモンの発生が阻害されうる。この現象をプリズム層101、金属膜102、溶媒層103の三層に分けた多層膜近似で考察した。図7Aは金属層102上に水溶媒層のみである場合、図7Bは金属膜102にポリスチレンの光応答性標識物質104が存在する場合に、プリズム層101側から光ビームを入射させた場合に金属膜表面に生じる電場Eを模式的に示している。
このような、光応答性標識物質による表面プラズモンの擾乱を考慮に入れ、光応答性標識物質の粒径と標識物質からの光量との関係をシミュレーションした結果を図9に示す。粒径が大きくなれば内包される光応答物質が増えるので、粒径が400nmまでは光量は粒径の増加に伴い増大するが、粒径500nmを超えると急激に光量が減少していくことが分かった。これは、粒径500nmを超えると上述の光応答性標識物質による表面プラズモンの擾乱が大きくなってくるためである。図9から、光応答性標識物質の径の増加による光量の増加と光応答性標識物質による表面プラズモンの擾乱とを考慮し、光量が最大ピークを示した粒径300nmの光量から1桁程度以上光量が落ちないようにするためには、光応答性標識物質の粒径を70nm〜900nmの範囲とすることが望ましい。
具体的には、SPF法と蛍光微粒子(II)との組合せでは、SPF増強度10×蛍光粒子(II)の光量1=10が得られ、一方、落射蛍光法と蛍光微粒子(I)との組合せでは、増強度1×蛍光微粒子(I)の光量4.4=4.4が得られる。この場合、蛍光微粒子の性能の差を含めたSPF法の落射蛍光法に対する信号増強効果は10/4.4=2.3となる。このように、使用可能な蛍光微粒子の性能を含めるとSPF法としての信号増強効果は、同一の性能の蛍光微粒子を用いる場合より減じられる。
さて、図12の光信号量において、その最大値はすなわちSPF法における落射蛍光法に対する増強度が約10倍となる値である。従って、図12において最大値からずれた場合、増強度自体が小さくなることを意味する。SPF法による信号増強効果としては、少なくとも落射蛍光法に対し1.6倍程度以上を得ることが望まれる。増強度A/蛍光性能差(4.4)≧1.6とすると、増強度A≧1.6×4.4≒7.0となる。従って、SPF法としての増強度Aが7倍以上であれば、すなわち、図12において最大値の70%以上であれば、落射蛍光法に対して1.6倍以上の蛍光信号量を得ることができる。
なお、この統計ばらつきの観点から定められるCVが5%、より好ましくはCVが3%以下とした場合の558nm以下、より好ましくは333nm以下という粒径の好ましい範囲については、光応答物質が、蛍光を生じるものでない場合も同様に適用可能である。
一般的な診断用途において、検出限界の抗原濃度として1pM(ピコモーラー:×10-12mol/l)程度は必要であるといわれている。そこで、この1pM以下の抗原濃度を検出し、ダイナミックレンジ2桁、すなわち、100pMまで検出できる感度特性を目標値として蛍光標識物質の好ましい粒径を導出した。
なお、上記においては、光応答性標識物質が球状であるとみなして好ましい粒径範囲を求めたが、光応答性標識物質は球状でなくてもよく、球状でない場合には、粒子の最大幅と最小幅との平均の長さを粒径とする球状で近似することができる。
第3の実施形態の光信号検出方法として、本発明の一実施形態の光信号検出用キットを用いた方法について図16A、16Bおよび17を参照して説明する。図16A、16Bおよび17において、上述の試料セルと同一の要素には同一符号を付し、詳細な説明を省略する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液(全血)を試料セル61の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図17を参照して説明する。
step1:注入口54aから検査対象である血液(全血)Soを注入する。ここでは、この血液So中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図17中において全血Soは網掛け領域で示している。
step2:全血Soはメンブレンフィルター55により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルター55で血球分離された血液(血漿)Sが毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図17中において血漿Sは斜線領域で示している。
step3:血漿Sは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、血漿S中の抗原Aが、第1の測定エリア58上に固定されている1次抗体B1と結合する。
step4:2次抗体B2が修飾された蛍光標識物質Fを含む標識用溶液63を供給口54aから注入する。
step5:2次抗体B2が修飾された蛍光標識物質Fが毛細管現象により流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
step6:蛍光標識物質Fは徐々に下流側に流れ、蛍光標識物質Fに修飾されている2次抗体が抗原Aと結合し、抗原Aが1次抗体B1と2次抗体B2で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
前述の手順で作製した蛍光標識物質溶液(蛍光物質の直径500nm、励起波長502nm、蛍光波長510nm)に50mM MESバッファーおよび、5.0mg/mLの抗hCGモノクローナル抗体(Anti−hCG 5008 SP−5、Medix Biochemica社)溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光標識物質への抗体の修飾がなされる。
さらに、2mol/L Glycine水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、PBS(pH7.4)を加え、超音波洗浄機により蛍光標識物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、1%BSAのPBS(pH7.4)溶液500μL加え、蛍光標識物質を再分散させて標識用溶液とする。
第4の実施形態である光信号検出方法およびそれに用いられる光信号検出装置について図18を参照して説明する。図18は装置の全体図であり、図中において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。なおここでは、第1実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
図19Aに示すセンサチップ10Aは、誘電体プレート11と、該プレート11の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子73aからなる金属微細構造体73で構成されている。金属粒子73aの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子73aの平均的な径及びピッチが励起光L0の波長よりも小さく設計される。
図19Cに示す例では、マッシュルーム状の金属75aの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属75aの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが測定光Lの波長よりも小さく設計される。
光源21から出射された励起光L0はハーフミラー23により反射されてセンサチップ10’の試料接触面上に入射される。この励起光L0の照射により、金属層12’の表面で局在プラズモンが励起される。この局在プラズモンにより金属層12’上には、電界分布Dが生じ、電場増強領域が形成される。一方、試料S中の励起光L0が照射された領域においては蛍光標識物質Fが励起されて蛍光が発生する。このとき、電場増強領域にある蛍光標識物質F1からの蛍光Lf1の強度は増強されるが、電場増強領域外にある蛍光標識F2からの蛍光Lf2強度は増強されない。検出器30においては、図示しない集光レンズにより蛍光を集光し、光検出器により蛍光検出を行う。この際には電場増強領域を含む広範囲の蛍光標識からの蛍光が集光され得るが、例えば、該蛍光を減衰させるフィルタを集光レンズと光検出器との間に備えることにより、蛍光強度が増強された強度の大きいもののみを検出することが可能となる。
第5の実施形態の光信号検出方法および装置5を図20を参照して説明する。ここでは、第2実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
まず、前述手順により蛍光標識物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン(PEI)(エポミン、日本触媒社)を修飾する。
次に、粒子表面のPEIにPdナノ粒子(平均粒径19nm、徳力本店)を吸着させる。
Pdナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(HAuCl4、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Pdナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
図23(A)に示すように、被検出物質(例えば、抗原)Aと同一の免疫反応を示す第3の結合物質C3を蛍光標識物質Fに修飾させておく。金属膜12上には、被検出物質Aおよび第3の結合物質C3といずれとも特異的に結合する第1の結合物質C1(例えば、1次抗体)を固定化しておく。第3の結合物質C3(例えば、競合抗原)が修飾された蛍光標識物質Fを所定濃度で、被検出物質Aと混合し、金属膜12上に固定化された第1の結合物質C1に競合的に反応させる(抗原−抗体反応)。抗原と蛍光標識物質との混合時における蛍光標識物質の濃度は既知である。
競合法の場合は、信号較正に用いられる第2の測定エリア59’には、抗原C3、一次抗体C1とは特異結合を持たない免疫反応物質対の一方を構成する物質D1を固定する必要があり、その免疫反応物質対の他方を構成する物質D2が、競合抗原C3と共に蛍光標識物質Fの表面に修飾されている。物質D1、D2の組合せとしては、例えばアビジンービオチンを用いることができる。
step1:注入口54aから検査対象である血液(全血)Soを注入する。ここでは、この血液So中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図24中において全血Soは網掛け領域で示している。
step2:全血Soはメンブレンフィルター55により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
step3:メンブレンフィルター55で血球分離された血液(血漿)Sが毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔54bにポンプを接続し、メンブレンフィルター55で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図24中において血漿Sは斜線領域で示している。
step4:流路52に染み出した血漿Sと競合抗原C3が付与された蛍光標識物質Fとが混ぜ合わされる。
step5:血漿Sは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、抗原Aと競合抗原C3とが競合して、第1の測定エリア58’上に固定されている1次抗体C1と結合する。
step6:第1の測定エリア58’上の1次抗体C1と結合しなかった競合抗原C3が修飾されている蛍光標識物質Fの一部は、その蛍光標識物質Fに表面修飾されている物質D2が第2の測定エリア59’上に固定されている物質D1と結合し、測定エリア59’上に固定される。さらに1次抗体C1または物質D1と、競合抗原C3または物質D2を介して結合していない蛍光標識物質が測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していたものを洗い流す。
2%蛍光標識物質の溶液250μLに、2mg/mLの抗hCGモノクローナル抗体(Medix社製#100006)、50mMのMESバッファー(pH6.0)溶液250μLを加え室温で15分間攪拌した。10mg/mLのWSC(品番01−62−0011、和光純薬)水溶液を5μL加え、室温で2時間撹拌した。2mol/LのGlycine水溶液を25μL添加し、30分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)にて、蛍光標識物質を沈降させた。上清を取り除き、PBS溶液(pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機により蛍光標識物質を再分散させた。さらに遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、上清を除いた後、1%BSAのPBS(pH7.4)溶液500μL加え、蛍光標識物質を再分散させることで、抗hCG抗体結合蛍光標識物質の1%(w/v)溶液を得た。
上板をセンサチップの流路に付ける前に、センサチップの測定エリアに、10μg/mLに調製した抗hCGモノクローナル抗体(Medix社製#100066)の150mM塩化ナトリウム溶液を100μL添加し、室温で1時間静置した。抗体溶液を除去し、予め調製した洗浄用バッファー(0.05%(w/v) Tween-20を含むPBS(pH7.4))で洗浄した(300μL/回、3回)。洗浄終了後、抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1%カゼインを含むPBS(pH7.4)を300μL添加し、1時間、室温で静置した。上記の洗浄用バッファーで洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)を300μLずつ各ウェルに添加し、室温で30分間放置後、溶液を除去し乾燥機中で水分を完全に取り除いた。抗hCG抗体結合処理後に、蓋材を用いてセンサチップの流路を封入し、流路型センサチップを作製する。流路の封入には超音波溶着などの方法を用いることができる。
精製hCG抗原をそれぞれ、0p、0.9pM、9pM、90pM添加した1%BSAのPBS溶液(リン酸緩衝液)を調製し、試料溶液とした。濃度0pは1%BSAのPBS溶液そのものである。
各試料溶液500μLに、上述の手順で調製した1%抗hCG抗体結合蛍光標識物質溶液を5μLずつ添加し混合させ反応液とした。図3Aおよび図3Bに示した試料セルと同様の試料セルを用い、反応液を、測定エリア上を流下させつつ、測定エリアからの蛍光信号を、異なる複数の時刻で測定した。この際、なお、試料セルの空気孔にポンプを接続し、一定流速(線速度1.4mm/s)となるようにポンプ吸引を行い、反応液のうち300μLを測定エリア上に送液しつつ、測定を行った。
このようにして、各濃度の反応液毎に蛍光信号強度の時間変化を測定した結果を図25に示す。図25に示す測定結果から、各hCG濃度での蛍光量の時間変化(傾きa)を求めることができる。具体的には図25に示すように、それぞれの濃度毎に直線フィッティングを行い、その関係式y=ax+bを求めた。
図25で求めた蛍光量の時間変化(傾きa)をy軸、濃度をx軸としてプロットして、図26に示すような蛍光量の時間変化対濃度の検量線を取得した。なおここでは、hCG抗原濃度(x)と蛍光量の時間変化(y)との関係を、y=0.043x0.9で表すことができた。例えば、未知の濃度のhCG抗原を含む試料について、蛍光量の時間変化を測定し、その時間変化(傾き)が0.2であった場合、図26において、y=0.043x0.9がy=0.2と交わった点における濃度(5.5pM)であると特定することができる。
10、10’ センサチップ
11 誘電体プレート
12 金属層(金属膜)
12’ 金属層(金属微細構造体)
14 センサ部
15 光応答物質
16 光透過材料
19 金属被膜
20、20’ 励起光照射光学系
21 光源
22 プリズム
30 光検出器
50、61 試料セル
51 誘電体プレート
52 流路
53 スペーサ
54 上板
57 光応答性標識物質吸着エリア
58、59 測定エリア
A 抗原(被検出物質)
B1 1次抗体(第1の結合物質)
B2 2次抗体(第2の結合物質)
F 光応答性標識物質
L0 励起光
Lf 蛍光
Claims (20)
- 誘電体プレートおよび、該プレートの一面の所定領域に設けられた金属層を備えたセンサ部を有するセンサチップを用意し、
該センサチップの前記センサ部に試料を接触させることにより、該センサ部に、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、光応答性標識物質が付与された結合物質を結合させ、
前記所定領域に対して励起光を照射し、該励起光の照射により前記金属層上に生じた電場増強場内において生じる前記光応答性標識物質からの光を検出することにより、前記被検出物質の量を求める光信号検出方法において、
前記光応答性標識物質として、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、包含されてなるものを用いたことを特徴とする光信号検出方法。 - 前記光の検出を、異なる複数の時刻に行い、該光の強度の時間変化に基づいて、前記被検出物質の量を求めることを特徴とする請求項1記載の光信号検出方法。
- 前記光応答性標識物質の粒径が、5300nm以下であることを特徴とする請求項1または2記載の光信号検出方法。
- 前記光応答性標識物質の粒径が、70nm〜900nmであることを特徴とする請求項1または2記載の光信号検出方法。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、90nm〜700nmであることを特徴とする請求項1または2記載の光信号検出方法。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、130nm〜500nmであることを特徴とする請求項1または2記載の光信号検出方法。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の表面に前記光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項1から6いずれか1項記載の光信号検出方法。
- 誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属層を備えたセンサ部を有するセンサチップと、
前記所定領域に対して励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記センサ部に試料を接触させた際に、該センサ部に、前記試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、光応答性標識物質が付与された結合物質が結合された場合に、前記センサチップへの前記励起光の照射により前記金属層上に生じた電場増強場内において生じる前記光応答性標識物質からの光を検出する光検出手段とを備え、
前記光応答標識が、複数の光応答物質が、該光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、該光応答物質が前記金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように包含されてなるものであることを特徴とする光信号検出装置。 - 光応答性標識物質から生じる光を検出する光信号検出方法に使用される試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートおよび該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属層からなるセンサチップ部と、
前記金属層上に固定された、被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質と、
前記流路内の、前記センサチップ部より上流側に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、または前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質が修飾された光応答性標識物質とを備えてなることを特徴とする光信号検出用試料セル。 - 前記光応答性標識物質の粒径が、5300nm以下であることを特徴とする請求項9記載の光信号検出用試料セル。
- 前記光応答性標識物質の粒径が、70nm〜900nmであることを特徴とする請求項9記載の光信号検出用試料セル。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、90nm〜700nmであることを特徴とする請求項9記載の光信号検出用試料セル。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、130nm〜500nmであることを特徴とする請求項9記載の光信号検出用試料セル。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の表面に前記蛍光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項9から13いずれか1項記載の光信号検出用試料セル。
- 光応答性標識物質から生じる光を検出する光検出法に使用される光信号検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部に設けられた誘電体プレートおよび該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属層からなるセンサチップ部と、前記金属層上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質とを備えた試料セル、および
光信号検出を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、または前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質が修飾された光応答性標識物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とする光信号検出用キット。 - 前記光応答性標識物質の粒径が、5300nm以下であることを特徴とする請求項15記載の光信号検出用キット。
- 前記光応答性標識物質の粒径が、70nm〜900nm以下であることを特徴とする請求項15記載の光信号検出用キット。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、90nm〜700nmであることを特徴とする請求項15記載の光信号検出用キット。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の粒径が、130nm〜500nmであることを特徴とする請求項15記載の光信号検出用キット。
- 前記光応答物質が前記励起光の照射を受けて蛍光を生じるものであり、前記光応答性標識物質の表面に前記光を透過する厚みの金属皮膜が設けられていることを特徴とする請求項15から19いずれか1項記載の光信号検出用キット。
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