JP2015072249A - 被検物質の測定方法、被検物質測定キット及び被検物質測定試薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】高感度で、被検物質の非特異反応を抑制することで偽陽性を回避し、かつ測定の再現性が良好な被検物質の測定方法、被検物質測定キット及び被検物質測定試薬を提供すること。【解決手段】(i）(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、(b)前記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、（ｃ）前記被検物質を含む被検試料液と、を混合して、混合液を得る工程、(ii)前記工程(i)で得た混合液を、基板上に適用する工程、(iii)前記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、前記基板上の反応部位において、前記被検物質を捕捉する工程、及び（iv）前記反応部位上に捕捉された前記被検物質を検出する工程、を含む、被検物質の測定方法。【選択図】なし
Description
本発明は、不溶性担体を使用し抗原抗体反応などに基づいて被検物質を測定する方法、並びに前記方法を行うための被検物質測定キット及び被検物質測定試薬に関する。
従来から、血液などの生体試料等の検体中の特定成分である微量の被検物質を測定する免疫学的測定方法は臨床検査の分野で広く用いられている。この、免疫学的測定方法は、例えば、抗原と抗体の反応に代表される特異的な反応を使用しており、測定したい被検物質を特異的に測定することが可能な非常に有効な測定手段となっている。しかしながら、被検物質を含む陽性となる被検試料だけでなく、被検物質を含まない陰性の被検試料に対しても反応し、陽性となる被検試料が存在し、偽陽性を示す問題が従来から認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。
これらの非特異反応を抑制する技術として、特許文献１には、免疫学的測定方法、特に、凝集を利用した免疫学的測定方法において、０．３〜２．０μｍの感作粒子の非特異的免疫反応を阻止するために０．２μｍ以下の超微粒子を使用することが記載されている。特許文献２には、０．４μｍ以上の感作粒子を用いた免疫凝集反応により被検物質を検出する方法において、ブロッキングに使用する粒子として０．０１μｍ〜０．５μｍの不溶性担体粒子を用いることが記載されている。また、特許文献３には、非特異反応の抑制を目的として、特異的に反応する粒子よりも小さい粒子に非測定物質と免疫学的に反応しない抗体、または抗原を固定したものを添加する方法が記載されている。さらに、特許文献４には、被測定物質に対して免疫学的に反応する抗体あるいは抗原を平均粒子径０．０５〜０．５μｍの担体に担持した免疫測定粒子を使用する免疫測定方法に用いられる非特異反応抑制剤であって、被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体または抗原を有機溶媒存在下で担持した不溶性担体からなり、前記不溶性担体の平均粒子径が前記担体の平均粒子径よりも小さいことを特徴とする非特異反応抑制剤が記載されている。特許文献５には、種々の生体分子間における特異的な結合反応と非特異的な結合反応を識別する検出方法において、外径１μｍ以下の粒子により非特異反応の影響を抑止することが記載されている。
一方、免疫学的測定方法の検出感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用意し、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させる。かかる励起光の照射により金属層に表面プラズモンが発生する。この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上することとなる。表面プラズモン励起による蛍光検出法（以下、「ＳＰＦ法」とする）は、落射励起による蛍光検出法（以下、「落射蛍光法」とする）と比較して、信号増強度が約１０倍得られ、高感度に測定することができる。
例えば、特許文献６に記載の被検物質の量を求める光信号検出方法では、誘電体プレートの一面の所定領域に設けられた金属層を備えたセンサ部を有するセンサチップを用意し、センサチップのセンサ部に試料を接触させる。かかる接触により、試料に含有される被検物質の量に応じた量の光応答性標識物質が付与された結合物質がセンサ部に結合する。次いで、所定領域に対して励起光を照射し、金属層上に生じた電場増強場内に生じる光応答性標識物質からの光を検出することにより、被検物質の量を求められる。また、この方法において、光応答性標識物質として、複数の光応答物質が、光応答物質から生じる光を透過する光透過材料により、光応答物質が金属層に近接した場合に生じる金属消光を防止するように、包含されてなるものを用いることも可能である。
また、特許文献７には、誘電体プレートの一面に、該誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用い、前記センサ部に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、蛍光標識と該蛍光標識に標識された結合物質とからなる蛍光標識結合物質を、前記センサ部上に結合させ、前記センサ部に励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、該増強した光電場により、前記蛍光標識を励起し、該励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、前記蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、該複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ該複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用い、前記センサ部に対する前記蛍光標識結合物質の非特異的吸着性により該蛍光標識結合物質が前記センサ部に吸着することを防ぐためのブロッキング剤として、前記第１の蛍光色素分子を含まずかつ前記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、前記蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いることを特徴とする検出方法が記載されている。
免疫学的測定方法は、高感度で再現性高く、精度よく測定でき、かつ保存性が良好であることが必要であり、さらに医療での診断のためには、各診療所単位で測定が可能となる程度の簡便性を備え、測定結果をその場で知ることができる短時間で測定できる性能も要望されている。また、前記特許文献１から５に開示された技術は、非特異吸着を抑制する粒子として、粒子径を小さくし、比表面積を大きくすることが可能となるために非特異吸着原因物質のトラップ効率が高い。しかしながら、これらの技術は、免疫凝集法により被検物質を検出する方法に関するものであり、被検物質の存在に依存して起こる粒子の凝集による濁度の変化を検出するため、高感度化にはどうしても大きな被検物質を検出する粒子を使用する必要があり、保存状態や測定のタイミングによっては、粒子の沈降、凝集等により測定の再現性、保存性などの問題があった。
本発明は、高感度で、被検物質の非特異反応を抑制することで偽陽性を回避し、かつ測定の再現性が良好な被検物質の測定方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、前記被検物質の測定方法を行うための被検物質測定キット及び被検物質測定試薬を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子とを、被検物質を含む被検試料液と混合することにより得た混合液を基板上に適用し、被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板上の反応部位において被検物質を捕捉し、反応部位上に捕捉された被検物質を検出することによって、高感度で、被検物質の非特異反応を抑制することで偽陽性を回避し、かつ測定の再現性が良好な被検物質の測定を実現できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、
（i）(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、
(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、
(c)被検物質を含む被検試料液と、
を混合して、混合液を得る工程、
(ii)工程(i)で得た混合液を、基板上に適用する工程、
(iii)被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、基板上の反応部位において、被検物質を捕捉する工程、及び
（iv）反応部位上に捕捉された被検物質を検出する工程、
を含む、被検物質の測定方法が提供される。
（i）(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、
(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、
(c)被検物質を含む被検試料液と、
を混合して、混合液を得る工程、
(ii)工程(i)で得た混合液を、基板上に適用する工程、
(iii)被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、基板上の反応部位において、被検物質を捕捉する工程、及び
（iv）反応部位上に捕捉された被検物質を検出する工程、
を含む、被検物質の測定方法が提供される。
さらに本発明によれば、
被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子；
被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子；
第一の乾燥粒子および第二の乾燥粒子とを貯蔵する容器；
第一の乾燥粒子および第二の乾燥粒子を流すための流路；及び
被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板；を含む、被検物質測定用センサキットが提供される。
被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子；
被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子；
第一の乾燥粒子および第二の乾燥粒子とを貯蔵する容器；
第一の乾燥粒子および第二の乾燥粒子を流すための流路；及び
被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板；を含む、被検物質測定用センサキットが提供される。
さらに本発明によれば、本発明の被検物質測定用センサキットを用いて行う、本発明の被検物質の測定方法が提供される。
さらに本発明によれば、
(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２０
０ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、
(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、
を含む、被検物質測定試薬が提供される。
(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２０
０ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、
(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、
を含む、被検物質測定試薬が提供される。
好ましくは、第一の乾燥粒子に対する第二の乾燥粒子の質量比は２〜６である。
好ましくは、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質は抗体である。
好ましくは、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質はマウス由来の抗体である。
好ましくは、標識を有する第一の乾燥粒子は、蛍光ラテックス粒子であり、第二の乾燥粒子がラテックス粒子である。
好ましくは、工程（iv）において、反応部位上に捕捉された被検物質を表面プラズモン蛍光法により検出する。
好ましくは、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質は抗体である。
好ましくは、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質はマウス由来の抗体である。
好ましくは、標識を有する第一の乾燥粒子は、蛍光ラテックス粒子であり、第二の乾燥粒子がラテックス粒子である。
好ましくは、工程（iv）において、反応部位上に捕捉された被検物質を表面プラズモン蛍光法により検出する。
本発明の被検物質の測定方法によれば、高感度な測定が可能であり、被検物質の非特異反応を抑制することで偽陽性を回避することができ、かつ測定の再現性が良好である。また、本発明の被検物質測定キット及び被検物質測定試薬を用いた被検物質の測定方法においても上記と同様に、高感度な測定が可能であり、被検物質の非特異反応を抑制することで偽陽性を回避することができ、かつ測定の再現性が良好である。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による被検物質の測定方法は、
（i）(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、
(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上
２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、
(c)被検物質を含む被検試料液と、
を混合する工程、
(ii)前記工程(i)で得た混合液を、基板上に適用する工程、
(iii)被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板上の反応部位において被検物質を捕捉する工程、及び
（iv）反応部位上に捕捉された被検物質を検出する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明による被検物質の測定方法は、
（i）(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、
(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上
２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、
(c)被検物質を含む被検試料液と、
を混合する工程、
(ii)前記工程(i)で得た混合液を、基板上に適用する工程、
(iii)被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板上の反応部位において被検物質を捕捉する工程、及び
（iv）反応部位上に捕捉された被検物質を検出する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明の特徴は特に、
被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の粒子を使用する点（第一の特徴）；並びに、
被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の粒子と、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の粒子の両方が乾燥粒子であり、これら２種の乾燥粒子を、被検物質を含む被検試料液と混合することによって使用する点（第二の特徴）：にある。上記第一の特徴により、被検物質の非特異反応を抑制することができる、これにより偽陽性を回避でき、高感度を達成することができる。また、上記第２の特徴により、測定の再現性を良好なものとすることができる。なお、粒子を溶液で保存すると凝集し、粒径が大きくなり、再現性が低下することが懸念される。本発明は、粒子を乾燥状態で保存することにより上記問題を解消したものである。
被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の粒子を使用する点（第一の特徴）；並びに、
被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の粒子と、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の粒子の両方が乾燥粒子であり、これら２種の乾燥粒子を、被検物質を含む被検試料液と混合することによって使用する点（第二の特徴）：にある。上記第一の特徴により、被検物質の非特異反応を抑制することができる、これにより偽陽性を回避でき、高感度を達成することができる。また、上記第２の特徴により、測定の再現性を良好なものとすることができる。なお、粒子を溶液で保存すると凝集し、粒径が大きくなり、再現性が低下することが懸念される。本発明は、粒子を乾燥状態で保存することにより上記問題を解消したものである。
（第一の乾燥粒子及び第二の乾燥粒子）
本発明で用いる第一の粒子（蛍光などの標識を有する粒子）および第二の粒子は、乾燥状態で保存され、測定時に被検物質を含む被検試料液と混合することによって使用される。第一の粒子及び第二の粒子を溶液状態で保存した場合、粒子同士が凝集や融着することにより大サイズ化し、測定精度が変化する場合があるので、本発明ではこの問題を回避するために、第一の粒子及び第二の粒子は乾燥状態で保存される。その場合、測定の再現性を良好に保つために、第二の粒子だけではなく、第一の粒子についても１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径であることが必要となる。即ち、本発明では、標識を有する第一の粒子、および第二の粒子の平均粒子径は１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。粒子の平均粒子径が２００ｎｍを超えると、被検物質を含む被検試料液と混合したときに溶解不良が起こる場合があり、測定、あるいは擬陽性の防止能力の再現性が低下してしまう。また、粒子の平均粒子径が１００ｎｍ未満であると、シグナル感度不足となり、本発明の測定の再現性を良好に保つ効果を実現できなくなる。本発明の第一の粒子及び第二の粒子の平均粒子径は、１００ｎｍ以上１９０ｎｍ以下であることがより好ましく、１３０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることが更に好ましい。
本発明で用いる第一の粒子（蛍光などの標識を有する粒子）および第二の粒子は、乾燥状態で保存され、測定時に被検物質を含む被検試料液と混合することによって使用される。第一の粒子及び第二の粒子を溶液状態で保存した場合、粒子同士が凝集や融着することにより大サイズ化し、測定精度が変化する場合があるので、本発明ではこの問題を回避するために、第一の粒子及び第二の粒子は乾燥状態で保存される。その場合、測定の再現性を良好に保つために、第二の粒子だけではなく、第一の粒子についても１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径であることが必要となる。即ち、本発明では、標識を有する第一の粒子、および第二の粒子の平均粒子径は１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。粒子の平均粒子径が２００ｎｍを超えると、被検物質を含む被検試料液と混合したときに溶解不良が起こる場合があり、測定、あるいは擬陽性の防止能力の再現性が低下してしまう。また、粒子の平均粒子径が１００ｎｍ未満であると、シグナル感度不足となり、本発明の測定の再現性を良好に保つ効果を実現できなくなる。本発明の第一の粒子及び第二の粒子の平均粒子径は、１００ｎｍ以上１９０ｎｍ以下であることがより好ましく、１３０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることが更に好ましい。
また、第一の乾燥粒子と第二の乾燥粒子の使用比率については、第一の乾燥粒子に対する第二の乾燥粒子の質量比が１〜６であることが好ましく、２〜６であることが更に好ましい。
（平均粒子径の測定方法）
本発明で用いる第一の乾燥粒子及び第二の乾燥粒子の平均粒子径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
本発明で用いる第一の乾燥粒子及び第二の乾燥粒子の平均粒子径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
粒子径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を好ましく用いることができる。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求めることができる。
（ラテックス粒子）
本発明で用いる第一の乾燥粒子及び第２の乾燥粒子の材質は本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、ラテックス粒子を用いることが好ましい。ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。
本発明で用いる第一の乾燥粒子及び第２の乾燥粒子の材質は本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、ラテックス粒子を用いることが好ましい。ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。
ラテックスの作成方法は特に限定されず、任意の重合方法により作成することができる。但し、抗体標識の際に界面活性化剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、ソープフリー重合が好ましい。
本発明で用いるラテックス粒子は、特に好ましい態様によれば、スチレンおよびアクリル酸またはメタクリル酸を含み、スチレン濃度が１．４Ｍ以下の水系懸濁液に重合開始剤を滴下して重合を行うことによって製造することができる。スチレン濃度が１．４Ｍより高い水系懸濁液を用いることは、重合系中に発生したラテックス粒子同士が結合し、結果として生成するラテックスの平均粒子径が大きくなってしまうので、好ましくない。また、重合開始剤の添加前に水系懸濁液を７５〜１００℃に昇温することが好ましい。このように昇温することにより、添加と同時に開始剤を分解、重合系中のラジカルを一気に発生させ、モノマーの消費を始めることができるため、ラテックスの粒子径を均一にする効果があるので、好ましい。
重合開始剤としては、重合を行えるものであれば特に限定されず、公知の重合開始剤を使用することができる。例えば、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、２，２'−アゾビスイソブチロニトリル、２，２'−アゾビス（２，４−ジメチル）バレロニトリル、２，２'−アゾビス４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル、ベンゾイルパーオキサイド、２，４−ジクロロパーオキサイド、イソプロピルパーオキシカーボネート、クメンハイドロパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイドなどを使用して重合を行なうことができ、特に好ましくは、過硫酸カリウムを用いて重合を行うことができる。重合開始剤の使用量は、単量体組成物の０．１〜５質量％程度であることが好ましい。
また、重合は、架橋剤の存在下で行うこともできる。架橋剤としては、例えば、ジビニルベンゼン、１，４ブタジエンなどを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の平均粒子径の範囲内のラテックス粒子を作製する方法としては、モノマー濃度や開始剤濃度、重合温度を調製することで可能となる。
（標識を有する第一の乾燥粒子）
本発明における第一の乾燥粒子は、標識を有する。標識の種類は検出することができるものであれば特に限定されないが、好ましくは蛍光物質である。即ち、本発明における標識を有する第一の乾燥粒子は、好ましくは、蛍光ラテックス粒子である。標識を有する第一の乾燥粒子として蛍光ラテックス粒子を使用する場合、重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。また、重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより製造できる。ラテックス粒子の溶液中のラテックス濃度は０．１〜１０質量％が好ましい。溶液には電解質が含まれることが好ましく、電解質としてはＮａＣｌが好ましく、溶液中の電解質濃度は１〜５００ｍＭが好ましい。またラテックス粒子の溶液中に含まれる水溶性有機溶剤としては、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、アセトンが好ましく、水と水溶性有機溶剤の比率は１０〜８０質量％程度が好ましい。
本発明における第一の乾燥粒子は、標識を有する。標識の種類は検出することができるものであれば特に限定されないが、好ましくは蛍光物質である。即ち、本発明における標識を有する第一の乾燥粒子は、好ましくは、蛍光ラテックス粒子である。標識を有する第一の乾燥粒子として蛍光ラテックス粒子を使用する場合、重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。また、重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより製造できる。ラテックス粒子の溶液中のラテックス濃度は０．１〜１０質量％が好ましい。溶液には電解質が含まれることが好ましく、電解質としてはＮａＣｌが好ましく、溶液中の電解質濃度は１〜５００ｍＭが好ましい。またラテックス粒子の溶液中に含まれる水溶性有機溶剤としては、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、アセトンが好ましく、水と水溶性有機溶剤の比率は１０〜８０質量％程度が好ましい。
上記の通り、本明細書で言う「蛍光ラテックス粒子」とは、重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合における当該蛍光ラテックス粒子と、重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合に、当該ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって得られる蛍光ラテックス粒子の両方の場合を包含するものである。
（結合物質で修飾された粒子）
本発明における第一の乾燥粒子は、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾されている。また、本発明における第二の乾燥粒子は、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾されている。
本発明における第一の乾燥粒子は、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾されている。また、本発明における第二の乾燥粒子は、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾されている。
（被検物質）
本発明の測定方法における検出対象である被検物質の種類は特に限定されないが、例えば、コルチゾール、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合蛋白３型（ＩＧＦＢＰ−３）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、尿中ＧＨ、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ＴＳＨ刺激性レセプター抗体（ＴＳＡｂ）、チロキシン（Ｔ４）、抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体（抗ＴＰＯ抗体）、マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、サイログロブリン、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ｆＴ４、ｆＴ３、１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ、Ｉ型コラーゲン架ＮN-テロペプチド（ＮＴｘ）、インタクトＩ型プロコラーゲン−Ｎ−プロペプチド（Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ）、オステオカルシン、カルシトニン、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、デオキシピリジノリン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、Ｌ−ドーパ、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルエチレングリコール（ＭＨＰＧ）、バニリルマンデル酸（ＶＭＡ）、カテコールアミン、セロトニン、メタネフリン、１１−デオキシコルチゾール、１７−ケトジェニックステロイド（１７−ＫＧＳ）、１７−ＯＨプレグネノロン、アルドステロン、アンドロステロン、アンドロステンジオン、１１−ヒドロキシコルチコステロイド（１１−ＯＨＣＳ）、コルチコステロン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン（ＤＯＣ）、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、プレグネノロン、５αジヒドロテストステロン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）βサブユニット、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、エストロゲン、エストロン（Ｅ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、テストステロン、プレグナンジオール、プレグナントリオール、プロゲステロン、Ｃペプチド（ＣＰＲ）、血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、インスリン、ガストリン、グルカゴン、抗グルタミン酸脱炭酸酵素抗体（抗ＧＡＤ抗体）、抗インスリノーマ抗原２抗体（抗ＩＡ−２抗体）、抗インスリン抗体、心筋トロポニンＴ、心室筋ミオシン軽鎖Ｉ、ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白（Ｈ−ＦＡＢＰ）、ヒト心房性利尿ペプタイド（ＨＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、ミオグロビンなどを挙げることができる。被検物質の特に好ましい一例としては、ＴＳＨである。
本発明の測定方法における検出対象である被検物質の種類は特に限定されないが、例えば、コルチゾール、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合蛋白３型（ＩＧＦＢＰ−３）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、尿中ＧＨ、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ＴＳＨ刺激性レセプター抗体（ＴＳＡｂ）、チロキシン（Ｔ４）、抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体（抗ＴＰＯ抗体）、マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、サイログロブリン、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ｆＴ４、ｆＴ３、１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ、Ｉ型コラーゲン架ＮN-テロペプチド（ＮＴｘ）、インタクトＩ型プロコラーゲン−Ｎ−プロペプチド（Ｉｎｔａｃｔ ＰＩＮＰ）、オステオカルシン、カルシトニン、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、デオキシピリジノリン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、Ｌ−ドーパ、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルエチレングリコール（ＭＨＰＧ）、バニリルマンデル酸（ＶＭＡ）、カテコールアミン、セロトニン、メタネフリン、１１−デオキシコルチゾール、１７−ケトジェニックステロイド（１７−ＫＧＳ）、１７−ＯＨプレグネノロン、アルドステロン、アンドロステロン、アンドロステンジオン、１１−ヒドロキシコルチコステロイド（１１−ＯＨＣＳ）、コルチコステロン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン（ＤＯＣ）、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、プレグネノロン、５αジヒドロテストステロン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）βサブユニット、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、エストロゲン、エストロン（Ｅ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、テストステロン、プレグナンジオール、プレグナントリオール、プロゲステロン、Ｃペプチド（ＣＰＲ）、血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、インスリン、ガストリン、グルカゴン、抗グルタミン酸脱炭酸酵素抗体（抗ＧＡＤ抗体）、抗インスリノーマ抗原２抗体（抗ＩＡ−２抗体）、抗インスリン抗体、心筋トロポニンＴ、心室筋ミオシン軽鎖Ｉ、ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白（Ｈ−ＦＡＢＰ）、ヒト心房性利尿ペプタイド（ＨＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、ミオグロビンなどを挙げることができる。被検物質の特に好ましい一例としては、ＴＳＨである。
（第一の結合物質）
本発明における第一の乾燥粒子は、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾されている。前記第一の結合物質の好ましい例は、抗原、抗体、又はこれらの複合体であるが、これらに限定されるものではない。例えば、結合物質が抗体である場合は、被検物質に対して特異性を有する抗体として、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
本発明における第一の乾燥粒子は、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾されている。前記第一の結合物質の好ましい例は、抗原、抗体、又はこれらの複合体であるが、これらに限定されるものではない。例えば、結合物質が抗体である場合は、被検物質に対して特異性を有する抗体として、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ＩｇＭウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルの両方に適用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
抗体や抗原などの結合物質を粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（第二の結合物質）
本発明における標識を有しない第二の乾燥粒子は、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾されている。前記第二の結合物質としては、例えば、結合物質（抗体）、あるいは結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Protein A、Protein G）など、被検物質と特異的な結合性を有しない化合物であり、且つ、第一の結合物質に対して親和性を有しない化合物であれば特に限定されず、いずれの化合物でも好ましく用いることができる。例えば、第二の結合物質が抗体である場合には、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
本発明における標識を有しない第二の乾燥粒子は、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾されている。前記第二の結合物質としては、例えば、結合物質（抗体）、あるいは結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Protein A、Protein G）など、被検物質と特異的な結合性を有しない化合物であり、且つ、第一の結合物質に対して親和性を有しない化合物であれば特に限定されず、いずれの化合物でも好ましく用いることができる。例えば、第二の結合物質が抗体である場合には、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
抗体などの第二の結合物質を粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（第三の結合物質、及び前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質）
本発明においては、基板上に、被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を固定化して反応部位を形成する。反応部位上に固定化する第三の結合物質の好ましい例は、抗原、抗体、又はこれらの複合体であるが、これらに限定されるものではない。例えば、結合物質が抗体である場合は、被検物質に対して特異性を有する抗体として、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。なお、被検物質が抗原であり、第一の結合物質及び第三の結合物質がともに抗体である場合は、第一の結合物質及び第三の結合物質は同じ抗原に対する抗体となるが、第一の結合物質及び第三の結合物質が認識するエピトープはそれぞれ異なるものである。
また、第一の結合物質に対して結合性を有する物質としては、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ物質を挙げることができる。
本発明においては、基板上に、被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を固定化して反応部位を形成する。反応部位上に固定化する第三の結合物質の好ましい例は、抗原、抗体、又はこれらの複合体であるが、これらに限定されるものではない。例えば、結合物質が抗体である場合は、被検物質に対して特異性を有する抗体として、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。なお、被検物質が抗原であり、第一の結合物質及び第三の結合物質がともに抗体である場合は、第一の結合物質及び第三の結合物質は同じ抗原に対する抗体となるが、第一の結合物質及び第三の結合物質が認識するエピトープはそれぞれ異なるものである。
また、第一の結合物質に対して結合性を有する物質としては、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ物質を挙げることができる。
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ＩｇＭウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルの両方に適用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
抗体などの第三の結合物質、又は第一の結合物質に対して結合性を有する物質を基板に固定化する方法は、例えば、Nunc社の提供するTech Notes Vol. 2-12などに記載されており、一般的なELISA試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（SAM）などを配することによる表面修飾を施しても良く、第三の結合物質として抗体を使用する場合、抗体を基板に固定化する原理としては、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を基板に固定させた後に抗体が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（第一の粒子及び第二の粒子の乾燥）
本発明における標識を有する第一の粒子、および標識を有しない第二の粒子は乾燥した状態で使用することを特徴とする。また、本発明のキットは、標識を有する第一の乾燥粒子、および標識を有しない第二の乾燥粒子を含有することを特徴とする。更に、本発明の被検物質測定試薬は、標識を有する第一の乾燥粒子、および標識を有しない第二の乾燥粒子を含有することを特徴とする。本発明において、乾燥した粒子とは、水分を含まない標識物質を含む粒子の固形分の質量に対する水分の質量（含水量）として、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２５質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下の水分の質量になるまで、含有する水分量を除去した状態の粒子をいう。本発明の乾燥を行う手段としては特に制限はなく、例えば、除湿剤を使用した乾燥方法、減圧乾燥方法、凍結乾燥方法などの公知の乾燥手段を用いることができる。本発明においては、第一の粒子及び第二の粒子を別々に乾燥して乾燥粒子を得てもよいし、第一の粒子と第二の粒子を、溶液状態で所望の質量比で混合した後に乾燥して乾燥粒子を得てもよい。
本発明における標識を有する第一の粒子、および標識を有しない第二の粒子は乾燥した状態で使用することを特徴とする。また、本発明のキットは、標識を有する第一の乾燥粒子、および標識を有しない第二の乾燥粒子を含有することを特徴とする。更に、本発明の被検物質測定試薬は、標識を有する第一の乾燥粒子、および標識を有しない第二の乾燥粒子を含有することを特徴とする。本発明において、乾燥した粒子とは、水分を含まない標識物質を含む粒子の固形分の質量に対する水分の質量（含水量）として、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２５質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下の水分の質量になるまで、含有する水分量を除去した状態の粒子をいう。本発明の乾燥を行う手段としては特に制限はなく、例えば、除湿剤を使用した乾燥方法、減圧乾燥方法、凍結乾燥方法などの公知の乾燥手段を用いることができる。本発明においては、第一の粒子及び第二の粒子を別々に乾燥して乾燥粒子を得てもよいし、第一の粒子と第二の粒子を、溶液状態で所望の質量比で混合した後に乾燥して乾燥粒子を得てもよい。
（被検物質を捕捉する工程）
本発明においては、被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質を有する基板上の反応部位において被検物質を捕捉する。反応部位における被検物質の捕捉は、サンドイッチ法又は競合法の何れで行ってもよい。サンドイッチ法及び競合法によって被検物質を捕捉する方法としては、例えばSigma−Aldrich社が提供する実験基礎情報p.258に記載の一般的なELISAアッセイの方法（即ち蛍光粒子と被検物質とを分散もしくは溶解した液体を基板上に添加して接触させて捕捉する方法）によって行うことができる。また、接触する場をマイクロ流路内に設けることにより、標識を有する粒子と被検物質とを分散もしくは溶解した液体を流して接触させて捕捉することもできる。以下、本発明の具体的な実施態様として、サンドイッチ法及び競合法について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明においては、被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質を有する基板上の反応部位において被検物質を捕捉する。反応部位における被検物質の捕捉は、サンドイッチ法又は競合法の何れで行ってもよい。サンドイッチ法及び競合法によって被検物質を捕捉する方法としては、例えばSigma−Aldrich社が提供する実験基礎情報p.258に記載の一般的なELISAアッセイの方法（即ち蛍光粒子と被検物質とを分散もしくは溶解した液体を基板上に添加して接触させて捕捉する方法）によって行うことができる。また、接触する場をマイクロ流路内に設けることにより、標識を有する粒子と被検物質とを分散もしくは溶解した液体を流して接触させて捕捉することもできる。以下、本発明の具体的な実施態様として、サンドイッチ法及び競合法について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（サンドイッチ法）
本発明においては、サンドイッチ法又は競合法の何れを用いてもよいが、サンドイッチ法を用いて測定することが好ましい。サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質を測定することができる。まず、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質、及び被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質を予め用意しておく。次いで第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に結合させて、「被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の粒子」を作製する。次いで第三の結合物質を用意し、基板上に固定して反応部位（テストエリア）とする。別途、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質を用意し、標識を有さない第二の粒子に結合させて、「被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の粒子」を作製する。上記の第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、乾燥した第一の粒子と第二の粒子の混合物とを混合溶解し、この混合溶解した液を基板に適用し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に被検物質が存在する場合には、反応部位で、被検物質と、第一の粒子に結合した第一の結合物質との間、及び被検物質と反応部位上の第三の結合物質との間で反応（抗原及び抗体を用いた場合には、抗原抗体反応）が起こり、被検物質の量に応じた第一の粒子が反応部位上に固定される。サンドイッチ法では、反応部位上に固定した第三の結合物質と、被検物質との反応、及び被検物質と第一の粒子に結合している第一の結合物質との反応が終了した後、２つの基板上のエリアで結合しなかった第一の粒子を除去する目的で、洗浄を行うこともできる。次いで反応部位に結合した第一の粒子からのシグナル強度を検出することで、正確な被検物質の濃度を測定することができる。なお、蛍光強度と被検物質の濃度は、正の相関関係がある。
本発明においては、サンドイッチ法又は競合法の何れを用いてもよいが、サンドイッチ法を用いて測定することが好ましい。サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質を測定することができる。まず、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質、及び被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質を予め用意しておく。次いで第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に結合させて、「被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の粒子」を作製する。次いで第三の結合物質を用意し、基板上に固定して反応部位（テストエリア）とする。別途、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質を用意し、標識を有さない第二の粒子に結合させて、「被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の粒子」を作製する。上記の第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、乾燥した第一の粒子と第二の粒子の混合物とを混合溶解し、この混合溶解した液を基板に適用し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に被検物質が存在する場合には、反応部位で、被検物質と、第一の粒子に結合した第一の結合物質との間、及び被検物質と反応部位上の第三の結合物質との間で反応（抗原及び抗体を用いた場合には、抗原抗体反応）が起こり、被検物質の量に応じた第一の粒子が反応部位上に固定される。サンドイッチ法では、反応部位上に固定した第三の結合物質と、被検物質との反応、及び被検物質と第一の粒子に結合している第一の結合物質との反応が終了した後、２つの基板上のエリアで結合しなかった第一の粒子を除去する目的で、洗浄を行うこともできる。次いで反応部位に結合した第一の粒子からのシグナル強度を検出することで、正確な被検物質の濃度を測定することができる。なお、蛍光強度と被検物質の濃度は、正の相関関係がある。
（競合法）
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質を測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として当業界においてよく知られている。まず、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質と、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質を予め調製する。次いで第一の結合物質を第一の粒子に結合させ、第二の結合物質を第二の粒子に結合させる。また、第一の結合物質に対して結合性を有する、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ化合物を基板上に固定し反応部位とする。次に、第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、乾燥した第一の粒子と第二の粒子の混合物とを混合溶解し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に被検物質が存在しない場合には、第一の粒子に結合した第一の結合物質と、反応部位上に固定した第一の結合物質に対して結合性を有する被検物質そのもの又は被検物質と同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ類似化合物とにより、基板上で反応が起こる。一方、被検物質が存在する場合には、第一の結合物質に被検物質が結合するため、第一の結合物質に対して結合性を有する、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ化合物との、反応部位上における反応が阻害され、標識を有する第一の粒子が反応部位上への固定が阻害される。競合法では、予め、被検物質濃度が異なる被検物質量既知の試料を複数用意し、この試料及び結合物質標識蛍光粒子を反応部位上に接触させつつ、反応部位からの蛍光信号を異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各被検物質濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、被検物質濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する被検物質濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる被検物質量を定量することができる。
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質を測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として当業界においてよく知られている。まず、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質と、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質を予め調製する。次いで第一の結合物質を第一の粒子に結合させ、第二の結合物質を第二の粒子に結合させる。また、第一の結合物質に対して結合性を有する、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ化合物を基板上に固定し反応部位とする。次に、第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、乾燥した第一の粒子と第二の粒子の混合物とを混合溶解し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に被検物質が存在しない場合には、第一の粒子に結合した第一の結合物質と、反応部位上に固定した第一の結合物質に対して結合性を有する被検物質そのもの又は被検物質と同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ類似化合物とにより、基板上で反応が起こる。一方、被検物質が存在する場合には、第一の結合物質に被検物質が結合するため、第一の結合物質に対して結合性を有する、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ化合物との、反応部位上における反応が阻害され、標識を有する第一の粒子が反応部位上への固定が阻害される。競合法では、予め、被検物質濃度が異なる被検物質量既知の試料を複数用意し、この試料及び結合物質標識蛍光粒子を反応部位上に接触させつつ、反応部位からの蛍光信号を異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各被検物質濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、被検物質濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する被検物質濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる被検物質量を定量することができる。
（流路）
本発明の好ましい態様においては、被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、標識を有する第一の乾燥粒子と、第二の乾燥粒子とを混合した混合液は、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、被検試料と、標識を有する第一の粒子と、第二の粒子とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子及び第二の粒子を含む被検試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、及び金属薄膜を超えて流路が存在し、被検試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口が設けることができる。
本発明の好ましい態様においては、被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、標識を有する第一の乾燥粒子と、第二の乾燥粒子とを混合した混合液は、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、被検試料と、標識を有する第一の粒子と、第二の粒子とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子及び第二の粒子を含む被検試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、及び金属薄膜を超えて流路が存在し、被検試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口が設けることができる。
（基板）
後述する表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行う場合における基板としては、前述の流路、及び表面に反応部位である金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は特に制限はないが、例えば、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるものが好ましく、更には、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるものが好ましく、特に１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるものが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
後述する表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行う場合における基板としては、前述の流路、及び表面に反応部位である金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は特に制限はないが、例えば、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるものが好ましく、更には、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるものが好ましく、特に１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるものが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタリング法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。本発明においては、スパッタリング法により金属膜を形成することが好ましい。
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。ＳＰＦ法による蛍光検出のための基板の一例としては、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)上に、金膜をスパッタリング法で作製した基板などを挙げることができる。
（蛍光の検出方法）
本発明における蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分〜数時間後に終了する。前記免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と被検物質の濃度の関係から、被検物質の濃度を定量することができる。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。なお、ＳＰＦ法は、
落射励起による蛍光検出法（以下、「落射蛍光法」という。）よりも高感度に測定することができる。
本発明における蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分〜数時間後に終了する。前記免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と被検物質の濃度の関係から、被検物質の濃度を定量することができる。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。なお、ＳＰＦ法は、
落射励起による蛍光検出法（以下、「落射蛍光法」という。）よりも高感度に測定することができる。
上記の表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８−２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを光導波路に通し、該光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、該表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
（被検物質量の測定方法）
本発明におけるＳＰＦ法での被検物質の定量方法の一例としては、以下の方法により被検物質を定量することができる。具体的には、各濃度既知の被検物質を含む試料を準備し、蛍光を検出する部位を流下させつつ、蛍光検出部位からの蛍光信号を異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各被検物質濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、被検物質濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する被検物質濃度の検量線を取得する。光信号システムとしては、被検物質ごとに対応する検量線に基づき、目的とする被検試料の被検物質量を特定することができる。
本発明におけるＳＰＦ法での被検物質の定量方法の一例としては、以下の方法により被検物質を定量することができる。具体的には、各濃度既知の被検物質を含む試料を準備し、蛍光を検出する部位を流下させつつ、蛍光検出部位からの蛍光信号を異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各被検物質濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、被検物質濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する被検物質濃度の検量線を取得する。光信号システムとしては、被検物質ごとに対応する検量線に基づき、目的とする被検試料の被検物質量を特定することができる。
本発明における表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、基板上の金属薄膜上に固定化された被検物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を、例えば濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法では、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと検体中の抗原が、抗体反応により結合し、凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方式が、ラテックス凝集法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な被検物質の検出方法を提供できる。
（センサキット）
本発明によれば、
被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子；
被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子；
前記第一の乾燥粒子および前記第二の乾燥粒子とを貯蔵する容器；、
前記第一の乾燥粒子および前記第二の乾燥粒子を流すための流路；及び
被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板：を含む、被検物質測定用センサキットが提供される。被検物質測定用センサキットの好ましい態様は、本明細書中上記した通りである。上記した被検物質測定用センサキットを用いて、本発明による被検物質の測定方法を実施することができる。
本発明によれば、
被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子；
被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子；
前記第一の乾燥粒子および前記第二の乾燥粒子とを貯蔵する容器；、
前記第一の乾燥粒子および前記第二の乾燥粒子を流すための流路；及び
被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板：を含む、被検物質測定用センサキットが提供される。被検物質測定用センサキットの好ましい態様は、本明細書中上記した通りである。上記した被検物質測定用センサキットを用いて、本発明による被検物質の測定方法を実施することができる。
（被検物質測定試薬）
さらに本発明によれば、(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子とを含む、被検物質測定試薬が提供される。上記した被検物質測定試薬を用いて、本発明による被検物質の測定方法を実施することができる。
さらに本発明によれば、(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、(b)被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子とを含む、被検物質測定試薬が提供される。上記した被検物質測定試薬を用いて、本発明による被検物質の測定方法を実施することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
１．平均粒子径２６０ｎｍラテックス粒子の製造
スチレン（和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬社製）１ｇ（１２ｍｍｏｌ）を超純水３３０ｍＬに懸濁させ、８５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬社製）１ｇを２５ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、８５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は２６０ｎｍであった。
スチレン（和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬社製）１ｇ（１２ｍｍｏｌ）を超純水３３０ｍＬに懸濁させ、８５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬社製）１ｇを２５ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、８５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は２６０ｎｍであった。
２．平均粒子径１５０ｎｍラテックス粒子の製造
スチレン（和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁させ、９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬社製）１ｇを１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであった。
スチレン（和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁させ、９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬社製）１ｇを１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであった。
また、平均粒子径１５０ｎｍのラテックス粒子の製造において、昇温時の温度を適宜調整した以外は平均粒子径１５０ｎｍのラテックス粒子の製造と同様にして、平均粒子径１４０ｎｍ、１７０ｎｍのラテックス粒子を調製した。平均粒子径は１．と同様に測定した。
３．蛍光ラテックス粒子の作製
上記のように作製したラテックス粒子の固形分濃度２質量％の水分散液１００ｍＬにメタノール１００ｍＬを加え、１０分間、室温で攪拌した。一方、別途用意した蛍光色素（ＮＫ１３６、林原生物化学研究所製）溶液（DMF 1mL, CHCl3 9mL, EtOH 16mLに溶解）を６０分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とＰＢＳ水溶液への再分散を３回繰り返し、精製を行うことで、蛍光ラテックス粒子を調製した。
上記のように作製したラテックス粒子の固形分濃度２質量％の水分散液１００ｍＬにメタノール１００ｍＬを加え、１０分間、室温で攪拌した。一方、別途用意した蛍光色素（ＮＫ１３６、林原生物化学研究所製）溶液（DMF 1mL, CHCl3 9mL, EtOH 16mLに溶解）を６０分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とＰＢＳ水溶液への再分散を３回繰り返し、精製を行うことで、蛍光ラテックス粒子を調製した。
４．抗ＴＳＨ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子の調製
抗ＴＳＨ抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２５０μＬに、５０ｍＭのＭＥＳバッファー(ｐＨ６．０)溶液２５０μＬを加え、5ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Meridian life science社製；Anti-TSH MAb MAT04-410）１００μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、和光純薬社製）水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液を２５μＬ添加して３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液(ｐＨ７．４)を５００μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ＴＳＨ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。平均粒子径２６０ｎｍの蛍光ラテックス粒子のＴＳＨ抗体修飾も同様に行った。
抗ＴＳＨ抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２５０μＬに、５０ｍＭのＭＥＳバッファー(ｐＨ６．０)溶液２５０μＬを加え、5ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Meridian life science社製；Anti-TSH MAb MAT04-410）１００μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、和光純薬社製）水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液を２５μＬ添加して３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液(ｐＨ７．４)を５００μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ＴＳＨ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。平均粒子径２６０ｎｍの蛍光ラテックス粒子のＴＳＨ抗体修飾も同様に行った。
５．蛍光標識をしない粒子の調製
抗Ｔ４抗体で修飾したラテックス粒子を、以下の通り調製した。
２質量％（固形分濃度）ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２５０μＬに、５０ｍＭのＭＥＳバッファー(ｐＨ６．０)溶液２５０μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗Ｔ４モノクローナル抗体（Medix社 Anti-Thyroxineモノクローナル抗体(6901)）１００μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液を２５μＬ添加して３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液(ｐＨ７．４)を５００μＬ加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬを加えて、ラテックス粒子を再分散させることで、抗Ｔ４抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。平均粒子径２６０ｎｍのラテックス粒子の抗Ｔ４抗体修飾も同様に行った。
同様にして、抗ｈＣＧ抗体（Medix社 Anti-hCG betaモノクローナル抗体(5008)）を用いて、平均粒子径１５０ｎｍのラテックス粒子の抗ｈＣＧ抗体修飾を行った。
抗Ｔ４抗体で修飾したラテックス粒子を、以下の通り調製した。
２質量％（固形分濃度）ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２５０μＬに、５０ｍＭのＭＥＳバッファー(ｐＨ６．０)溶液２５０μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗Ｔ４モノクローナル抗体（Medix社 Anti-Thyroxineモノクローナル抗体(6901)）１００μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液を２５μＬ添加して３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液(ｐＨ７．４)を５００μＬ加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬを加えて、ラテックス粒子を再分散させることで、抗Ｔ４抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。平均粒子径２６０ｎｍのラテックス粒子の抗Ｔ４抗体修飾も同様に行った。
同様にして、抗ｈＣＧ抗体（Medix社 Anti-hCG betaモノクローナル抗体(5008)）を用いて、平均粒子径１５０ｎｍのラテックス粒子の抗ｈＣＧ抗体修飾を行った。
６．蛍光標識粒子と、蛍光標識をしない粒子の乾燥粒子の作製
超純水２８０μＬ、１２．５質量％スクロース水溶液４２７μＬ、２０質量％ＢＳＡ水溶液１３３μＬ、１質量％抗ＴＳＨ抗体修飾蛍光ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）８０μＬ、１質量％抗Ｔ４抗体修飾ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）８０μＬを混合した。ポリプロピレン（プライムポリマー社製、プライムポリプロ ランダムＰＰグレード）を基体としたカップを準備し、１５μＬ点着した。その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５％以下となるまで乾燥させ、表１に示す実験水準５に示した乾燥粒子を作製した。他の実験水準に使用した乾燥粒子については、ラテックス粒子の平均粒子径、および使用量を適宜変更して、実験水準１から１１の乾燥粒子を作製した。
超純水２８０μＬ、１２．５質量％スクロース水溶液４２７μＬ、２０質量％ＢＳＡ水溶液１３３μＬ、１質量％抗ＴＳＨ抗体修飾蛍光ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）８０μＬ、１質量％抗Ｔ４抗体修飾ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）８０μＬを混合した。ポリプロピレン（プライムポリマー社製、プライムポリプロ ランダムＰＰグレード）を基体としたカップを準備し、１５μＬ点着した。その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５％以下となるまで乾燥させ、表１に示す実験水準５に示した乾燥粒子を作製した。他の実験水準に使用した乾燥粒子については、ラテックス粒子の平均粒子径、および使用量を適宜変更して、実験水準１から１１の乾燥粒子を作製した。
７．基板の作製
ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ、三菱レイヨン社製、アクリペットＶＨ−００１)からなる基体の片面に、テストエリア用の金膜と、その隣に、コントロールエリア用の金膜とを、スパッタリングにより横方向に作製した（いずれの金膜も、幅は４ｍｍ、厚さは４５ｎｍ）。金膜を有する基体を縦方向に裁断して（幅５ｍｍ）、基板を作製した。この基板のテストエリアの金蒸着膜上には、抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Medix社製、5409）を含む液（濃度：1０μg/mL in１５０ mM NaCl）を点着し、１時間、２５℃にてインキュベートし、物理吸着させて固定化を行った。
ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ、三菱レイヨン社製、アクリペットＶＨ−００１)からなる基体の片面に、テストエリア用の金膜と、その隣に、コントロールエリア用の金膜とを、スパッタリングにより横方向に作製した（いずれの金膜も、幅は４ｍｍ、厚さは４５ｎｍ）。金膜を有する基体を縦方向に裁断して（幅５ｍｍ）、基板を作製した。この基板のテストエリアの金蒸着膜上には、抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Medix社製、5409）を含む液（濃度：1０μg/mL in１５０ mM NaCl）を点着し、１時間、２５℃にてインキュベートし、物理吸着させて固定化を行った。
８．基板の洗浄、ブロッキング
このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を３００μＬ用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金蒸着膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Thermo Scientific社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を３００μＬ用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金蒸着膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Thermo Scientific社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
９．センサチップの作製
特開２０１０−１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。
特開２０１０−１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。
１０．被検試料の準備
イヌ血清は、北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を使用し、被検試料（検体）No. １〜１１を用意した。
イヌ血清は、北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を使用し、被検試料（検体）No. １〜１１を用意した。
１１．蛍光粒子を用いたＴＳＨの免疫測定
１０．で準備した被検試料（イヌ血清）１００μＬと、塩化マグネシウム４４μｍｏｌを充分に混合して、混合試料を作製した。６．で調製した、カップ内の乾燥粒子を、２５℃５０％ＲＨの環境下で１５日間保存した。ここに、上記の混合試料を装置内で点着し、１０分間攪拌しながら混合して、混合液１を得た。次に、９．で作製した、基板を封入した流路型センサチップに、得られた混合液１を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液１を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流下させた。ＴＳＨ抗体を固定した金蒸着面上の蛍光強度を１．５分間継続して測定した。得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求めた。
別途、下記の（表１）の１’、及び７’に示した分散液を、６．において用いたカップに１５μＬ点着して密閉し、乾燥を行うことなく、２５℃５０％ＲＨの環境下で１５日間保存した。ここに、上記の混合試料を装置内で点着し、１０分間攪拌しながら混合して、混合液２及び混合液３を得た。混合液１に代えて混合液２または混合液３を用いた以外は上記の方法と同様にして、蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求めた。
１０．で準備した被検試料（イヌ血清）１００μＬと、塩化マグネシウム４４μｍｏｌを充分に混合して、混合試料を作製した。６．で調製した、カップ内の乾燥粒子を、２５℃５０％ＲＨの環境下で１５日間保存した。ここに、上記の混合試料を装置内で点着し、１０分間攪拌しながら混合して、混合液１を得た。次に、９．で作製した、基板を封入した流路型センサチップに、得られた混合液１を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液１を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流下させた。ＴＳＨ抗体を固定した金蒸着面上の蛍光強度を１．５分間継続して測定した。得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求めた。
別途、下記の（表１）の１’、及び７’に示した分散液を、６．において用いたカップに１５μＬ点着して密閉し、乾燥を行うことなく、２５℃５０％ＲＨの環境下で１５日間保存した。ここに、上記の混合試料を装置内で点着し、１０分間攪拌しながら混合して、混合液２及び混合液３を得た。混合液１に代えて混合液２または混合液３を用いた以外は上記の方法と同様にして、蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求めた。
１２．対照機による測定
免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機であるシーメンス社IMMULYZE1000全自動免疫化学発光測定装置により、取り扱い説明書に従い、被検試料中の被検物質の測定を行った。本発明は、対照機で測定した測定値を基準にし、迅速で簡便に測定が可能となる発明であり、対照機の測定値との差が小さいことを基準とした。対照機の測定値との差を以下の基準で評価し、表１に示した。
免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機であるシーメンス社IMMULYZE1000全自動免疫化学発光測定装置により、取り扱い説明書に従い、被検試料中の被検物質の測定を行った。本発明は、対照機で測定した測定値を基準にし、迅速で簡便に測定が可能となる発明であり、対照機の測定値との差が小さいことを基準とした。対照機の測定値との差を以下の基準で評価し、表１に示した。
非特異改善の評価基準：
Ｅ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値１５ｎｇ／ｍＬ以上
Ｄ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値１０ｎｇ／ｍＬ以上、１５ｎｇ／ｍＬ未満
Ｃ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値１ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ未満
Ｂ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値０．６ｎｇ／ｍＬ以上、１ｎｇ／ｍＬ未満
Ａ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値０．６ｎｇ／ｍＬ未満
Ｅ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値１５ｎｇ／ｍＬ以上
Ｄ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値１０ｎｇ／ｍＬ以上、１５ｎｇ／ｍＬ未満
Ｃ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値１ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ未満
Ｂ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値０．６ｎｇ／ｍＬ以上、１ｎｇ／ｍＬ未満
Ａ：対照機（シーメンス社イムライズ）からの解離値０．６ｎｇ／ｍＬ未満
１３．シグナルのばらつき度（ＣＶ）の測定
シグナルのＣＶは、テストエリアのシグナル値をＮ＝１０で取得したときの標準偏差（ＳＤ値）を平均値で割り算し、１００を乗じた値をＣＶとして示した。評価基準は、ＣＶ≦１０％をａ、ＣＶ＞１０％をｂとして表中に示した。
シグナルのＣＶは、テストエリアのシグナル値をＮ＝１０で取得したときの標準偏差（ＳＤ値）を平均値で割り算し、１００を乗じた値をＣＶとして示した。評価基準は、ＣＶ≦１０％をａ、ＣＶ＞１０％をｂとして表中に示した。
偽陽性が検出される検体１を用いた結果を表１に示した。シーメンス社製イムライズによる測定結果は、０．１ｎｇ／ｍＬであった。
（マウス抗体の種類）
1: Medix社Anti-Thyroxineモノクローナル抗体(6901)
2: Medix社Anti-hCG betaモノクローナル抗体(5008)
1: Medix社Anti-Thyroxineモノクローナル抗体(6901)
2: Medix社Anti-hCG betaモノクローナル抗体(5008)
表１の結果から、本発明の平均粒子径の標識粒子、および無標識粒子を使用することで対照機との測定値の差が小さくなることが確認された。特に、標識粒子に対する無標識粒子の比が、１／２から１／６の実験水準６〜１１では、ＴＳＨ免疫測定値は、対照機の測定値と良く一致した。また、本発明の平均粒子径の範囲の乾燥した蛍光標識粒子をもちいることにより、溶液状態の標識粒子、あるいは２００ｎｍ以上の平均粒子径の標識粒子に対し、測定のバラツキ（シグナルＣＶ）が小さくなることが確認された。
実施例２
実施例１で用いた乾燥粒子７、及び２６０ｎｍの標識粒子および２６０ｎｍの無標識粒子を１／４で混合した乾燥粒子を、上記６で作製した方法で作製し、これらの粒子を用いて、検体Ｎｏ．２〜７の被検試料を使用して、本発明の効果を確認するための実験を行った。実験及び測定は、実施例１と同様に行った。
実施例１で用いた乾燥粒子７、及び２６０ｎｍの標識粒子および２６０ｎｍの無標識粒子を１／４で混合した乾燥粒子を、上記６で作製した方法で作製し、これらの粒子を用いて、検体Ｎｏ．２〜７の被検試料を使用して、本発明の効果を確認するための実験を行った。実験及び測定は、実施例１と同様に行った。
複数の検体に対し、１５０ｎｍの平均粒子径の無標識粒子を使用することで対照機との測定値の差が小さくなることが確認された。また、１５０ｎｍの平均粒子径の蛍光標識粒子を用いることで、測定のばらつき（シグナルＣＶ）が小さくなることが確認された。
Claims (17)
- （i）(a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、
(b)前記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、
(c)前記被検物質を含む被検試料液と、
を混合して、混合液を得る工程、
(ii)前記工程(i)で得た混合液を、基板上に適用する工程、
(iii)前記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、前記基板上の反応部位において、前記被検物質を捕捉する工程、
及び
(iv）前記反応部位上に捕捉された前記被検物質を検出する工程、
を含む、被検物質の測定方法。 - 前記第一の乾燥粒子に対する前記第二の乾燥粒子の質量比が２〜６である、請求項１に記載の被検物質の測定方法。
- 前記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、請求項１又は２に記載の被検物質の測定方法。
- 前記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質がマウス由来の抗体である、請求項１から３の何れか１項に記載の被検物質の測定方法。
- 前記標識を有する第一の乾燥粒子が、蛍光ラテックス粒子であり、前記第二の乾燥粒子がラテックス粒子である、請求項１から４の何れか１項に記載の被検物質の測定方法。
- 工程（iv）において、前記反応部位上に捕捉された被検物質を表面プラズモン蛍光法により検出する、請求項１から５の何れか１項に記載の被検物質の測定方法。
- 被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子；
前記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子；
前記第一の乾燥粒子および前記第二の乾燥粒子とを貯蔵する容器；
前記第一の乾燥粒子および前記第二の乾燥粒子を流すための流路；及び
前記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板；を含む、被検物質測定用センサキット。 - 前記第一の乾燥粒子に対する前記第二の乾燥粒子の質量比が２〜６である、請求項７に記載の被検物質測定用センサキット。
- 前記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、請求項７又は８に被検物質測定用センサキット。
- 前記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質がマウス由来の抗体である、請求項７から９の何れか１項に記載の被検物質測定用センサキット。
- 前記標識を有する第一の乾燥粒子が、蛍光ラテックス粒子であり、前記第二の乾燥粒子がラテックス粒子である、請求項７から１０の何れか１項に記載の被検物質測定用センサキット。
- 請求項７から１１の何れか１項に記載の被検物質測定用センサキットを用いて行う、請求項１から６の何れか１項に記載の被検物質の測定方法。
- (a)被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２０
０ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有する第一の乾燥粒子と、
(b)前記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾され、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下の平均粒子径を有し、標識を有しない第二の乾燥粒子と、
を含む、被検物質測定試薬。 - 前記第一の乾燥粒子に対する前記第二の乾燥粒子の質量比が２〜６である、請求項１３に記載の被検物質測定試薬。
- 前記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、請求項１３又は１４に記載の被検物質測定試薬。
- 前記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質がマウス由来の抗体である、請求項１３から１５の何れか１項に記載の被検物質測定試薬。
- 前記標識を有する第一の乾燥粒子が、蛍光ラテックス粒子であり、前記第二の乾燥粒子がラテックス粒子である、請求項１３から１６の何れか１項に記載の被検物質測定試薬。
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