JP2014228385A - 免疫試験方法および免疫試験キット - Google Patents

Abstract

【課題】測定感度を向上させ、尚且つ非特異反応が少ないという優れた効果を有する免疫試験方法および免疫試験キットの提供。【解決手段】コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の存在下で免疫反応を行うことを特徴とする免疫試験方法を提供する。【選択図】図２

Description

本発明は免疫反応を利用する試験方法に関し、測定感度を向上させ、尚且つ非特異反応が少ないという優れた効果を有する免疫試験方法および免疫試験キットに関する。

ヒトの血液等の検体中の微量成分を定量する体外診断薬の分野において、抗原と抗体の反応を利用した免疫測定方法が広く用いられている。

免疫試験において測定感度の向上あるいは非特異反応の抑制を図るために、これまでに多くの添加剤に関する技術が開示されている。例えば、特許文献１では、被測定物質が含まれる試料溶液中にコンドロイチン硫酸を０．１〜０．３％（Ｗ／Ｗ）の割合で存在させる方法が提案されている。また、特許文献２では、該試料溶液中に塩化ナトリウムを０．９４〜２．４％（Ｗ／Ｖ）の割合で存在させる方法を提案している。

特開平２−２３８３６１号公報 特許第３６４４７０４号公報

免疫試験において測定感度の向上を図る場合、信号値を増加させるために、反応を促進させる効果を持った物質を添加する方法や、バックグラウンド信号を低下させるために、反応を抑制させる効果を持った物質を添加する方法が多用される。しかし、反応促進剤と反応抑制剤の効果は相反関係にあるため、測定感度を向上させ、尚且つ非特異反応を抑制することのできる有効な方法は少なかった。

例えば、特許文献１では、測定感度の向上を目的としてコンドロイチン硫酸を添加しているが、添加量を向上させるにしたがって非特異反応も生じやすくなるという問題があった。それゆえ、測定感度の向上が見られる有効な濃度までコンドロイチン硫酸を添加できないという課題があった。

一方、特許文献２では、非特異反応の抑制を目的として塩化ナトリウムを添加しているが、添加量を向上させるにしたがって抗原抗体反応も抑制されてしまうという問題があった。それゆえ、非特異反応の低減が見られる有効な濃度まで塩化ナトリウムを添加できないという課題があった。

本発明は、上記課題を克服するものであり、免疫試験において、測定感度を向上させ、尚且つ非特異反応を抑制することのできる方法ならびに試験キットを提供する。

本発明は、コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の存在下で免疫反応を行うことを特徴とする、免疫試験方法を提供する。

本発明の免疫試験方法によれば、反応促進効果を持つコンドロイチン硫酸を０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、反応抑制効果を持つ塩化ナトリウムを３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の割合で添加することによって、免疫試験において、感度を向上させ、尚且つ非特異反応を抑制することができる。

本発明の免疫試験キットによれば、反応促進効果を持つコンドロイチン硫酸を０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、反応抑制効果を持つ塩化ナトリウムを３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の割合で添加することによって、免疫試験において、測定感度を向上させ、尚且つ非特異反応を抑制することができる。

本発明の比較例１、２、および実施例１で使用した免疫試験キット用の分析装置の概念図である。 本発明の比較例１、２、および実施例１で行った検討結果をまとめたグラフである。 本発明の比較例３で行った検討結果を示す写真である。 本発明の実施例２で行った検討結果を示す写真である。

以下、本発明の免疫試験方法および免疫試験キットの実施形態について説明する。尚、ここに示す実施の形態は、あくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。

（実施の形態１）
本発明の第一の実施形態は、コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の存在下で免疫反応を行うことを特徴とする免疫試験方法である。本発明の免疫試験方法にて測定される試料としては、ヒトや動物の血液、血清、血漿、尿、精液、ずい液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊水など、被測定物質が含まれる可能性のある生体試料であれば全て対象となる。

本発明における被測定物質としては、特に限定されるものではなく、公知の抗原抗体反応を利用して測定できる物質であれば全て対象となる。例えば、核酸、タンパク質、脂質、糖類、ホルモン、抗体、レセプター、酵素などである。さらに詳細には、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、繊維素分解産物（ＦＤＰ）、インターロイキンなどのサイトカイン、ケモカイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｂｏｘ １（ＨＭＧＢ１）、好中球エラスターゼ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどが挙げられる。

免疫試験とは、抗原抗体反応のように、被測定物質と、その物質と相補的な物質とを反応させて行う、被測定物質の検出あるいは測定を意味する。相補な物質とは、被測定物質を特異的に認識し、アフィニティーを示す物質を意味している。例えば、被測定物質が抗原であれば、相補的な物質の例として抗体を挙げることができる。この場合、抗原となりうるのは、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ，ＲＮＡ，低分子化合物などを挙げられる。また被測定物質が抗体であれば、免疫学的に相補的な物質の例として抗原、抗体を挙げることができる。その他、被測定物質と、その相補的な物質の組み合わせは、互いに特異的に認識することができれば限定はなく、リガンドとレセプター、抗原と抗体断片（あるいは改変抗体）、核酸と相補的核酸などを例として挙げることができる。

本発明の免疫試験方法としては、特に限定されるものではなく、公知の測定方法が利用できる。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、などを挙げることができる。また、本発明の免疫試験方法における測定は、用手法で行ってもよいし、分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

例えば、酵素免疫測定法の場合は、被測定物質を特異的に認識する第一の抗体が固相化されたマイクロプレートと、試料希釈液、ＨＲＰ等の酵素が修飾された被測定物質を特異的に認識する第二の抗体、洗浄緩衝液、及び発光／発色基質溶液を用いて行うと良い。また測定は、第二の抗体に修飾されている酵素に、その至適条件下で前記の基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法により測定すると良い。

また、蛍光免疫測定法の場合には、被測定物質を特異的に認識する第一の抗体が固相化された光導波路やマイクロプレートと、試料希釈液、蛍光物質が修飾された被測定物質を特異的に認識する第二の抗体、洗浄緩衝液を用いて行うと良い。また測定は、第二の抗体に修飾されている蛍光物質に励起光を照射し、その蛍光物質が発する蛍光強度を測定すると良い。さらに放射免疫測定法の場合には、前述した方法と同様の操作により、放射性物質による放射線量を測定すると良いし、発光免疫測定法の場合には、発光反応系による発光量を測定すると良い。

また、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法などの場合には、エンドポイント法またはレート法により透過光や散乱光を測定すると良い。そして、イムノクロマトグラフィー法の場合には、テストライン上に現れる標識物質の色を目視的に確認すると良い。なお、この目視的に確認する替わりに、分析装置等の機器を用いてもよい。

本明細書中では、試料溶液とは、被測定物質が含まれる、もしくは含まれると疑われる、溶液を意味する。免疫反応溶液という場合には、被測定物質と、その相補的な物質が含まれた溶液を指す。試料溶液の例として、ヒトの血液、血清、血漿、尿、精液、ずい液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、あるいはそれらを含む希釈液など、被測定物質の含まれる可能性がある溶液を挙げることができる。さらには、前記の試料を緩衝液などと混合した溶液も、試料溶液に含まれる。混合あるいは希釈する溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。例えば、精製水、生理食塩水、またはトリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝液生理食塩水などの各種緩衝液を挙げることができる。さらに、緩衝液のｐＨについては、適宜、好適なｐＨを選択して用いればよく、特に限定されることはないが、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。また溶媒に、被測定物質の構造的な保護を目的として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインなどのタンパク質、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等、１種または２種以上を適宜含有させてもよい。

コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の存在下で免疫反応を行う手段は限定されない。免疫反応液に、コンドロイチン硫酸と塩化ナトリウム、被測定物質、相補的な物質が、いずれの順番で加えられてもよく、また、コンドロイチン硫酸、塩化ナトリウム、被測定物質、相補的な物質は、濃縮状態、あるいは、乾燥状態で加えられてもよい。すなわち、試料溶液にあらかじめ、コンドロイチン硫酸、塩化ナトリウムが加えられ、後に抗体が加えられてもよいし、コンドロイチン硫酸、塩化ナトリウムの存在する容器に、試料溶液と、抗体が加えられてもよいし、抗体を含む溶液にあらかじめ、コンドロイチン硫酸、塩化ナトリウムが加えられ、後に試料溶液と混合してもよいし、その他、あらゆる手段を取りうる。ここで、試料溶液に存在させるコンドロイチン硫酸と塩化ナトリウムの効果について説明する。

コンドロイチン硫酸は、免疫反応や非特異反応など、その反応の種類を問わず、反応を促進させる効果を持つ。それゆえ、コンドロイチン硫酸を試料溶液に存在させることで、免疫試験における信号値を増幅させることができるが、非特異反応も増幅されるという欠点を持つ。つまり、免疫反応の信号増幅を期待してコンドロイチン硫酸を高い割合で存在させた場合、非特異反応によるバックグラウンド信号も増加してしまい、結果として測定感度は低下してしまう。

一方、塩化ナトリウムは、免疫反応や非特異反応など、その反応の種類を問わず、反応を抑制させる効果を持つ。それゆえ、塩化ナトリウムを免疫反応溶液に存在させることで、非特異反応を減少させることができるが、免疫反応も抑制されるという欠点をもつ。つまり、非特異反応の抑制を期待して塩化ナトリウムを高い割合で存在させた場合、免疫試験による信号値も低下してしまい、結果として測定感度は低下してしまう。

本発明では、コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の存在下で免疫反応を行うことを特徴としている。本願発明者らは、鋭意研究の結果、反応抑制効果を持つ塩化ナトリウムと、反応促進効果を持つコンドロイチン硫酸を、前記の割合で存在させることで、非特異反応を抑制し、尚且つ免疫反応を促進させる効果が得られることを見出したのである。

免疫反応溶液中に存在させる塩化ナトリウムの割合は、３．５％（Ｗ／Ｖ）以上が好適であり、顕著に反応が抑制される。また、添加割合の上限は特に規定されないが、塩化ナトリウムには塩析効果も認められるため、過度の添加は避けるべきである。したがって、塩化ナトリウムの割合は３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）程度が好適と言える。

免疫反応溶液中に存在させるコンドロイチン硫酸の割合は０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）が好適である。コンドロイチン硫酸の割合は、０．６７％以上で、顕著な反応促進効果を得ることができる。一方で、３．３％（Ｗ／Ｖ）以上のコンドロイチン硫酸を存在させた場合、試料溶液の粘性が非常に高くなり、用手法や自動分析装置での免疫反応操作に不具合が生じる。また、本発明で使用されるコンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸またはその塩化物が用いられる。例えばコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、またはコンドロイチン硫酸Ｃナトリウムなどを用いると良い。

（実施の形態２）
本発明の第二の実施形態は、コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の存在下で免疫反応を行うように調製されている、免疫試験キットである。

本発明の免疫試験キットとしては、コンドロイチン硫酸が０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウムが３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の割合で免疫反応溶液中に存在するように構成される限り、特に限定されるものではない。上記と同様に、免疫反応液に、コンドロイチン硫酸と塩化ナトリウム、被測定物質、相補的な物質は、いずれの順番で加えられてもよく、例えば、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウムをそれぞれ別の容器に準備しておき、測定前に被測定物質を含む試料と混合し、上記割合となるように調製すること、また、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウムを予め混合液として準備しておき、上記割合となるように試料や希釈液などと混合する方法も可能である。さらに、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウムを乾燥状態で準備し、試料や希釈液を混合しても良い。さらに、本発明の免疫試験キットの構成においては、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウムは、試薬と組み合わせておいてもよいし、あるいは、固相にあらかじめ付着させておいてもよい。例えば、試薬に組み合わせておく場合、組み合わせる試薬は、免疫反応に必要な緩衝液、試料希釈液、酵素などの標識物質を含有する抗体溶液、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、較正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬などが挙げられる。固相の例としては、免疫試験キットに用いられる不溶性担体や試験紙、マイクロプレート、ガラス板、マイクロチューブ、ろ紙、ポリマー樹脂等を挙げることができる。

免疫試験キットとは、免疫試験に必要な試薬等を含むキットをさし、免疫試験に必要な種々の試薬のセット、免疫試験に必要な種々の試薬を充填した使いきりタイプの免疫試験キット、複数の試料を同時に測定するためのマイクロプレートタイプの試験キットや、内部に試薬等を含み目視による結果の判定が可能なイムノクロマトグラフィーや、試験紙も、免疫試験キットに含まれる。

使いきりタイプの免疫試験キットの形態の一例としては、被測定物質を特異的に認識する第一の抗体が固相化された球状や棒状の担体、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウム溶液、試薬希釈液、ＡＬＰ等の酵素が修飾された被測定物質を特異的に認識する第二の抗体、洗浄液、および発光基質溶液などを検査容器に充填する構成が考えられる。検査容器の形状は、被測定物質の測定を行うことができる限り特に限定されるものではない。例えば、反応槽や試薬格納槽が複数並んだ舟型の容器や、板状の基体に溝を設け、反応槽や格納槽を流路で繋いだ流路型の容器があげられる。また、検査容器の大きさも特に限定されるものではないが、該分析装置に組み込んで用いるためには、１０センチメートル×１０センチメートル程度以下の小型であることが望ましい。さらに、反応槽への異物の混入や、試薬格納槽に充填しておいた試薬の蒸発・劣化を避けるために、各槽の上部をシールすることもできる。例えば、アルミニウム箔や高分子フィルム等を検査容器の反応槽と格納槽の上部に接着させる方法があげられる。特に、アルミニウム箔によるシールは、分析装置の穿孔機構や分注チップの先端で容易に開封できるので好ましい。検査容器の素材としては、被測定物質を測定するための反応を阻害する物質でない限り特に限定されるものではない。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂等があげられる。

また、マイクロプレートタイプの試験キットの形態としては、以下の構成が考えられる。例えば、被測定物質を特異的に認識する第一の抗体が固相化されたマイクロプレートと共に、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウム溶液、試料希釈液、ＨＲＰ等の酵素が修飾された被測定物質を特異的に認識する第二の抗体、洗浄液、および発色基質溶液などを、それぞれ試薬ボトルとして付属する構成である。また、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウムを予め試料希釈液に含有させておいても良いし、マイクロプレート上に乾燥状態で付着させておいても良い。

イムノクロマトグラフィーの形態としては、ハウジングケース、サンプルパット、コンジュゲートパット、メンブレンフィルター、吸収パットから構成されるラテラルフローが好適である。また、ラテラルフローは以下の手順により作製される。まず、金コロイドや着色ビーズを標識した被測定物質を特異的に認識する第一の抗体を作製し、これをコンジュゲーションパットに塗布・乾燥させる。一方で、被測定物質を特異的に認識する第二の抗体をメンブレンフィルターのテストライン上に塗布・乾燥させる。さらに、前記第二の抗体を特異的に認識する第三の抗体をメンブレンフィルターのコントロールライン上に塗布・乾燥させる。最後に、このフィルターに前記コンジュゲーションパット、サンプルパット、吸収パットを貼りつけたものをラテラルフローとする。

そして、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウム溶液を、上記のラテラルフローに付属し、これをイムノクロマト測定試験キットとすることができる。また、コンドロイチン硫酸ならびに塩化ナトリウム溶液をサンプルパットやコンジュゲートパットに塗布・乾燥させておき、これを前記メンブレンフィルターに貼りつけたものをイムノクロマト測定試験キットとしてもよい。

本実施形態のさらに具体的な形態として、例えば、コンドロイチン硫酸溶液と塩化ナトリウムを含む溶液と、抗体溶液を含み、免疫反応の際に、コンドロイチン硫酸が０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウムが３．５％（Ｗ／Ｖ）以上となるような免疫試験キットを例示できる。このような免疫試験キットは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法など、あらゆる免疫試験に用いることができ、それぞれの方法に合わせ、適宜、抗体は修飾でき、あるいは、担体に固定されてもよく、また、免疫試験キットは、ラテックスビーズ、マイクロチューブ、あるいは、イムノクロマトグラフィー法に用いられる場合は、ハウジングケース、サンプルパット、コンジュゲートパット、メンブレンフィルター、吸収パット、コロイドなどを含むことができる。

あるいは、別の例として、コンドロイチン硫酸と塩化ナトリウムが付着したマイクロプレートと、抗体溶液を含み、免疫反応の際に、コンドロイチン硫酸が０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウムが３．５％（Ｗ／Ｖ）以上となるような免疫試験キットを例示できる。このような免疫試験キットは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、等の免疫試験に用いることができ、それぞれの方法に合わせ、適宜、抗体は修飾でき、また、免疫試験キットは、基質溶液などを含むことができる。

（実施の形態３）
本発明の第三の実施形態は、免疫反応溶液に加えるコンドロイチン硫酸と塩化ナトリウムを含む試薬であって、免疫反応の際に、コンドロイチン硫酸が０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウムが３．５％（Ｗ／Ｖ）以上となるような試薬、である。本実施形態において、試薬の形状は特に限定されず、コンドロイチン硫酸と、塩化ナトリウムを含む、溶液であってもよいし、あるいは、タブレット、粉末、容器に付着させた乾燥状態など、目的となる試験にあわせた容量、形状をとることができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。

（１）免疫試験キット用の分析装置
図１に本実施例で作製した免疫試験キット用の分析装置の概念図を示す。図示のように検査容器１が分析装置に組み込まれている。同図において、２は光電子倍増管、３はフォトンカウンター、４は柱状の不溶性担体５を搬送するためのハンドリングアームである。図示のように、光電子倍増管２は、被測定物質の測定の際に生じる発光反応を受光するために、検査容器１の上部に配置されている。また、フォトンカウンター３は、光電子増倍管２からの信号を計測するために設置されており、外部出力装置に接続されている。図示のように、ハンドリングアーム４は、不溶性担体５を搬送する際に用いられ、検査容器１の上部に設置されている。

（２）不溶性担体の作製
ポリスチレン樹脂を射出成形することにより、図１に記載の不溶性担体５を作製した。担体上部の平板状部位は、ハンドリングアーム４による搬送の際に使用される平板状の部位であり、直径を１２ｍｍ、厚みは１．５ｍｍとした。また、不溶性担体５の柱状部位は、被測定物質を特異的に認識する抗体を固相化しておくための部位であり、直径を０．７ｍｍ、長さを４０ｍｍとした。

（３）検査容器の作製
ポリプロピレン樹脂を射出成形することにより、図１に記載の検査容器１を作製した。検査容器には免疫試験を行うための反応槽が複数設けられている。各槽の直径は２．６ｍｍ、深さは４１ｍｍとした。また隣の槽との間隔を１８ｍｍとした。

（４）不溶性担体の搬送方法
ハンドリングアーム４の先端に、シリコーンゴム製の円柱形先端を有する管状治具とチューブを取り付けた（不図示）。更に、そのチューブの先に電磁バルブと空気ポンプを取り付けた。この空気ポンプによりチューブ内を負圧とし、電磁バルブをオン／オフさせることで、平板状部位を介して不溶性担体５を持ち上げ／放せるようにした。この機構により、ハンドリングアーム４を移動させて、検査容器１の各槽から槽へ不溶性担体５を移動することが可能になった。

（５）不溶性担体へのＨＭＧＢ１抗体の固相化
ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ社）をトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、抗体固相化用の容器に１００μＬずつ分注した。その後、この溶液に不溶性担体５の柱状部位を浸漬させて、４℃で一昼夜静置した。次に、不溶性担体５を取り出し、表面をトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。次に、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社）をトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で５％に希釈し、抗体固相化用の容器に１００μＬずつ分注した。その後、この溶液に不溶性担体５の柱状部位を浸漬させて、室温で２時間静置した。その後、不溶性担体５を取り出し、表面をトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。次に、Ｓｕｃｒｏｓｅ（和光純薬工業社）をトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で５％に希釈し、抗体固相化用の容器に１００μＬずつ分注した。その後、この溶液に不溶性担体５の柱状部位を浸漬させて、室温で２時間静置した。最後に不溶性担体５を取り出し、乾燥させて４℃で保存した。

（６）ＨＭＧＢ１抗体へのＡＬＰ標識
ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ社）への酵素標識は、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社）を用いてメーカープロトコール通りに行った。
次に、１％ＢＳＡ含有トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ＡＬＰ標識されたＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を２．０μｇ／ｍｌに調整し、４℃で保存した。

（７）免疫試験キットの作製
免疫試験キット１１の作製においては、図１に記載の検査容器１を使用した。検査容器の不溶性担体設置槽６に、ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体を固相化した不溶性担体５を挿入した。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を洗浄液として、洗浄槽８、９に１１５μＬずつ分注した。最後に、化学発光試薬（Ｌｕｍｉｇｅｎ社）を発光反応槽１０に１００μＬ分注し、これを免疫試験キット１１とした。

尚、免疫試験キット１１を使用する際には、２．０μｇ／ｍＬに調整したＡＬＰ標識ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体溶液（３３μＬ）と、被測定物質を含む試料（３３μＬ）と、コンドロイチン硫酸と塩化ナトリウムを含有させた試料希釈液（６６μＬ）を混合し、免疫反応槽７に分注した。その後、前記分析装置に設置して測定を行った。

＜参考例１＞
参考例１として、試料溶液中の塩化ナトリウムの割合（Ｗ／Ｖ）と、免疫試験における発光信号値の関係を調べた。

測定は前述の分析装置を用いた。また免疫試験キットは、前記（７）に従って作製した。被測定物質を含む試料として、ＨＭＧＢ１を０、３．９１、１５．６３、６２．５ｎｇ／ｍＬ含有するヒト血清溶液を使用した。また、健常人の血漿検体Ａ、Ｂ、Ｃも合わせて使用した。試料希釈液として、０、１００、１５０、３００、６００、９００、１２００、１５００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する３％ＢＳＡ−トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を使用した。

測定方法としては、まず、２．０μｇ／ｍＬに調整したＡＬＰ標識ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体溶液（３３μＬ）と、被測定物質を含む各種の試料（３３μＬ）と、塩化ナトリウムを含有させた各種検体希釈液（６６μＬ）を混合し、検査容器１の免疫反応槽７に分注した。尚、この操作により、試料溶液中の塩化ナトリウムは、０、０．３９、０．５８、１．１７、２．３４、３．５０、４．６７、５．８４％（Ｗ／Ｖ）の割合で存在することになる。免疫試験は１ステップサンドイッチＣＬＥＩＡ法を用いた。また反応条件は、免疫反応時間を１０分、洗浄時間を２分（合計２回）、発光反応時間を３分、発光測定時間を６秒で行った。

表１から、試料溶液中の塩化ナトリウムの割合が高くなるにつれて、免疫反応や非特異反応など、その反応の種類を問わず、反応が抑制されることが理解される。例えば、健常人の血漿検体の信号値は、塩化ナトリウムの割合が高くなるにつれて低下する。これは非特異反応が塩化ナトリウムにより抑制されていることを意味している。さらに、６２．５ｎｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１を測定したときの結果に示されるように、ヒト血清検体の信号値も、塩化ナトリウムの割合が高くなるにつれて低下する。これは、免疫反応も塩化ナトリウムにより抑制されていることを意味している。そして、塩化ナトリウムを３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の割合で試料溶液中に存在させると、免疫反応と非特異反応が十分に抑制されることが分かる。

＜参考例２＞
参考例２として、試料溶液中のコンドロイチン硫酸の割合（Ｗ／Ｖ）と、免疫試験における発光信号値の関係を調べた。

測定装置は前述の分析装置を用いた。また免疫試験キットは、前記（７）に従って作製した。その他、免疫試験、ならびに試料溶液の作製は、参考例１と同様に実施した。

被測定物質を含む試料として、ＨＭＧＢ１を０、３．９１、１５．６３、６２．５ｎｇ／ｍＬ含有するヒト血清溶液を使用した。試料希釈液として、０、１、２、３、４、５、６、７％のコンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（和光純薬工業社）を含有する３％ＢＳＡ−１５００ｍＭ塩化ナトリウム‐トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を使用した。尚、この操作により、試料溶液中のコンドロイチン硫酸は、０、０．６７、１．３３、２．００、２．６７、３．３３、４．００、４．６７％の割合で存在することになる。

表２から、試料溶液中のコンドロイチン硫酸の割合が高くなるにつれて、免疫反応が促進されていることが理解される。例えば、６２．５ｎｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１を測定したときの結果に示されるように、ヒト血清検体の信号値は、コンドロイチン硫酸の割合が高くなるにつれて増加している。一方で、試料溶液中のコンドロイチン硫酸が３．３３％（Ｗ／Ｖ）以上の割合になると、溶液の粘性が非常に高くなり、自動分析装置での洗浄操作等に障害が生じた。それゆえ、コンドロイチン硫酸の割合は０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）が好ましいと言えた。

＜比較例１＞
比較例１として、試料希釈液に３％ＢＳＡ−トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ＨＭＧＢ１の測定を行った。尚、使用したトリス緩衝液には塩化ナトリウムが０．８８％（Ｗ／Ｖ）含まれているため、参考例で示した試料溶液の調製により、塩化ナトリウムは０．５８％の割合で存在することになる。

測定は前述の分析装置を用いた。また免疫試験キットは、前記（７）に従って作製した。その他、免疫試験、ならびに試料溶液の作製は、参考例１と同様に実施した。

被測定物質を含む試料としては、ＨＭＧＢ１を０、０．２４、０．９８、３．９１、１５．６３、６２．５、２５０、１０００ｎｇ／ｍＬ含有するヒト血清溶液を使用した。

表３に結果を発光強度で示す。試料溶液中に０．５８％の塩化ナトリウムを存在させた場合の検出限界（±２ＳＤ法）は、１５．６３ｎｇ／ｍＬであった。

＜比較例２＞
比較例２として、試料希釈液に０．２％コンドロイチン硫酸を含有する３％ＢＳＡ−トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ＨＭＧＢ１の測定を行った。尚、使用したトリス緩衝液には塩化ナトリウムが０．８８％含まれているため、参考例で示した試料溶液の調製により、コンドロイチン硫酸は０．１３％、塩化ナトリウムは０．５８％の割合で存在することになる。

測定は前述の分析装置を用いた。また免疫試験キットは、前記（７）に従って作製した。その他、免疫試験、ならびに試料溶液の作製は、参考例１と同様に実施した。また、被測定物質を含む試料は、比較例１と同様のものを使用した。

表４に結果を発光強度で示す。試料溶液中に０．１３％のコンドロイチン硫酸と、０．５８％の塩化ナトリウムを含有させた場合の検出限界（±２ＳＤ法）は、１５．６３ｎｇ／ｍＬであった。

＜実施例１＞
実施例１として、試料希釈液に３％コンドロイチン硫酸ならびに１５００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する３％ＢＳＡ−トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ＨＭＧＢ１の測定を行った。

測定装置は前述の分析装置を用いた。また免疫試験キットは、前記（７）に従って作製した。その他、免疫試験、ならびに試料溶液の作製は、参考例１と同様に実施した。また、被測定物質を含む試料は、比較例１と同様のものを使用した。

表５に結果を示す。試料溶液中に２％のコンドロイチン硫酸と、５．８％の塩化ナトリウムを含有させた場合の検出限界（±２ＳＤ法）は、３．９１ｎｇ／ｍＬであった。

図２に比較例１、２および実施例１で得られた測定結果を示した。尚、得られた結果を比較しやすいように、グラフのＸ軸をＨＭＧＢ１濃度比（１０００ｎｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１濃度を１とした場合の濃度比）、Ｙ軸を発光信号比（１０００ｎｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１濃度を測定した際に得られた信号値を１とした場合の信号比）で表した。

試料溶液中に０．５８％の塩化ナトリウムのみを含有させた場合に比べ、０．１３％のコンドロイチン硫酸を含有させた場合の方が高い信号を得ることができる。しかし、この濃度のコンドロイチン硫酸には検出限界を向上させる程の効果は見られない。一方、試料溶液中に２％のコンドロイチン硫酸と、５．８％の塩化ナトリウムを含有させた場合では、検出限界が向上していることが分かる。

以上、本発明の免疫試験キットを用いることで、測定感度を向上させ、尚且つ非特異反応を抑制することができる。

（８）ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体感作コロイドの作製
５０ｍＬの遠心分離用チューブに、金コロイド溶液（ＢＢＩ社、粒子径４０ｎｍ）を９ｍＬ、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍＬ加え、軽く撹拌した。次に、８０μｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を１ｍＬ加えて、室温で１０分間清置した。その後、１％ＰＥＧ２００００（キシダ化学社）を０．５５ｍＬ、１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加えて、軽く撹拌した。この溶液を８０００ｇ−１５分間の条件で遠心分離し、金コロイドを沈澱させて上清を取り除いた。そこに、ｐＨ８．２の金コロイド保存緩衝液（ＢＳＡ：５ｇ、アジ化ナトリウム：０．５ｇ、ＰＥＧ２００００：０．２５ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１．２１１ｇ、塩化ナトリウム：４．３８３ｇを純水５００ｍＬに溶解した水溶液）を２０ｍＬ加え、再度、遠心分離を行った。その後、上清を取り除き、得られた金コロイド感作ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を、吸光度（５２０ｎｍ）で６．０となるように、金コロイド保存緩衝液で希釈した。

（９）ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体固相化ハーフストリップの作製
吸収パット（日本ミリポア社、１７ｍｍ×３０ｃｍ）を、メンブレンカード（日本ミリポア社、ハイフロープラスメンブレンカード、６ｃｍ×３０ｃｍ）の吸収パット接着部に貼りつけた。次に、メンブレンカードのコンジュゲートパット接着部から下を切り離した。さらに、メンブレンカードを約５ｍｍの幅に切断し、これをハーフストリップ用のイムノクロマトとして使用した。

テストラインおよびコントロールラインへの抗体の塗布は、マイクロピペッターによる滴下で行った。まず、端部（前記切断部）から約１０ｍｍの位置に０．５ｍｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体を０．５μＬ滴下して、これをテストラインとした。次に、前記テストラインから約５ｍｍの間隔をあけて、０．５ｍｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を０．５μＬ滴下し、これをコントロールラインとした。

＜比較例３＞
比較例３として、試料希釈液に２％コンドロイチン硫酸を含有する３％ＢＳＡ−トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ＨＭＧＢ１のイムノクロマト測定を行った。

被測定物質を含む試料として、ＨＭＧＢ１を０、０．２４、０．９８、３．９１、１５．６３、６２．５、２５０、１０００ｎｇ／ｍＬ含有するヒト血清溶液を使用した。

測定方法は下記の通りである。まず、ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体感作コロイド溶液（１０μＬ）と、上記の試料希釈液（５０μＬ）と、被測定物質を含む各種の試料（５０μＬ）を混合して、９６穴マイクロプレートに分注した。次に作製したＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体固相化ハーフストリップを浸漬し、混合液をメンブレンへと展開させた。そして、浸漬から４０分後にハーフストリップを取り出し、テストラインの有無を目視にて確認した。尚、使用した試料希釈液とＨＭＧＢ１モノクローナル抗体感作コロイド溶液には、塩化ナトリウムが０．８８％含まれている。そのため、試料溶液中にコンドロイチン硫酸は０．９％、塩化ナトリウムは０．４８％の割合で存在することになる。

図３に測定結果を示す。０ｎｇ／ｍＬの濃度のＨＭＧＢ１を測定した場合において、テストラインに擬陽性反応が生じており、本条件における定性的な判定は行えなかった。このことから、試料溶液中にコンドロイチン硫酸が好適な割合で存在していても、塩化ナトリウムが好適な割合で存在しない場合は、非特異反応が抑制されず、擬陽性が生じてしまうことが分かる。

＜実施例２＞
実施例２として、試料希釈液に２％コンドロイチン硫酸ならびに１５００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する３％ＢＳＡ−トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ＨＭＧＢ１のイムノクロマト測定を行った。

被測定物質を含む試料は比較例３と同様のものを用いた。また、測定方法も比較例３と同様に実施した。尚、使用したＨＭＧＢ１モノクローナル抗体感作コロイド溶液には、塩化ナトリウムが０．８８％含まれている。そのため、試料溶液中にコンドロイチン硫酸は０．９％、塩化ナトリウムは４．１％の割合で存在することになる。

図４に測定結果を示す。０ｎｇ／ｍＬの濃度のＨＭＧＢ１を測定した場合において、テストラインに擬陽性（非特異的な反応）は認められなかった。そして、３．９１ｎｇ／ｍｌの濃度からＨＭＧＢ１の目視判定が可能であった。

以上、本発明の免疫試験キットを用いることで、測定感度を向上させ、尚且つ非特異反応を抑制することができる。

１．検査容器
２．光電子倍増管
３．フォトンカウンター
４．ハンドリングアーム
５．不溶性担体
６．不溶性担体設置槽
７．免疫反応槽
８．洗浄槽
９．洗浄槽
１０．発光反応槽
１１．免疫試験キット

Claims (7)

1. 被測定物質の免疫試験方法であって、コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の存在下で免疫反応を行うことを特徴とする免疫試験方法。
2. 被測定物質がＨＭＧＢ１であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫試験方法。
3. コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上の存在下で免疫反応を行うように調製されている、免疫試験キット。
4. 前記免疫試験キットが、少なくとも、コンドロイチン硫酸と塩化ナトリウムを含有する試料希釈液と、被測定物質を特異的に認識する抗体が固相化された不溶性担体と、検査容器とを具備し、
   試料溶液を試料希釈液で希釈する工程において、
   試料−試料希釈混合液が、コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上となるように調製されることを特徴とする、請求項３に記載の免疫試験キット。
5. 被測定物質がＨＭＧＢ１であることを特徴とする、請求項４に記載の免疫試験キット。
6. 前記免疫試験キットがイムノクロマト測定試験キットであり、
   少なくとも、コンドロイチン硫酸と塩化ナトリウムを含有する試料希釈液と、被測定物質を特異的に認識する抗体が固相化されたラテラルフローとを具備し、
   試料溶液を試料希釈液で希釈する工程において、
   試料−試料希釈混合液が、コンドロイチン硫酸０．６７〜２．６７％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム３．５％（Ｗ／Ｖ）以上となるように調整されることを特徴とする、請求項３に記載の免疫試験キット。
7. 被測定物質がＨＭＧＢ１であることを特徴とする、請求項６に記載の免疫試験キット。