JPWO2019163929A1 - プロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬 - Google Patents

プロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2019163929A1
JPWO2019163929A1 JP2020501053A JP2020501053A JPWO2019163929A1 JP WO2019163929 A1 JPWO2019163929 A1 JP WO2019163929A1 JP 2020501053 A JP2020501053 A JP 2020501053A JP 2020501053 A JP2020501053 A JP 2020501053A JP WO2019163929 A1 JPWO2019163929 A1 JP WO2019163929A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
particle
progesterone
formula
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2020501053A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6936383B2 (ja
Inventor
浩之 知久
浩之 知久
武尊 繁村
武尊 繁村
渡辺 康介
康介 渡辺
吉憲 金澤
吉憲 金澤
晃逸 佐々木
晃逸 佐々木
和平 金子
和平 金子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Corp filed Critical Fujifilm Corp
Publication of JPWO2019163929A1 publication Critical patent/JPWO2019163929A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6936383B2 publication Critical patent/JP6936383B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553Metal or metal coated
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545Synthetic resin
    • G01N33/547Synthetic resin with antigen or antibody attached to the carrier via a bridging agent
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7756Sensor type
    • G01N2021/7763Sample through flow
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本発明の課題は、生体試料中のプロゲステロンの測定において、非特異吸着による偽陽性の問題を防止し、発生するノイズの増加を抑え、低濃度から高濃度にわたる広範囲の濃度域においてプロゲステロンの高精度の測定を実現することができるキット、方法及び試薬を提供することである。本発明によれば、第一の結合物質で修飾され標識を有する第一の粒子と、第二の結合物質で修飾され標識を有しない第二の粒子と、流路と、基板とを含むプロゲステロン測定キットであって、第一の粒子は式(1)で示される化合物と粒子とを含有し、第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きいキットが提供される。式中、各記号は本明細書に記載した意味を有する。

Description

本発明は、プロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬に関する。
タンパク質、酵素又は無機化合物などを定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。測定対象物質が蛍光体でない場合には、例えば、測定対象物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した物質を、試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、測定対象物質の存在を確認することができる。
上記のような蛍光検出法において、微量に存在する測定対象物質を検出するための感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用意し、支持体と金属層との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させる。かかる励起光の照射により金属層に表面プラズモンが発生するが、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル/ノイズ比(S/N比)が向上し高感度な測定が可能となる。表面プラズモン励起による蛍光検出法(以下、「SPF法」ともいう)は、落射励起による蛍光検出法(落射蛍光法とも称する)に対して、信号増強度が約10倍得られ、高感度に測定することができる。
特許文献1には、好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とをポリマー微小粒子中に配合させることにより製造される蛍光微小粒子が記載されている。特許文献1では、上記染料としてポリアザインダセン染料を使用することが記載されている。
非特許文献1には、新規なジスチリルBODIPY(登録商標)(boron-dipyrrometheneの略称である)染料を設計及び合成したことが記載され、合成したジスチリルBODIPY(登録商標)染料について、クロロメタン溶液中での吸収及び発光スペクトルが分析されている。
また、免疫測定方法では、被検物質を含む陽性となる被検試料だけでなく、被検物質を含まない陰性の被検試料に対しても反応し、陽性となる被検試料が存在し、偽陽性を示す問題が従来から認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。
非特異反応を抑制する技術として、特許文献2には、免疫学的測定方法、特に、凝集を利用した免疫学的測定方法において、0.3〜2.0μmの感作粒子の非特異的免疫反応を阻止するために、非特異的免疫反応の原因物質と反応性を有する物質を結合した0.2μm以下の超微粒子を使用することが記載されている。特許文献3には、0.4μm以上の感作粒子を用いた免疫凝集反応により被検物質を検出する方法において、ブロッキングに使用する粒子として0.01μm〜0.5μmの不溶性担体粒子を用いることが記載されている。また、特許文献4には、非特異反応の抑制を目的として、特異的に反応する粒子よりも小さい粒子に非測定物質と免疫学的に反応しない抗体、又は抗原を固定したものを添加する方法が記載されている。さらに、特許文献5には、被測定物質に対して免疫学的に反応する抗体あるいは抗原を平均粒子径0.05〜0.5μmの担体に担持した免疫測定粒子を使用する免疫測定方法に用いられる非特異反応抑制剤であって、被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体又は抗原を有機溶媒存在下で担持した不溶性担体からなり、不溶性担体の平均粒子径が担体の平均粒子径よりも小さいことを特徴とする非特異反応抑制剤が記載されている。特許文献6には、蛍光分光技術を使用した免疫検出方法において、外径1μm以下の粒子により非特異反応の影響を抑止することが記載されている。
特許文献7には、誘電体プレートの一面に、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用いて被検出物質の量を検出する検出方法が記載されている。具体的には、センサ部に試料を接触させることにより、試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、蛍光標識と蛍光標識に標識された結合物質とからなる蛍光標識結合物質を、センサ部上に結合させ、センサ部に励起光を照射することにより、センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、増強した光電場により、蛍光標識を励起し、励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量が検出される。特許文献7においては、蛍光標識として、複数の第1の蛍光色素分子と、複数の第1の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第1の蛍光色素分子を包含する第1の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。また、センサ部に対する蛍光標識結合物質の非特異的吸着性により蛍光標識結合物質がセンサ部に吸着することを防ぐためのブロッキング剤として、第1の蛍光色素分子を含まずかつ結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。
特許文献8には、粒子サイズを規定した乾燥粒子を用いて非特異吸着を抑制する免疫測定法が開示されている。
特許文献9には、黄体ホルモンであるプロゲステロン測定の初期妊娠テストにおける重要性に関して記載されている。プロゲステロン測定により、様々な哺乳動物種における排卵サイクル、発情期、妊娠又は繁殖失調に関し結論を出すことができる。
特許第3442777号公報 特開昭60−256057号公報 特開2000−221196号公報 特開平11−337551号公報 特開2007−127438号公報 特開2010−19553号公報 特開2010−112748号公報 特開2015−072249号公報 特表平8-503547号公報
Olivier Galangau et al.,Org.Biomol.Chem.,2010,8,4546−4553
上記の通り、簡易的な測定方法で高感度に測定が可能な方法としてはSPF法が知られているが、非常に微量な測定対象物質の測定に対しては十分に満足のいくものではなかった。検出法の中で、プロゲステロンのように抗体でサンドイッチできないような低分子を測定する競合法においては、測定対象物質の濃度が低い領域の検出感度を上げるためには反応系中の蛍光標識濃度を低く抑える必要があるが、その場合、測定対象物質の高濃度域側における蛍光強度が不足し、高濃度域では、誤差が非常に大きくなるため測定対象物質が精度よく測定できない問題があった。
また、特許文献2から6に記載のように、試料中に存在する非特異的免疫反応原因物質による偽陽性が問題となる特定の試料があり、非特異的免疫反応原因物質と相互作用する物質を付与した微粒子を用いて、偽陽性の問題を回避することが開示されているが、特許文献2、3、4及び5に記載の方法では、凝集法による測定は低感度であり非常に微量な測定対象物質の検出には使用できない問題があった。また、特許文献2に開示された免疫測定法は、洗浄工程や、遠心分離操作が必要であり、簡便な測定方法ではないという欠点を有していた。
特許文献6には、蛍光分光技術を使用した免疫検出方法において、外径1μm以下の粒子により非特異反応の影響を抑止することが記載されているが、非常に簡易な測定ではなかった。また、特許文献7及び8は共に、流路を用いた簡易的な免疫測定法を開示し、蛍光法を用いた測定方法として検体を測定しているが、測定対象物質の濃度が低い領域の検出感度を上げる技術に関しては開示していない。
更に感度を上げて微量の検出物質を検出可能とすることで、非特異吸着による偽陽性の問題に限らず、ノイズも増加してしまうという問題がある。
本発明は、生体試料中のプロゲステロンの測定において、非特異吸着による偽陽性の問題を防止し、発生するノイズの増加を抑え、低濃度から高濃度にわたる広範囲の濃度域においてプロゲステロンの高精度の測定を実現することができるキット、方法及び試薬を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために、プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、上記プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、上記第一の粒子及び上記第二の粒子を流すための流路と、上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板と、を含むプロゲステロンを測定するためのキットの構成について鋭意検討した。その結果、標識を有する第一の粒子として、680nm以上という長波長領域に発光極大波長を有し、かつ高い量子収率を示す標識粒子を用い、さらに第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ第一の粒子の平均粒子径より第二の粒子の平均粒子径が大きいという条件を満たすことにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
[1] プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
上記第一の粒子及び上記第二の粒子を流すための流路と、
上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板と、
を含むプロゲステロン測定キットであって、
上記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
キット。
Figure 2019163929
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 2019163929
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
[2] 上記第一の粒子及び上記第二の粒子がラテックス粒子である、[1]に記載のキット。
[3] 上記の標識を有する第一の粒子が、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する発光性粒子であって、上記エネルギードナー化合物及び上記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、上記式(1)で示される化合物である、[1]又は[2]に記載のキット。
[4] 上記エネルギードナー化合物として、少なくとも一種の上記式(1)で示される化合物を含有し、上記エネルギーアクセプター化合物として、少なくとも一種の上記式(1)で示される化合物を含有する、[3]に記載のキット。
[5] エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が1:10〜10:1である、[3]又は[4]に記載のキット。
[6] 上記第一の粒子に対する上記第二の粒子の質量比が1〜20である、[1]から[5]の何れか一に記載のキット。
[7] プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、[1]から[6]の何れか一に記載のキット。
[8] (i)(a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
(c)プロゲステロンを含む被検試料と、
を混合して、混合物を得る工程と、
(ii)上記工程(i)で得た混合物を、基板上に適用する工程と、
(iii)上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、上記基板上の反応部位において、上記第一の結合物質を捕捉する工程と、
(iv)上記反応部位上に捕捉された上記第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を検出する工程と、
を含むプロゲステロンの測定方法であって、
上記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
プロゲステロンの測定方法。
Figure 2019163929
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 2019163929
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
[9] 上記第一の粒子及び上記第二の粒子がラテックス粒子である、[8]に記載の方法。
[10] 上記の標識を有する第一の粒子が、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する発光性粒子であって、上記エネルギードナー化合物及び上記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、上記式(1)で示される化合物である、[8]又は[9]に記載の方法。
[11] 上記エネルギードナー化合物として、少なくとも一種の上記式(1)で示される化合物を含有し、上記エネルギーアクセプター化合物として、少なくとも一種の上記式(1)で示される化合物を含有する、[10]に記載の方法。
[12] 上記第一の粒子に対する上記第二の粒子の質量比が1〜20である、[8]から[11]の何れか一に記載の方法。
[13] 工程(iv)において、上記反応部位上に捕捉された上記第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を表面プラズモン蛍光法により検出する、[8]から[12]の何れか一に記載の方法。
[14] (a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子とを含む、プロゲステロン測定試薬であって、
上記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
プロゲステロン測定試薬。
Figure 2019163929
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 2019163929
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
[15] 上記式(1)で示される化合物が、下記式(3)で示される化合物である、[14]に記載のプロゲステロン測定試薬。
Figure 2019163929
式中、R11、R12、R14、R15、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、但し、R11、R12、R14及びR15の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基である。R31〜R35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R31、R32、R34及びR35のいずれか一つは2原子以上からなる基である。
[16] 上記式(1)で示される化合物が、下記式(4)で示される化合物である、[14]に記載のプロゲステロン測定試薬。
Figure 2019163929
式中、R12、R13、R14、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、但し、R12、R13及びR14の少なくとも1つは水素原子以外の原子又は基である。R41及びR42はそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
[17] 上記式(1)で示される化合物が、下記式(5)で示される化合物である、[14]に記載のプロゲステロン測定試薬。
Figure 2019163929
式中、R11〜R15、X、X、L及びLは、式(1)における定義と同義である。R51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Q及びQはそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環又は芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。
[18] 上記第一の粒子に対する上記第二の粒子の質量比が1〜20である、[14]から[17]の何れか一に記載のプロゲステロン測定試薬。
[19] 上記プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、[14]から[18]の何れか一に記載のプロゲステロン測定試薬。
[20] 上記標識を有する第一の粒子が、蛍光ラテックス粒子であり、上記第二の粒子がラテックス粒子である、[14]から[19]の何れか一に記載のプロゲステロン測定試薬。
本発明のプロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬によれば、非特異吸着による偽陽性の問題を防止し、発生するノイズの増加を抑え、低濃度から高濃度にわたる広範囲の濃度域においてプロゲステロンの高精度の測定を実現することができる。
図1は、センサチップの概略図を示す。 図2は、センサチップの分解図を示す。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
[プロゲステロン測定キット]
本発明によるプロゲステロン測定キットは、
プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
上記第一の粒子及び上記第二の粒子を流すための流路と、
上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板と、
を含むプロゲステロン測定キットであって、
上記の標識を有する第一の粒子は、本明細書で規定する式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
キットである。
(生体試料)
本発明では、生体試料中のプロゲステロンを測定することができる。
生体試料としては、プロゲステロンを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
(プロゲステロン)
プロゲステロンは、卵巣と胎盤から分泌され、黄体機能や妊娠に関係する性ホルモンである。月経の周期異常、不妊症の診断に利用される。また、犬の交配時期、猫の卵巣遺残確認にも使用される。
(粒子)
本発明における粒子(第一の粒子及び第二の粒子)の材質及び形態は特に限定されず、例えば、ポリスチレンビーズなどの有機高分子粒子、又はガラスビーズ等の無機粒子を用いることができる。粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル(メタ)アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、又はブチルメタクリレートなどのモノマーを重合させたホモポリマー、並びに2種以上のモノマーを重合させたコポリマーなどが挙げられ、上記のホモポリマー又はコポリマーを均一に懸濁させたラテックスでもよい。また、粒子としては、その他の有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球、細胞膜片、リポソーム、マイクロカプセルなどが挙げられる。第一の粒子及び第二の粒子としては、ラテックス粒子が好ましい。
ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、本発明の発光性粒子に抗体を標識して使用する場合には、界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
(第一の結合物質)
本発明で用いる第一の結合物質は、プロゲステロンと特異的な結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗体を使用できるが、これに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、例えば、そのプロゲステロンによって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、プロゲステロンによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)、Fab、Fab’、又はFv]などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清又は培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
本発明においては、第一の結合物質としては、プロゲステロンと特異的な結合性を有する(好ましくは、プロゲステロンを特異的に認識する)抗プロゲステロン抗体を使用することが好ましい。
抗プロゲステロン抗体の作製方法の一つを例に挙げて以下に説明する。
プロゲステロンと、牛血清アルブミン(Bovine Serum Albumin、以下BSAと略す)と、縮合剤を混合してプロゲステロン−BSA結合体を作製することができる。結合体をマウス免疫感作抗原として用いて、数回、マウス背部皮下に免疫する。この場合、完全アジュバント(Complete Freund‘s Adjuvant:CFA)、および/又は不完全アジュバント(Incomplete Freund‘s Adjuvant:IFA)を適宜選択して免疫感作抗原と混合して使用することができる。完全アジュバントとは、免疫を刺激する物質であって、パラフィンとアラセルの混合物である。不完全アジュバントとは、完全アジュバントに死滅したミコバクテリア又は結核菌の死菌を加え、抗原性をさらに増強させたものである。数週間で数回、適宜免疫感作を行った後にマウスから採血し抗体価の測定を実施する。抗体価の十分な上昇が認められた場合に腹腔内に抗原を投与し、数日後に脾臓を摘出する。こうして免疫マウスより摘出した脾臓細胞を、変異株骨髄腫細胞(ミエローマ)と融合させることで、抗体産生能力を備えた融合細胞を作製することができる。この融合細胞の中から目的とする抗原に対する抗体産生細胞のみを選択し、さらにその細胞株だけを増殖するために限界希釈を行う。希釈後の細胞の培養(クローニング)を行うことができる。このようにして得られる融合細胞株を、マウスの腹腔内に注射して、腹水型の抗体産生細胞を増殖させることによってモノクローナル抗体を腹水中に産生することが可能となり、これらの抗体を回収することで、目的の抗体を入手することができる。
(標識を有する第一の粒子)
本発明で使用される標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する粒子であり、標識粒子又は蛍光標識粒子とも表記する。標識を有する第一の粒子は、好ましくはラテックス粒子であり、より好ましくは蛍光ラテックス粒子である。
Figure 2019163929
式(1)中の各記号の意味は、本明細書中に定義した通りである。
通常の色素化合物は、粒子への取り込み量を増やすと会合の影響を受け、量子収率が低下していくことが知られている(これを濃度消光とも言う)。特に、吸収波長が650nm以上の長波長である蛍光色素化合物は粒子に取り込まれると濃度消光しやすく、量子収率を維持することは困難である。
本発明で使用する式(1)で示される化合物は、共役系置換基を有することで長波長発光を可能としており、かつ、ジピロメテン骨格に複数の置換基を持たせることによりポリマー粒子中での量子収率の低下を抑制することができる。量子収率低下抑制の要因としては、ジピロメテン骨格に対して垂直方向に張り出す複数の置換基による分子間の相互作用(例えばπ−π相互作用)の抑制が考えられる。式(1)で示される化合物によれば、特に長波長領域において輝度の高い標識を有する第一の粒子(好ましくは蛍光粒子、より好ましくは蛍光ナノ粒子)を製造することができる。なお、標識を有する第一の粒子が蛍光粒子である場合、輝度とは、蛍光強度のことである。本発明によれば、生体の窓の領域(生体を透過しやすい近赤外波長域である650〜900nm付近)で発光量子収率が高いことから、発光を用いたセンシングの感度向上が可能である。
本明細書において、アルキル基とは、直鎖、分岐鎖、環状又はこれらの組み合わせの何れでもよく、直鎖又は分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは1〜36であり、より好ましくは1〜18であり、さらに好ましくは1〜12であり、特に好ましくは1〜6である。環状のアルキル基としては、例えば炭素数3〜8のシクロアルキルなどが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、iso−ブチル基、sec−ブチル基、t−ブチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基、n−ヘプチル基、n−オクチル基、n−ノニル基、n−デシル基、n−ウンデシル基、n−ドデシル基、n−トリデシル基、n−テトラデシル基、n−ペンタデシル基、n−ヘキサデシル基、n−ヘプタデシル基、n−オクタデシル基、及びシクロヘキシル基などが挙げられる。
本明細書において、アリール基とは、炭素数が6〜48のアリール基が好ましく、炭素数が6〜24のアリール基がより好ましく、炭素数が6〜14のアリール基がさらに好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、ピレニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、フルオレニル基などが挙げられる。
本明細書において、ヘテロ環基としては、好ましくは5〜7員の置換もしくは無置換、飽和もしくは不飽和、芳香族もしくは非芳香族、単環もしくは縮環のヘテロ環基の何れでもよい。ヘテロ環基は、好ましくは、環構成原子が炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択され、かつ窒素原子、酸素原子及び硫黄原子の何れかのヘテロ原子を少なくとも一個有するヘテロ環基であり、さらに好ましくは、炭素数3〜30の5もしくは6員の芳香族のヘテロ環基である。ヘテロ環基としては、例えば、フリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、チエニル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、キノリル基、イソキノリル基、アクリジニル基、フェナントリジニル基、プテリジニル基、ピラジニル基、キノキサリニル基、ピリミジニル基、キナゾリル基、ピリダジニル基、シンノリニル基、フタラジニル基、トリアジニル基、オキサゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、チアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、イミダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、インダゾリル基、イソオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、インドリル基、イミダゾピリジニル基、カルバゾリル基等が挙げられる。
本明細書において、アシル基としては、好ましくは炭素数2〜15の直鎖、又は分岐アルカノイル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、ベンゾイル基などが挙げられる。
本明細書において、アルコキシ基としては、好ましくは、炭素数1〜20のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、n−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基などが挙げられる。
本明細書において、アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数6〜14のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
アルキルチオ基としては、好ましくは、炭素数1から30のアルキルチオ基であり、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、n−ヘキサデシルチオ基等が挙げられる。
アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数6から30のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、p−クロロフェニルチオ基、m−メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
本明細書において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。
本明細書において、芳香環とは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナンスレン環、ピレン環、ペリレン環及びテリレン環等の芳香族炭化水素環;インデン環、アズレン環、ピリジン環、ピラジン環、ピリミジン環、ピラゾール環、ピラゾリジン環、チアゾリジン環、オキサゾリジン環、ピラン環、クロメン環、ピロール環、ピロリジン環、ベンゾイミダゾール環、イミダゾリン環、イミダゾリジン環、イミダゾール環、ピラゾール環、トリアゾール環、トリアジン環、ジアゾール環、インドリン環、チオフェン環、チエノチオフェン環、フラン環、オキサゾール環、オキサジアゾール環、チアジン環、チアゾール環、インドール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾチアジアゾール環、ナフトチアゾール環、ベンゾオキサゾール環、ナフトオキサゾール環、インドレニン環、ベンゾインドレニン環、ピラジン環、キノリン環及びキナゾリン環等の芳香族ヘテロ環;並びにフルオレン環及びカルバゾール環等の縮合型芳香環等が挙げられ、炭素数5〜16の芳香環(芳香環及び芳香環を含む縮合環)が好ましい。
なお、芳香環は置換基を有していてもよく、「芳香環」との用語は、置換基を有する芳香環、及び置換基を有さない芳香環の両方を意味する。芳香環が有する置換基としては、後記する置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
本明細書において、アミノ基としては、アミノ基;モノ又はジメチルアミノ基、モノ又はジエチルアミノ基並びにモノ又はジ(n−プロピル)アミノ基等のアルキル置換アミノ基;モノ又はジフェニルアミノ基並びにモノ又はジナフチルアミノ基等の芳香族残基で置換されたアミノ基;モノアルキルモノフェニルアミノ基等のアルキル基と芳香族残基が一つずつ置換したアミノ基;ベンジルアミノ基、アセチルアミノ基、フェニルアセチルアミノ基等が挙げられる。ここで芳香族残基とは、芳香環から水素原子1個を除いた基を意味し、芳香環は本明細書中上記した通りである。
11〜R15が表すアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、下記の置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
置換基群A:
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、及びトリアルキルシリル基(トリメチルシリル基等)。
及びXが表すアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
Ar及びArが表すアリール基又はヘテロ環基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
111〜R116が表すアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
<式(1)で示される化合物>
式(1)中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表し、好ましくはR11〜R15のうち少なくとも4つは水素原子以外の原子又は基を表し、より好ましくはR11〜R15の全てが水素原子以外の原子又は基を表す。
11及びR15は、同一の又は異なる原子又は基でもよいが、好ましくは同一の原子又は基である。R12及びR14は、同一の又は異なる原子又は基でもよいが、好ましくは同一の原子又は基である。
11及びR15は、好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
12及びR14は、好ましくは、アルキル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
13は、好ましくは、アリール基を表し、これは置換基を有していてもよい。
式(1)中、X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。
及びXは、好ましくは、ハロゲン原子、又はアルコキシ基を表す。X及びXは、フッ素原子、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、t−ブチルオキシ基であることがより好ましく、これらはフッ素原子、アルコキシ基によって置換されていることも好ましい。
式(1)中、Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
式(1)中、L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 2019163929
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
及びLは、好ましくは、式(L−1)又は式(L−2)の何れかを表し、より好ましくは式(L−1)を表す。
111〜R116は、好ましくは水素原子である。
<式(2)で示される化合物について>
式(1)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(2)で示される化合物が挙げられる。
Figure 2019163929
式中、R11〜R15、X、X、Ar及びArは式(1)における定義と同義であり、好ましい範囲も、式(1)における好ましい範囲と同じである。L21及びL22はそれぞれ独立に、式(L−1)又は式(L−2)で表される基を表わす。L21及びL22は、好ましくは式(L−1)で表される基を表わす。
Figure 2019163929
<式(3)で示される化合物について>
式(1)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(3)で示される化合物が挙げられる。
Figure 2019163929
式(3)中、R11、R12、R14、R15、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、好ましい範囲も、式(1)における好ましい範囲と同じである。但し、R11、R12、R14及びR15の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基であり、好ましくは、R11、R12、R14及びR15の少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基であり、より好ましくは、R11、R12、R14及びR15は、水素原子以外の原子又は基である。
式(3)中、R31〜R35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、シアノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基(上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる)を有していてもよく、R31、R32、R34及びR35のいずれか一つは2原子以上からなる基である。2原子以上からなる基としては、アルキル基、アリール基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、シアノ基、アルコキシ基が好ましく、アルキル基がより好ましい。アルキル基の中でも、炭素原子と水素原子のみで構成されるアルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基が好ましく、炭素数1〜6の炭素原子と水素原子のみで構成されるアルキル基、フッ素原子で置換されたアルキル基がより好ましく、メチル基、イソプロピル基、t−ブチル基、トリフルオロメチル基がさらに好ましく、メチル基が特に好ましい。
<式(4)で示される化合物について>
式(1)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(4)で示される化合物が挙げられる。
Figure 2019163929
式(4)中、R12、R13、R14、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、好ましい範囲も、式(1)における好ましい範囲と同じである。但し、R12、R13及びR14の少なくとも1つは水素原子以外の原子又は基であり、好ましくは、R12、R13及びR14の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基であり、より好ましくは、R12、R13及びR14は水素原子以外の原子又は基である。
式(4)中、R41及びR42はそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。R41及びR42はそれぞれ独立に、アリール基、エテニル基、又はエチニル基であることが好ましく、量子収率向上の観点からは、アリール基が好ましく、長波長化の観点からは、エテニル基、エチニル基であることが好ましい。アリール基である場合、アリール基のオルト位又はメタ位に少なくとも一つ置換基を有していることが好ましく、オルト位に少なくとも一つ置換基を有していることがより好ましい。アリール基に置換する置換基の数は、1〜3つが好ましく、2つ又は3つがより好ましい。アリール基に置換する置換基としては、アルキル基であることが好ましく、メチル基、イソプロピル基、t−ブチル基であることがより好ましく、メチル基であることがさらに好ましい。
<式(5)で示される化合物について>
式(1)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(5)で示される化合物が挙げられる。
Figure 2019163929
式(5)中、R11〜R15、X、X、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、好ましい範囲も、式(1)における好ましい範囲と同じである。
式(5)中、R51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。R51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アルコキシ基であることが好ましく、量子収率向上の観点では、アルキル基であることがより好ましく、メチル基、エチル基、イソプロピル基、t−ブチル基であることがさらに好ましく、メチル基であることが特に好ましい。長波長化の観点では、アルコキシ基であることがより好ましく、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、t−ブチルオキシ基であることがさらに好ましく、メトキシ基であることが特に好ましい。
及びQはそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環又は芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。Q及びQは、芳香族炭化水素環であることが好ましく、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナンスレン環、ピレン環であることがより好ましく、ベンゼン環、ナフタレン環であることがさらに好ましく、ベンゼン環であることが特に好ましい。R51を含みQを形成する基、及び、R52を含みQを形成する基としては、トリル基、キシリル基、メシチル基が好ましく、キシリル基、メシチル基であることがより好ましく、LあるいはLとの結合位置に対してオルト位の両方にメチル基を有するキシリル基、LあるいはLとの結合位置に対してオルト位の両方及びパラ位にメチル基を有するメシチル基であることがさらに好ましく、LあるいはLとの結合位置に対してオルト位の両方及びパラ位にメチル基を有するメシチル基であることが特に好ましい。
<式(6)で示される化合物について>
式(5)で示される化合物は、下記式(6)で示される化合物であることがより好ましい。
Figure 2019163929
式中、R11、R12、R14及びR15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11、R12、R14及びR15の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基である。
及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。
31〜R35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、シアノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R31〜R35のいずれか一つは水素原子である。
51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
及びQはそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環又は芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。
及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 2019163929
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
11及びR15はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基であることが好ましく、上記R41及びR42と同義であること、すなわち、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基であることがより好ましく、アリール基、エテニル基、エチニル基であることがさらに好ましい。量子収率向上の観点からは、アリール基がより好ましく、長波長化の観点からは、エテニル基、エチニル基であることがより好ましい。アリール基である場合、アリール基のオルト位又はメタ位に少なくとも一つ置換基を有していることが好ましく、オルト位に少なくとも一つ置換基を有していることがより好ましい。アリール基に置換する置換基の数は、1〜3つが好ましく、2つ又は3つがより好ましい。アリール基に置換する置換基としては、アルキル基であることが好ましく、メチル基、イソプロピル基、t−ブチル基であることがより好ましく、メチル基であることがさらに好ましい。
<式(1)〜式(6)で示される化合物の具体例>
式(1)〜式(6)で示される化合物の具体例を以下に記載する。Meはメチル基を示し、Etはエチル基を示し、iPrはイソプロピル基を示す。
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
標識粒子は、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する標識粒子であってもよく、その場合、上記エネルギードナー化合物及び上記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、上記式(1)で示される化合物であればよい。
本発明の別の例においては、発光性粒子は、エネルギードナー化合物及びエネルギーアクセプター化合物の何れか一方として、式(1)で示される化合物を含有し、エネルギードナー化合物及びエネルギーアクセプター化合物の何れか他方として、後記する式(10)で示される化合物を含有する。即ち、発光性粒子としては、エネルギードナー化合物として式(1)で示される化合物を含有し、エネルギーアクセプター化合物として式(10)で示される化合物を含有する発光性粒子でもよいし、エネルギーアクセプター化合物として式(1)で示される化合物を含有し、エネルギードナー化合物として式(10)で示される化合物を含有する発光性粒子でもよい。
<式(10)で示される化合物>
Figure 2019163929
式(10)中、m1及びm2はそれぞれ独立に0〜4の整数を表し、m1及びm2の何れかは少なくとも1以上である。Mは半金属原子又は金属原子を表す。R、R及びRはそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Y及びYはそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Y及びYは互いに連結して環を形成してもよい。Ar11及びAr12はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Z及びZはそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。m1が2以上である場合、複数のZは同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、m2が2以上である場合、複数のZは同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
式(10)中、m1及びm2はそれぞれ独立に0〜4の整数を表し、好ましくは、m1及びm2は共に1以上である。m1及びm2は同一でも異なる整数でもよいが、好ましくは同一の整数である。好ましくは、m1及びm2はそれぞれ独立に1又は2であり、より好ましくは、m1及びm2は共に1又は共に2であり、特に好ましくはm1及びm2は共に1である。
式(10)中、Mは半金属原子又は金属原子を表し、好ましくは半金属原子を表し、特に好ましくは、ホウ素原子を示す。
式(10)中、R、R及びRはそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、R及びRはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
及びRはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
及びRは、連結して環を形成することはない。
好ましくは、Rは、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。より好ましくは、Rは、水素原子である。
式(10)中、Y及びYはそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Y及びYは互いに連結して環を形成してもよい。
好ましくは、Y及びYはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、又はアリールオキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Y及びYは互いに連結して環を形成してもよい。
より好ましくは、Y及びYはそれぞれ独立に、ハロゲン原子である。
さらに好ましくは、Y及びYはフッ素原子である。
及びYはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
式(10)中、Ar11及びAr12はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。
好ましくは、Ar11及びAr12はベンゼン環を表す。
式(10)中、Z及びZはそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。m1が2以上である場合、複数のZは同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、m2が2以上である場合、複数のZは同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
好ましくは、Z及びZは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアリール基を表す。
より好ましくは、Z及びZは、それぞれ独立に、フェニル基、ナフチル基、又はアントリル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、m1が2以上である場合、複数のZは同じ基である。
好ましくは、m2が2以上である場合、複数のZは同じ基である。
式(10)で示される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
<式(10A)で示される化合物について>
式(10)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(10A)で示される化合物が挙げられる。
Figure 2019163929
式(10A)中、Y及びYはそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
好ましくは、Y及びYはそれぞれ独立にハロゲン原子を表す。
特に好ましくは、Y及びYはフッ素原子である。
式(10A)中、Rは水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、Rは、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
より好ましくは、Rは、水素原子である。
式(10A)中、Ar及びArはそれぞれ独立にアリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
式(10A)中、R34〜R41はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
式(10A)中、好ましくは、R34〜R41の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
さらに好ましくは、R34〜R37の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基であり、R38〜R41の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
より好ましくは、R34〜R41の少なくとも1つ以上が、式(11)で表される基である。さらに好ましくは、R34〜R37の少なくとも1つ以上が、式(11)で表される基であり、R38〜R41の少なくとも1つ以上が、式(11)で表される基である。
Figure 2019163929
式(11)中、R201〜R205は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基であり、R201及びR205の少なくとも一方は水素原子以外の原子又は基である。R201とR202は互いに連結して環を形成してもよく、R202とR203は互いに連結して環を形成してもよく、R203とR204は互いに連結して環を形成してもよく、R204とR205は互いに連結して環を形成してもよい。
別の好ましい態様によれば、R34〜R41の少なくとも1つ以上が、式(12)で表される基である。さらに好ましくは、R34〜R37の少なくとも1つ以上が、式(12)で表される基であり、R38〜R41の少なくとも1つ以上が、式(12)で表される基である。
Figure 2019163929
式(12)中、R101は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。Ar101はアリール基、又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。Ar101とR101は互いに連結して環を形成してもよい。
式(10A)で示される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
<式(10)又は式(10A)で示される化合物の具体例>
式(10)又は式(10A)で示される化合物の具体例を以下に記載する。Meはメチル基を示し、Buはn−ブチル基を示し、Phはフェニル基を示す。
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
<エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせの具体例について>
エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせの具体例を以下に記載する。
Figure 2019163929
Figure 2019163929
エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の選択に関しては、吸収が短波長の化合物がエネルギードナー化合物であり、吸収が長波長の化合物がエネルギーアクセプター化合物であり、エネルギードナー化合物の発光とエネルギーアクセプター化合物の吸収が少しでも重なっている場合には、本発明の粒子において使用できる可能性がある。エネルギーアクセプター化合物の吸収の極大波長が、エネルギードナー化合物の吸収の波長より10〜100nm程度長波長側にある場合が好ましい。エネルギーアクセプター化合物の吸収の極大波長が、エネルギードナー化合物の吸収の波長より10〜70nm長波長側にある場合がより好ましい。
エネルギードナー化合物の発光が吸収のどの程度長波長に出るか(ストークスシフトの大きさ)は化合物によって異なるため、一概には言えないが、式(1)で示される化合物では吸収極大波長+30nm程度に発光の極大があり、そこから+100nm程度までは発光スペクトルが存在するため、その付近に吸収を持つアクセプター化合物を併用することによりエネルギー移動の系が実現できることが想定される。
なお、各化合物の吸収波長に関しては、化合物を合成して測定するだけでなく、Gaussian等による計算から予測することも可能であり、計算値の関係から、エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせを推定することもできる。
本発明においては、ストークスシフトの大きさが、好ましくは25nm以上であり、より好ましくは30nm以上であり、より一層好ましくは35nm以上であり、さらに好ましくは40nm以上であり、さらに一層好ましくは45nm以上であり、特に好ましくは50nm以上であり、最も好ましくは60nm以上である。ストークスシフトの大きさの上限は特に限定されないが、一般的には、150nm以下である。
<式(1)〜式(6)で示される化合物の使用量>
本発明で用いる粒子(即ち、式(1)〜式(6)で示される化合物を添加する前の粒子)に対する式(1)〜式(6)で示される化合物の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは0.5μmol/g〜400μmol/gであり、より好ましくは1μmol/g〜300μmol/gであり、さらに好ましくは2μmol/g〜200μmol/gであり、特に好ましくは3μmol/g〜100μmol/gである。
本発明で用いる粒子(即ち、式(1)〜式(6)で示される化合物を添加する前の粒子)に対する式(1)〜式(6)で示される化合物の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは0.1質量%〜30質量%であり、より好ましくは0.2質量%〜20質量%であり、さらに好ましくは0.3質量%〜10質量%であり、特に好ましくは0.4質量%〜8質量%である。
本発明の発光性粒子において、式(1)〜式(6)で示される化合物は少なくとも一種使用するが、二種以上の式(1)〜式(6)で示される化合物を使用してもよい。二種以上の式(1)〜式(6)で示される化合物を使用する場合には、合計量が、上記の範囲内となることが好ましい。
エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせを使用する場合には、エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比は、1:10〜20:1であることが好ましく、1:10〜10:1であることがより好ましく、1:5〜10:1であることがより好ましい。
エネルギードナー化合物として式(1)で示される少なくとも一種の化合物を使用し、エネルギーアクセプター化合物として、式(1)で示される少なくとも一種の化合物を使用する場合においては、エネルギードナー化合物として二種以上の式(1)で示される化合物を使用してもよく、またエネルギーアクセプター化合物として二種以上の式(1)で示される化合物を使用してもよい。上記の場合、使用される式(1)で示される化合物の合計量が、上記の範囲内となることが好ましい。
<式(1)〜式(6)で示される化合物の製造方法>
式(1)〜式(6)で示される化合物は、例えば、後記する実施例に示す合成スキームにより製造することができる。
一例として、化合物(1)の合成の概要を以下に示す。3,5−ビス(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド及びジクロロメタンの混合物に、水冷しながら3−エチル−2,4−ジメチルピロールとトリフルオロ酢酸を加えた後、室温で撹拌し、水冷しながらクロラニルを加え、室温で撹拌した後、水冷しながらジイソプロピルエチルアミンを滴下し、室温で撹拌し、続いて、水冷しながら三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体を滴下し、室温で撹拌して反応を行うことにより、化合物(1−A)を合成することができる。続いて、化合物(1−A)、2,4,6−トリメチルベンズアルデヒド、及び脱水トルエンを混合し、室温で撹拌する。ピペリジン及びp−トルエンスルホン酸1水和物1片を加えて溶媒を留去しながら撹拌し、放冷後に脱水トルエンを加えて溶媒を留去しながら撹拌して反応を行うことにより、化合物(1)を製造することができる。
別の例としては、化合物(5)は、後記する実施例における合成スキームに従って、2,3,5,6−テトラフルオロベンズアルデヒドと2,4−ジメチルピロールを出発化合物として、化合物(5−A)、化合物(5−B)、及び化合物(5−C)を経由して製造することができる。
化合物(1)及び化合物(5)は、式(1)で示される化合物の定義の範囲内である。化合物(1)及び化合物(5)以外の式(1)で示される化合物についても、反応に使用する化合物を、所望の式(1)で示される目的化合物に対応する置換基を有する化合物に置き換えることによって、製造することができる。
<式(10)で示される化合物の製造方法>
式(10)で示される化合物は、例えば、以下に示す合成スキームにより製造することができる。
Figure 2019163929
上記合成スキームにおけるR及びZの定義は、式(10)におけるR及びZの定義と同義である。
化合物A−10と化合物A−20とをMacromolecules 2010、43、193−200に記載の方法に従って反応させることにより、化合物A−30を合成することができる。次いで、化合物A−30、式:Z−B(OH)で表される化合物、及びフッ化セシウム(CsF)をジメトキシエタン(DME)と水の混合溶液に加え、真空引き、窒素置換を繰り返して脱気を行う。酢酸パラジウム(Pd(OAc))、及び2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2’、6’−ジメトキシビフェニル(SPhos)を加え、昇温し、還流下、所定の時間(例えば、2〜24時間)反応させることにより、化合物D−10を製造することができる。
化合物D−10は、式(10)で示される化合物の定義の範囲内である。化合物D−10以外の式(10)で示される化合物についても、化合物A−10、化合物A−20、及び式:Z−B(OH)で表される化合物の何れか一種以上の化合物を、対応する化合物に置き換えることによって、製造することができる。
(標識を有する第一の粒子)
本発明における標識を有する第一の粒子は、式(1)で示される化合物を含むことにより、高い量子収率と高い輝度を示す。
標識を有する第一の粒子の励起極大波長とは、励起スペクトルで蛍光強度の最も大きい波長である。標識を有する第一の粒子の蛍光極大波長とは、蛍光スペクトルで蛍光強度の最も大きい波長のことである。また、励起スペクトルとは、蛍光標識強度の励起波長依存性を示し、蛍光スペクトルは、蛍光強度の蛍光波長依存性を示す。
標識を有する第一の粒子の励起極大波長は、好ましくは640nm〜900nmであり、より好ましくは640nm〜800nmであり、さらにより好ましくは650nm〜750nmである。
標識を有する第一の粒子の蛍光極大波長は、好ましくは660nm〜900nmであり、より好ましくは660nm〜800nmであり、さらに好ましくは670nm〜750nmである。
標識を有する第一の粒子の蛍光強度とは、ある測定条件で測定した際の蛍光の強度のことであり、測定条件に依存するため一般的には相対的な比較をするために用いられる。
標識を有する第一の粒子の励起極大波長、蛍光極大波長、及び蛍光強度は、市販の蛍光分光光度計を使用して測定することができ、例えば、島津製作所製の蛍光分光光度計RF−5300PCを使用して測定することができる。
標識を有する第一の粒子の量子収率とは、標識を有する第一の粒子が吸収した光子数に対する蛍光として発光した光子数の割合のことである。
標識を有する第一の粒子が示す量子収率は、好ましくは0.25以上であり、より好ましくは0.30以上であり、さらに好ましくは0.40以上である。量子収率の上限は特に限定されないが、一般的には、1.0以下である。
標識を有する第一の粒子の量子収率は、市販の量子収率測定装置を使用して測定することができ、例えば、浜松ホトニクス社製の絶対PL量子収率測定装置C9920−02を使用して測定することができる。
<標識を有する第一の粒子の製造方法>
標識を有する第一の粒子の製造方法は特に限定されないが、式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを混合することによって製造することができる。例えば、ラテックス粒子などの粒子に、式(1)で示される化合物を添加することによって、標識を有する第一の粒子を作製することができる。より具体的には、水及び水溶性有機溶剤(テトラヒドロフラン、メタノール等)の何れか一種以上を含む粒子の溶液に、式(1)で示される化合物を含む溶液を添加して攪拌することにより、標識を有する第一の粒子を製造することができる。
本発明においては、上記した標識を有する第一の粒子を含む分散液を調製してもよい。
分散液は、標識を有する第一の粒子を分散媒に分散することにより製造することができる。分散媒としては、水、有機溶媒、又は水と有機溶媒との混合物等が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒などを使用することができる。
分散液における標識を有する第一の粒子の固形分濃度は特に限定されないが、一般的には0.1〜20質量%であり、好ましくは0.5〜10質量%であり、より好ましくは1〜5質量%である。
(第一の結合物質による標識を有する第一の粒子の修飾)
第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に固定化する方法は、例えば、特開2000−206115号公報やThermo Fisher 社FluoSpheres(登録商標)ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤(即ち、第一のブロッキング剤)としては、例えば、アルブミン(BSAなど)、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。さらに、第一のブロッキング剤としては、プロゲステロンと結合性を有しない抗体(グロブリン)、あるいはテストエリアに使用しないタンパク質(Protein A、Protein G)などを使用することもできる。
抗体を粒子に固定化する具体的な方法を、以下に例示する。粒子の固形分濃度が0.1〜10質量%になるよう分散させた液に、0.01〜20mg/mLの濃度に調整した抗体溶液を添加して、混合する。温度4〜50℃の条件下で5分間〜48時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により粒子と溶液を分離して、溶液に含まれている、粒子に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、粒子を緩衝液にて洗浄する操作を0〜10回繰り返す。粒子と抗体とを混合して、粒子に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはグロブリン、アルブミン、ブロックエース(登録商標)、スキムミルク及びカゼインなどのブロッキング剤を使用して粒子表面の抗体が結合していない部分を保護することが望ましい。
抗原や抗体等を粒子に固定化する際に、安定化剤を必要に応じて添加可能である。安定化剤としては、ショ糖や多糖類などの合成高分子あるいは天然高分子など、抗原や抗体を安定化するものであれば特に制限されず、Immunoassay Stabilizer(Advanced Biotechnologies Inc (ABI社))などの市販の安定化剤も使用可能である。
第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子は、本発明のキットに含まれており、キットの一部である容器、たとえばカップに含まれている態様が好ましい。この場合、プロゲステロンを含む生体試料を、標識を有する第一の粒子を含む容器に注入して混合および攪拌することにより、生体試料中のプロゲステロンと第一の結合物質とを結合させることができる。
(第二の結合物質)
本発明における標識を有しない第二の粒子は、プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾されている。第二の結合物質としては、例えば、結合物質(抗体)、あるいは結合物質(抗体)に対して結合するタンパク質(Protein A、Protein G)など、プロゲステロンと特異的な結合性を有しない化合物であり、かつ、第一の結合物質に対して親和性を有しない化合物であれば特に限定されず、いずれの化合物でも好ましく用いることができる。例えば、第二の結合物質が抗体である場合には、免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、又はFv]などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
抗体などの第二の結合物質を粒子に固定化する方法は、例えば、特開2000−206115号公報やモレキュラープローブ社FluoSpheres(登録商標)ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、BSAやスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
(第一の粒子及び第二の粒子)
第一の粒子と第二の粒子の使用比率については、第一の粒子に対する第二の粒子の質量比が一般的には1〜20であり、1〜10であることが好ましく、2〜8であることがより好ましく、4〜6がさらに好ましい。
本発明においては、第一の粒子の平均粒子径は50〜250nmであり、第二の粒子の平均粒子径は70〜500nmであり、かつ第一の粒子の平均粒子径より第二の粒子の平均粒子径が大きい。
第一の粒子の平均粒子径は、好ましくは70〜130nmであり、より好ましくは80〜120nmであり、さらに好ましくは85〜110nmである。
第二の粒子の平均粒子径は、好ましくは130〜300nmであり、より好ましくは135〜260nmであり、さらに好ましくは140〜200nmである。
平均粒子径の測定方法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。これらの測定方法のうち、粒子径範囲及び測定の容易さから、動的光散乱法を用いて蛍光粒子の平均粒径を測定することが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックUPA(日機装(株))、動的光散乱式粒径分布測定装置LB−550((株)堀場製作所)、濃厚系粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))等が挙げられる。本発明では、平均粒径は、25℃にて、粘度0.8872CP(但し、1Pa・s=1000cP)、水の屈折率1.330の条件で測定したメジアン径(d=50)として求めるものとする。
本発明で用いる第一の粒子(標識を有する粒子)及び第二の粒子は、乾燥状態で保存し、測定時にプロゲステロンを含む生体試料と混合することによって使用してもよい。第一の粒子及び第二の粒子を溶液状態で保存した場合、粒子同士が凝集や融着することにより大サイズ化し、測定精度が変化する場合があるので、このような場合には、第一の粒子及び第二の粒子は乾燥状態で保存することができる。乾燥状態で保存した粒子は、乾燥粒子とも言う。乾燥粒子とは、水分を含まない標識物質を含む粒子の固形分の質量に対する水分の質量(含水量)として、好ましくは30質量%以下、より好ましくは25質量%以下、更に好ましくは20質量%以下の水分の質量になるまで、含有する水分量を除去した状態の粒子をいう。乾燥を行う手段としては特に制限はなく、例えば、除湿剤を使用した乾燥方法、減圧乾燥方法、凍結乾燥方法などの公知の乾燥手段を用いることができる。本発明においては、第一の粒子及び第二の粒子を別々に乾燥して乾燥粒子を得てもよいし、第一の粒子と第二の粒子を、溶液状態で所望の質量比で混合した後に乾燥して乾燥粒子を得てもよい。
(流路)
本発明のキットは、第一の粒子及び第二の粒子を流すための流路を含む。本発明においては、プロゲステロンを含む可能性のある生体試料と、標識を有する第一の粒子と、標識を有しない第二の粒子とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、標識を有する第一の粒子と、第二の粒子とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子及び第二の粒子を含む生体試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、及び金属薄膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
(基板)
本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光(SPF)検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、又は白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、1nm以上500nm以下であるのが好ましく、特に10nm以上200nm以下であるのが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上、10nm以下であることが好ましい。
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、又は無電解めっき法等によって行うことができるが、基板材質と金属膜との混合層を設けて、金属膜の密着性を良くするためには、スパッタ法により金属膜を作製することが好ましい。この場合、基板材質と金属膜との混合層の厚さは十分な密着性が確保できれば特に制限はないが、10nm以下が好ましい。
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるBK7(ホウ珪酸ガラス)等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、又はシクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
SPF検出のための基板の好ましい態様としては、ポリメチルメタクリレート(PMMA)に金膜をスパッタ法等で形成した基板などを挙げることができる。
基板は、第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する検出領域を備えている。
第一の結合物質に対して結合性を有する物質を基板に固定化する方法は、例えば、Nunc社の提供するTech Notes Vol. 2-12などに記載されており、一般的なELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay:酵素結合免疫吸着法)試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜(SAM:Self-Assembled Monolayer)などを配することによる表面修飾を施してもよい。第一の結合物質に対して結合性を有する物質を基板に固定化する原理としては、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。第一の結合物質に対して結合性を有する物質を基板に固定させた後に、第一の結合物質に対して結合性を有する物質が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、BSAやスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
(検出領域<テストエリア>)
本発明においては、基板上に生体試料中のプロゲステロンの有無を検出するテストエリアを設けることができる。このテストエリアでは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原の結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。この検出方法は競合法と呼ばれているが、ここでは、競合法に関する基板について説明する。
基板のテストエリアには、標識粒子上に存在する結合物質(例えば抗体)と反応するサイトを有することが好ましい。本発明の好ましい一態様としては、生体試料中に存在するプロゲステロンを、基板のテストエリア上に有する態様が好ましい。この場合、プロゲステロンとBSAを縮合剤の存在下で反応させて、プロゲステロン・BSA結合体を作製し、この結合体をテストエリア上に吸着させることでテストエリアを作製することが可能となる。測定対象物質であるプロゲステロン−BSA結合体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板上のテストエリアに結合させることが可能である。
(参照領域<コントロールエリア>)
本発明では、測定環境、特に測定温度の影響を極力抑えるために、基板上にコントロールエリアを有し、テストエリアの情報を、コントロールエリアの情報で規格化することによって、環境依存性を非常に低く抑えることが可能となる。コントロールエリアとしては、使用する生体試料の中に存在するプロゲステロンの量に依存せず、すべての標識と結合することが可能なように設計されていることが好ましい。標識粒子上に存在する抗体すべてに相互作用する抗体を有することが好ましい。このように設計することによって、テストエリアの情報をコントロールエリアの情報で規格化することにより、例えば、低温環境で、生体試料の流れや、反応速度が影響を受けた場合でも、規格化によってその影響をキャンセルして、常に精度よく、測定環境に影響されない結果を得ることが可能になる。
コントロールエリアに存在させる好ましい抗体としては、標識粒子上に存在する結合物質(例えば、抗体)を認識する機能をもち、その抗体がマウス由来であれば、抗マウス抗体であることが好ましく、標識粒子上の抗体が、ヤギ由来であれば、抗ヤギ抗体であることが好ましい。これらコントロールエリア上の抗体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板に結合させることが可能である。
(ブロッキング剤)
例えば、競合法において、プロゲステロンを含まない陰性となる生体試料だけでなく、プロゲステロンを含む陽性となる生体試料に対しても反応して陰性となる生体試料が存在しており、高値乖離の問題の解決が課題として認識されている。このような擬陰性を示す原因は明確にはなっていないが、抗体に覆われていない標識粒子表面と、検出領域(テストエリア)との非特異的な相互作用により、本来結合してほしくない標識粒子が存在することが原因の一つではないかと考えられている。また、テストエリア上に存在する物質と同じ物質が標識粒子表面上に存在する場合にも、遊離した抗体などが生体試料中に存在する場合には、その抗体が、テストエリア上に存在する物質と、標識粒子表面上の物質のどちらにも結合することで、プロゲステロンを含む陽性となる生体試料を測定した場合においても陰性として検出される場合がある。
一般的に、固相表面(例えば標識粒子表面、基板の金膜表面)への非特異吸着抑制のためにBSAでのブロッキングが用いられている。
(抗体)
本発明において、抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスIgG、マウスIgM、ラットIgG、ラットIgM、ハムスターIgG、ハムスターIgM、ウサギIgG、ウサギIgM、ヤギIgG、ヤギIgM、ヒツジIgG、ヒツジIgM、ウシIgG、ウシIgM、トリIgY等であり、ポリクローナル又はモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはF(ab’)、Fab、Fab’、又はFv等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
(キットの他の要素)
本発明のキットは、プロゲステロンを測定する方法に用いられるものである。本発明のキットは、標識を有する第一の粒子と、標識を有しない第二の粒子とを含み、さらに第一の粒子及び第二の粒子を流すための流路と、第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板とを含むセンサチップを含む。本発明のキットにはさらに、表面プラズモン励起装置、及び蛍光測定デバイスなどの、プロゲステロンの測定に使用される各種の器材又は装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量のプロゲステロンを含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
[プロゲステロンの測定方法]
さらに本発明によれば、
(i)(a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
(c)プロゲステロンを含む被検試料と、
を混合して、混合物を得る工程と、
(ii)工程(i)で得た混合物を、基板上に適用する工程と、
(iii)第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、基板上の反応部位において、第一の結合物質を捕捉する工程と、
(iv)反応部位上に捕捉された第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を検出する工程と、
を含むプロゲステロンの測定方法であって、
標識を有する第一の粒子は、本明細書に記載した式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ第一の粒子の平均粒子径より第二の粒子の平均粒子径が大きい、
プロゲステロンの測定方法が提供される。
本発明においては、反応部位上に捕捉された第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を検出することにより、プロゲステロンを測定する。
本発明における測定は、プロゲステロンの量の測定である限り、最も広い概念として解釈される。測定方法の具体的な実施態様としては、競合法が好ましい。
プロゲステロンを定量する場合を以下に説明する。
競合法では、先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン)とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中の胆汁酸)との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体(即ち、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体)の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
競合法における蛍光の測定形態は、プレートリーダー測定、あるいはフロー測定のいずれかの測定を採用することが可能であり、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、プロゲステロン濃度が異なるプロゲステロン量既知の試料を複数用意し、この試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を予め混合する。この混合液を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号として測定する。この複数の蛍光信号から、各プロゲステロン濃度において、蛍光量の時間変化(傾き)を求める。この時間変化をY軸、プロゲステロン濃度をX軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対するプロゲステロン濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、生体試料に含まれるプロゲステロン量を定量することができる。
このプロゲステロン量の定量は、短時間で行うことが好ましい。具体的には、10分以内に行われることが好ましく、8分以内がより好ましく、更には6分以内で行われることが好ましい。この定量時間には、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて予め取得した蛍光量の時間変化とプロゲステロン濃度との関係式を利用して、試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている検出領域に接触させてから、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を基に生体試料に含まれるプロゲステロン量を換算する時間が含まれていることが好ましい。
(表面プラズモン蛍光測定)
本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出(SPF)を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、プロゲステロンの量に関連した標識情報を取得することができる。
なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。表面プラズモン励起による蛍光検出法(SPF法)は、落射励起による蛍光検出法(落射蛍光法)よりも高感度に測定することができる。
表面プラズモン蛍光(SPF)バイオセンサーとしては、例えば、特開2008−249361号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されることによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
本発明の蛍光粒子を用いた表面プラズモン励起による蛍光検出(SPF)系は、好ましくは、基板上の金属膜上に固定化されたプロゲステロンの量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、例えば、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法は、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと生体試料中の抗原が、抗体反応により結合し凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便なプロゲステロンの検出方法を提供できる。
(規格化)
さらに本発明の方法は、標識粒子の量に関連した標識情報を取得する、標識粒子関連標識情報取得工程;及びプロゲステロンの量に関連した標識情報を取得するプロゲステロン関連標識情報取得工程で取得した標識情報を、標識粒子関連標識情報取得工程で取得した標識情報により規格化する、規格化工程を含む方法でもよい。
ここで、生体試料と、プロゲステロンと結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子とを含む混合液を、検出領域(テストエリア)と参照領域(コントロールエリア)とを有する基板に接触させて検出領域と参照領域上に表面プラズモンを発生させ、放出された蛍光の強度を測定する工程のうち、検出領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、プロゲステロンの量に関連した標識情報を取得するプロゲステロン関連標識情報取得工程であり、参照領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、標識粒子関連標識情報取得工程である。この2つの工程で取得した蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値の変化率として求め、検出領域のシグナル値の変化率を参照領域のシグナル値の変化率で除する工程が規格化工程である。
[プロゲステロン測定試薬]
さらに本発明によれば、(a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子とを含む、プロゲステロン測定試薬であって、上記の標識を有する第一の粒子は、本明細書に記載した式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、プロゲステロン測定試薬が提供される。
上記したプロゲステロン測定試薬を用いて、本発明によるプロゲステロンの測定方法を実施することができる。
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
<1>ラテックス粒子の調製
<1−1>平均粒子径303nmラテックス粒子の調製
スチレン(和光純薬社製)30g(288mmol)とアクリル酸(和光純薬社製)1g(12mmol)を超純水330mLに懸濁させ、85℃に昇温し、過硫酸カリウム(KPS)(和光純薬社製)1gを25mLに溶解させた水溶液を添加し、85℃、250rpmで6時間攪拌した。その後、10,000rpmで6時間遠心分離を3回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が1質量%となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))を用いて、温度25℃で測定したメジアン径(d=50)として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は303nmであった。
<1−2>平均粒子径220nmラテックス粒子の調製
スチレン(和光純薬社製)30g(288mmol)とアクリル酸(和光純薬社製)2g(24mmol)を超純水330mLに懸濁させ、85℃に昇温し、過硫酸カリウム(KPS)(和光純薬社製)1gを25mLに溶解させた水溶液を添加し、85℃、250rpmで6時間攪拌した。その後、10,000rpmで6時間遠心分離を3回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が1質量%となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))を用いて、温度25℃で測定したメジアン径(d=50)として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は220nmであった。
<1−3>平均粒子径151nmラテックス粒子の調製
スチレン(和光純薬社製)30g(288mmol)とアクリル酸(和光純薬社製)3g(42mmol)を超純水440mLに懸濁させ、95℃に昇温し、過硫酸カリウム(KPS)(和光純薬社製)1gを10mLに溶解させた水溶液を添加し、95℃、250rpmで6時間攪拌した。その後、10,000rpmで6時間遠心分離を3回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が1質量%となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))を用いて、温度25℃で測定したメジアン径(d=50)として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は151nmであった。
<1−4>平均粒子径129、100、72nmラテックス粒子の調製
平均粒子径151nmのラテックス粒子の調製において、昇温時の温度を適宜調整することで、平均粒子径129、100、72nmのラテックス粒子を調製した。平均粒子径は<1−1>と同様に測定した。
<2>比較用蛍光ラテックス粒子の調製
上記のように作製したラテックス粒子の固形分濃度2質量%の水分散液100mLにメタノール100mLを加え、10分間、室温で攪拌した。一方、別途用意した蛍光色素(比較化合物:特許3442777号公報記載の化合物5)を60分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エバポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とPBS水溶液への再分散を3回繰り返し、精製を行うことで、平均粒子径が、302nm、218nm、150nm、132nm、98nm、71nmの6種類の比較用蛍光ラテックス粒子を調製した。
<3>抗プロゲステロン抗体で修飾した比較用蛍光ラテックス粒子の調製
抗プロゲステロン抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
<2>で調製した平均粒子径150nmの2質量%(固形分濃度)蛍光ラテックス粒子水溶液を375μL準備し、50mmol/LのMES(2−モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製)緩衝液(pH6.0)を117μL、10mg/mLの水溶性カルボジイミド(water soluble carbodiimide:WSC)水溶液を5μL加え、室温で15分間攪拌した。その後、0.5mg/mLの抗プロゲステロンモノクローナル抗体(GeneTex社製)を182.4μL添加し、室温で1.5時間撹拌した。2mol/LのGlycine(和光純薬社製)水溶液を37.5μL添加し、15分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、30分)にて、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。上清液を取り除き、PBS(Phosphate Buffered Saline リン酸緩衝生理食塩水;和光純薬社製)溶液(pH7.4)を750μL加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。さらに遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、上清液を除いた後、1質量%BSAを含むPBS(pH7.4)溶液750μLを加え、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗プロゲステロン抗体結合蛍光ラテックス粒子の1質量%溶液を得た。平均粒子径303nm、220nm、129nm、100nm、72nmの蛍光ラテックス粒子のプロゲステロン抗体修飾も同様に行った。
<4>蛍光標識を有しないラテックス粒子の調製
抗T4抗体で修飾したラテックス粒子を、以下の通り調製した。
<1−3>で調製した平均粒子径151nmの2質量%(固形分濃度)ラテックス粒子水溶液250μLに、50mmol/LのMESバッファー(pH6.0)溶液250μLを加え、5mg/mLの抗T4モノクローナル抗体(Medix社Anti−Thyroxineモノクローナル抗体(6901))100μLを添加し、室温で15分間攪拌した。その後、10mg/mLの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)水溶液を5μL加え、室温で2時間撹拌した。2mol/LのGlycine(和光純薬社製)水溶液を25μL添加して30分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、PBS溶液(pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行って上清を除いた後、1質量%BSAを含むPBS(pH7.4)溶液500μLを加えて、ラテックス粒子を再分散させることで、抗T4抗体結合ラテックス粒子の1質量%溶液を調製した。その他の粒子径(302nm、218nm、132nm、98nm、71nm)のラテックス粒子の抗T4抗体修飾も同様に行った。
同様にして、抗hCG抗体(Medix社Anti−hCG betaモノクローナル抗体(5008))を用いて、それぞれの平均粒子径のラテックス粒子に対して抗hCG抗体修飾を行った。
無標識粒子のマウス抗体の種類の表記として、抗T4抗体を1、抗hCG抗体を2とし、下記の表3に記載した。
<5>高輝度蛍光ラテックス粒子の作製
<5−1>化合物の合成
用語は以下の意味を示す。
MS:質量分析 (mass spectrometry)
ESI:エレクトロスプレーイオン化(electrospray ionization)
NMR:核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance)
rt:室温
Et:エチル基
PL:フォトルミネッセンス
THF:テトラヒドロフラン
<<化合物(1)の合成>>
Figure 2019163929
化合物(1−A)の合成
100mL三ツ口フラスコに、窒素雰囲気下、3,5−ビス(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド1.00g及びジクロロメタン20mLを導入し、室温で撹拌した。水冷しながら3−エチル−2,4−ジメチルピロール0.98gを滴下し、続いて、トリフルオロ酢酸を2滴加えた後、室温で30分間撹拌した。水冷しながらクロラニル1.0gを加え、室温で10分間撹拌した後、水冷しながらジイソプロピルエチルアミン(NiPr2Et)3.67gを滴下し、室温で15分間撹拌した。続いて、水冷しながら三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体5.6mLを滴下し、室温で30分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム及びトルエンを滴下し、抽出・分液して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで予備乾燥した後、減圧濃縮した。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル)で精製した後、メタノールで再結晶することにより、化合物(1−A)を1.28g得た。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 8.03(s,1H),7.83(s,2H),2.54(s,6H),2.31(q,J=7.6Hz,4H),1.21(s,6H),1.00(t,J=7.6Hz,6H).
化合物(1)の合成
100mL三ツ口フラスコに、化合物(1−A)100mg、2,4,6−トリメチルベンズアルデヒド115mg、及び脱水トルエン5mLを導入し、室温で撹拌した。ピペリジン1mL及びp−トルエンスルホン酸1水和物(和光純薬工業(株)社製、試薬特級)1片を加えて140℃で溶媒を留去しながら1時間撹拌し、放冷後に脱水トルエン5mLを加えて140℃で溶媒を留去しながら1時間撹拌した。反応液を減圧濃縮して得られた粗生成物を分取TLC(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル)で精製した後、メタノールで再結晶することにより、化合物(1)を71mg得た。化合物の同定は、1H−NMRとESI−MSにより行った。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 8.06(s,1H),7.87(s,2H),7,38(d,J=17.2Hz,2H),7,32(d,J=17.2Hz,2H),6.93(s,4H),2.63(q,J=7.6Hz,4H),2.44(s,12H),2.30(s,6H),1.27(s,6H),1.17(t,J=7.6Hz,6H).
ESI−MS:[M−H]-=775.8
<化合物(5)の合成>
Figure 2019163929
化合物(5−A)の合成
500mL三ツ口フラスコに、窒素雰囲気下、2,4−ジメチルピロール1.16ml及びジクロロメタン140mLを導入し、室温で撹拌した。2,3,5,6−テトラフルオロベンズアルデヒド1.0g、トリフルオロ酢酸1滴を加えた後、室温で15分間撹拌した。クロラニル(Chloranil)1.38gを加え、室温で15分間撹拌した後、水冷しながらジイソプロピルエチルアミン(NiPr2Et)6.8mLを滴下し、室温で20分間撹拌した。続いて、水冷しながら三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体(BF3・Et2O)7.8mLを滴下し、室温で30分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム400mLを滴下し、ジクロロメタンで抽出・分液して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで予備乾燥した後、減圧濃縮した。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル)で精製した後、メタノールで再結晶することにより、化合物(5−A)を360mg得た。
化合物(5−B)の合成
Figure 2019163929
300mL三ツ口フラスコに、化合物(5−A)を300mg、及び1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール8mLを導入し、室温で撹拌した。N−ヨードスクシンイミド409mgを導入し、室温で1時間半撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、塩化メチレン40mLを加え、抽出・分液して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで予備乾燥した後、ろ過を施し減圧濃縮した。この粗生成物にエタノールを加えて分散洗浄及びろ過を施すことにより、化合物(5−B)を382mg得た。
化合物(5−C)の合成
Figure 2019163929
100mL三ツ口フラスコに、化合物(5−B)を278mg、2,4,6−トリメチルフェニルボロン酸564mg、フッ化セシウム653mg、及びメトキシシクロペンタン43mLを導入し、室温で撹拌しながら、減圧脱気後、窒素雰囲気にした。ここに、SPhos Pd G3(Aldrich製)269mgを加え、1時間加熱還流した。酢酸エチル250mLを加え、抽出・分液して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで予備乾燥した後、減圧濃縮した。この組成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル)で精製した後、ジクロロメタン5mlに溶解させ、さらにメタノール15mlを加えた後にジクロロメタンを留去し、再沈殿させた。沈殿物をろ過し、化合物(5−C)206mgを得た。
化合物(5)の合成
Figure 2019163929
100mL三ツ口フラスコに、化合物(5−C)を50mg、トルエン5ml、2,4,6−トリメチルベンズアルデヒド46μl、ピペリジン400μl、p−トルエンスルホン酸1片を導入し、窒素下で1時間加熱還流した。2,4,6−トリメチルベンズアルデヒド46μlを追添して1時間加熱還流させた後、ピペリジン200μlを追添してさらに1時間加熱還流させた。反応終了後、減圧濃縮し、この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/トルエン)で精製した後、ジクロロメタン3mlに溶解させ、メタノール15mlを加えた後にジクロロメタンを留去し、再沈殿させることにより、化合物(5)を16mg得た。化合物の同定は、1H−NMRとESI−MSにより行った。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 7.43(s,1H),7.39(s,1H),7.29−7.21(m,1H),6.94(s,4H),6.80(s,4H),6.69(s,1H),6.65(s,1H),2.29(s,6H),2.23(s,6H),2.08(s,12H),2.03(s,12H),1.33(s,6H).
ESI−MS:[M−H]-=891.4
<5−2>高輝度蛍光ラテックス粒子の作製
<1−3>で調製した固形分濃度が2質量%の平均粒子径151nmのラテックス粒子分散液(ラテックス分散液25mL、固形分500mg)に対してTHF(5mL)を滴下して10分攪拌した。そこに、化合物(5)48μmol/gを含むTHF溶液(2.5mL)を15分間かけて滴下した。そこに化合物(1)48μmol/gを含むTHF溶液(2.5mL)を15分間かけて滴下した。化合物の滴下終了後、30分攪拌した後、減圧濃縮してTHFを除去した。その後、遠心分離して粒子を沈殿させた後、超純水を加えて再度分散させることで固形分濃度2質量%の高輝度蛍光ラテックス粒子の分散液を調製した。また、化合物(1)の代わりに化合物(5)を用いて同様の操作を行い、化合物(5)を含む固形分濃度2質量%の高輝度蛍光ラテックス分散液を調製した。
さらに、化合物(1)24μmol/gと化合物(5)12μmol/gを混合したものを用いて同様の操作を行い、化合物(1)と化合物(5)を含む固形分濃度2質量%の高輝度蛍光ラテックス分散液を調製した。
その他の平均粒子径(303nm、220nm、129nm、100nm、72nm)のラテックス粒子についても同様の操作を行い、化合物(1)のみ、化合物(5)のみ、及び、化合物(1)と化合物(5)を同時に含む固形分濃度2質量%の高輝度蛍光ラテックス分散液をそれぞれ調製した。
<5−3>抗プロゲステロン抗体で修飾した高輝度蛍光ラテックス粒子の調製
<5−2>で調製した固形分濃度が2質量%の高輝度蛍光ラテックス粒子それぞれを用いて<3>と同様の作業を実施し、平均粒子径303nm、220nm、151nm、129nm、100nm、72nmの抗プロゲステロン抗体結合高輝度蛍光ラテックス粒子の1質量%溶液を調製した。
<6>蛍光標識粒子と、蛍光標識をしない粒子の乾燥粒子の作製
超純水280μL、12.5質量%スクロース水溶液427μL、20質量%BSA水溶液133μL、1質量%抗プロゲステロン抗体修飾蛍光ラテックス粒子(平均粒子径150nm)80μL、1質量%抗T4抗体修飾ラテックス粒子(平均粒子径150nm)80μLを混合した。ポリプロピレン(プライムポリマー社製、プライムポリプロ ランダムPPグレード)を基体としたカップを準備し、15μL点着した。その後、スーパードライ乾燥機(TOYOリビング社、ウルトラスーパードライ00シリーズ)を用いて、12時間かけて含水量を25質量%以下となるまで乾燥させ、乾燥粒子を作製した。他の実験水準に使用した乾燥粒子については、ラテックス粒子の平均粒子径、および抗プロゲステロン抗体修飾蛍光ラテックス粒子と、抗T4抗体修飾ラテックス粒子の使用する質量比率を表3に示すように適宜変更して、乾燥粒子を作製した。
<7>基板の作製
<7−1>プロゲステロン−BSA結合体のクエン酸緩衝液の溶液の調製
プロゲステロン−BSA結合体(BIO−RAD社製)150μgを、50mmol/L濃度のクエン酸緩衝液1mL(pH5.2、150mmol/L NaCl)に添加して溶解させ、クエン酸緩衝液の溶液を得た。
<7−2>抗マウス抗体の作製
マウス由来のグロブリン(LAMPIRE Biological Laboratories社製、カタログ番号7404302、Mouse Gamma Globulin Salt Fractionation、500mg)を準備し、完全フロイントアジュバント(CFA)と混合したエマルジョンを初回投与し、2〜4回目の免疫には不完全アジュバント(IFA)と混合したエマルジョンを投与する方法で、ヤギへ免疫感作(皮下免疫)を2週間隔で4回免疫を行った。その後、ELISA測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、Protein Aカラム(Thermo scientific社製Pierce ProteinA Columns、カタログ番号20356)により精製し、目的の抗マウス抗体を取得した。
<7−3>プロゲステロン−BSA結合体固定基板の作製
ポリメチルメタクリレート(PMMA)の基体(三菱レイヨン(株)社製、アクリペットVH)を準備し、マグネトロンスパッタ法により、検出領域と参照領域の2箇所に、それぞれ厚さ45nmの金膜を片面に幅4mm、長さ3mmとなるように作製して基板を構成するためのチップを作製した。このチップの検出領域の金膜面上に、<7−1>で調製したプロゲステロン−BSA結合体のクエン酸緩衝液による溶液を点着して乾燥させ、プロゲステロン−BSA結合体を固定化した基板を作製した。また、それぞれの基板の参照領域には、<7−2>で作製した抗マウス抗体を含む液(濃度:50μg/mL in 50mmol/L MES緩衝液 pH6,150mmol/L NaCl)を点着して、乾燥させた。
<8>基板の洗浄およびブロッキング
このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液(0.05質量%Tween(登録商標)20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製)を含むPBS溶液(pH7.4))を300μL用いて3回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金薄膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1質量%カゼイン(Thermo Scientific社製)を含むPBS溶液(pH7.4)を300μL添加し、1時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)300μLを添加し、室温で30分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
<9>センサチップの作製
特開2010−190880号公報の第2の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。その概略図を図1および図2に示した。図1は、センサチップ1の概略図であり、図2は、センサチップ1の分解図である。センサチップ1は、上部部材2、中間部材3および基板4から構成されている。上部部材2には、第一の容器5および第二の容器6が設けられている。なお、第一の容器5および第二の容器6を併せて、容器群7と称する。基板4には、流路10が形成されており、流路10の上には、検出領域8および参照領域9が形成されている。
<10>被検試料の準備
検量線評価用に、各種濃度(0.00ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL)のプロゲステロンを含む試料を用意した。
また、性能評価用に、イヌ血清として北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を使用し、被検試料(検体)No. 1〜11を用意した。
<11>蛍光粒子を用いたプロゲステロンの免疫測定
<6>で調製した、カップ内の乾燥粒子を、25℃50%RH(相対湿度)の環境下で15日間保存した後、このカップ内に、<10>で準備した各種濃度のプロゲステロンを含む試料、及び被検試料(検体)それぞれ100μLと、塩化マグネシウム44μmolを充分に混合して調製した混合試料を点着し、10分間攪拌しながら混合して混合液を得た。次に、<9>で作製した、基板を封入した流路型センサチップに、得られた混合液を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液1を10μL/minの速度で流下させた。プロゲステロン−BSA結合体を固定した金薄膜面上の蛍光強度を1.5分間継続して測定した。得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求めた。
<12>検量線の作成
文献「The Immunoassay Handbook Third Edition Edited by David Wild(2005)」に競合法の検量線として、シグモイド関数の4パラメータロジスティック曲線モデルが適用できることが記載されており、この方法に従って、近似線を得る方法として一般的に知られている最小二乗法を用いて、下記の表3に記載された比較例、及び実施例ごとに、<11>で測定したプロゲステロンを含む試料の各種濃度(0.00ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL)における蛍光シグナル値の各点の最近傍を通る4パラメータロジスティック曲線を求め、検量線とした。
以上のようにして求めた検量線から、被検試料(検体)No.1〜11の各々のプロゲステロン濃度の測定値を算出した。
性能は検量線の規格を満たすかどうかで判定した。検量線は2箇所で規格を決定した。一つ目はプロゲステロンの低濃度域の検量線の傾きであり、逆数を取って、1.4以内であることを規格とした。二つ目はプロゲステロンの高濃度域の測定点の検量線からの乖離(ズレ)であり、2%以内を規格とした。これらの規格の範囲内では、測定値の変動係数が10%以内を実現でき、且つ、正確度が10%以内であることが実現できるので、低濃度域から高濃度域の全領域にわたって非常に精度の高い測定が可能となる。
規格として決定した低濃度域のプロゲステロンの濃度は、臨床的に意義のあるプロゲステロンの最小濃度である0.5ng/mLにおける検量線の傾きを求めた。また、規格として決定した高濃度域については、プロゲステロン濃度が30.0ng/mLと45.0ng/mLのそれぞれの検量線からの乖離(ズレ)を求め、平均値を算出して評価した。結果を表3にまとめた。
<13>対照機による測定
免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機であるシーメンス社IMMULYZE1000全自動免疫化学発光測定装置により、取り扱い説明書に従い、被検試料中の被検物質の測定を行った。測定は、<10>で準備した被検試料(検体)No. 1〜11に対して行った。本発明は、対照機で測定した測定値を基準にし、迅速で簡便に測定が可能となる発明であり、対照機の測定値との差が小さいことが必要であり、被検試料(検体)No. 1に対して、大型機から求めたプロゲステロン測定値と、12.で作成した検量線から求めたプロゲステロン測定値(本発明 プロゲステロン測定値)を用いて以下の基準で評価し、結果を表3に示した。
大型機との乖離幅(%)の計算式
Figure 2019163929
<評価基準>
低濃度域の検量線傾きの逆数は、1.4以内の場合の判定をAとし、1.5より大きい場合の判定をBとし、Aの判定を許容範囲とした。
高濃度域での検量線からのズレは、1.5%未満の場合の判定をA、1.5%以上2%以下の場合の判定をB、2%より大きい場合の判定をCとし、A及びBの判定を許容範囲とした。
大型機との乖離幅(%)は、2.0%未満の判定をA、2.0%以上5.0%未満の判定をB、5.0%以上の判定をCとし、A及びBの判定を許容範囲とした。
<14>粒子蛍光強度(相対値)の測定
上記で固形分濃度2質量%の蛍光ラテックス分散液を超純水で200倍に希釈し、蛍光分光光度計RF−5300PC(島津製作所製)の励起光を658nmに設定し、測定を行った。蛍光ラテックス分散液の蛍光強度が測定範囲を超えるほど高い場合には、蛍光強度の極大値が測定可能な範囲まで超純水で希釈を行った。<6>で作製した蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値に対する、蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値を粒子蛍光強度(相対値)とした。算出に用いた計算式を以下に示す。
蛍光強度(相対値)=(蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値)/(<6>で作製した蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値)
結果を表3に示す。
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
Figure 2019163929
表3の結果から、本発明の高輝度粒子、および無標識粒子を使用することで、測定範囲全般で高精度に測定できることがわかり、本発明の効果が確認された。
1 センサチップ
2 上部部材
3 中間部材
4 基板
5 第一の容器
6 第二の容器
7 容器群
8 検出領域
9 参照領域
10 流路

Claims (20)

  1. プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
    プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
    前記第一の粒子及び前記第二の粒子を流すための流路と、
    前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板と、
    を含むプロゲステロン測定キットであって、
    前記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
    前記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、前記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ前記第一の粒子の平均粒子径より前記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
    キット。
    Figure 2019163929
    式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
    Figure 2019163929
    式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
  2. 前記第一の粒子及び前記第二の粒子がラテックス粒子である、請求項1に記載のキット。
  3. 前記の標識を有する第一の粒子が、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する発光性粒子であって、前記エネルギードナー化合物及び前記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、前記式(1)で示される化合物である、請求項1又は2に記載のキット。
  4. 前記エネルギードナー化合物として、少なくとも一種の前記式(1)で示される化合物を含有し、前記エネルギーアクセプター化合物として、少なくとも一種の前記式(1)で示される化合物を含有する、請求項3に記載のキット。
  5. エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が1:10〜10:1である、請求項3又は4に記載のキット。
  6. 前記第一の粒子に対する前記第二の粒子の質量比が1〜20である、請求項1から5の何れか一項に記載のキット。
  7. プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、請求項1から6の何れか一項に記載のキット。
  8. (i)(a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
    (b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
    (c)プロゲステロンを含む被検試料と、
    を混合して、混合物を得る工程と、
    (ii)前記工程(i)で得た混合物を、基板上に適用する工程と、
    (iii)前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、前記基板上の反応部位において、前記第一の結合物質を捕捉する工程と、
    (iv)前記反応部位上に捕捉された前記第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を検出する工程と、
    を含むプロゲステロンの測定方法であって、
    前記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
    前記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、前記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ前記第一の粒子の平均粒子径より前記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
    プロゲステロンの測定方法。
    Figure 2019163929
    式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
    Figure 2019163929
    式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
  9. 前記第一の粒子及び前記第二の粒子がラテックス粒子である、請求項8に記載の方法。
  10. 前記の標識を有する第一の粒子が、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する発光性粒子であって、前記エネルギードナー化合物及び前記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、前記式(1)で示される化合物である、請求項8又は9に記載の方法。
  11. 前記エネルギードナー化合物として、少なくとも一種の前記式(1)で示される化合物を含有し、前記エネルギーアクセプター化合物として、少なくとも一種の前記式(1)で示される化合物を含有する、請求項10に記載の方法。
  12. 前記第一の粒子に対する前記第二の粒子の質量比が1〜20である、請求項8から11の何れか一項に記載の方法。
  13. 工程(iv)において、前記反応部位上に捕捉された前記第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を表面プラズモン蛍光法により検出する、請求項8から12の何れか一項に記載の方法。
  14. (a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子とを含む、プロゲステロン測定試薬であって、
    前記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
    前記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、前記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ前記第一の粒子の平均粒子径より前記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
    プロゲステロン測定試薬。
    Figure 2019163929
    式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
    Figure 2019163929
    式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
  15. 前記式(1)で示される化合物が、下記式(3)で示される化合物である、請求項14に記載のプロゲステロン測定試薬。
    Figure 2019163929
    式中、R11、R12、R14、R15、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、但し、R11、R12、R14及びR15の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基である。R31〜R35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R31、R32、R34及びR35のいずれか一つは2原子以上からなる基である。
  16. 前記式(1)で示される化合物が、下記式(4)で示される化合物である、請求項14に記載のプロゲステロン測定試薬。
    Figure 2019163929
    式中、R12、R13、R14、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、但し、R12、R13及びR14の少なくとも1つは水素原子以外の原子又は基である。R41及びR42はそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
  17. 前記式(1)で示される化合物が、下記式(5)で示される化合物である、請求項14に記載のプロゲステロン測定試薬。
    Figure 2019163929
    式中、R11〜R15、X、X、L及びLは、式(1)における定義と同義である。R51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Q及びQはそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環又は芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。
  18. 前記第一の粒子に対する前記第二の粒子の質量比が1〜20である、請求項14から17の何れか一項に記載のプロゲステロン測定試薬。
  19. 前記プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、請求項14から18の何れか一項に記載のプロゲステロン測定試薬。
  20. 前記標識を有する第一の粒子が、蛍光ラテックス粒子であり、前記第二の粒子がラテックス粒子である、請求項14から19の何れか一項に記載のプロゲステロン測定試薬。
JP2020501053A 2018-02-22 2019-02-22 プロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬 Active JP6936383B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018029328 2018-02-22
JP2018029328 2018-02-22
PCT/JP2019/006705 WO2019163929A1 (ja) 2018-02-22 2019-02-22 プロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2019163929A1 true JPWO2019163929A1 (ja) 2021-01-14
JP6936383B2 JP6936383B2 (ja) 2021-09-15

Family

ID=67687259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020501053A Active JP6936383B2 (ja) 2018-02-22 2019-02-22 プロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20200378962A1 (ja)
EP (1) EP3757569B1 (ja)
JP (1) JP6936383B2 (ja)
CN (1) CN111758031B (ja)
WO (1) WO2019163929A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3605095B1 (en) 2017-03-30 2024-07-17 FUJIFILM Corporation Kit, method and reagent for measuring measurement target substance
EP3605092B1 (en) * 2017-03-30 2024-07-24 FUJIFILM Corporation Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
KR20190120327A (ko) 2017-03-30 2019-10-23 후지필름 가부시키가이샤 생체 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하기 위한 키트 및 방법

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0472564A (ja) * 1990-07-13 1992-03-06 Mitsubishi Kasei Corp 免疫測定法
JPH07508309A (ja) * 1992-05-13 1995-09-14 モレキュラー・プロウブズ・インコーポレーテッド 制御可能な強化ストークスシフトを有する蛍光微小粒子
CN1944540A (zh) * 2006-09-15 2007-04-11 大连理工大学 生物分析用近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料
JP2007127438A (ja) * 2005-11-01 2007-05-24 Sekisui Chem Co Ltd 非特異反応抑制剤、免疫学的測定試薬免疫測定方法及び非特異反応抑制剤の製造方法
JP2010112748A (ja) * 2008-11-04 2010-05-20 Fujifilm Corp 検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット
US20110054187A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Bam Bundesanstalt Fuer Materialforschung Und -Pruefung Difluoroboradiazaindacene dyes
WO2013146694A1 (ja) * 2012-03-28 2013-10-03 コニカミノルタ株式会社 生体物質の検出方法
JP2015072249A (ja) * 2013-03-29 2015-04-16 富士フイルム株式会社 被検物質の測定方法、被検物質測定キット及び被検物質測定試薬
CN105462576A (zh) * 2015-09-01 2016-04-06 南京林业大学 一种近红外bodipy类荧光染料及其制备方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60256057A (ja) 1984-06-01 1985-12-17 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 免疫学的測定法
DE9216110U1 (de) 1992-11-26 1993-01-28 Biolab GmbH, 80995 München Progesteron-Schnelltest für Mensch und Haustiere
JP3623657B2 (ja) 1998-05-22 2005-02-23 積水化学工業株式会社 非特異反応抑制剤、免疫測定試薬及び免疫測定方法
JP4086266B2 (ja) 1998-11-26 2008-05-14 日本化薬株式会社 免疫測定方法
JP2000206115A (ja) 1999-01-11 2000-07-28 Eiken Chem Co Ltd 抗体断片を用いた免疫凝集反応試薬
JP2010019553A (ja) 2006-11-02 2010-01-28 Olympus Corp 一分子蛍光分析による分子の特異的結合反応検出方法
JP2008249361A (ja) 2007-03-29 2008-10-16 Fujifilm Corp 表面プラズモンセンサーおよび免疫学的測定方法
JP2010190880A (ja) 2008-04-18 2010-09-02 Fujifilm Corp 光信号検出方法、光信号検出装置、光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キット
JP6277099B2 (ja) * 2014-09-09 2018-02-07 富士フイルム株式会社 試薬キット、測定キット及び被検物質の測定方法。
JP6756839B2 (ja) * 2016-08-23 2020-09-16 富士フイルム株式会社 発光性粒子及び化合物
EP3605092B1 (en) * 2017-03-30 2024-07-24 FUJIFILM Corporation Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
KR20190120327A (ko) * 2017-03-30 2019-10-23 후지필름 가부시키가이샤 생체 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하기 위한 키트 및 방법
WO2018181799A1 (ja) * 2017-03-30 2018-10-04 富士フイルム株式会社 測定対象物質を測定するためのキット、方法及び試薬
EP3605095B1 (en) * 2017-03-30 2024-07-17 FUJIFILM Corporation Kit, method and reagent for measuring measurement target substance

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0472564A (ja) * 1990-07-13 1992-03-06 Mitsubishi Kasei Corp 免疫測定法
JPH07508309A (ja) * 1992-05-13 1995-09-14 モレキュラー・プロウブズ・インコーポレーテッド 制御可能な強化ストークスシフトを有する蛍光微小粒子
JP2007127438A (ja) * 2005-11-01 2007-05-24 Sekisui Chem Co Ltd 非特異反応抑制剤、免疫学的測定試薬免疫測定方法及び非特異反応抑制剤の製造方法
CN1944540A (zh) * 2006-09-15 2007-04-11 大连理工大学 生物分析用近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料
JP2010112748A (ja) * 2008-11-04 2010-05-20 Fujifilm Corp 検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット
US20110054187A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Bam Bundesanstalt Fuer Materialforschung Und -Pruefung Difluoroboradiazaindacene dyes
WO2013146694A1 (ja) * 2012-03-28 2013-10-03 コニカミノルタ株式会社 生体物質の検出方法
JP2015072249A (ja) * 2013-03-29 2015-04-16 富士フイルム株式会社 被検物質の測定方法、被検物質測定キット及び被検物質測定試薬
CN105462576A (zh) * 2015-09-01 2016-04-06 南京林业大学 一种近红外bodipy类荧光染料及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XU, JUNCHAO ET AL.: "meso-C6F5 substituted BODIPYs with distinctive spectroscopic properties and their application for bi", TETRAHEDRON, vol. 70, JPN6018024368, 2014, pages 5800 - 5805, ISSN: 0004485812 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3757569B1 (en) 2024-07-17
EP3757569A4 (en) 2021-04-21
EP3757569A1 (en) 2020-12-30
CN111758031B (zh) 2024-03-19
CN111758031A (zh) 2020-10-09
WO2019163929A1 (ja) 2019-08-29
US20200378962A1 (en) 2020-12-03
JP6936383B2 (ja) 2021-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6808821B2 (ja) 測定対象物質を測定するためのキット、方法及び試薬
JP6808819B2 (ja) 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法
JP6857714B2 (ja) 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法
JP6808822B2 (ja) 測定対象物質を測定するためのキット、方法及び試薬
JP6936383B2 (ja) プロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬
US11674966B2 (en) Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
JP6808818B2 (ja) 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200731

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210413

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210611

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210803

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210826

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6936383

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250