WO2013146694A1 - 生体物質の検出方法 - Google Patents

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phosphor
encapsulated
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星野　秀樹
秀樹 郷田
健作 高梨
中野　寧
幸祐 権田
憲明 大内
みか 渡邉
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コニカミノルタ株式会社
国立大学法人東北大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a biological substance. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a biological substance using both phosphor-encapsulated nanoparticles and nanoparticles not encapsulating a phosphor.
  • Cancer is a disease that bisects the cause of death in adults along with vascular diseases such as myocardial infarction and cerebral infarction.
  • vascular diseases such as myocardial infarction and cerebral infarction.
  • the incidence of breast cancer is lower in Japanese than in Western countries, but it has been increasing in recent years. In 1998, it surpassed the incidence of gastric cancer and became the first female prevalence.
  • the annual number of breast cancer cases exceeds 50,000.
  • the number is increasing every year in the world.
  • breast cancer has the highest incidence rate for both men and women, and the annual number of cases exceeds 1.38 million. , Accounting for about 23% of women's cancer.
  • cancer diagnostics include methods that detect cancer markers that are specifically expressed in specific cancers, cancer markers that leak into blood and tissues, etc. Has been.
  • General screening tests for breast cancer include interviews, palpation, soft x-ray mammography (mammography), ultrasonography, etc. If clinical suspicion arises, cytology and biopsy are performed and pathological diagnosis It is determined whether it is cancer.
  • Pathological diagnosis is important for determining the course of cancer treatment and prognosis, and “HE (hematoxylin and eosin) staining method for morphological observation” and “cancer marker” are the core of this diagnosis.
  • immunohistochemistry is marketed as Herceptin (registered trademark), an antibody drug targeting human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), which is a factor involved in cancer growth.
  • Herceptin registered trademark
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • Trastuzumab is known to be a typical anticancer agent for breast cancer.
  • Immunohistochemistry (IHC) method for analyzing the expression of HER2 protein and the like, and FISH (Fluorescence in situ hybridization) method for analyzing the amplification of HER2 gene and the like are clinical methods for determining the effectiveness of this drug administration. Widely used in the field.
  • the expression level of HER2 can be detected by staining and visualizing the HER2 antibody bound to the HER2 antigen site using DAB [Diaminobenzidine] by the IHC method.
  • DAB Diaminobenzidine
  • the criteria are rough criteria based on only four stages with a staining level of score 0 to 3, it lacks quantitativeness, and the criteria depend on the skill level of the pathologist. It is a clinical problem.
  • the FISH method is performed using a probe for detecting the HER2 gene and a probe for detecting the chromosome 17 centromere, and is based on the gene copy number of HER2 per chromosome 17 analyzed by the FISH method. The presence or absence of HER2 gene amplification can be determined.
  • the FISH method is a quantitative test method, it is not a method for directly evaluating the amount of HER2 protein or the intracellular localization of HER2. Under such circumstances, it is necessary to develop a method for determining the effectiveness of a medicine containing a highly accurate antibody as a component.
  • Fluorescent staining is characterized by excellent quantitativeness compared to DAB staining (Non-patent Document 1).
  • general fluorescent dyes and semiconductor nanoparticles have a small amount of fluorescence, unless the autofluorescence is separated and removed properly, the target molecule cannot be judged by fluorescence, and morphological information still requires HE staining in separate sections. Met.
  • Patent Document 1 discloses a reverse micelle method and a sol-gel method using a mixture of an organoalkoxysilane and an alkoxide having an organic functional group having a good adsorptivity to semiconductor nanoparticles at the end of a molecule as a glass precursor.
  • glass phosphor nanoparticles in which semiconductor nanoparticles are dispersed and fixed therein are disclosed.
  • this method increases the amount of fluorescence and makes it possible to determine the target molecule, even a slight amount of non-specific binding can cause background noise to increase, so quantitative detection with high sensitivity is possible. It was a big issue to do.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and even when a high-intensity fluorescent labeling material is used, the background noise does not increase and is suitable for a highly quantitative immunohistochemical staining method with an improved S / N ratio. It is an object to provide a simple detection method.
  • the present inventors have obtained a phosphor from bovine serum albumin [BSA], which is usually used as a blocking agent, in an immunohistochemical staining method using phosphor-encapsulated nanoparticles as a color former. As a result, it was found that nanoparticles that do not encapsulate are significantly superior in blocking ability, thereby completing the present invention.
  • BSA bovine serum albumin
  • a detection method reflecting one aspect of the present invention is: A method for detecting a specific biological substance, using as a color former a fluorescent substance-encapsulated nanoparticle in which a biological substance recognition molecule that specifically recognizes a specific biological substance is bound to the surface of the particle. This includes using nanoparticles that do not encapsulate a phosphor as a blocking agent for preventing particles from adsorbing nonspecifically to biological materials other than specific biological materials.
  • the S / N ratio is improved by using high-intensity phosphor-encapsulated nanoparticles as color formers and nanoparticles that do not encapsulate phosphors as blocking agents. Tissue stained images can be observed, and the diagnostic accuracy of the pathologist can be improved.
  • the reason why nanoparticles that do not encapsulate a phosphor preferably function as a blocking agent is, for example, that a conventional blocking agent for proteins such as BSA prevents nonspecific adsorption related to an antigen-antibody reaction.
  • a conventional blocking agent for proteins such as BSA prevents nonspecific adsorption related to an antigen-antibody reaction.
  • the non-specific adsorption of the antibody or the like bound to the fluorescent substance-encapsulated nanoparticles can be prevented. This is considered to be because non-specific adsorption that occurs depending on the organic molecules covering the surface, the size of the nanoparticles, and the like can be prevented.
  • the present invention is a method for detecting a specific biological substance, using as a color former a fluorescent substance-encapsulated nanoparticle in which a biological substance recognition molecule that specifically recognizes a specific biological substance is bound to the particle surface, As a blocking agent for preventing the phosphor-encapsulated nanoparticles from adsorbing nonspecifically to biological substances other than a specific biological substance, nanoparticles that do not encapsulate the phosphor are used.
  • ⁇ Method for detecting a specific biological substance Specifically, as a method for detecting a specific biological substance according to the present invention, conventionally known immunochromatography, immunoassay, Western blotting, Northern blotting, Southern blotting, DNA array (or DNA microarray or DNA Examples of such methods include hybridization using a chip), immunohistochemistry, and immunocytochemistry. Of these, the method of fluorescent staining of tissue sections is preferred, and the immunohistochemical method is particularly preferred.
  • Examples of the phosphor used in the present invention include fluorescent substances including fluorescent organic dyes and semiconductor nanoparticles.
  • a phosphor that emits visible to near infrared light in the wavelength range of 400 to 900 nm when excited by ultraviolet to near infrared light in the wavelength range of 200 to 700 nm is preferred.
  • Organic fluorescent dyes include fluorescein dye molecules, rhodamine dye molecules, Alexa Fluor (Invitrogen) dye molecules, BODIPY (Invitrogen) dye molecules, cascade dye molecules, coumarin dye molecules, and eosin dyes. Examples include molecules, NBD dye molecules, pyrene dye molecules, Texas Red dye molecules, and cyanine dye molecules.
  • the semiconductor nanoparticles used in the present invention are those having a core / shell structure and having a nano-size (1 to 1,000 nm) particle size containing a material (material) for forming a semiconductor described later. And particles having a multiple structure composed of a core part (core part) and a shell part (covering part) covering the core part.
  • Semiconductor nanoparticles containing II-VI group compounds, III-V group compounds, or IV group elements as components (“II-VI group semiconductor nanoparticles", "III-V group semiconductor nanoparticles", “Group IV semiconductor nanoparticles", respectively) Or any one of them may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the material for forming the core include silicon [Si], germanium [Ge], indium nitride [InN], indium phosphide [InP], and gallium arsenide [GaAs. ], Aluminum selenide [AlSe], cadmium selenide [CdSe], aluminum arsenide [AlAs], gallium phosphide [GaP], zinc telluride [ZnTe], cadmium telluride [CdTe], indium arsenide [InAs] , Semiconductors such as indium-gallium-phosphorus [InGaP], or raw materials for forming them can be used. InP, CdTe or CdSe is particularly preferably used.
  • II-VI group, III-V group, and IV group inorganic semiconductors can be used as a material for forming the shell portion.
  • a semiconductor having a band gap larger than that of each core portion forming inorganic material such as Si, Ge, InN, InP, GaAs, AlSe, CdSe, AlAs, GaP, ZnTe, CdTe, InAs, etc., or a non-toxic semiconductor is formed.
  • Raw materials are preferred.
  • ZnS is applied as a shell part to the core part of InP, CdTe or CdSe.
  • CdSe / ZnS examples include CdSe / ZnS, CdS / ZnS, InP / ZnS, InGaP / ZnS, Si / SiO 2 , Si / ZnS, Ge / GeO 2 , and Ge / ZnS. It is not limited to these.
  • semiconductor nanoparticles those subjected to surface treatment with an organic polymer or the like may be used as necessary.
  • semiconductor nanoparticles include CdSe / ZnS having a surface carboxy group (manufactured by Invitrogen) and CdSe / ZnS having a surface amino group (manufactured by Invitrogen).
  • the phosphor-encapsulated nanoparticles used in the present invention are those in which the phosphor is dispersed inside the nanoparticles, and the material constituting the nanoparticles (sometimes referred to as “matrix” in the present invention) and the phosphor. And may be chemically bonded or not.
  • a nanoparticle that does not include a phosphor used as a blocking agent in the present invention refers to a nanoparticle that does not contain a phosphor inside the nanoparticle, typically a nanoparticle consisting only of the host material as described above.
  • the material constituting the nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include silica, melamine, polystyrene, polylactic acid, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • a nanoparticle when the base is made of silica may be simply referred to as “silica nanoparticle”.
  • the site where non-specific adsorption may occur due to the composition of the matrix it is preferable that the base of the nanoparticles not including the phosphor is the same in composition (synthesized using the same raw material), but if equivalent blocking ability or higher blocking ability is obtained, The parent composition need not be the same. Moreover, there is no problem even if a plurality of different compositions are used, and it may be used in combination with a conventionally used blocking agent such as BSA.
  • the phosphor-encapsulated nanoparticles used in the present invention can be prepared by a known method.
  • Silica nanoparticles encapsulating an organic fluorescent dye can be prepared with reference to the synthesis of FITC-encapsulated silica nanoparticles described in Langmuir, Vol. 8, page 2921 (1992), for example.
  • FITC-encapsulated silica nanoparticles described in Langmuir, Vol. 8, page 2921 (1992), for example.
  • Silica nanoparticles encapsulating semiconductor nanoparticles can be prepared with reference to the synthesis of CdTe-encapsulated silica nanoparticles described in New Journal of Chemistry, 33, 561 (2009).
  • Melamine nanoparticles encapsulating organic fluorescent dyes can be prepared, for example, with reference to the synthesis of melamine nanoparticles using a fluorescent whitening agent described in Japanese Patent Publication No. Sho 62-68811 (1987). .
  • a desired organic fluorescent dye instead of the optical brightener, various organic fluorescent dye-encapsulated melamine nanoparticles can be synthesized.
  • Polystyrene nanoparticles encapsulating an organic fluorescent dye are, for example, a copolymerization method using an organic dye having a polymerizable functional group described in U.S. Pat.No. 4,320,008 (1982), or U.S. Pat.
  • an impregnation method of an organic fluorescent dye into polystyrene nanoparticles described in (1) are, for example, a copolymerization method using an organic dye having a polymerizable functional group described in U.S. Pat.No. 4,320,008 (1982), or U.S. Pat.
  • an impregnation method of an organic fluorescent dye into polystyrene nanoparticles described in (1) are, for example, a copolymerization method using an organic dye having a polymerizable functional group described in U.S. Pat.No. 4,320,008 (1982), or U.S. Pat.
  • an impregnation method of an organic fluorescent dye into polystyrene nanoparticles described in (1) are,
  • Polymer nanoparticles encapsulating semiconductor nanoparticles should be prepared with reference to the method of impregnating semiconductor nanoparticles into polystyrene nanoparticles described in Nature Biotechnology, Vol. 19, p. 631 (2001), for example. Can do.
  • organic molecules that are difficult to adsorb on biological materials are organic molecules that do not have the ability to specifically bind to any biological material and do not bind nonspecifically or are difficult to adsorb (preferably organic polymers)
  • organic polymers for example, polyethylene glycol [PEG], polymethyl methacrylate (PMMA), polyvinyl alcohol (PVA) and the like.
  • the phosphor-encapsulated nanoparticles It is preferable that the organic molecules that coat the nanoparticles and the organic molecules that coat the nanoparticles that do not encapsulate the phosphor are the same (the same material is used for the coating treatment), but equivalent blocking ability or higher blocking ability.
  • the organic molecules need not be the same.
  • the fluorescent substance-encapsulated nanoparticles may have a biological substance recognition molecule (for example, an antibody) bound to a part of such an organic molecule (for example, PEG) that modifies the particle surface.
  • the “organic molecule to which a biological substance recognition molecule is bound” is distinguished from the “organic molecule that is difficult to adsorb on the biological substance” in the above description.
  • the average particle diameter of the nanoparticles used in the phosphor-encapsulated nanoparticles and the nanoparticles not encapsulating the phosphor is not particularly limited, but is about 30 to 800 nm.
  • the coefficient of variation indicating the variation in particle size is not particularly limited, but is preferably about 20% or less.
  • the average particle diameter of the nanoparticles corresponds to the measured value obtained by taking an electron micrograph using a scanning electron microscope [SEM] and measuring the cross-sectional area of 1,000 nanoparticles.
  • the diameter when the area of the circle to be used was determined as the particle diameter, and the arithmetic average thereof was defined as the average particle diameter.
  • the coefficient of variation was also a value calculated from the particle size distribution of 1,000 particles.
  • the site that may cause non-specific adsorption depending on the size of the encapsulated nanoparticles and phosphor The difference in the average particle size of the nanoparticles used for the non-performed nanoparticles is preferably within 25%, more preferably within 5%. Note that the difference in average particle size is expressed as
  • the biological substance recognition molecule used in the present invention refers to a molecule that recognizes a specific target biological substance and specifically binds and / or reacts with the biological substance.
  • biological substances that can be a target in the present invention include nucleotide chains, proteins, lipids, sugar chains and the like derived from living bodies.
  • biological substance recognition molecules include molecules that specifically bind to and / or react with such biological substances, such as nucleotide chains (when the biological substance is a nucleotide chain having a complementary base sequence), antibodies ( And a lectin (when it is a sugar chain, etc.). More specifically, an anti-HER2 antibody that specifically binds to HER2, which is a protein present on the cell surface, an anti-ER antibody that specifically binds to an estrogen receptor [ER] present in the cell nucleus, and a cytoskeleton are formed. And anti-actin antibodies that specifically bind to actin. Of these, anti-HER2 antibody and anti-ER antibody are preferable from the viewpoint that they can be used for selection of breast cancer medication.
  • the mode of binding between the biological substance recognition molecule and the fluorescent substance-encapsulated nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include covalent bonding, ionic bonding, hydrogen bonding, coordination bonding, physical adsorption, and chemical adsorption.
  • a bond having a strong bonding force such as a covalent bond is preferable from the viewpoint of bond stability.
  • the spacer there may be an organic molecule that connects the biological substance recognition molecule and the fluorescent substance-encapsulated nanoparticle.
  • a polyethylene glycol chain can be used in order to suppress non-specific adsorption with a biological substance, and specific examples include commercially available products such as “SM (PEG) 12” manufactured by Thermo Scientific.
  • the polyethylene glycol [PEG] chain itself that is not bonded to the biological substance recognition molecule also has a function as the “organic molecule that is difficult to be adsorbed on the biological substance” as described above.
  • a silane coupling agent which is a compound widely used for bonding an inorganic substance and an organic substance can be used.
  • This silane coupling agent is a compound having an alkoxysilyl group that gives a silanol group by hydrolysis at one end of the molecule and a functional group such as a carboxyl group, an amino group, an epoxy group, an aldehyde group at the other end, Bonding with an inorganic substance through an oxygen atom of the silanol group.
  • silane coupling agent having a polyethylene glycol chain for example, “PEG-silaneano.SIM6492.7” manufactured by Gelest
  • silane coupling agent it may be used individually by 1 type, or may use 2 or more types together.
  • the reaction procedure between the phosphor-encapsulated silica nanoparticles and the silane coupling agent a known one can be used.
  • the obtained phosphor-encapsulated silica nanoparticles are dispersed in pure water, aminopropyltriethoxysilane is added and reacted at room temperature for 12 hours.
  • phosphor-encapsulated silica nanoparticles whose surface is modified with an aminopropyl group can be obtained by centrifugation or filtration.
  • the antibody by reacting an amino group with a carboxyl group in the antibody, the antibody can be bound to the fluorescent substance-encapsulated silica nanoparticles via an amide bond.
  • a condensing agent such as EDC [1-Ethyl-3- [3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride] (Pierce) may be used.
  • a linker compound having a site that can be directly bonded to the organic substance-modified phosphor-encapsulated silica nanoparticles and a site that can be bonded to the biological substance recognition molecule can be used.
  • sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4 [N-maleimidomethyl] -cyclohexane-1-carboxylate] (manufactured by Pierce) having both a site selectively reacting with an amino group and a site selectively reacting with a mercapto group
  • sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4 [N-maleimidomethyl] -cyclohexane-1-carboxylate] (manufactured by Pierce) having both a site selectively reacting with an amino group and a site selectively reacting with a mercapto group
  • sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4 [N-maleimidomethyl
  • the present invention is a detection method using a specific color former and a blocking agent in combination, and is suitable for a conventionally known method of fluorescently staining a tissue section.
  • the tissue section is composed of a biological material, but is not limited to a pathological tissue section, and can also be applied to cell staining.
  • a method for preparing a tissue section to which the detection method according to the present invention can be applied is not particularly limited, and a tissue section prepared by a known method can be used.
  • a tissue section prepared by a known method can be used.
  • the tissue section is immersed in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 to 30 minutes. If necessary, xylene may be exchanged during the immersion.
  • this section is immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 to 30 minutes. If necessary, ethanol may be exchanged during the immersion.
  • this section is immersed in a container filled with water to remove ethanol.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 to 30 minutes. If necessary, water may be exchanged during the immersion.
  • activation processing of a specific biological material is performed. There are no specific activation conditions, but the activation solution is 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer. A solution containing the above can be used.
  • the heating device an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The temperature can be 50 to 130 ° C. and the time can be 5 to 30 minutes.
  • the section after activation treatment is immersed in a container containing water and PBS and washed.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 to 30 minutes. If necessary, PBS may be replaced during the immersion.
  • a blocking agent is dropped before dyeing with phosphor-encapsulated nanoparticles.
  • the blocking agent nanoparticles having no fluorescent property, that is, nanoparticles not including a phosphor are used.
  • the matrix composition of the phosphor-containing nanoparticles and the nanoparticles having no fluorescence characteristics are the same. More preferably, the difference between the average particle diameters of the two is 25% or less, and particularly preferably, the surface of the nanoparticles having no fluorescence property is covered with polyethylene glycol.
  • the amount of the blocking agent used is not particularly limited, but generally 0.5 to 10 times the amount of the color former is suitable.
  • the blocking agent concerning this invention may be used individually by 1 type, and may be used together with well-known blocking agents, such as BSA and skim milk.
  • a PBS solution may contain a surfactant such as Tween20.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 to 30 minutes. If necessary, PBS may be replaced during the immersion.
  • the required fixing treatment step is a step of fixing the labeled probe biological material introduced in the staining step (3) to a tissue section.
  • Examples of the fixing treatment solution used in the present invention include cross-linking agents such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, and methanol, and cell membrane permeants.
  • the fixing process can be performed by a conventionally known method.
  • Fixed processing is Specifically, it can be performed by immersing the stained tissue section obtained by the histochemical staining step (3) in such a fixing treatment solution.
  • it can be carried out by immersing the stained tissue section obtained by the histochemical staining step (3) in a dilute paraformaldehyde aqueous solution for several minutes to several hours.
  • Observation process under a fluorescence microscope Using the fluorescence microscope, the expression level of a specific biological substance can be measured based on the number of bright spots or light emission luminance with respect to the slices thus obtained.
  • Those skilled in the art can appropriately select the excitation light source and the fluorescence detection optical filter corresponding to the absorption maximum wavelength and fluorescence wavelength of the phosphor used.
  • Measurement of the number of bright spots or emission luminance can be performed using image analysis software such as ImageJ, which is open analysis software, or G-Count, a total bright spot automatic measurement software manufactured by G. Angstrom.
  • image analysis software such as ImageJ, which is open analysis software, or G-Count, a total bright spot automatic measurement software manufactured by G. Angstrom.
  • S (PEG) 12 Thermo Scientific succinimidyl-[(N-maleomidopropionamid) -dodecaethyleneglycol manufactured by Thermo Scientific Co., Ltd.
  • Step (2-5) Centrifuge each reaction mixture in step (2-4) at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, remove the supernatant, add ethanol, disperse the sediment, and centrifuge again. went. In the same procedure, washing with ethanol and washing with pure water were performed once more.
  • Step (4-1) 40 mL of ethanol and 9.7 mL of 14% aqueous ammonia were mixed.
  • Step (4-2) Tetraethoxysilane 400 ⁇ L (1.796 mmol) was added to the stirring solution of the mixed solution of Step (4-1) at room temperature. Stirring was performed for 7 hours from the start of addition.
  • Step (4-3) The reaction mixture of step (4-2) was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. In the same procedure, washing with ethanol and washing with pure water were performed once more.
  • the average particle diameter was 69 nm and the variation coefficient was 17%.
  • the amount of 14% aqueous ammonia was changed from 9.7 mL to 10 mL, 11.5 mL, and 13 mL, respectively, as in steps (4-1) to (4-3).
  • the average particle diameter (coefficient of variation) of the obtained silica nanoparticles was 79 nm (10%), 88 nm (12.6%), and 99 nm (11.3%), respectively.
  • Step (5-2) The reaction mixture of step (5-1) was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, and the supernatant was removed.
  • micromer registered trademark
  • ethanol 2: 8.
  • Step (6-4) The phosphor-encapsulated polystyrene nanoparticles in Step (6-3) were adjusted to 3 nM using PBS containing 2 mM EDTA.
  • Step (6-6) The reaction mixture of step (6-5) was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, and the supernatant was removed.
  • Step (6-8) When 100 ⁇ g of anti-HER2 antibody was dissolved in 100 ⁇ L of PBS, 1 M dithiothreitol [DTT] was added and reacted for 30 minutes.
  • Step (6-9) Excess DTT was removed from the reaction mixture of step (6-8) with a gel filtration column to obtain a reduced anti-HER2 antibody solution.
  • Step (6-10) The particle dispersion of step (6-7) and the reduced anti-HER2 antibody solution of step (6-9) were mixed in PBS and allowed to react for 1 hour.
  • Step (6-11) 4 ⁇ L of 10 mM mercaptoethanol was added to the reaction solution of step (6-10) to stop the reaction.
  • Step (7-2) The mixture of step (7-1) was heated to 70 ° C. with stirring and reacted for 30 minutes to obtain an initial condensate.
  • Step (7-4) 1 g of the initial condensate of step (7-2) was added to the solution of step (7-3), 0.93 mL of dodecylbenzenesulfonic acid was added, and the mixture was stirred for 6 hours.
  • Step (7-5) The reaction mixture of step (7-4) was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added thereto to disperse the sediment and centrifuged again. In the same procedure, washing with ethanol and washing with pure water were performed once more. The phosphor-encapsulated melamine nanoparticles thus obtained were observed by SEM. The average particle size was 97 nm and the coefficient of variation was 10%.
  • the anti-HER2 antibody was obtained in the same manner as in the steps (6-4) to (6-12) except that the phosphor-encapsulated melamine nanoparticles were used instead of the phosphor-encapsulated polystyrene nanoparticles.
  • Step (8-2) 40 mL of ethanol was mixed with 13.8 mL of 14% aqueous ammonia.
  • Step (8-3) While the mixed solution of Step (8-2) was stirred at room temperature, the mixed solution of Step (8-1) was added. Stirring was performed for 12 hours from the start of addition.
  • Step (8-4) The reaction mixture of step (8-3) was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added thereto to disperse the sediment and centrifuged again. In the same procedure, washing with ethanol and washing with pure water were performed once more. The phosphor-encapsulated silica nanoparticles thus obtained were observed with an SEM. The average particle size was 99 nm and the coefficient of variation was 12%.
  • Step (8-5) Step (5-1) except that the phosphor-encapsulated silica nanoparticles in Step (8-4) were used in place of the silica nanoparticles not encapsulating the phosphor in Step (5-1).
  • phosphor-encapsulated silica nanoparticles modified with amino groups were produced.
  • Step (8-6) Covered with PEG in the same manner as in Production Example 1 except that the amino group-modified phosphor-encapsulated silica nanoparticles produced as described above were used instead of polystyrene nanoparticles in Production Example 1. Phosphor-encapsulated silica nanoparticles were produced.
  • Step (8-7) The particle dispersion of Step (8-6) and the reduced anti-HER2 antibody solution of Step (6-9) were mixed in PBS and allowed to react for 1 hour.
  • Step (8-8) 4 ⁇ L of 10 mM mercaptoethanol was added to the reaction solution of step (8-7) to stop the reaction.
  • Step (8-9) The reaction mixture of step (8-8) is centrifuged at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, the supernatant is removed, PBS containing 2 mM EDTA is added, the precipitate is dispersed, and again Centrifugation was performed. Washing by the same procedure was performed three times. Finally, redispersion using 500 ⁇ L of PBS to disperse particles of phosphor nanoparticles (average particle size: 135 nm) (ie, color former ⁇ C>) encapsulated with anti-HER2 antibody and coated with PEG. A liquid was obtained.
  • Step (9-2) 4 mL of ethanol and 2.5 mL of 14% aqueous ammonia were mixed.
  • Step (9-4) The reaction mixture was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added thereto to disperse the sediment, and centrifugation was performed again. In the same procedure, washing with ethanol and washing with pure water were performed once more. When the obtained phosphor-encapsulated silica nanoparticles were observed with an SEM, the average particle size was 130 nm and the coefficient of variation was 13%.
  • step (8-5) in place of the phosphor-encapsulated silica nanoparticles in the step (8-4), except that the phosphor-encapsulated silica nanoparticles in the step (9-4) were used, the process (8-5)
  • particle dispersion of phosphor nanoparticles average particle size: 101 nm
  • color former ⁇ D> encapsulated with anti-HER2 antibody and coated with PEG (CdSe / ZnS)
  • a liquid was produced.
  • Step (C-1) The section was immersed in a container containing xylene for 30 minutes. On the way, xylene was changed three times.
  • Step (C-3) This section was immersed in a container containing water for 30 minutes. The water was changed three times along the way.
  • Step (C-5) Autoclaving was performed at 121 ° C. for 10 minutes.
  • Step (C-7) PBS containing 1% BSA as a blocking agent was placed on the tissue and left for 1 hour.
  • Step (C-9) Each section after staining was immersed in a container containing PBS for 30 minutes.
  • Example 1 Polystyrene nanoparticles (average particle size: 70 nm) as a blocking agent
  • the section was obtained in the same manner as in the comparative example, except that a PBS dispersion containing polystyrene nanoparticles (“3070A” manufactured by Thermo Fisher Scientific; average particle size: 70 nm) was used. The tissue was stained and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 2 Polystyrene nanoparticles (average particle size: 80 nm) as a blocking agent
  • the section was obtained in the same manner as in the comparative example, except that a PBS dispersion containing polystyrene nanoparticles (“3080A” manufactured by Thermo Fisher Scientific; average particle size: 80 nm) was used. The tissue was stained and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 3 Polystyrene nanoparticles (average particle size: 90 nm) as a blocking agent
  • the section was obtained in the same manner as in the comparative example, except that a PBS dispersion containing polystyrene nanoparticles (“3090A” manufactured by Thermo Fisher Scientific; average particle size: 90 nm) was used. The tissue was stained and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 4 Polystyrene nanoparticles (average particle size: 100 nm) as a blocking agent
  • a PBS dispersion containing polystyrene nanoparticles (“micromer (registered trademark) 01-01-102” manufactured by Micromod; average particle size: 100 nm) was used.
  • the sections were immunohistologically stained and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 5 PEG-coated polystyrene nanoparticles (average particle size: 100 nm) as a blocking agent
  • the PEG-coated polystyrene nanoparticle-containing PBS dispersion obtained in Production Example 1 was used. Except for use, the sections were immunohistologically stained in the same manner as in the comparative example, and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 6 Melamine nanoparticles as a blocking agent (average particle size: 72 nm)
  • the section of the immune tissue was obtained in the same manner as in the comparative example, except that the melamine nanoparticle (average particle size: 72 nm) -containing PBS dispersion obtained in Production Example 2 was used. Stained and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 7 Melamine nanoparticles as a blocking agent (average particle size: 83 nm)
  • the slice was obtained from the immune tissue in the same manner as in the comparative example, except that the melamine nanoparticle (average particle size: 83 nm) -containing PBS dispersion obtained in Production Example 2 was used. Stained and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 8 Melamine nanoparticles as a blocking agent (average particle size: 91 nm)
  • the slice was obtained from the immune tissue in the same manner as in the comparative example, except that the melamine nanoparticle (average particle size: 91 nm) -containing PBS dispersion obtained in Production Example 2 was used. Stained and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 9 Melamine nanoparticles as a blocking agent (average particle size: 98 nm)
  • the immune tissue was obtained in the same manner as in the comparative example except that the melamine nanoparticle (average particle size: 98 nm) -containing PBS dispersion obtained in Production Example 2 was used. Stained and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 10 PEG-coated melamine nanoparticles (average particle size: 98 nm) as a blocking agent
  • the section was immunohistologically stained in the same manner as in the comparative example except that the PEG-coated melamine nanoparticle-containing PBS dispersion obtained in Production Example 3 was used instead of 1% BSA-containing PBS. Observed below.
  • Example 11 Silica nanoparticles as a blocking agent (average particle size: 69 nm)
  • the sections were stained with immunohistochemistry in the same manner as in the comparative example, except that the silica nanoparticle (average particle size: 69 nm) -containing PBS dispersion obtained in Production Example 4 was used. And observed under a fluorescence microscope.
  • Example 12 Silica nanoparticles as a blocking agent (average particle size: 79 nm)
  • the sections were immunohistologically stained in the same manner as in the comparative example except that the silica nanoparticle (average particle diameter: 79 nm) -containing PBS dispersion obtained in Production Example 4 was used. And observed under a fluorescence microscope.
  • Example 13 Silica nanoparticles (average particle size: 88 nm) as a blocking agent
  • the section was stained with immunohistochemistry in the same manner as in the comparative example, except that the silica nanoparticle (average particle size: 88 nm) -containing PBS dispersion obtained in Production Example 4 was used. And observed under a fluorescence microscope.
  • Example 14 Silica nanoparticles as a blocking agent (average particle size: 99 nm)
  • the section was stained with immunohistochemistry in the same manner as in the comparative example except that the silica nanoparticle (average particle size: 99 nm) -containing PBS dispersion obtained in Production Example 4 was used. And observed under a fluorescence microscope.
  • Example 15 PEG-coated silica nanoparticles (average particle size: 99 nm) as a blocking agent
  • the section was immunized in the same manner as in the comparative example, except that the PBS dispersion containing PEG-coated silica nanoparticles (average particle size: 99 nm) obtained in Production Example 5 was used instead of PBS containing 1% BSA. The tissue was stained and observed under a fluorescence microscope.

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Abstract

　本発明は、高輝度の蛍光標識材料を用いてもバックグラウンドノイズが高くならず、Ｓ／Ｎ比が向上した定量性の高い免疫組織染色方法に好適な検出方法を提供することを目的とする。本発明は、特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用することにより、Ｓ／Ｎ比が向上した定量性の高い免疫組織染色方法に好適な検出方法を提供する。

Description

生体物質の検出方法
　本発明は、生体物質の検出方法に関する。さらに詳細には、本発明は、蛍光体内包ナノ粒子と蛍光体を内包しないナノ粒子とを併用する生体物質の検出方法に関する。
　がんは、心筋梗塞や脳梗塞に代表される血管系疾患とともに、成人の死亡原因を二分する疾患である。例えば、乳がん罹患率は、日本人では欧米諸国に比べて低いが、近年では増加傾向にあり、1998年には胃がんの罹患率を抜いて女性罹患率の第1位となった。最近の報告である2005年の厚生労働省統計によれば、乳がんの年間罹患数は5万人を超えている。世界でも同様にその数は年々増加しており、2008年のＷＨＯの報告によれば、乳がんは男女合わせても第1位の罹患率となっており、その年間罹患数は138万人を超え、女性のがん全体の約23％を占めている。
　がんの診断にはＸ線ＣＴやＭＲＩ等の画像診断のほか、特定のがんに特異的に発現するがんマーカーや、血液、組織中に漏出するがんマーカー等を検出する方法も汎用されている。乳がんの一般的なスクリーニング検査としては、問診、触診、軟Ｘ線乳房撮影（マンモグラフィー）、超音波検査等が実施され臨床的に疑いが生じると、細胞診や生検が実施され病理学的診断によりがんであるかどうか判別される。がん治療や予後の経過を判定するために、病理学診断は重要であり、この診断の中心となるのは「形態観察を行うためのＨＥ〔ヘマトキシリン・エオジン〕染色法」と「がんマーカー因子に対する抗体を用いた免疫組織化学法」である。特に近年の抗体医薬の登場により、免疫組織化学の重要性は著しく高まっている。例えば、がんの増殖に関与する因子であるヒト上皮成長因子受容体2〔human epidermal growth factor receptor-2；ＨＥＲ2〕を標的とした抗体医薬であるハーセプチン〔Herceptin；登録商標〕として市販されているトラスツズマブ〔Trastuzumab〕は、乳がんの代表的な抗がん剤であることが知られている。この薬剤投与の有効性の判定方法として、ＨＥＲ2タンパク質等の発現を解析する免疫組織化学〔Immunohistochemistry；ＩＨＣ〕法と、ＨＥＲ2遺伝子等の増幅を解析するＦＩＳＨ〔Fluorescence in situ hybridization〕法とが臨床の場で広く用いられている。ＩＨＣ法により、ＨＥＲ2抗原部位に結合したＨＥＲ2抗体をＤＡＢ〔Diaminobenzidine；ジアミノベンジジン〕を用いて染色し、可視化することでＨＥＲ2の発現量を検出することができる。しかし、その判定基準は染色レベルをスコア0～3とした四段階のみによる大雑把な判定基準であるため、定量性に欠けており、さらに病理医の熟練度により判定基準が左右されることから、臨床的に問題となっている。他方、ＦＩＳＨ法は、ＨＥＲ2遺伝子を検出するプローブと、17番染色体セントロメアを検出するプローブを用いて行われ、このＦＩＳＨ法により解析された17番染色体1本あたりのＨＥＲ2の遺伝子コピー数を基に、ＨＥＲ2遺伝子の増幅の有無を判定することができる。ＦＩＳＨ法は定量的検査法ではあるが、ＨＥＲ2タンパク質量やＨＥＲ2の細胞内局在を直接評価する方法ではない。かかる事情から、高精度な抗体を成分として含む医薬品の有効性を判定する方法の開発が必要とされている。
　このような状況から蛍光色素や半導体ナノ粒子等の蛍光体を抗体に結合し標的分子の有無を判断する方法も為されてきた。蛍光染色はＤＡＢ染色と比べて定量性に優れるという特徴がある（非特許文献1）。しかしながら、一般的な蛍光色素や半導体ナノ粒子は蛍光量が少ないため、自家蛍光をきちんと分離除去しないと、蛍光による標的分子の判断ができず、形態情報は依然として、別切片でのＨＥ染色が必要であった。
　このような理由から、蛍光色素や半導体ナノ粒子を包含させて一標識体当たりの蛍光量を多くする方法が考えられた。例えば、特許文献1には、逆ミセル法と、ガラスの前駆体として分子の末端に半導体ナノ粒子への吸着性が良い有機官能基を有する有機アルコキシシランとアルコキシドの混合物を用いたゾル－ゲル法とを組み合わせることにより、半導体ナノ粒子を内部に分散固定したガラス蛍光体ナノ粒子が開示されている。しかしながら、このような手段では蛍光量が多くなり、標的分子の判断が可能になるものの、わずかな非特異的な結合があってもバックグラウンドノイズが高くなる原因となるため、高感度に定量検出する為の大きな課題となっていた。
特開2005-281019号公報
「病理と臨床　Vol.25　2007年臨時増刊号　診断に役立つ免疫組織化学」,2007年3月12日発行,文光堂
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、高輝度の蛍光標識材料を用いてもバックグラウンドノイズが高くならず、Ｓ／Ｎ比が向上した定量性の高い免疫組織染色法に好適な検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、発色剤として蛍光体内包ナノ粒子を使用する免疫組織染色法において、通常ブロッキング剤として使用するウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕より、蛍光体を内包しないナノ粒子の方が、ブロッキング能が有意に優れることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、上述した目的の少なくとも１つを実現するために、本発明の一側面を反映した検出方法は、
　特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用することを含む。
　本発明によれば、特定の生体物質の検出において、高輝度の蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子をブロッキング剤として使用することによって、Ｓ/Ｎ比の向上した組織染色画像が観察でき、病理医の診断精度の向上を図ることができる。
　なお、本発明において蛍光体を内包しないナノ粒子がブロッキング剤として好ましく機能することの理由としては、例えば、従来のＢＳＡ等のタンパク質のブロッキング剤が抗原抗体反応に関する非特異的吸着を防止するためのものである（従って蛍光体内包ナノ粒子に結合された抗体等の非特異的吸着は防止できる）のに対し、本発明では上記のブロッキング剤によって、ナノ粒子を構成する母体の組成、ナノ粒子の表面を被覆する有機分子、ナノ粒子のサイズ等に依存して起きる非特異的吸着を防止することができるためであると考えられる。
　以下、本発明に係る特定の生体物質を検出する方法について詳細に説明する。
　本発明は、特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用する。
　　　　　　　　　　　＜特定の生体物質を検出する方法＞
　本発明に係る特定の生体物質を検出する方法として、具体的には、従来公知であるイムノクロマト法、イムノアッセイ、ウエスタンブロティング法、ノーザンブロティング法、サザンブロッティング法、ＤＮＡアレイ（またはＤＮＡマイクロアレイもしくはＤＮＡチップ）を使用するハイブリダイゼーション法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法などを例示できる。これらのうち、組織切片を蛍光染色する方法が好ましく、特に免疫組織化学法が好ましい。
　　　　　　　　　　　　　　　　＜蛍光体＞
　本発明で用いられる蛍光体としては、蛍光有機色素および半導体ナノ粒子を包含する蛍光物質を挙げることができる。200～700ｎｍの波長範囲である紫外～近赤外光により励起されたときに、400～900ｎｍの波長範囲である可視～近赤外光の発光を示す蛍光体が好ましい。
　（有機蛍光色素）
　有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
　具体的には、5-カルボキシ-フルオレセイン、6-カルボキシ-フルオレセイン、5,6-ジカルボキシ-フルオレセイン、6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン、6-カルボキシ-2',4,7,7'-テトラクロロフルオレセイン、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、5-カルボキシ-ローダミン、6-カルボキシ-ローダミン、5,6-ジカルボキシ-ローダミン、ローダミン6Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ-ローダミン、および、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 350、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 405、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 430、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 488、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 500、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 514、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 532、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 546、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 555、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 568、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 594、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 610、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 633、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 635、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 647、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 660、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 680、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 700、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 750、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ 493/503、ＢＯＤＩＰＹ 530/550、ＢＯＤＩＰＹ 558/568、ＢＯＤＩＰＹ 564/570、ＢＯＤＩＰＹ 576/589、ＢＯＤＩＰＹ 581/591、ＢＯＤＩＰＹ 630/650、ＢＯＤＩＰＹ 650/665（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ5、Ｃｙ5.5、Ｃｙ7等を挙げることができる。一種単独でも二種以上を併用してもよい。
　（半導体ナノ粒子）
　本発明に用いる半導体ナノ粒子とは、コア/シェル構造を有するものであり、後述する半導体を形成する材料（素材）を含有するナノサイズ（1～1,000ｎｍ）の粒径を有する粒子であって、コア部（芯部）とそれを被覆するシェル部（被覆部）で構成される多重構造を有する粒子をいう。II－VI族化合物，III－Ｖ族化合物またはIV族元素を成分として含有する半導体ナノ粒子（それぞれ「II－VI族半導体ナノ粒子」「III－Ｖ族半導体ナノ粒子」「IV族半導体ナノ粒子」ともいう。）のいずれかを用いることができ、一種単独でも二種以上併用してもよい。
　コア部（「コア粒子」ともいう。）を形成するための素材としては、例えば、ケイ素〔Ｓｉ〕，ゲルマニウム〔Ｇｅ〕，窒化インジウム〔ＩｎＮ〕，リン化インジウム〔ＩｎＰ〕，ヒ素化ガリウム〔ＧａＡｓ〕，セレン化アルミニウム〔ＡｌＳｅ〕，セレン化カドミウム〔ＣｄＳｅ〕，ヒ素化アルミニウム〔ＡｌＡｓ〕，リン化ガリウム〔ＧａＰ〕，テルル化亜鉛〔ＺｎＴｅ〕，テルル化カドミウム〔ＣｄＴｅ〕，ヒ素化インジウム〔ＩｎＡｓ〕，インジウム－ガリウム－リン〔ＩｎＧａＰ〕などの半導体またはこれらを形成する原料を用いることができる。本発明においては、特に、ＩｎＰ，ＣｄＴｅまたはＣｄＳｅがより好ましく用いられる。
　シェル部を形成するための素材としては、II－VI族，III－Ｖ族，IV族の無機半導体を用いることができる。例えば、Ｓｉ，Ｇｅ，ＩｎＮ，ＩｎＰ，ＧａＡｓ，ＡｌＳｅ，ＣｄＳｅ，ＡｌＡｓ，ＧａＰ，ＺｎＴｅ，ＣｄＴｅ，ＩｎＡｓなどの各コア部形成無機材料よりバンドギャップが大きく、毒性を有さない半導体またはこれらを形成する原料が好ましい。より好ましくは、ＩｎＰ，ＣｄＴｅまたはＣｄＳｅのコア部に対してＺｎＳをシェル部として適用される。
　以下、本明細書において、半導体ナノ粒子の表記法として、例えば、コア部がＣｄＳｅであり、シェル部がＺｎＳである場合、「ＣｄＳｅ/ＺｎＳ」と表記することがある。
　半導体ナノ粒子としては、例えば、ＣｄＳｅ/ＺｎＳ，ＣｄＳ/ＺｎＳ，ＩｎＰ/ＺｎＳ，ＩｎＧａＰ/ＺｎＳ，Ｓｉ／ＳｉＯ2，Ｓｉ/ＺｎＳ，Ｇｅ／ＧｅＯ2，Ｇｅ/ＺｎＳなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
　半導体ナノ粒子は、必要に応じて、有機ポリマーなどにより表面処理が施されているものを用いてもよい。このような半導体ナノ粒子としては、例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ/ＺｎＳ（インビトロジェン社製）や表面アミノ基を有するＣｄＳｅ/ＺｎＳ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。
　　　　　　＜蛍光体内包ナノ粒子・蛍光体を内包しないナノ粒子＞
　本発明で用いる蛍光体内包ナノ粒子とは、蛍光体がナノ粒子の内部に分散されたものを言い、ナノ粒子を構成する材料（本発明において「母体」と称することがある。）と蛍光体とは、化学的に結合していても、していなくてもよい。一方、本発明でブロッキング剤として用いる蛍光体を内包しないナノ粒子とは、蛍光体をナノ粒子の内部に含まないナノ粒子、典型的には上記のような母体のみからなるナノ粒子を言う。
　ナノ粒子を構成する材料は特に限定されるものではなく、例えば、シリカ、メラミン、ポリスチレン、ポリ乳酸などが挙げられ、一種単独で用いても二種以上を併用してもよい。なお、本明細書において、例えば、母体がシリカからなる場合のナノ粒子を、単に「シリカナノ粒子」と称することがある。
　蛍光体内包ナノ粒子がその母体の組成によって非特異吸着を起こす可能性のある部位を、蛍光体を内包しないナノ粒子を用いてブロッキングするという作用効果を考慮すると、蛍光体内包ナノ粒子の母体と、蛍光体を内包しないナノ粒子の母体とは、組成が同じである（同じ原料を用いて合成される）ことが好ましいが、同等のブロッキング能、あるいはより高いブロッキング能が得られる場合は、それらの母体の組成は同じである必要はない。また、異なる複数の組成を用いても何ら問題はなく、さらにはＢＳＡなどの従来使用されているブロッキング剤と併用しても構わない。
　本発明で用いる蛍光体内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することができる。有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子は、例えば、ラングミュア,8巻,2921頁(1992年)に記載されているＦＩＴＣ内包シリカナノ粒子の合成を参考にして作製することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の有機蛍光色素を用いることによって、種々の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を合成できる。
　半導体ナノ粒子を内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー,33巻,561頁(2009年)に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考にして作製することができる。
　有機蛍光色素を内包したメラミンナノ粒子は、例えば、公開特許公報昭62-68811(1987年)に記載されている蛍光増白剤を用いたメラミンナノ粒子の合成を参考にして作製することができる。蛍光増白剤の代わりに所望の有機蛍光色素を用いることによって、種々の有機蛍光色素内包メラミンナノ粒子を合成することができる。
　有機蛍光色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、例えば、米国特許第4326008号(1982年)に記載されている重合性官能基を有する有機色素を用いた共重合法や、米国特許第5326692号(1992年)に記載されているポリスチレンナノ粒子への有機蛍光色素の含浸法などを用いて作製することができる。
　また、半導体ナノ粒子を内包したポリマーナノ粒子は、例えば、ネイチャー バイオテクノロジー,19巻,631頁(2001年)に記載のポリスチレンナノ粒子への半導体ナノ粒子の含浸法などを参考にして作製することができる。
　このような含浸法において、溶剤中でポリスチレンナノ粒子を膨潤させて蛍光体を含浸させた後、水中で収縮させることを行うため、ポリスチレンナノ粒子内に一旦取り込まれた蛍光体は、他の水中（水溶液中）に分散させても、蛍光体はポリスチレンナノ粒子外に拡散することはほとんどない。
　一方、蛍光体を内包しないナノ粒子の製造方法としては、例えば、上述した蛍光体内包ナノ粒子の製造方法において、蛍光体を使用しない（添加しない）以外は、蛍光体内包ナノ粒子の製造方法と同様の製造方法などが挙げられる。
　蛍光体内包ナノ粒子と蛍光体を内包しないナノ粒子とで用いるナノ粒子において、それら粒子表面の少なくとも一部、望ましくは全部が、生体物質に吸着しづらい同じ有機分子で被覆されていることが好ましい。生体物質に吸着しづらい有機分子とは、少なくともそれ自身が何らかの生体物質に特異的に結合する能力を有さず、非特異的にも結合しないか、吸着しづらい有機分子（好ましくは有機高分子）を言い、例えば、ポリエチレングリコール〔ＰＥＧ〕、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などが挙げられる。
　蛍光体内包ナノ粒子がその表面を被覆する有機分子によって非特異吸着を起こす可能性がある部位を、蛍光体を内包しないナノ粒子を用いてブロッキングするという作用効果を考慮すると、蛍光体内包ナノ粒子を被覆する有機分子と蛍光体を内包しないナノ粒子を被覆する有機分子とは、同じである（同じ物質を用いて被覆処理をする）ことが好ましいが、同等のブロッキング能、あるいはより高いブロッキング能が得られる場合は、それらの有機分子は同じである必要はない。なお、後述するように、蛍光体内包ナノ粒子は粒子表面を修飾するこのような有機分子（例えばＰＥＧ）の一部に生体物質認識分子（例えば抗体）を結合させている場合もあるが、「生体物質認識分子が結合した有機分子」は、上記の記載における「生体物質に吸着しづらい有機分子」とは区別される存在である。
　蛍光体内包ナノ粒子と蛍光体を内包しないナノ粒子とで用いるナノ粒子において、その平均粒径は特に限定されないが、約30～800ｎｍ程度である。また、粒径のばらつきを示す変動係数は特に限定されないが、20％程度以下が好ましい。
　なお、本発明において、ナノ粒子の平均粒径とは、走査型電子顕微鏡〔ＳＥＭ〕を使用して電子顕微鏡写真を撮影し、1,000個のナノ粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求め、その算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1,000個の粒子の粒径分布から算出される値とした。
　蛍光体内包ナノ粒子がそのサイズによって非特異吸着を起こす可能性がある部位を、蛍光体を内包しないナノ粒子を用いてブロッキングするという作用効果を考慮すると、蛍光体内包ナノ粒子と蛍光体を内包しないナノ粒子とで用いるナノ粒子それぞれの平均粒径の差は、好ましくは25％以内、より好ましくは5％以内である。なお、当該平均粒径の差は、蛍光体内包ナノ粒子の平均粒径をＸ（ｎｍ）とし、蛍光体を内包しないナノ粒子の平均粒径をＹ（ｎｍ）とするとき、｜(Ｘ－Ｙ)／Ｘ｜×100（％）の式から算出することができる。
　　　　　　　＜生体物質認識分子・蛍光体内包ナノ粒子との結合＞
　本発明で用いる生体物質認識分子とは、標的とする特定の生体物質を認識し、該生体物質に特異的に結合および/または反応する分子を言う。
　本発明において標的となりうる生体物質としては、例えば、生体由来のヌクレオチド鎖、タンパク質、脂質、糖鎖などが挙げられる。従って、生体物質認識分子としては、それらの生体物質と特異的に結合および/または反応する分子、例えば、ヌクレオチド鎖（生体物質が相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖等である場合）、抗体（生体物質が抗原となるタンパク質等である場合）、レクチン（同じく糖鎖等である場合）、等が挙げられる。より具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ2に特異的に結合する抗ＨＥＲ2抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体〔ＥＲ〕に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体などが挙げられる。なかでも抗ＨＥＲ2抗体および抗ＥＲ抗体は乳がんの投薬選定に用いることができるという観点から好ましい。
　生体物質認識分子と蛍光体内包ナノ粒子との結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着などが挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
　また、スペーサーとして、生体物質認識分子と蛍光体内包ナノ粒子との間を連結する有機分子があってもよい。例えば生体物質との非特異的な吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖を用いることができ、具体的には、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の「ＳＭ(ＰＥＧ)12」などの市販品が例示できる。なお、生体物質認識分子と結合していないポリエチレングリコール〔ＰＥＧ〕鎖それ自身は、上述したような「生体物質に吸着しづらい有機分子」としての機能も有する。
　蛍光体内包シリカナノ粒子に生体物質認識分子を結合させる際、蛍光体として有機蛍光色素を使用する場合であっても、半導体ナノ粒子を使用する場合であっても、同様の方法を適用することができる。例えば、無機物と有機物とを結合させるために広く用いられる化合物であるシランカップリング剤を使用することができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖を有するシランカップリング剤（例えばＧｅｌｅｓｔ社製「ＰＥＧ-ｓｉｌａｎｅ ｎｏ.ＳＩＭ6492.7」）などが挙げられる。シランカップリング剤として、一種単独で用いても二種以上を併用してもよい。
　蛍光体内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知のものを用いることができる。具体例として、得られた蛍光体内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で12時間反応させる。反応終了後、遠心分離またはろ過により、表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光体内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光体内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ〔1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride〕（Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
　必要により、有機分子修飾された蛍光体内包シリカナノ粒子に直接結合し得る部位と、生体物質認識分子に結合し得る部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基に選択的に反応する部位とメルカプト基に選択的に反応する部位の両方を有するｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ〔Sulfosuccinimidyl 4[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate〕（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランにより修飾された蛍光体内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基とを結合させることで、抗体が結合した蛍光体内包シリカナノ粒子を作製できる。
　蛍光体内包メラミンナノ粒子に生体物質認識分子を結合させる場合、蛍光体として有機蛍光色素を使用する場合であっても、半導体ナノ粒子を使用する場合であっても、同様の手順を適用することができる。例えば、メラミンナノ粒子上のアミノ基を介してＥＤＣまたはｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣを用いることで、抗体が結合した蛍光体内包メラミンナノ粒子を作製できる。
　蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子に生体物質認識分子を結合させる場合、蛍光体として有機蛍光色素を使用する場合であっても、半導体ナノ粒子を使用する場合であっても、同様の手順を適用することができる。例えば、上述の含浸法を用いてアミノ基などの官能基を有するポリスチレンナノ粒子中に有機蛍光色素または半導体ナノ粒子を含浸することにより、アミノ基などの官能基を有する蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣまたはｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣを用いることで、抗体が結合した蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
　　　　　　　　　　　　　　＜検出方法の手順＞
　本発明は、上述のとおり、特定の発色剤とブロッキング剤とを併用する検出方法であり、組織切片を蛍光染色する従来公知の方法に好適である。組織切片は生体物質から構成されるが、病理組織切片には限定されず、また、細胞染色にも適用することができる。
　本発明に係る検出方法が適用可能な組織切片の作製方法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを使用することができる。
　以下、本発明の検出方法に含まれる下記の工程を順に説明する。
　(1) 脱パラフィン工程：
　キシレンを入れた容器に、組織切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3～30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いで、エタノールを入れた容器にこの切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3～30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　次いで、水を入れた容器に、この切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3～30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
　(2) 賦活化処理工程：
　公知の方法にならい、特定の生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ6.0）、1ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ8.0）、5％の尿素、0.1Ｍのトリス塩酸緩衝液などを含有する溶液を用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50～130℃、時間は5～30分間で行うことができる。
　次いで、水とＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3～30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　(3) 生体物質認識分子を結合した蛍光体内包ナノ粒子（発色剤）による染色工程：
　この組織化学染色工程(3)において、まず、生体物質認識分子を結合した蛍光体内包ナノ粒子のリン酸緩衝液生理的食塩水〔ＰＢＳ〕分散液を調整し、切片に乗せ、特定の生体物質との反応を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、5分間～24時間であることが好ましい。特定の生体物質と生体物質認識分子との反応に適した環境を安定して維持するための溶媒として、上記ではＰＢＳを例示したが、ＰＢＳ以外に、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸-リン酸緩衝液なども用いることができる。
　本発明においては、蛍光体内包ナノ粒子による染色を行う前に、ブロッキング剤を滴下する。ブロッキング剤として、蛍光特性を持たないナノ粒子、すなわち蛍光体を内包しないナノ粒子を使用する。好ましい態様としては、蛍光体包含ナノ粒子と当該蛍光特性を持たないナノ粒子の母体組成が同一である。より好ましくは、さらに双方の平均粒径の差が25％以下であり、特に好ましくは、さらに蛍光特性を持たないナノ粒子表面がポリエチレングリコールで覆われていることである。
　ブロッキング剤の使用量は特に限定されないが、一般的には発色剤の0.5～10倍量が好適である。本発明に係るブロッキング剤は、一種単独で用いてもよいし、ＢＳＡやスキムミルク等の公知のブロッキング剤と併用してもよい。
　次いで、ＰＢＳを入れた容器に染色後の切片を浸漬させ、未反応の蛍光体内包ナノ粒子の除去を行う。ＰＢＳ溶液にはＴｗｅｅｎ20等の界面活性剤を含有させてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3～30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　(4) 固定処理工程：
　本発明において所要の固定処理工程は、上記の染色工程(3)により導入された標識化プローブ生体物質を、組織切片に固定化する工程である。
　本発明で用いられる固定処理溶液としては、例えば、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤、細胞膜透過物質などが挙げられる。
　本発明において、固定処理は、従来公知の手法により行うことができる。固定処理は、
具体的には、このような固定処理溶液に、組織化学染色工程(3)により得られた染色組織切片を浸漬することにより行うことができる。例えば、稀パラホルムアルデヒド水溶液中に、組織化学染色工程(3)により得られた染色組織切片を数分から数時間程度浸漬することにより行うことができる。
　(5) 蛍光顕微鏡下の観察工程：
　このようにして得られる切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、特定の生体物質の発現レベルを輝点数または発光輝度を基に計測することができる。用いた蛍光体の吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源および蛍光検出用光学フィルターは、当業者であれば適宜選択することができる。
　輝点数または発光輝度の計測は、画像解析ソフト、例えば公開解析ソフトであるImageJ、(株)ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトG-Countなどを用いて行うことができる。
　以下、本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　　　　　　　　　　　　　＜ブロッキング剤の製造＞
　ブロッキング剤として「蛍光体を内包しないナノ粒子」を、以下のようにして数種類製造した。これらの粒子は、母体の組成・平均粒径・ポリエチレングリコール〔ＰＥＧ〕で被覆されているか否かの点で種類が異なるものである。
　［製造例1］ＰＥＧで被覆されたポリスチレンナノ粒子
　工程(1-1)：ポリスチレンナノ粒子（Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」；平均粒径：100ｎｍ）1ｍgに対して、エチレンジアミン四酢酸〔ＥＤＴＡ〕を2ｍＭ含有したリン酸緩衝液生理的食塩水〔ＰＢＳ〕を用いて3ｎＭに調整した。
　工程(1-2)：工程(1-1)で調整した溶液に、最終濃度10ｍＭとなるよう「ＳＭ(ＰＥＧ)12」（サーモサイエンティフィック社製のsuccinimidyl-[(N-maleomidopropionamid)-dodecaethyleneglycol]ester）を混合し、3時間反応した。
　工程(1-3)：工程(1-2)の反応混合液を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程(1-4)：工程(1-3)の沈殿物に、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを加え、分散させて、再度遠心分離を行い、上澄みを除去するという洗浄を行った。同様の手順による洗浄を、さらに二回行った。その後、500μＬのＰＢＳで再分散させた。その結果、ＰＥＧで被覆された、蛍光体を内包しないポリスチレンナノ粒子が得られた。
　［製造例2］メラミンナノ粒子
　工程(2-1)：メラミン15ｇと37％ホルマリン29ｇと28％アンモニア水溶液1.5ｇとを混合して、ｐＨ8に調整した。
　工程（2-2）：工程(2-1)の混合溶液を撹拌しながら70℃に昇温して30分間反応させて、初期縮合物を得た。
　工程(2-3)：「ネオペレックスＧ-15」（花王(株)製）0.12ｍｌを水22ｍｌ中に溶解して、90℃に昇温したサンプルを四本準備した。
　工程(2-4)：工程(2-2)で得られた初期縮合物1ｇを、工程(2-3)の各サンプルに投入した後、ドデシルベンゼンスルホン酸0.5ｍＬ、0.7ｍＬ、0.85ｍＬ、0.9ｍＬをそれぞれに添加して、6時間撹拌した。
　工程(2-5)：工程(2-4)の各反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、エタノールを加え、沈降物を分散させて、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。
　このようにして得られた、蛍光体を内包しないメラミンナノ粒子それぞれを走査型電子顕微鏡〔ＳＥＭ〕（(株)日立製作所製S-800型）で観察したところ、平均粒径（変動係数）がそれぞれ72ｎｍ（10.5％）、83ｎｍ（11.3％）、91ｎｍ（9.5％）、98ｎｍ（9.3％）
であった。
　［製造例3］ＰＥＧで被覆されたメラミンナノ粒子
　製造例1において、ポリスチレンナノ粒子の代わりに、製造例2で得られた平均粒径が98ｎｍのメラミンナノ粒子を用いた以外は、製造例1と同様にして、ＰＥＧで被覆されたメラミンナノ粒子を製造した。
　［製造例4］シリカナノ粒子
　工程(4-1)：エタノール40ｍＬと14％アンモニア水9.7ｍＬとを混合した。
　工程(4-2)：工程(4-1)の混合液を室温で撹拌しているところに、テトラエトキシシラン400μＬ（1.796ｍｍｏｌ）を添加した。添加開始から7時間撹拌を行った。
　工程(4-3)：工程(4-2)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄とをさらに一回ずつ行った。
　このようにして得られた、蛍光体を内包しないシリカナノ粒子について、ＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径が69ｎｍ、変動係数は17％であった。
　また、工程(4-1)において、14％アンモニア水の配合量を9.7ｍＬから、それぞれ10ｍＬ、11.5ｍＬ、13ｍＬに変更した以外は、工程(4-1)～(4-3)と同様にして、それぞれ平均粒径の異なる三種類のシリカナノ粒子を製造した。得られたシリカナノ粒子の平均粒径（変動係数）はそれぞれ、79ｎｍ（10％）、88ｎｍ（12.6％）、99ｎｍ（11.3％）であった。
　［製造例5］ＰＥＧで被覆されたシリカナノ粒子
　工程(5-1)：製造例4で得られた平均粒径が99ｎｍのシリカナノ粒子1ｍｇを、純水5ｍＬに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン100μＬを添加し、室温で12時間撹拌した。
　工程(5-2)：工程(5-1)の反応混合物を10,000×ｇで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程(5-3)：工程(5-2)の沈殿物にエタノールを加えて、分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄とをさらに一回ずつ行った。
　得られたアミノ基修飾シリカナノ粒子のＦＴ-ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基により修飾されていることが確認された。
　以下、製造例1において、ポリスチレンナノ粒子の代わりに、工程(5-3)で得られたアミノ基修飾シリカナノ粒子を用いた以外は、製造例1と同様にして、ＰＥＧで被覆された、蛍光体を内包しないシリカナノ粒子を製造した。
　　　　　　　　　　　　　　　＜発色剤の製造＞
　発色剤として「特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子」を四種類製造した。それらは、いずれもＰＥＧで被覆され、その粒子表面に抗ＨＥＲ2抗体が結合しているが、蛍光体の種類・母体の組成・平均粒径の点で異なるものである。
　［製造例6］発色剤〈Ａ〉
　工程(6-1)：ポリスチレンナノ粒子（Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」；平均粒径：100ｎｍ）10ｇを、水：エタノール＝2:8の混合溶媒中に分散し、室温で3時間撹拌した。
　工程(6-2)：工程(6-1)の分散液中にＣｙ5（ＧＥヘルスケア・ジャパン(株)製）1ｍｇ（0.00126ｍｍｏｌ）を加えて、60℃で12時間撹拌した。
　工程(6-3)：工程(6-2)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。その結果、蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子が得られた。
　工程(6-4)：工程(6-3)の蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子1ｍgに対して、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを用いて3ｎＭに調整した。
　工程(6-5)：工程(6-4)の溶液に、最終濃度10ｍＭとなるよう「ＳＭ(ＰＥＧ)12」を混合し、3時間反応した。
　工程(6-6)：工程(6-5)の反応混合液を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程(6-7)：工程(6-6)の沈殿物に、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを加えて分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を三回行った。最後に500μＬのＰＢＳを用いて再分散させることによって、ＰＥＧで被覆されたポリスチレンナノ粒子の粒子分散液が得られた。
　工程(6-8)：抗ＨＥＲ2抗体100μｇを100μＬのＰＢＳに溶解させたところに、1Ｍジチオスレイトール〔ＤＴＴ〕を添加し、30分間反応させた。
　工程(6-9)：工程(6-8)の反応混合物について、ゲルろ過カラムで過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ2抗体溶液を得た。
　工程(6-10)：工程(6-7)の粒子分散液と、工程(6-9)の還元化抗ＨＥＲ2抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、1時間反応させた。
　工程(6-11)：工程(6-10)の反応液に、10ｍＭメルカプトエタノール4μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程(6-12)：工程(6-11)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を三回行った。最後に500μＬのＰＢＳを用いて再分散させて、抗ＨＥＲ2抗体が結合しＰＥＧで被覆された蛍光体（Ｃｙ5）内包ポリスチレンナノ粒子（すなわち発色剤〈Ａ〉）の粒子分散液が得られた。
　［製造例7］発色剤〈Ｂ〉
　工程(7-1)：メラミン15ｇと37％ホルマリン29ｇと28％アンモニア水溶液1.5ｇとを混合して、ｐＨ8に調整した。
　工程(7-2)：工程(7-1)の混合物を撹拌しながら70℃に昇温して30分間反応させて、初期縮合物を得た。
　工程(7-3)：「ネオペレックスＧ-15」を0.12ｍｌと、Ｃｙ5を1ｍｇ（0.00126ｍｍｏｌ）とを水22ｍＬ中に溶解して90℃に昇温した。
　工程(7-4)：工程(7-2)の初期縮合物1ｇを工程(7-3)の溶液に投入した後、ドデシルベンゼンスルホン酸0.93ｍＬを添加して、6時間撹拌した。
　工程(7-5)：工程(7-4)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。このようにして得られた蛍光体内包メラミンナノ粒子をＳＥＭにより観察したところ、平均粒径が97ｎｍ、変動係数が10％であった。
　以下、工程(6-4)において蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子の代わりに、蛍光体内包メラミンナノ粒子を用いた以外は工程(6-4)～(6-12)と同様にして、抗ＨＥＲ2抗体が結合しＰＥＧで被覆された蛍光体（Ｃｙ5）内包メラミンナノ粒子（すなわち発色剤〈Ｂ〉）の粒子分散液を製造した。
　［製造例8］発色剤〈Ｃ〉
　工程(8-1)：Ｃｙ5のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア・ジャパン(株)製）1ｍｇ（0.00126ｍｍｏｌ）をテトラエトキシシラン420μＬ（1.796ｍｍｏｌ）と混合した。
　工程(8-2)：エタノール40ｍＬを14％アンモニア水13.8ｍＬと混合した。
　工程(8-3)：工程(8-2)の混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(8-1)の混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
　工程(8-4)：工程(8-3)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。このようにして得られた蛍光体内包シリカナノ粒子をＳＥＭにより観察したところ、平均粒径が99ｎｍ、変動係数が12％であった。
　工程(8-5)：工程(5-1)において、蛍光体を内包しないシリカナノ粒子の代わりに、工程(8-4)の蛍光体内包シリカナノ粒子を用いた以外は、工程(5-1)～(5-3)と同様にしてアミノ基が修飾された蛍光体内包シリカナノ粒子を製造した。
　工程(8-6)：製造例1において、ポリスチレンナノ粒子の代わりに、上記のように製造されたアミノ基修飾蛍光体内包シリカナノ粒子を用いた以外は製造例1と同様にして、ＰＥＧで被覆された蛍光体内包シリカナノ粒子を製造した。
　工程(8-7)：工程(8-6)の粒子分散液と、工程(6-9)の還元化抗ＨＥＲ2抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、1時間反応させた。
　工程(8-8)：工程(8-7)の反応液に、10ｍＭメルカプトエタノール4μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程(8-9)：工程(8-8)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を三回行った。最後に500μＬのＰＢＳを用いて再分散させて、抗ＨＥＲ2抗体が結合しＰＥＧで被覆された蛍光体（Ｃｙ5）内包シリカナノ粒子（平均粒径：135ｎｍ）（すなわち発色剤〈Ｃ〉）の粒子分散液が得られた。
　［製造例9］発色剤〈Ｄ〉
　工程(9-1)：発光波長655ｎｍを有するＣｄＳｅ/ＺｎＳのデカン分散液（インビトロジェン(株)製「Ｑｄｏｔ655」）10μＬとテトラエトキシシラン40μＬとを混合した。
　工程(9-2)：エタノール4ｍＬと14％アンモニア水2.5ｍＬとを混合した。
　工程(9-3)：工程(9-2)の混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(9-1)の混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
　工程(9-4)：反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄とをさらに一回ずつ行った。得られた蛍光体内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径が130ｎｍ、変動係数が13％であった。
　以下、工程(8-5)において、工程(8-4)の蛍光体内包シリカナノ粒子の代わりに、工程(9-4)の蛍光体内包シリカナノ粒子を用いた以外は、工程(8-5)～(8-9)と同様にして、抗ＨＥＲ2抗体が結合しＰＥＧで被覆された蛍光体（ＣｄＳｅ/ＺｎＳ）内包シリカナノ粒子（平均粒径：101ｎｍ）（すなわち発色剤〈Ｄ〉）の粒子分散液を製造した。
　　　　　　　＜ＨＥＲ2の免疫組織染色における検出方法の実施＞
　［比較例］ブロッキング剤としてＢＳＡを使用
　発色剤として、製造例6～9で得られた発色剤〈Ａ〉～〈Ｄ〉それぞれを使用して、ＤＡＢ染色により判定結果が既知のヒト乳房組織の隣接切片を用い、下記の工程に従って免疫組織染色を行った。該切片として、コスモ・バイオ(株)製の組織アレイスライド「ＣＢ-Ａ712」を用いた。
　工程(C-1)：キシレンを入れた容器に、上記切片を30分間浸漬させた。途中三回キシレンを交換した。
　工程(C-2)：この切片を、エタノールを入れた容器に30分間浸漬させた。途中三回エタノールを交換した。
　工程(C-3)：この切片を、水を入れた容器に30分間浸漬させた。途中三回水を交換した。
　工程(C-4)：この切片を、10ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ6.0）に30分間浸漬させた。
　工程(C-5)：121℃で10分間オートクレーブ処理を行った。
　工程(C-6)：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を30分間浸漬させた。
　工程(C-7)：ブロッキング剤として1％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織に乗せて、1時間放置した。
　工程(C-8)：1％ＢＳＡ含有ＰＢＳで0.05ｎＭに希釈した発色剤〈Ａ〉～〈Ｄ〉それぞれを各切片に乗せて、3時間放置した。
　工程(C-9)：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ30分間浸漬させた。
　工程(C-10)：Merck Chemicals社製「Ａｑｕａｔｅｘ」を滴下後、カバーガラスを乗せ封入した。
　蛍光顕微鏡下の観察：続いて、染色した切片に対し、オリンパス(株)製の蛍光顕微鏡「ＢＸ53」を用いて、目的とする生体物質、すなわちＨＥＲ2の発現を輝点数から特定し、イメージＪを用いた二値処理およびノイズ除去処理後に輝点計測を行い、10細胞当たりの輝点数を計測した。輝点の計測はスライド上の20のスポットについて行った。
　［実施例1］ブロッキング剤としてポリスチレンナノ粒子（平均粒径：70ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、ポリスチレンナノ粒子（Thermo Fisher Scientific社製「3070Ａ」；平均粒径：70ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例2］ブロッキング剤としてポリスチレンナノ粒子（平均粒径：80ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、ポリスチレンナノ粒子（Thermo Fisher Scientific社製「3080Ａ」；平均粒径：80ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例3］ブロッキング剤としてポリスチレンナノ粒子（平均粒径：90ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、ポリスチレンナノ粒子（Thermo Fisher Scientific社製「3090Ａ」；平均粒径：90ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例4］ブロッキング剤としてポリスチレンナノ粒子（平均粒径：100ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、ポリスチレンナノ粒子（Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」；平均粒径：100ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例5］ブロッキング剤としてＰＥＧ被覆ポリスチレンナノ粒子（平均粒径：100ｎｍ）　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例1で得られたＰＥＧ被覆ポリスチレンナノ粒子含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例6］ブロッキング剤としてメラミンナノ粒子（平均粒径：72ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子（平均粒径：72ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例7]ブロッキング剤としてメラミンナノ粒子（平均粒径：83ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子（平均粒径：83ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例8]ブロッキング剤としてメラミンナノ粒子（平均粒径：91ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子（平均粒径：91ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例9]ブロッキング剤としてメラミンナノ粒子（平均粒径：98ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子（平均粒径：98ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例10]ブロッキング剤としてＰＥＧ被覆メラミンナノ粒子（平均粒径：98ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例3で得られたＰＥＧ被覆メラミンナノ粒子含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例11］ブロッキング剤としてシリカナノ粒子（平均粒径：69ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子（平均粒径：69ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例12］ブロッキング剤としてシリカナノ粒子（平均粒径：79ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子（平均粒径：79ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例13］ブロッキング剤としてシリカナノ粒子（平均粒径：88ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子（平均粒径：88ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例14］ブロッキング剤としてシリカナノ粒子（平均粒径：99ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子（平均粒径：99ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　［実施例15］ブロッキング剤としてＰＥＧ被覆シリカナノ粒子（平均粒径：99ｎｍ）
　比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例5で得られたＰＥＧ被覆シリカナノ粒子（平均粒径：99ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　これらの結果を表1に示す。なお、表1において、ブロッキング剤がＰＥＧで被覆されている場合を「＋」、されていない場合を「－」として示し、平均粒径の差は、発色剤の平均粒径をＸ（ｎｍ）とし、ブロッキング剤の平均粒径をＹ（ｎｍ）とするとき、｛(Ｘ－Ｙ)／Ｘ｝×100（％）の式から算出し、輝点数は、比較例の発色剤〈Ａ〉～〈Ｄ〉それぞれの陰性を1とした相対値で表わす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 《考察》
　表1から、ブロッキング剤として通常使用するＢＳＡより、蛍光体を内包しないナノ粒子の方が有意にブロッキング能に優れていることがわかった。これは、おそらくＢＳＡが抗原抗体反応に関する非特異吸着を防止しているのに対して、蛍光体を内包しないナノ粒子は、抗原抗体反応に関する非特異吸着のみならず、ナノ粒子のサイズ等に依存して起きる非特異的吸着についても、粒子どうしの立体的な障害によって防止することができるためであろうと考えられる。

Claims (5)

  1. 　特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用する検出方法。
  2. 　上記生体物質が、組織切片を構成するものである、請求項1に記載の検出方法。
  3. 　上記蛍光体内包ナノ粒子の母体と、上記の蛍光体を内包しないナノ粒子の母体とが、同じ組成を有する、請求項1または2に記載の検出方法。
  4. 　上記蛍光体内包ナノ粒子および上記の蛍光体を内包しないナノ粒子の粒子表面の少なくとも一部が、それぞれ、生体物質に吸着しづらい同じ有機分子で被覆されている、請求項1～3のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　上記蛍光体内包ナノ粒子の平均粒径と、上記の蛍光体を内包しないナノ粒子の平均粒径との差が、25％以内である、請求項1～4のいずれか一項に記載の検出方法。
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