JP2022501590A - 発光マーカー粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
−((CR14R15)bO)c−
(I)
式中、R14およびR15は、それぞれ独立してHまたはC1〜6アルキルであり、bは、少なくとも1、場合により1〜5、好ましくは2であり、cは、少なくとも2、場合により2〜1,000、好ましくは10〜500、10〜200または10〜100である。
図2は、本開示のいくつかの実施形態による、発光マーカー粒子を形成するプロセスを示している。
アミン基、場合により−NR8 2(式中、R8は、各出現時、独立して、Hまたは置換基、好ましくはHまたはC1〜5アルキル、さらに好ましくはHである);−COOH;−OH、−SH;アルケン;アルキン;およびアジド。
(R7O)3Si−(Sp1)x−RG1
(I)
式中、R7は、Hまたは置換基、好ましくはC1〜10アルキル基であり、
Sp1はスペーサー基であり、
xは0または1であり、
RG1は第1の反応基である。
RG2−PG1−RG2
(IIa)
いくつかの実施形態では、式(IIa)の各RG2基は、反応性基RG1と反応して、2つの結合基BGの間に延びる第1の表面基を形成する。
アミン、好ましくは−N(R8)2(式中、R8は、各出現時、Hまたは置換基、好ましくはHまたはC1〜5アルキル、さらに好ましくはHである);
ヒドロキシル;チオール;および
RG1とRG2との反応時にカルボン酸基またはその塩を形成するカルボン酸またはその誘導体、例えば、無水物、酸塩化物またはエステル。
粒子コアは、1つ以上の発光材料からなり得る。
粒子コアの発光材料は、蛍光、リン光またはそれらの組合せを放出し得る。
・1つ以上の非隣接C原子がO、S、NまたはC=Oによって置換されていてもよいC1〜20アルキレンまたはフェニレン−C1〜20アルキレン;
・1つ以上の置換基R1に加えて、非置換であってもよいか、1つ以上の非極性置換基、場合により1つ以上のC1〜20アルキル基によって置換されていてもよいC6〜20アリーレンまたは5〜20員ヘテロアリーレン、さらに好ましくはフェニレン。
・1つ以上の非隣接C原子がO、SまたはCOによって置換されていてもよいC1〜20アルキレン;および
・非置換であってもよいか、1つ以上の非極性置換基によって置換されていてもよいC6〜20アリーレンまたは5〜20員ヘテロアリーレン、さらになお好ましくはフェニレン。
・式−O(CH2CH2O)tR4(式中、tは、少なくとも1、場合により1〜10であり、R4は、C1〜5アルキル基、好ましくはメチルである)のポリエチレングリコール(PEG)基;
・式−N(R5)2(式中、R5は、HまたはC1〜12ヒドロカルビルである)の基;または
・式−COO−のアニオン性基。
・アルキル、場合によりC1〜20アルキル;ならびに
・非置換であってもよいか、1つ以上の置換基によって置換されていてもよいアリール基およびヘテロアリール基、好ましくは1つ以上のC1〜20アルキル基によって置換されたフェニル;
・各々が独立して置換されていてもよいアリール基またはヘテロアリール基、例えば式−(Ar3)s(式中、各Ar3は、独立してアリール基またはヘテロアリール基であり、sは少なくとも2である)の基の直鎖または分岐鎖、好ましくは、それぞれが非置換であってもよいか、1つ以上のC1〜20アルキル基によって置換されていてもよいフェニル基の分岐鎖または直鎖;ならびに
・架橋可能な基、例えば、そのような二重結合を含む基、およびビニル基もしくはアクリレート基、またはベンゾシクロブテン基。
粒子は、液体中に懸濁された粒子を含むコロイド懸濁液として提供され得る。好ましくは、液体は、水、C1〜10アルコールおよびそれらの混合物から選択される。好ましくは、粒子は、液体中で均一な(凝集していない)コロイドを形成する。
本開示の粒子は、蛍光性またはリン光性であり得る。好ましくは、粒子は蛍光性である。好ましくは、粒子は、生体分子を検出するための、または生体分子を標識するための蛍光プローブとして使用するためのものである。いくつかの実施形態では、粒子は、ラテラルフローイムノアッセイまたは固体イムノアッセイなどのイムノアッセイで蛍光プローブとして使用され得る。粒子は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、次世代シーケンシング、インビボイメージング、または標的分析物に結合するように構成された発光マーカーが分析対象の試料と接触させられる任意の他の用途で使用するためのものであってもよい。これらの用途は、患者(該当する場合)を含むか、研究目的であるかどうかにかかわらず、医学用途、獣医学用途、農業用途または環境用途のためのものであり得る。
ビオチン化ナノ粒子の形成
反応性アミン基を有する発光ナノ粒子コアの形成
Stober法によって、シリカのコアと発光ポリマーとを有するナノ粒子を形成し、ナノ粒子コアと、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる国際公開第2018/060722号の実施例に記載されているように(3−アミノプロピル)トリエトキシシランとを反応させて、動的光散乱による数平均直径が80nmであり、コアの表面上にアミン反応性基を有するナノ粒子を得た。
上記の実施例で形成された、メタノール中のアミノ修飾ナノ粒子コアの懸濁液1mLを14,000rpmで2分間遠心分離して、上清のデカンテーションによってナノ粒子を分離した。α,ω−ビス{2−[(3−カルボキシ−1−オキソプロピル)アミノ]エチル}ポリエチレングリコール(以下に示すSAA−PEG−SAA、MW=2000g/mol)、ビオチン−PEG−COOH(MW=2000g/mol)、N−(3−アミノプロピル)−N−エチルカルボジイミド(2.1mg)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(2.5mg)のメタノール溶液1mLを使用して、穏やかな超音波処理によってナノ粒子ペレットを再分散させ、得られた懸濁液を室温で1時間撹拌した。SAA−PEG−SAAとビオチン−PEG−COOHとの相対量を表1に示す。懸濁液を14,000rpmで2分間遠心分離して、過剰な未反応のPEG化試薬を含有する上清から、得られたシリカ−LEPナノ粒子を分離した。デカンテーションによって上清を除去し、穏やかな超音波処理を使用して、ナノ粒子の分離されたペレットを1mLの新鮮なメタノールに再分散させた。遠心分離、デカンテーション、およびメタノール(1mL)への再分散からなる洗浄サイクルをさらに2回繰り返した。最後の遠心分離およびデカンテーションの前に、懸濁液を4つの250μL部分に分注し、得られたペレットを使用前に−20℃で保存した。
ストレプトアビジンへのビオチン化ナノ粒子の共役
穏やかな超音波処理によって、1mLのリン酸緩衝食塩水(pH7.4、1重量%のウシ血清アルブミンを含有する)に実施例1の分離されたペグ化ナノ粒子ペレットの1つを再懸濁し、続いて、同じ緩衝液に50μLのストレプトアビジン溶液を直ちに加えた(1mg/mL)。懸濁液を室温で1時間撹拌した後、試料を14000rpmで3分間遠心分離して、上清および非共役タンパク質からタンパク質共役ナノ粒子を収集および分離した。穏やかな超音波処理によって、100μLのリン酸緩衝食塩水にペレットを再懸濁し、保存した。
ナノ粒子の安定性
リン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)を用いて、実施例1に記載の不活性PEG表面基およびビオチン置換PEG表面基を担持するナノ粒子のコロイドを形成し、動的光散乱を使用して、ナノ粒子のZ平均直径を定期的に測定して、ナノ粒子の凝集を決定した。
バイオアッセイの感度に対する凝集の影響
バイオアッセイ用のビオチン−BSA修飾スライドガラスの作製
無水コハク酸(1g)およびトリメチルアミン(1.3mL)を含有するアセトニトリル(50mL)溶液に、(3−アミノプロピル)シランの自己組織化単層を用いて官能化したガラス顕微鏡スライドを16時間浸漬した後、新鮮なアセトニトリル(50mL)を用いて3回洗浄した。乾燥後、得られたカルボキシ官能化スライドガラスの表面に、Grace−Biolabs Secure Sealイメージングスペーサーを貼り付けて、4つの円形領域(直径=9mm)を隔離して、後続の結合アッセイで使用した。スライドの各隔離領域内に、N−(3−アミノプロピル)−N−エチルカルボジイミド(77.0mg)およびN−ヒドロキシルスルホスクシンイミド(33.0mg)を含有する80μLの1mL溶液を加えた。室温で30分間放置した後、溶液を除去し、水(80μL)を用いて、隔離された領域を3回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、2つの領域に、ビオチン化ウシ血清アルブミン(50μg/mL)のリン酸緩衝食塩水(pH7.4)溶液80μLを加え、残りの2つの領域に、0.01重量%のTween−20を含有するリン酸緩衝食塩水(pH7.4)中のウシ血清アルブミン(3重量%)を含有するブロッキングバッファー80μLを加えた。室温で1時間後、ビオチン化ウシ血清アルブミン溶液を含有する2つの領域から溶液を除去し、代わりに上記のブロッキングバッファー80μLを加えた。室温でさらに1時間後、4つの全領域から溶液を除去し、0.01重量%のTween−20を含有するリン酸緩衝食塩水(pH7.4)を用いて、それぞれを3回洗浄した。
実施例2に記載のストレプトアビジン修飾ビオチン化ナノ粒子を0.1mol%、1mol%および10mol%含有するコロイド(1%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水中0.1mg/mL)をスライドガラスに適用した。室温で30分間放置した後、溶液を除去し、80μLのリン酸緩衝食塩水(pH7.4)を用いて3回洗浄した。空気中で乾燥させた後、励起源(λex=365nm)として水銀ランプと検出用の光ファイバー分光計とを使用して、顕微鏡ベースの分光計を使用して、4つのアッセイ領域のそれぞれの蛍光強度を測定した。ビオチンにより官能化された領域からの平均積分強度を、BSAのみ(ビオチンなし)を用いてブロックされた領域の平均強度で割ることによって、信号−雑音を決定した。
表面基の分子量の影響
アミノ基をSAA−PEG−SAAのみ(Mw550、100、2000または5000Da)またはmPEG−SAAのみ(以下に示す、MW550、100、2000および5000Da)と反応させた、すなわち、得られた表面基が、生体分子結合基を有する基を含まなかったことを除いて、実施例1に記載されているようにナノ粒子を調製した。
ビオチン化抗体への共役
実施例2に記載のストレプトアビジン官能化ナノ粒子1mgに、0.5mg/mLのビオチン化ヤギ抗マウス抗体250μL(クローンPoly4053、Biolegendから購入)を加え、混合物を室温で1時間撹拌した。この工程を4回繰り返した。最終工程で、ペレットを500μLのBSA/PBSに再懸濁して、2mg/mLの最終粒子濃度を得た。
フローサイトメトリーアッセイ
Propel Labs YETI分析機器を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。
・BV421−hCD4:250μg/mL
・NP(s)−hCD4:31.3μg/mL
・NP(n)−hCD4:15.6μg/mL
各チャネルについてBV421−hCD4、NP(s)−hCD4およびNP(n)−hCD4の最適電圧は同じであり、表2に要約されている:
図6および表4では、NP(s)−hCD4によるCyto−Trol細胞の染色とBV421−hCD4とを比較している。BV421−hCD4と同様に、NP(s)−hCD4は陰性細胞のごくわずかな染色を示す。ただし、NP(s)−hCD4の陽性信号は、BV421−hCD4と比較して陽性信号の標準偏差がわずかに増加するにとどまりながら、比較的高い吸光係数に大幅にシフトする。MFI1のこの増加は、BV421と比較してNP(s)−hCD4の染色指数の約2.5倍の増加につながる。
図8および表6では、NP(s)−hCD4に関して、NP(n)−hCD4によるCyto−Trol細胞の染色とBV421−hCD4とを比較している。NP(s)−hCD4と同様に、NP(n)−hCD4はごくわずかな陰性染色を示す。NP(n)−hCD4の比較的明るい陽性信号は、BV421−hCD4と比較して5.4倍の染色指数を示す。
ビオチン−PEG−COOH+SAA−PEG−SAAの総重量の割合としてのビオチン−PEG−COOHを0.5重量%、1重量%、5重量%および10重量%まで変化させたことを除いて、実施例1に記載のナノ粒子を使用して、第1のビオチン基密度(したがって、前駆体ナノ粒子の表面上のタンパク質結合部位の数)の影響を試験した。
・BV421−hCD4:250μg/mL
・NP(s)−0.5%hCD4:62.5μg/mL
・NP(s)−1%hCD4:250μg/mL
・NP(s)−5%hCD4:125μg/mL
・NP(s)−10%hCD4:62.5μg/mL
各チャネルについてBV421−hCD4およびNP(s)−x%hCD4の最適電圧は同じであり、表10に要約されている:
Claims (21)
- 発光粒子コアと、前記発光粒子コアに結合した第1の表面基と、前記発光粒子コアに結合した第2の表面基とを含む発光マーカー粒子であって、前記発光コアが発光材料を含み、前記第1の表面基が極性基を含み、前記第1の表面基が不活性であり、前記第2の表面基が生体分子結合基を含み、前記第2の表面基のモル数が、前記第1および第2の表面基の総モル数の10%未満である発光マーカー粒子。
- 前記極性基がポリエーテル鎖を含む、請求項1に記載の発光マーカーナノ粒子。
- 前記極性基が式(I)の基であり、
−((CR14R15)bO)c−
(I)
式中、R14およびR15が、それぞれ独立してHまたはC1〜6アルキルであり、bが、少なくとも1、場合により1〜5、好ましくは2であり、cが、少なくとも2、場合により2〜1,000、好ましくは10〜500、10〜200、10〜100または20〜50である、請求項2に記載の発光マーカーナノ粒子。 - 前記生体分子結合基が、DNA、RNA、ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質およびホルモンからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の発光マーカー粒子。
- 前記第2の表面基が、前記ナノ粒子コアと前記生体分子結合基との間に極性基を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の発光マーカー粒子。
- 前記発光材料が発光ポリマーである、請求項1から5のいずれか一項に記載の発光マーカー粒子。
- 前記ナノ粒子コアが無機マトリックスを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の発光マーカー粒子。
- 前記無機マトリックスが無機酸化物である、請求項7に記載の発光マーカー粒子。
- 前記無機酸化物がシリカである、請求項8に記載の発光マーカー粒子。
- その表面に結合した複数の第1の反応性基を有する発光粒子コアを提供すること、
前記第1の表面基を形成することであって、前記第1の表面基の形成が、前記第1の反応性基の一部と第1の化合物とを反応させることを含むこと、および
前記第2の表面基を形成することであって、前記第2の表面基の形成が、前記第1の反応性基の一部と第2の化合物とを反応させることを含むこと、
を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の発光マーカー粒子を形成する方法。 - 前記第1の反応性基が、前記第1および第2の化合物のうちの少なくとも1つと反応して、前記第1または第2の表面基を前記発光粒子コアに結合するアミド結合基を形成する、請求項10に記載の方法。
- 前記第1の反応性基が、前記発光粒子コアの表面で式(I)の化合物とシリカとを反応させることによって、その表面に形成され、
(R7O)3Si−(Sp1)x−RG1
(I)
式中、R7が、Hまたは置換基であり、
Sp1がスペーサー基であり、
xが0または1であり、
RG1が前記第1の反応性基である、請求項10または11に記載の方法。 - 液体中に懸濁された請求項1から10のいずれか一項に記載の発光マーカー粒子を含むコロイド。
- 前記液体が水を含む、請求項13に記載のコロイド。
- 前記液体が緩衝液である、請求項13または14に記載のコロイド。
- 前記発光マーカーナノ粒子の濃度が、0.1mg/mLを超える、請求項13から15のいずれか一項に記載のコロイド。
- 生体分子をマーキングする方法であって、請求項1から9のいずれか一項に記載の発光マーカー粒子に前記生体分子を結合する工程を含む方法。
- 試料と、請求項1から9のいずれか一項に記載の発光マーカー粒子とを接触させること、および前記発光マーカーに対する標的分析物の何らかの結合を決定することを含む、標的分析物のアッセイ方法。
- 前記発光マーカー粒子と接触した前記試料が、フローサイトメトリーによって分析される、請求項18に記載のアッセイ方法。
- 前記発光マーカー粒子に結合した標的分析物の量が決定される、請求項19に記載のアッセイ方法。
- 前記試料が、細胞の混合物を含み、前記発光マーカーに結合した1つの又は複数の異なるタイプの標的細胞が、同定および/または定量される、請求項20に記載のアッセイ方法。
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