JP2007506084A - ナノ粒子コンジュゲート及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、実質的に同様のアミノ酸配列の複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲート、システイン(C)残基によって該ナノ粒子に結合したペプチド及び該ペプチドに結合したリガンド及び更なる同定手段をさらに含むナノ粒子コンジュゲートに関する。本発明は、該ナノ粒子コンジュゲートを生産する方法にも関連する。
Description
本発明は、ナノ粒子を安定化し且つ生体分子の化学量論的カップリングを可能にする、ペプチドシェルを形成するための複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートに関する(該ペプチドは、更にリガンドを含む)。
生命科学の分野におけるナノ粒子の使用は、近年に亘るこの技術の発展にもかかわらず、元来予測されたようには広く普及していない。ナノ粒子は、広い潜在的適用範囲を有するが、診断又は治療剤としてのそれらの使用には多くの問題が付随する。例えば、細胞組織及び/又は液体において見られるものと同様の条件においてナノ粒子に付着したコンジュゲートの安定性を維持することは、多様な化学的環境に起因して多くの問題を引き起こす。更に、ナノ粒子を検出することの感度に関する問題も経験されている。
金属ナノ粒子における表面プラズモン(粒子中に閉じ込められた電子の集合的振動)は、粒度に依存して特徴的な共鳴振動数を有する。従って、白い非極性光は、金属ナノ粒子に、共鳴光散乱(RLS)として知られる現象においてそれらのサイズに特徴的な波長における光を放出させる(Elghanian, R., et al. (1977) Science, 277: 1078−1081及びSchultz, S. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:996−1001)。散乱された光の波長は、ナノ粒子のサイズ及びそれを囲む媒体に依存する。重要なことに、それらの電子的及び光学的性質の両方は、それらの環境に敏感な様式で依存し、これらの性質は極めて感度のよいプローブとして使用され得る(Elghanian, R., et al. (1997); Schultz, S. et al., (2000)及びBaum, T. et al., (1999) Langmuir, 15: 866−871)。3つの技術が、単粒子レベルにおいて金属ナノ粒子を検出するために開発されてきた。金属ナノ粒子における表面プラズモン(粒子中に閉じ込められた電子の集合的振動)は、粒度に依存した特徴的な共鳴振動数を有する。従って、ナノ粒子は、それらのサイズに特徴的な様式で光を吸収、放出及び散乱する。3つの技術は、以下の通りである:(i)単粒子による共鳴光散乱(RLS)は、これらが相当大きい(30〜40nm Ag、50〜60nm Au)場合、単純な暗視野顕微鏡によって容易に検出されるが、例えば、細胞などのサンプル、強く散乱するスライドガラスでは極めて困難である(Doty,C.,et al(2004)Cell. Mol. Life Sci. (61), 1843−1849);(ii)表面におけるエバネッセント場からのRLSは、検出できる粒度を、4倍まで低下させ、バックグラウンド散乱の問題を低減する;そして(iii)ボルドーのナノフォトニック研究所によって開発された光熱検出は、バックグラウンド散乱の問題なく、2nmまでの小さい粒子を検出できる(Boer, D., et al., (2002) Science, (297), 1160−1163及びCognet, L., et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (100), 11350−11355)。
顕著なことに、モルベースの金属ナノ粒子からのシグナル出力は、生物学において従来使用されるフルオロフォアのもの(これは、Q−dotsを用いて見出されたように、消光を受け、シグナル出力は、ブリンキングの傾向がない(Doty, C., et al. (2004))よりも遥かに大きい(103〜106倍)。さらに、このような粒子2つを近隣に持ってくると、RLS検出の場合における散乱光の波長のシフト又は他の検出システムにおけるシグナルの振幅における増加としての、(プラズモンカップリングに起因する)シグナル出力における変化を結果的に生じる。従って、ナノ粒子を用いた相補的な生体分子のタギングに単純に基づいた、生体分子相互作用のための検出メカニズムは、容易にアクセス可能である(例えば、Elghanian, R., et al. (1997))。ナノ粒子は、標準トランスフェクション法を用いて細胞中に導入される。従って、金属ナノ粒子は、単粒子の感度を有する生体分子作用のための単純なプローブへの特有の道筋を与える。
一般的に“Q−dots”と呼ばれる半導体ナノ粒子の蛍光特性について同様の検討がなされてきた。これらは、粒度に依存する狭い蛍光発光を示し、“光退色(photobleaching)”の傾向がない。最後に、ナノ粒子の光学的範囲は、高度のマルチプレクシングが可能である程度である。
上記の注目すべき特徴(それは、血液サンプルについて現在実施されるテストのための医師の処方が不要な(OTC)家庭用診断法を含む診断法、高スループットスクリーニング(HTS)を含む生体分子研究等の分野を大幅に変化させるだろう)を考慮すると、金属及び半導体のナノ粒子が実際の世界に殆ど影響を及ぼさなかったことは驚きである。金属及び半導体のナノ粒子が今日まで好結果でなかった理由の1つは、シグナル対ノイズ比に起因する。例えば、有機溶媒や純水などの理想的な物理的条件下において、ナノ粒子は、単純な単粒子の検出を許容するが、電解質を含む溶液中で凝集し、実質的に全てのマクロ分子に非特異的に結合するそれらの性質は、ナノ粒子に基づくアッセイの感度を急激に低下させる。ナノ粒子の‘粘着性’(ナノ粒子同士の凝集)を低減する現在のアプローチは、ナノ粒子の周りにリガンドシェルを構築することを必要とする。理想的なリガンドシェルは、ナノ粒子を生物学的システムの複雑な環境から保護し、ナノ粒子が近傍にある場合に観られるカップリング効果を利用したアッセイを可能にするために、所定の厚みの所定の化学量論的作用のある生体分子において特異的に結合する手段を提供する。
チオールは、ナノ粒子と強い共有結合を形成するため、存在するリガンドシェルは、多くの場合、1つ以上のチオールを有し、アルキルチオール及び誘導体、例えば、メルカプトウンデカン酸(MUA)、リポエート、チオール化されたデキストランとポリエチレングリコールを含む。薄い自己組織化単分子膜(self-assembled monolayer)(例えば、MUA,リポエート、システイン、グルタチオン(ECG))を作る単純なリガンドシェルは、それらが所定の化学的環境を提供し、且つリガンドシェルの厚みは単層単位の長さによって制御されるため、魅力的である。しかし、最良の場合においても、これらのリガンドシェルは、水性の生物学的溶液中で部分的な安定化しか提供しない。より複雑なポリマー(例えば、チオール化されたデキストランとポリエチレングリコールは、適度に安定なナノ粒子を作る。しかし、これらリガンドシェルの厚みは、制御することができず、該ポリマーは、生体マクロ分子に吸着し得る局所的ミクロ環境を形成すると知られており、マクロ分子の化学量論的カップリングは、困難であり、多くの場合不可能である。
従って、本発明の目的は、ナノ粒子を安定化し、且つ生体分子の化学量論的カップリングを可能にし得るリガンドをキャッピングするペプチドを含むナノ粒子コンジュゲートを提供することである。該ナノ粒子コンジュゲートを製造する方法を提供することも本発明の目的である。
本発明に従って、実質的に同様なアミノ酸配列の複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートが提供され、該ペプチドは、システイン(C)残基によって該ナノ粒子に結合され、且つ該ナノ粒子コンジュゲートは、該ペプチドに付随したリガンドをさらに含む。
従って、本発明は、多くの生物学的及び化学的環境において非常に向上した安定性を有するナノ粒子コンジュゲートを提供する。ナノ粒子コンジュゲートの形態は、タンパク質に類似し、これは、組織化した表面(ペプチドによって提供される)によって隠される“粘着性の”コア(例えば、無機金属または半導体材料を含む)をさらに有し得、従って、これは、特定の用途の必要性に合わせて作られ得る。ペプチドの二次構造(アルファへリックス、ベータストランド、H−結合)がナノ粒子の安定化を促進すると考えられる。実際、ベータストランドを形成するペプチドは、達成されるナノ粒子へのペプチドの高い充填密度を可能にするストランド形成に好ましい。
好ましくは、システイン(C)残基は、そのチオール及びアミノ基によってナノ粒子に結合する。さらに、ペプチドの遠位末端がカルボキシル基で終端する、又はペプチドが、カルボキシル基によってリガンドに結合していることが好ましい。アミノ酸配列の的確な選択は、ナノ粒子表面上の密な充填を可能にするアミノ酸によって決定され、これは、次に、とりわけナノ粒子の曲率によって決定される。コアペプチドは、CXn(リガンド)、CCXn(リガンド)、CXn(リガンド)Xn又はCCXn(リガンド)Xnの一般配列を有し得、ここで、Xは、任意のアミノ酸残基を表し、nは、アミノ酸残基の任意の長さを表す。好ましくは、リガンドから独立したペプチド配列は、H2N−システイン−アラニン−ロイシン−アスパラギン−アスパラギン−COOH(CALNN)またはH2N−システイン−システイン−アラニン−ロイシン−アスパラギン−アスパラギン−COOH(CCALNN)の配列を有する。
本発明の他の側面に従って、実質的に類似のアミノ酸配列の複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲート(該ペプチドは、該ペプチドの中央領域に位置するシステイン(C)残基によって該ナノ粒子に結合される)が提供される。
ペプチドが、中央に位置するシステイン残基によってナノ粒子に結合する場合、ペプチドの中央領域に2つ以上のシステイン残基が存在し得る。好ましくは、システイン残基のいずれかの側のペプチド配列は、実質的に対称的である。従って、ペプチドは、(リガンド)XnCXn(リガンド)、Xn(リガンド)XnCXn(リガンド)Xn、(リガンド)XnCCXn(リガンド)またはXn(リガンド)XnCCXn(リガンド)Xnの一般配列を有し、ここでXは、任意のアミノ酸残基を表し、nは、アミノ酸残基の任意の長さを表す。好ましくは、リガンドから独立のペプチドは、NNLACALNNまたはNNLACCALNN配列を有する。
ナノ粒子コンジュゲートは、ペプチド又はリガンドに結合した同定手段を更に含み得る。ナノ粒子コンジュゲートは、ペプチド又はリガンドに結合した官能基(同定手段に追加的又はそうでない)を更に含み得る。“同定手段”は官能基も含むと理解される。アミノ酸残基の更なる配列は、リガンドと同定手段及び/又は官能基及び/又はリガンドまたは同定手段または官能基の間に配置される。従って、“スペーサー”エレメントが、コアペプチド配列とリガンドの間に配置され得、及び/又はリガンドと同定手段/官能基の間に配置され得る。更に、アミノ酸残基の更なる配列は、同定手段/官能基が存在しない場合、リガンドの後に配置され得、又は代替的に、それが存在する場合、該残基は、同定手段の後に配置され得る。更なる配列は、任意の配列を含み得るが、好ましくは、それは、2つ以上のグリシン残基を含む。
ナノ粒子コンジュゲートは、ペプチドの異なるサブグループを含み得る。更に、異なるリガンド及び必要に応じて、異なる同定手段及び/又は官能基がペプチドの異なるサブグループに結合し得る。従って、単一のナノ粒子(または少数のナノ粒子)は、一定範囲のリガンド及び/または同定手段及び/又は官能基で作られ得る。単一のナノ粒子は、次いで、サンプルの複数の試験を実施するために既知の活性のある他のものと併せて使用され得る。実際、ナノ粒子コンジュゲートは、ペプチドの遠位末端に更なるアミノ酸残基を有するリガンドと更なるアミノ酸残基を有さないリガンドを有するペプチドの混合物を有し得る。これが、例えば、サンプル中の2つ以上の蛋白質の共存などの多くの実験に多いに役立つことは明らかである。
ナノ粒子は、当業者に明らかである多くの材料から作られ得る。好ましくは、ナノ粒子は、以下の材料の1つから作られる;金属材料、磁性材料又は半導体材料。このような材料は、金、銀、コバルド、ニッケル、プラチナ、カドミウムセレニド又は硫化亜鉛(或いは、“量子ドット”または同様の粒子を作るために使用される他の材料)であり得る。
磁性ナノ粒子は、磁気共鳴イメージングのためのコントラスト増強剤(contrast enhancement agent)、ガンのための標的治療薬剤送達及び温熱療法などの生体医学における多くの用途を有する(Berry,C.C. and Curtis A.S.G.,(2003) J. Phys. D: Appl. Phys. 36: R189−206及びParkhurst, Q.A.et al.,(2003)J. Phys. D: Appl.Phys.36: R167−181)。磁気的にラベルされた標的によって生成された磁場が、高感度の磁気計を用いて直接的に検出される磁気的免疫検定技術も、開発されており(Chemla, Y.R., et al., (2002) P. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 14268−14272)、このような技術は、本発明に従って使用され得る。
磁性ナノ粒子が、本発明に従って使用される場合、そのようなナノ粒子は、それらが小さな外的/かけられた磁場又は磁気センサーのシグナルに強く(敏感に)反応する;しかし重力、ブラウン運動、粘度、ファンデルワールス相互作用等の他の力に弱く反応するように、好ましくは、大きな飽和磁化及び高い磁化率を有することは、当業者に明らかである。さらに、ナノ粒子は、粒子の凝集を回避するために、室温において超常磁性でもあり得る(即ち、磁場がない場合に磁気モーメントが自由に変動し、従ってそれは非磁性的な挙動をする)。磁性ナノ粒子のこれらの性質の完全な利用は、サイズ又は形状の単分散並びに、空気及び水溶液中の安定性を含む生物学的環境における完全又は実質的に完全な安定性を必要とし得る。
同定手段は、リガンドの標的分子への結合を同定する若しくは“標識付けする”ために一般的に使用される多くの分子及び/又は化合物から選択され得る。未だ開発されていない分子及び化合物も、同定手段として使用され得ることが理解される。好ましくは、同定手段及び/又は官能基及び/又はリガンドは、以下の1つ以上から選択される:ビオチン及び/又はアビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン、ヒスチジンタグ、NTA、放射性ラベル、抗原、エピトープまたはエピトープの一部、抗体、蛍光色素、核酸、認識配列、酵素、抗体、ペプチド、タンパク質、受容体又は標的分子、糖、多糖及び脂質。同定手段及び/又は官能基は、ヘパルニンサルフェート(heparnin sulphate)を含み得、このようなナノ粒子コンジュゲートは、水銀付加物と結合し得る。
リガンドシェルとしての合成ペプチド(そこに付着した同定手段及び/又は官能基を有するペプチド)の使用は、ナノ粒子を、所定比率の天然ペプチド及びエクステンション(それはタグ/シントンとして働く又は組換タンパク質である)を有するペプチドとインキュベートすることによって、化学量論的誘導体化を独特に可能にする。従って、精製は、必要であれば、タグ/シントン又は結合したマクロ分子の標準クロマトグラフィー特性を利用することができる。
従って、自動化され且つ極めて用途の広い合成ペプチド化学が、ペプチド中に同定手段及び/又は官能基(例えば、タグ)を導入するために使用され得る。同定手段及び/又は官能基は、天然である必要はなく、非天然であってもよい(後者は、例えば、特有の化学的反応性を有する合成側鎖を有するアミノ酸及びD−アミノ酸を含む)。
ナノ粒子に結合したリガンドは、ナノ粒子を特定のサイトに付着させるために(それは、サンプル内の特定分子の同定のため又は後の精製のために分子を保持するためであり得る)、他の分子と結合することができる多くの異なる分子であり得る。さらに、リガンドは、薬学的化合物を送達するために、特定のサイト(例えば、特定のエピトープを発現する細胞)にナノ粒子を向けるためにも使用され得る。好ましくは、リガンドは、次の1つ以上から選択され得る:核酸、抗体、ペプチド、タンパク質、受容体又は標的分子、糖、多糖及び脂質。
ナノ粒子コンジュゲートはまた、少なくとも1つの他のナノ粒子コンジュゲートに結合することができ、又はナノ粒子コンジュゲートアセンブリを形成するために、少なくとも1つの他のナノ粒子コンジュゲートに結合する。このようなアセンブリは、細胞表面上の多くの異なる抗原などの多くの可変部(variable)を同定するための診断ツール又はプロービングのために、或いは、例えば主なナノ粒子検体相互反応に関係するナノ粒子の数を増加することによりシグナルを増幅するための手段として使用され得る。
ここに記載されるナノ粒子コンジュゲートは、ナノ粒子に結合した、又はペプチドに結合した薬学的活性のある塩の化合物又は化合物の一部をさらに有し得る。従って、治療用化合物の送達は、異なる細胞又は細胞学的成分に向けられ得る。薬学的活性塩の一部の供給は、利用されるプロドラッグ療法の二段階アプローチを可能にし得る。
ナノ粒子は、1〜100nmの範囲の直径を有し得る。好ましくは、複数のペプチドが、ナノ粒子の周りにシェルを供給するために、ナノ粒子の表面を実質的に覆い得る。従って、このようなシェルが、多くの細胞学的及び生物学的環境を通してナノ粒子コアを“シールド(shield)”し、ナノ粒子が極めて安定なままであることを可能にすることは、当業者に明らかである。シェルは、多数のナノ粒子についてのカップリング効果を含むナノ粒子の光学的検出を可能にする。
12.3nmの金ナノ粒子は、ナノ粒子毎に約855±70ペプチドまで有し得る(この数値は、潜在的に、ナノ粒子毎500〜1500ペプチドの範囲内になり得るが)。これに基づいて、ペプチドの数は、異なる用途のために合わせられ得、それはまた、ナノ粒子の全表面積だけでなくその曲率にも依存するが、12.3nmの直径を有する実質的に球状のナノ粒子は、約475nm2の表面積を有し、これは、約1.1〜3.2ペプチド/nm2(ナノ粒子)を可能にすることと等しい。約1〜3.2ペプチド/cm2(ナノ粒子)の範囲にあることが好ましい。さらに、ナノ粒子上のペプチドの密度は、より大きなナノ粒子について異なり得る。好ましくは、ナノ粒子毎のペプチドの密度は、密に充填したアレンジメントを得るために、可能な限り高い。
ナノ粒子コンジュゲートは、診断アッセイの生成、タンパク質の分離及び/又は精製、或いは治療薬の製造に使用され得る。ナノ粒子コンジュゲートは、生物学及び化学及び応用分野内の幅広い範囲の用途に使用され得ることが明らかである。好ましくは、ナノ粒子コンジュゲートは、次の技術のいずれかと併せて使用され得る:クロマトグラフィー、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)、凍結乾燥、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、in situハイブリダイゼーション(ISH)、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、フローサイトメトリー、免疫組織化学、タンパク質精製、ウェスタンブロッティング、細胞遺伝的分析、分子相互作用アッセイ、固定され且つ生きた細胞/組織上の組織化学、及び高スループットスクリーニング;ナノデバイスの構築用のタグ/リガンドに向けられるナノ粒子の“ボトムアップ”アセンブリ(ペプチドシェル及び/又はタグ/リガンドが後に除去される場合も含む)。
本発明の他の側面に従って、ここにおいて上記に記載されるように、安定化溶液中で安定化されたナノ粒子をリン酸緩衝生理食塩水中の複数のペプチドと水中でインキュベートすることによってナノ粒子コンジュゲートを生産する方法が提供される。このような安定化溶液は、当業者に明らかであり、シトレート、アクリレート、又はオキサレート溶液及び未だ開発されない他のものを含み得る。1つ以上のリガンド及び必要に応じて1つ以上の同定手段及び/又は官能基は、ナノ粒子を用いたインキュベーションの前、又はインキュベーションの過程の間にペプチドに結合され得る。12.3nmAuナノ粒子について、ペプチドは、一般的にPBS、pH7.2中に溶解され、ペプチド(1mg/ml〜10μg/ml)とシトレート安定化ナノ粒子(6nM)をインキュベートする(1容量対1容量)。
本発明のさらに他の側面に従って、ここにおいて上記に記載されるように、1つ以上のリガンド及び必要に応じて1つ以上の同定手段を含む複数のペプチドをナノ粒子の合成時に含むことにより、ナノ粒子コンジュゲートを製造する方法が提供される。
ナノ粒子コンジュゲートを製造する両方の方法は、ナノ粒子コンジュゲートが使用前に保存又は輸送され得るように、凍結乾燥の使用をさらに用い得る。経時的に劣化又は変性し得る特定のリガンドのためにこれが必要とされ得ることは明らかである。
ナノ粒子コンジュゲートは、分子相互作用センサーとして使用され得る。ナノ粒子の“色”は、それらのサイズに依存し、ナノ粒子のサイズは、それらの双極子が結合するように、単に2つ以上の粒子を密な会合に持っていくこと(nmスケールにおいて、それは、タンパク質のスケールを示す)によって、変えられ得る。同定手段及び/又は官能基を取り込んだナノ粒子コンジュゲートは、従って、受容体二量化センサー(receptor dimerisation sensor)等の分子相互作用センサーとして使用され得る。このようなセンサーは、その活性が分子相互作用を妨げまたは促進することにより発揮される化合物の探索のための高スループットスクリーニング用途において、、非常に効率的(高感度、バックグラウンドがない、少量のマクロ分子が必要とされる)である。このようなセンサーはまた、“受容体”の二量化またはオリゴマー化を引き起こす分子の非常に効率的な検出を可能にする。
ナノ粒子コンジュゲートは、複雑な二次的遺伝子産物の分析のために使用され得る。例えば、グライコミクス(glycomics)は、合成がテンプレート駆動されない事実を被る分野である。従って、分析ツール及びアッセイは、精製方法及び検出システムの感度程度にだけ優れる。例えば、糖を還元するためのヒドラジド等の糖結合官能基を有するナノ粒子コンジュゲートは、数桁感度を上げる。この方法を使用するユーザーは、スクリーニングアッセイなどを利用する研究所であろう。
ナノ粒子コンジュゲートは、現在まで主として足場としてDNAを使用することに限られた生体電子工学の用途においても使用され得る。任意のバイオアッセイからの相互作用が生体電子工学デバイスアセンブリにおいて使用され得る。さらに、多くのこのような相互作用がスイッチングに役に立つ。1つの例は、アクチュエーターを形成するために、ナノ粒子を酸化還元基又はタンパク質(例えば、アズリン)に結合させることである。さらなる例は、リン酸化−脱リン酸化及びCa2+‐誘導型の構造変化及び結果的な結合反応を含み得る。幾つか場合において、時にペプチドシェル上のタグによって許容されるナノ粒子間の結合または構造を開拓するために、ナノ粒子を融合する手段によって、有機物質が部分的に又は完全に除去され得る。要するに、ペプチドシェル上に配置され得るタグの特異性及び範囲によって、ナノ粒子を一緒にするために利用可能なコンビナトリアルオーダー(combinatorial ordered)のアセンブリの範囲は、生体電子工学における用途を顕著に増加する。
本発明は、ここで以下の実施例及び図面を参照してより詳細に説明される。
実施例1
シトレート及びペプチドでキャップされた12.3nmの金ナノ粒子のスペクトルを調べるために、実験が行われた。
シトレート及びペプチドでキャップされた12.3nmの金ナノ粒子のスペクトルを調べるために、実験が行われた。
水中のシトレートナノ粒子は、CALNNペプチドを有する又は有しない1容量のリン酸緩衝生理食塩水と混合された。1mLのサンプルのスペクトルは、走査型分光計上で分析された。ペプチドの金ナノ粒子(50%PBSにおける)への吸着によって起こされたスペクトルのシフトは、水中のシトレートナノ粒子と比較された。
図1において示されるように、シトレートナノ粒子は、(凝集した金ナノ粒子の特徴である)622nmにおける吸収バンドの出現によって明らかなように、50%PBS(70mM NaCl、5mM Na2HPO4、pH7.2)において不安定である。逆に、50%PBS中のペプチドの存在は、金ナノ粒子の凝集を妨げた。518nmから521.1へプラズモンバンドにおいて2.1nmのシフトがあるため、メカニズムは、ペプチドの金ナノ粒子への吸着に起因するようである。従って、ペプチドのナノ粒子への吸着は、他のチオール化リガンドの金への吸着と比較して、驚くほど迅速である。この独特の実質的に即時のナノ粒子の安定化はまた、広範囲のペプチド濃度に亘って起こるようである。
実施例2
ペプチドでキャップされた12.3nmの金ナノ粒子のSephadexG25カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーを実施するための実験が行われた。
ペプチドでキャップされた12.3nmの金ナノ粒子のSephadexG25カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーを実施するための実験が行われた。
図2に示されるように、ペプチドで安定化されたナノ粒子は、Sephadex G25サイズ−排除カラム(クロマトグラフィー範囲1000Da〜5000Da、ボイド容量>5000Da)上のサイズ−排除クロマトグラフィーによって、遊離ペプチド及びシトレートから分離されることが見出された。ナノ粒子は、ボイド容量中に溶出され、一方で遊離ペプチドは、Vt付近でクロマトグラフされ、シトレートはVt直前の後のピークにおいて溶出した。予測されるように、カップリング反応においてナノ粒子の濃度が減少し、一方でペプチドの濃度が一定に維持されると、ナノ粒子及びシトレートのピークは低下し、一方でより少量がナノ粒子に吸着するため、遊離ペプチドのピークにおいて小さいが有意な増加が存在する。
G25上のクロマトグラフィーによって精製されたペプチドでキャップされたナノ粒子は、過剰なペプチド及びシトレートが無く、実施例4及び図4に記載されるもの以外の以下の実験全てにおいて使用される。
実施例3
ペプチドキャップされたナノ粒子のある範囲のpH及びNaCl濃度に亘る安定性を評価するために実験が行われた。
ペプチドキャップされたナノ粒子のある範囲のpH及びNaCl濃度に亘る安定性を評価するために実験が行われた。
図3Aは、ペプチドキャップされた12.3nmの金ナノ粒子の安定性に対するpHの影響を示す。10%(v/v)PBS中のペプチドキャップされたナノ粒子溶液のpHが、調整され、スペクトルが5分のインキュベーションの後に記録された。522nm(安定、単一ナノ粒子)及び622(ナノ粒子の凝集体)における吸光度の割合がナノ粒子の安定性の測定尺度として使用される。ペプチドキャップされたナノ粒子は、それらがpH4〜pH12で安定であるため、pH媒介された(mediated)凝集に顕著な抵抗性を示した。
図3Bは、NaCl濃度のナノ粒子の安定性に対する影響を示す。ナノ粒子は、異なる濃度のNaCl(pH7.0)において5分間インキュベートされた。1MのNaClにおいて認識できるスペクトルのシフトはないが、1.5Mからナノ粒子の安定性は、低下し始める(622nmにおける吸光度の上昇によって実証される)。1M NaClにおいて、ペプチドキャップされたナノ粒子は、数週間安定であることが見出された。
実施例4
ペプチドキャップされた12.3nmの金ナノ粒子上に吸着したペプチドの量を滴定によって評価するために、実験が行われた。
ペプチドキャップされた12.3nmの金ナノ粒子上に吸着したペプチドの量を滴定によって評価するために、実験が行われた。
吸着したペプチドの全量を確立するための滴定が実施され、次いでナノ粒子が遠心によって除去された。上清中の遊離ペプチドの濃度は、上清の190nmにおける吸光度を測定することによって測定された。この値は、遊離ペプチドの相対量を定めるため、そして従って、ナノ粒子に結合したペプチドの概算量を決定するために使用された。図4は、直径12.3nmの粒子毎に約855±70ペプチドが存在することを示す(プロトコールの改良によって直径12.3nmのナノ粒子に1500ペプチドまで結合し得ることが考えられるが)。
実施例5
ペプチドキャップされた12.3nmの金ナノ粒子上のペプチドのオリエンテーション実験が陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、DEAE−Sepharoseカラム上で行われた。
ペプチドキャップされた12.3nmの金ナノ粒子上のペプチドのオリエンテーション実験が陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、DEAE−Sepharoseカラム上で行われた。
ペプチドキャップされたナノ粒子は、0.1M NaCl(pH7.2)中のDEAE Sepharoseファーストフローカラム(0.5ml)上に載せられた。このカラムは次いで、NaCl(pH7.2)を次第に上昇することにおいて、溶出された。
図5は、ナノ粒子が0.4M NaClにおいて溶出されたことを示し、これは、それらが非常に陰イオン性であることを実証する。ペプチド上の唯一の陰イオン基は、C末端のカルボン酸である。一般的に、このような基は、それらが親和力効果を生み出す高局所濃度にあるのでない限り、ずっとより低い濃度のNaClにおいて溶出する。従って、もし全てでなければ、ナノ粒子に吸着したペプチドの大部分が、金表面上のN−末端方向を向いており、C末端は溶媒に曝されていることが見出された。
実施例6
キャッピングペプチド上のリガンドによって駆動されるナノ粒子の特別な会合を評価するために、実験が行われた。
キャッピングペプチド上のリガンドによって駆動されるナノ粒子の特別な会合を評価するために、実験が行われた。
ナノ粒子は、10:1の割合の標準ペプチド(CALNN)と3つのアミノ酸C−末端エクステンション及びビオチンを含む標準ペプチドでキャップされ、コアへのエクステンションを有するペプチドを含むナノ粒子コンジュゲートの構造はCALNNK(ビオチン)GGである。Sephadex G25上の精製に続いて、ビオチン化された12.3nmのナノ粒子は、アビジンで覆われた5nmのナノ粒子と混合され、これら後者は標準方法によって作られ、TEMグリッドに送られ、イメージが撮られた。
図6A及び6Bは、12.3nmのビオチン化されたナノ粒子及び5nmのアビジンで覆われたナノ粒子の高い相対比率を示す。低倍率(100nmのスケールバー、パネルA)において、イメージは、ナノ粒子の大きな複合体が明確であることを示す。複合体のより高い倍率において(10nmスケールバー、パネルB)、それが多くの12.3nmナノ粒子からなることが明らかである。5nmのアビジンで覆われたナノ粒子のブリッジングは、主として不明瞭である。
図6C及び6Dは、コントロール実験の結果を示し、ここで12.3nm及び5nmのナノ粒子の比率は図6A及び6Bと同一であるが、12.3nmのナノ粒子は標準のビオチン化されていないペプチドのみでキャップされている。12.3nmのナノ粒子上にビオチンがない場合、2つのサイズのナノ粒子間の複合体はどちらの倍率においても明確ではなく、12.3nmのナノ粒子及び5nmのアビジンで覆われたナノ粒子の会合は、ビオチンによって特異的に駆動されることを明らかに実証する。
図6E及び6Fは、混合物中の12.3nmのナノ粒子の5nmのアビジンで覆われたナノ粒子に対する、図6A〜Dよりも5倍低い比率を示す。図6(E)において、ビオチン化された12.3nmのナノ粒子は、5nmのアビジンで覆われたナノ粒子と混合され、数個の5nmのアビジンで覆われたナノ粒子によって囲まれたコアの12.3nmのナノ粒子から成る複合体を明らかに形成した。図6F標準において、ビオチン化されていないペプチドでキャップされた12.3nmのナノ粒子は、5nmのアビジンで覆われたナノ粒子と混合された。12.3nm及び5nmのアビジンで覆われたナノ粒子間で会合は見られず、再度、それらの会合がビオチン−アビジン相互作用によって駆動されることを示した。
実施例7
前の実施例において概説したように、ナノ粒子コンジュゲートは、リガンド誘導型二量化のためのセンサーのための基礎として使用され得る。図7Aは、HBM(ハイブリッド二層膜)に固定され、且つ特別なタグを介してN末端においてナノ粒子に結合されるFGFR1−GPI(繊維芽細胞増殖因子受容体1の細胞外ドメイン−グリコシルホスファチジリノシトールアンカー)を示す。図7Bは、リガンド(FGF−2(繊維芽細胞成長因子)、三角)による受容体(FGFR−1)の二量化の誘導を示し、図7Cは、ヘパラン硫酸(HS)共受容体(鎖)を示す。ナノ粒子−オリゴ糖コンジュゲート(オーログリカン(auroglycan))の使用は、図7Dに示される複合体におけるHSの機能を探索するための手段を提供する。分子の相互作用によって一緒にされるナノ粒子の近接は、結果それらの双極子カップリングを生じ、従って、観測されるプラズモンバンドのレッドシフトを生じ、そしてナノ粒子によって散乱された光の周波数を生じる。原理上、感度は、1ナノ粒子またはナノ粒子の群である。
前の実施例において概説したように、ナノ粒子コンジュゲートは、リガンド誘導型二量化のためのセンサーのための基礎として使用され得る。図7Aは、HBM(ハイブリッド二層膜)に固定され、且つ特別なタグを介してN末端においてナノ粒子に結合されるFGFR1−GPI(繊維芽細胞増殖因子受容体1の細胞外ドメイン−グリコシルホスファチジリノシトールアンカー)を示す。図7Bは、リガンド(FGF−2(繊維芽細胞成長因子)、三角)による受容体(FGFR−1)の二量化の誘導を示し、図7Cは、ヘパラン硫酸(HS)共受容体(鎖)を示す。ナノ粒子−オリゴ糖コンジュゲート(オーログリカン(auroglycan))の使用は、図7Dに示される複合体におけるHSの機能を探索するための手段を提供する。分子の相互作用によって一緒にされるナノ粒子の近接は、結果それらの双極子カップリングを生じ、従って、観測されるプラズモンバンドのレッドシフトを生じ、そしてナノ粒子によって散乱された光の周波数を生じる。原理上、感度は、1ナノ粒子またはナノ粒子の群である。
実施例8
ナノ粒子コンジュゲートを作るために2つの実験が行われ、ここでペプチドが銀ナノ粒子の合成時に取り込まれ、2つの実験は、二相合成及び単相合成を含む。
ナノ粒子コンジュゲートを作るために2つの実験が行われ、ここでペプチドが銀ナノ粒子の合成時に取り込まれ、2つの実験は、二相合成及び単相合成を含む。
相間移動触媒ペプチドの2m/ml溶液の1mLが、次いで混合物に添加され、15分間撹拌された。7.5mLの0.4Mの水素化ホウ酸ナトリウム水溶液が、次いで一滴ずつ添加され、溶液は、2時間撹拌された。相は次いで分離され、接合したペプチドなくAg粒子を除去するために水相は濾過された。
一相合成は、2mg/mLの水中のペプチド溶液1mlを25mMの硝酸銀水溶液9mLに添加することによって実施され、混合液は、次いで15分間撹拌された。混合液に、0.4Mの水素化ホウ酸ナトリウム水溶液7.5mLが一滴ずつ添加され、溶液は、2時間の撹拌のため放置された。次いで、接合したペプチドなくを用いる二相合成は、25mMの硝酸銀水溶液9mLをトルエン中の0.2Mのテトラオクチルアンモニウムブロミド溶液7mlに添加することによって実施された。この混合物はついで、室温で1時間激しく撹拌された。DMF(又はDMSO、水等)中のペプチドの2mg/ml溶液の1mLが、次いで混合物に添加され、15分間撹拌された。7.5mLの0.4Mホウ水素化ナトリウム水溶液が、次いで滴下され、溶液は、2時間撹拌された。相は次いで分離され、結合したペプチドではなくAg粒子を除去するために水相は濾過された。
一相合成は、2mg/mLの水中のペプチド溶液1mlを25mMの硝酸銀水溶液9mLに添加することによって実施され、混合液は、次いで15分間撹拌された。混合液に、0.4Mのホウ水素化ナトリウム水溶液7.5mLが滴下され、溶液は、2時間の撹拌のため放置された。次いで、結合したペプチドでないAg粒子を除去するために該水が濾過された。
要約すると、二相合成において、ペプチドは水相に含まれ、一方で一相合成においてペプチドは反応混合液に含まれる。ナノ粒子コンジュゲートは、金属塩の還元の後、水相中に現れる。
実施例9
金ナノ粒子に結合した場合のペンタペプチドCALNNのタンパク質の折りたたみ問題及びそのバリエーション/関連する配列を評価するための研究が実施された。金ナノ粒子に結合した58個の異なるペプチド配列の効果、大部分がナノ粒子への結合のために少なくとも1つのシステイン残基を含んでいた。これらのペプチドによって付与された安定性は、それらの長さ、疎水性、及び電荷に依存することが見出され、幾つかの場合において、CALNNと比較したさらに向上した安定性を結果生じた。
金ナノ粒子に結合した場合のペンタペプチドCALNNのタンパク質の折りたたみ問題及びそのバリエーション/関連する配列を評価するための研究が実施された。金ナノ粒子に結合した58個の異なるペプチド配列の効果、大部分がナノ粒子への結合のために少なくとも1つのシステイン残基を含んでいた。これらのペプチドによって付与された安定性は、それらの長さ、疎水性、及び電荷に依存することが見出され、幾つかの場合において、CALNNと比較したさらに向上した安定性を結果生じた。
ペプチド配列の設計は、金に対する強い親和性、実質的に水を排除する密な層に自己組織化する能力及び水中での溶解性及び安定性を確実にする親水性末端を有する必要性が考慮された。前の実施例に記載するように、ペンタペプチドCALNNが最初に開発され、このペンタペプチドは、必要条件を満たすことにおいて成功であった。N末端のシステインの側鎖におけるチオール基は、金表面への共有結合を作る能力を有する。アミノ基は、金表面と強い相互作用を有するとも知られているため、このような相互作用は、N末端の第一級アミンのものに対して付加的であり得る。理解され得るように、CALNNは、5つの天然アミノ酸の3,200,000の可能性ある配列の1つである。ペプチド配列のシステマチックなバリエーションは、異なるペプチドによって付与される金ナノ粒子の安定性を評価するために合成された。CALNNに直接関連性のない9つの配列も試験され、これらは、水素結合及びβ−ストランド形成並びにペプチドの中央または両端におけるチオール(システイン)の存在に基づいた。
以下の表は、合成され、そして分析されたペプチドを列挙する:
金ナノ粒子の電解質誘導型の凝集に対する、これら58のペプチドの影響が研究された。ペプチドの幾つかは、非常に疎水性であったため、配列の比較を容易にするために、ジメチルスルホキシド(DMSO)が水性金コロイド溶液におけるそれらの取り込みのための共通溶媒として使用された。一時間後、pHは7に調節され、NaCl濃度が漸進的に増加し、同時に吸光度スペクトルがモニターされた。
調査された配列のうち19について、ペプチドの添加は、粒子の即時的凝集を誘導した。これらのペプチドは、共通の構造的特徴としての2つの粒子をくっ付ける能力を共有する。それらの殆どがチオールの遠位にアミノ基(リジン上、K)又はグアニジノ基(アルギニン上、R)を有する。これらの基は、金に対する強い親和性を有する。NNLAC(CALNNの逆配列)は、同じ理由で凝集を誘導する。方向性は別として、これら2つのペプチド間の唯一の違いは、CALNNにおいてアミノ末端基は、チオール基を有するシステイン上にあるが、NNLACにおいてシステインのチオールは、末端のカルボン酸に隣接し、アミノ末端基は、1位におけるアスパラギン(N)上にあることである。CAALPDGLAAC及びCVVITPDGTIVVCもまた、凝集を誘導することが見出された。
研究の間、第一アミノ酸(Anchorage)及びペプチドの長さの影響も評価され、二つのアミノ酸のペプチド(CA)について、凝集パラメーターがNaCl濃度と共に急激に上昇することが見出された。CAからCAL、CALN、そして最終的にCALNNにペプチドの長さが増大すると、NaCl誘導型凝集は、益々高い濃度のNaClに置換され、ペプチドの長さとペプチドでキャップされたナノ粒子の安定性の間の正の相関を示す。チオール含有ペプチドCALNN及びCCALNNは、KALNN及びAALNNよりも遥かに高い安定性を示すため、明らかにチオール基は、安定化において主要な働きをする。興味深い事に、AALNNでキャップされたナノ粒子の凝集は、KALNNでキャップされたナノ粒子よりも高い濃度のNaClにおいて起こる。KALNNにおける末端アミノ基のより高い密度は、ペプチド間の一定の静電反発を結果生じ得、これは、自己組織化単分子膜の形成を妨げ得る。さらに、AALNNにおけるアラニンのさらなるメチル側鎖に起因する疎水性相互作用も、AALNNの増加した安定性を結果として生じ得る。
位置2及び3におけるアミノ酸の影響も評価され、ペンタペプチドの疎水性コア(第二及び第三アミノ酸)は、他の疎水性アミノ酸(表1のコア、疎水性を参照)に変えられた。9つの結果生じたペプチドは、親のCALNNペプチドのものと同様のNaCl誘導型の凝集に対するナノ粒子の一定の安定化を提供した。フェニルアラニン(F)等の嵩高い芳香族アミノ酸さえ、ペプチドの自己組織化単分子膜を崩壊させるようには見えない。幾分驚くべき事に、粒子の曲率を考慮するために、CALNNが位置3においてより嵩高い疎水性基を用いて設計されたことを考慮すると、位置2における嵩高い疎水性側鎖(I及びF)は、位置3に存在する時よりも、NaCl誘導型の凝集に対してより良い安定性を提供すると思われる。従って、CILNNは、CAINNよりも安定であり、CFLNNは、CAFNNよりも安定である。チャージした(K及びD)及び中性の親水性(T、S、及びN)アミノ酸は、前の疎水性コアに置換された(表1、コア、親水性)。チャージしたアミノ酸の存在は、凝集に対して一般的に乏しい保護を提供するペプチド配列を結果生じる。例えば、第三位置における負の電荷の存在(CADNN)は、第二位置におけるよりも優れた安定性を提供すると思われるが、CDDNN−、CKLNN−、及びCDLNN−キャップされたナノ粒子は、低NaCl濃度で凝集する。逆に、中性の親水性アミノ酸で置換されたペプチド、CNLNN,CANNN、CTLNN、CATNN、及びCTTNNでキャップされたナノ粒子は、疎水性コアを有するペプチドのものに匹敵するNaCl濃度において一般に凝集する(中性の親水性アミノ酸の幾つかの組合せ(CTSNN)は、許容されないと見出されたが)。要約すると、位置2及び3におけるアミノ酸は、安定性を提供するために、隣接するペプチド鎖間の幾らかの引力のある相互作用を必要とすると思われる。従って、極性及び疎水性のアミノ酸は、各々水素結合及び疎水性相互作用を介して自己組織化単分子膜の形成を促進する。しかし、コアにおけるチャージしたアミノ酸側鎖の静電反発は、密なペプチド層の形成を妨げ得、従って乏しい安定化に導く。
位置4及び5におけるアミノ酸の影響も評価され、そしてペプチドのカルボン酸末端の役割(表1、端)も取り組まれた。この研究のために選択された配列の殆どは、ペプチドの添加でナノ粒子の即時の凝集を誘導する。7つのペンタペプチド配列は、一定の安定化を提供する。末端の2つのアミノ酸の安定性と同一性の間の明確なパターンは見られなかったが、これらの結果は末端アミノ酸の電荷がペプチドでキャップされたナノ粒子の安定性に顕著に貢献することを示した。第二の末端の陰電荷を導入すること(CALND、CALLD、CALSD、CALKD)は、ペプチドでキャップされたナノ粒子の凝集を誘導するNaCl濃度を低下する。余分な陰電荷の存在及び末端アミノ酸間の水素結合がないことは、ペプチドのパッキングに影響し得、CALNNでキャップされたナノ粒子のものと同様の表面電荷密度を有するが、より緻密でない保護ペプチド層を有する粒子へ導く。末位から二番目のNを水素結合により影響を受けにくい側鎖を有する残基で置換することは(例えば、CALND対CALSD)、安定性を低下するため、末端アミノ酸間の水素結合は、重要な役割を担っているようである。
コンビナトリアル分析は、最初の設計基準を確証する。それは、金ナノ粒子へのアンカーとしてのチオール(システイン)の必要性、ペプチドの長さと安定性の間の明らかな相関及び、高い安定性を供給するための疎水相互作用または水素結合による隣接するペプチド鎖間の結合性のある相互作用の必要性を確立する。ペプチドの電荷及び結合性のある相互作用の間のバランスが主要な役割を果たすことが示される。コンビナトリアル分析はまた、金ナノ粒子の即時的凝集へと導くペプチドのための基準の定義を可能にする。
CALNNに関連のない他の配列(CCVVVT、CVVIT及びCTTT)(これも試験された)はそれらの強いβ−ストランド形成特性のために選択された。NNLACALNN及びNNLACCALNNは、それらの配列の中央に各々1つ及び2つのシステインを有する。結合は、システインにおける中央のチオールにおいて優先的に起こることが期待されるため、これら2つのペプチドは、ペプチド−水界面においてカルボン酸及びアミノ末端基が露出される全体的に中性の表面を有するはずである。第2のシステイン(C)の存在は、おそらくパッキングにより好ましいペプチド構造を課すことによって、安定性を格段に向上する。2つのβ−ストランド形成ペプチド、CCVVVT及びCTTTTはまた、500mMのNaClにおける凝集パラメーターの小さな値で、非常に見込みある挙動を示す。特に、CCVVVTは、500mMのNaClにおいて凝集を示さず、CALNNよりも優れた安定性を有する。比較的少数の配列が試験されたことを考慮すると、より大きいライブラリーの使用は、より良い特性を有するキャッピングリガンドの同定を可能にする。
実施例10
バイオアプリケーションのための多くのペプチドでキャップされた水溶性磁性ナノ粒子を調製及び特徴付けるための実験が行われた。特に、一連のコバルト物質が、他の磁性材料と共に分析された。
バイオアプリケーションのための多くのペプチドでキャップされた水溶性磁性ナノ粒子を調製及び特徴付けるための実験が行われた。特に、一連のコバルト物質が、他の磁性材料と共に分析された。
コバルトナノ粒子は、サイズの完全制御で合成され(Puntes, V.F.,et al., (2001) Science 291: 2115−2117)、所望される高い磁気モーメント及び感受性を有する。しかし、それらは、有機溶媒環境において安定であるだけで;水中で、それらは酸化してCo2+を与える。これらの種(例えば、水酸化コバルト)は、金属の磁気特性を有さない。水中で溶解性のある磁性粒子を作成するための二つの主なアプローチは、in situ合成及び相間移動である。ペプチド存在下のCoナノ粒子のin situ合成は、Au−シトレートナノ粒子を使用したものに類似する、明らかな置換反応に加え、水溶性のCoナノ粒子を作るためのルートとして説明される。密に詰まったリガンドシェルへのペプチドの急速な自己組織化は、他の金属ナノ粒子を安定に保護すると示された(Levy, R., et al., (2004) J. Am. Chem。Soc., 126, 10076−10084)。従って、ナノ粒子の表面上への認識基の導入は、リガンド交換/合成時に、特定のタグを有する所定パーセントの修飾されたペプチドを含むことによって容易に成し遂げられ得る。幾つかの可能性あるプロトコールがある:1つは、Puntesの文献であるが、有機溶媒中のオレイン酸/TOPOリガンドをDMF又はDMSO中に溶解したペプチドで置換する−これは、TEM中で該物質を与える。Auはシトレートで安定化され、水中であるが、Coは、Puntesの文献に記載される溶媒(例えば、ジクロロベンゼン、トルエン)において開始するため、他の方法は、Auに類似するが、詳細において異なる。例えば、以下である:
1. 過剰なリガンド全てを除去するために、Coナノ粒子を溶媒で洗浄する。実際、これは、Puntesの文献に記載されるオレイン酸及びTOPOであるが、将来に開発される任意の他のものでもあり得る。
2. DMASO又はDMF中に溶解されるペプチドを添加する。
3. リガンド交換を可能にするために、混合及び放置する。これは、Au又はAgと比較した相対的な様子である。
4. 溶媒を除去する。
5. 水を添加する。
注:Coナノ粒子の洗浄は、それらの磁性を利用し得る:マグネットは、チューブの横に配置され得、液相が除去される。
1. 過剰なリガンド全てを除去するために、Coナノ粒子を溶媒で洗浄する。実際、これは、Puntesの文献に記載されるオレイン酸及びTOPOであるが、将来に開発される任意の他のものでもあり得る。
2. DMASO又はDMF中に溶解されるペプチドを添加する。
3. リガンド交換を可能にするために、混合及び放置する。これは、Au又はAgと比較した相対的な様子である。
4. 溶媒を除去する。
5. 水を添加する。
注:Coナノ粒子の洗浄は、それらの磁性を利用し得る:マグネットは、チューブの横に配置され得、液相が除去される。
以下の表は異なる材料の磁気特性を列挙し、Coナノ粒子は小さなサイズと高い磁化飽和を組み合わせることを示し、それは、非常に需要の多い物質である:
以下のペプチドは、本発明に従った使用のためのコバルトナノ粒子の安定性を試験するために、ナノ粒子合成時にin situでナノ粒子と結合された:
サンプルは、明視野(BF)及び暗視野(DF)透過型電子顕微鏡によって調査され、そのナノ粒子は図8において見られ得る。図8の暗視野の図は、透過電子の代わりに回析電子によって作られたイメージを見ることにより成る。暗視野イメージングは、有機物質内の金属ナノ粒子(NP)の直接的な観察を提供する。異なるタイプの化合物が基板上に堆積したことが見出された:有機(ペプチド)小滴に埋没した7nmの金属粒子、大きな凝集体及び個別のナノ粒子、並びにこれらの組合せ。疎水性NPが有機溶媒から親水性基板上に蒸発される場合と異なり、自己組織化は、観察されなかった。
図9は、異なる合成についてのX線回析パターン(Co ka=1.798)を示し、ここでhcp及びイプシロンCoの結晶構造が現れる(純粋な又はCo酸化物及び水酸化物との混合(*ピーク))。ピークの広さは、それらのナノメートルサイズに関連する。
ナノ粒子は、SQUID[SQUID=機器であり方法ではない]によって分析され、ZFC/FC測定(図10)は、約6KにおいてZFC曲線中にピークを示す。これは、サンプル中のNPの直径が数ナノメートルよりも小さい証拠である。これらの小さい粒子のモーメントは低温でブロックされ、そのように観察されたZFC/FC曲線に導く。しかし、サンプルはまた、幅広いサイズ分布のより大きなサイズのNPを含む。結果として、ZFC及びFC曲線は、ピーク(6K)の位置ではなく、非常に高い温度で分離する。室温でさえ、我々は、オープンヒステリシスループ(open hysteresis loop)を観察し(図10の挿込み)、これは直径約10nmの幾つかの粒子もサンプル中に存在することを示す。
置換実験において、オレイン酸及びTOPOを用いて合成された10nmのCoナノ粒子は(前に参照されたPuntesのScienceの参考文献)、トルエン中で洗浄され、この溶媒中で再懸濁され、次いでペプチドと混合された。ライブラリーからの58ペプチド全てが、試験された。ナノ粒子の凝集の状態は6日にわたり続いた。この後、それらは、凍結乾燥され、水中に再懸濁された。幾つかのペプチド(そのうちCALNNが最も効果的であった)は、ナノ粒子が磁気特性を保持しつつ水中で再懸濁されることを可能にした。凍結乾燥の代わりに、溶媒は、簡単にCoナノ粒子から除去され、水で置換され得る。
実施例11
多くのペプチドでキャップされた銀(Ag)ナノ粒子をペプチドリガンドのシトレート−Auナノ粒子上への置換によって調製及び特徴付けるために実験が行われた。
多くのペプチドでキャップされた銀(Ag)ナノ粒子をペプチドリガンドのシトレート−Auナノ粒子上への置換によって調製及び特徴付けるために実験が行われた。
Au粒子と同様に、Agナノ粒子の安定化は、即時的であり、極めて安定なナノ粒子を作る。水性環境において酸化するAgの傾向を考慮すると、ペプチドによるAgナノ粒子の長期安定化は、ペプチドリガンドの顕著な特性のさらによりストリンジェントな試験を与える。安定性は、ペプチドの添加後、10〜15分(以下“短期”)及び24時間(以下“長期”)で測定される。実際、長期の安定性を示す粒子の調製物は、数ヶ月間安定である。標準のナノ粒子調製物は、10mMのTris(pH8.0)(別途示されない限り)中であり;NaClはこのバッファーに追加的である。実験の結果は、以下の図面を参照して見られ得る:
図11 Ag−CALNN: ペンタペプチドCALNNは、シトレートAg−ナノ粒子水溶液に添加された。シトレートAgナノ粒子は、直径15.3+/−6.4nmであった。精製された粒子の溶液は、異なるpH値(A)及びNaCl濃度(B)において試験された。パネルAは、粒子がpH4〜12で長期安定性を示すことを示す。パネルBは、粒子が1M NaCl以下で安定であることを示す。これは、短期と長期の両方について当てはまる。
図11 Ag−CALNN: ペンタペプチドCALNNは、シトレートAg−ナノ粒子水溶液に添加された。シトレートAgナノ粒子は、直径15.3+/−6.4nmであった。精製された粒子の溶液は、異なるpH値(A)及びNaCl濃度(B)において試験された。パネルAは、粒子がpH4〜12で長期安定性を示すことを示す。パネルBは、粒子が1M NaCl以下で安定であることを示す。これは、短期と長期の両方について当てはまる。
図12 Ag−CCALNN: ヘキサペプチドCCALNNは、シトレート−Agナノ粒子の水溶液に添加された。精製された粒子の溶液は、異なるpH値(A)及びNaCl濃度(B)において試験された。パネルAは、粒子がpH4〜12で安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。パネルBは、粒子が1M NaClまでで安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。
図13 Ag−CVVVT: ペンタペプチドCVVVTは、シトレートAgナノ粒子水溶液に添加された。精製された粒子の溶液は、異なるpH値(A)及び塩濃度(B)において試験された。パネルAは、粒子がpH2〜12で短期の安定性を示し、pH2〜6でプラズモンピークのシフトを有することを示す。該粒子は、pH2及び3において長期の安定性を示さない。パネルBは、該粒子が1MのNaClまでで安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。
図14 Ag−CCVVVT: ヘキサペプチドCCVVVTがシトレート安定化Agナノ粒子の水溶液に添加された。精製された粒子の溶液は、異なるpH値(A)及びNaCl濃度(B)において試験された。パネルAは、粒子がpH2〜12で短期の安定性を示し、pH2〜6でプラズモンピークのシフトを有することを示す。該粒子は、pH2及び3において長期の安定性を示さない。下のグラフは、該粒子が1M NaClまでで安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。
CALNNでキャップされたAgナノ粒子は、二相の修飾されたBrust合成において作られた。簡略に、銀は、トルエン、水及び相間移動触媒の二相混合においてペプチドの存在下で還元される。
図15 Ag−CALNN:精製された粒子の溶液は、異なるpH値(A)及びNaCl濃度(B)において試験された。パネルAは、該粒子がpH3〜12で短期の安定性を示すことを示す。pH3において粒子は、長期の安定性を示さない。パネルBは、粒子が1MのNaClにおいて安定であることを示す。これは、短期及び長期の両方について当てはまる。
図16 Ag粒子のTEM: パネルA〜C シトレートを用いた置換によって作られるCALNNでキャップされたAgナノ粒子。シトレートを用いた置換によって作られるCALNNでキャップされたAgナノ粒子のTEMイメージ。大部分の粒子の直径は、10〜20nmであり、直径16.3+/−4.5nmのサイズ分布(平均±SD)を有することが見出された。該粒子は、殆どが球形状であり、そのサイズ範囲に亘って優れた形状の均一性を示す。パネルD〜F CALNNを用いた二相合成において作られたAgナノ粒子。二相合成において作られ、そして前の安定性試験において使用されたCALNNでキャップされたAgナノ粒子のTEMイメージ。大部分の粒子の直径は、5〜15nmであり、直径8.2+/−2.4nmのサイズ分布(平均±SD)を有する。該粒子は、殆ど球形状でありそのサイズ範囲に亘って優れた形状の均一性を示す。
図17 CL−6Bカラム上のAg−PEG及びAu−CCALNNの分離: Agナノ粒子の合成は、Auナノ粒子のための合成のような比較的単分散の粒子を結果生じないため、重力駆動のゲルろ過カラム上のサイズ分離がサイズ分布を下げるために使用される。これらは、分離したエンティティーであると目で容易に検出されるため、実験は、Au及びAgナノ粒子を用いた概念実証実験を実証する。12nmのCALNNでキャップされたAuナノ粒子(赤)は、直径3〜7nmのテトラエチレングリコールでキャップされたAgナノ粒子(黄色)から分離される。(A〜C)より小さいAgナノ粒子からのより大きいAuナノ粒子の漸進的な分離を示すCL−6Bのカラム上のクロマトグラフィーの進行。(D)CL−6Bカラムから集められた1mLの画分は、2つのサイズの粒子の明確な分離を示す。
実施例12
Auペプチドでキャップされたナノ粒子を官能化するために実験が行われた。
Auペプチドでキャップされたナノ粒子を官能化するために実験が行われた。
ペプチドリガンドは、2つの特徴的な性質を有する。第一は、ナノ粒子を瞬時に安定化するそれらの能力である。第二は、それらが、所定の原子価を有するナノ粒子を作ることによる制御様式においてナノ粒子を官能化するための特有のルートを提供することである。これらの実験は、ペプチドの官能化の幾つかの例を提供し、ペプチド−DNA研究は、官能化の原子価を制御する原理を実証する。実験の結果は、以下の図を参照して見られ得る:
図18は、安定化のためのマトリクスペプチド(この場合CALNN)及び特定の官能性(通常は、認識機能)を付与するエクステンションを有する所定モルパーセントの1つ以上のペプチド種(与えられた例においてCALNNXXX及びCALNNYYY)を用いる原理の略図を示す。ナノ粒子毎のペプチドリガンドの数は知られており(12.3nmのナノ粒子について855±70)、この数は、マトリクスペプチド:官能化ペプチドの比率を選択するために使用される。例えば、比率1000:1は、1つの官能化されたペプチドを有する大部分のナノ粒子を生じる。一原子価置換は、例えば3000:1等のより高い比率及び官能化されていないナノ粒子を除去するためのエクステンションの特有の性質に基づくクロマトグラフィー分離(実際は、アフィニティークロマトグラフィー)を使用して達成される。アフィニティークロマトグラフィーにおける溶出勾配及びより低いペプチド比率を使用して、異なる原子価のナノ粒子種が精製され得る(ジ、トリ、などの原子価)。
図18は、安定化のためのマトリクスペプチド(この場合CALNN)及び特定の官能性(通常は、認識機能)を付与するエクステンションを有する所定モルパーセントの1つ以上のペプチド種(与えられた例においてCALNNXXX及びCALNNYYY)を用いる原理の略図を示す。ナノ粒子毎のペプチドリガンドの数は知られており(12.3nmのナノ粒子について855±70)、この数は、マトリクスペプチド:官能化ペプチドの比率を選択するために使用される。例えば、比率1000:1は、1つの官能化されたペプチドを有する大部分のナノ粒子を生じる。一原子価置換は、例えば3000:1等のより高い比率及び官能化されていないナノ粒子を除去するためのエクステンションの特有の性質に基づくクロマトグラフィー分離(実際は、アフィニティークロマトグラフィー)を使用して達成される。アフィニティークロマトグラフィーにおける溶出勾配及びより低いペプチド比率を使用して、異なる原子価のナノ粒子種が精製され得る(ジ、トリ、などの原子価)。
図19は、官能化されたペプチドとCALNN(以下マトリクスペプチド)としてのCALNN−DNA(以下ペプチド−DNA)の例を示す。HSDNAは、ナノ粒子をDNAを用いて官能化するために使用される標準のチオール化DNAである。リンカーDNAは、大きいナノ粒子上の一本鎖HSDNA及び小さいナノ粒子上のペプチド−DNAに相補的である。
以下は、HS−DNAリガンドを有する40nmのナノ粒子とマトリクスペプチド及びペプチド−DNAを有する12.3nmのナノ粒子間で形成される複合体の例である。12.3nmのナノ粒子に対する40nmの比率及びペプチド−DNAをマトリクスペプチドのパーセントとして単純に制御することによって、ナノ粒子のアセンブリを制御することが可能である。このルートは、このようなナノ粒子アセンブリの状態の制御と極めて容易な調製を兼ね合わせる唯一のものである。
図20は、0.3%におけるペプチド−DNA及びナノ粒子12.3nmペプチド/ペプチド−DNA:40nmDNAの割合=10:1を示す。0.3%のペプチド−DNAにおいて、ナノ粒子毎に〜3ペプチド−DNAまで存在する。1つ又はただ数個の12.3nmペプチド−DNAナノ粒子が結合した単一の40nmHS−DNAナノ粒子からなる単純アセンブリが作られる。
図21は、12.3nmのペプチド−DNAナノ粒子の数を増加する影響を示す。ナノ粒子12.3nmペプチド/ペプチド−DNA:40nmDNAの比率=30:1(図20、0.3%と同一のパーセントにおけるペプチド−DNA)。より多くの小さいナノ粒子を用いると、アセンブリは依然として単純であるが、小さい12.3nmペプチド−DNAナノ粒子によって殆ど完全に囲まれた中央の40nmHS−DNAナノ粒子から成る。
図22は、12.3nmのペプチド−DNAナノ粒子の数をさらに増加することの影響を示す。ナノ粒子12.3nmペプチド/ペプチド−DNA:40nmDNAの比率=100:1(図21、0.3%と同一パーセントにおけるペプチド−DNA)。さらに多くの小さいナノ粒子を用いると、アセンブリは依然単純であるが、今度は、小さい12.3nmペプチド−DNAナノ粒子によって完全に囲まれた中央の40nmHS−DNAナノ粒子から成る。
図23は、1.0%のペプチド−DNAとナノ粒子12.3nmペプチド/ペプチド−DNA:40nmDNAの割合=3:1及び10:1を示す。1.0%のペプチド−DNAにおいてナノ粒子毎に〜9ペプチド−DNAが存在する。12.3nmペプチド−DNAナノ粒子のより高い原子価は、3:1及び10:1の12.3nmペプチドDNAナノ粒子:40nmHS−DNAナノ粒子の粒子比において、アセンブリが図20〜22において見られるよりもより複雑である事実によって反映される(1つ以上の大きなHS−DNA40nmナノ粒子の12.3nmペプチド−DNAナノ粒子によるブリッジングは明らかであるため)。
図24は、12.3nmのペプチド−DNAナノ粒子の数を増加することの影響を示す。ナノ粒子12.3nmペプチド/ペプチド−DNA:40nmDNAの割合=30:1(図23、1.0%と同一パーセントにおけるペプチド−DNA)。12.3nmペプチドナノ粒子の濃度が上昇すると、それらは、40nmHS−DNA粒子を殆ど包囲し、ブリッジングを妨げる。
図25は、12.3nmペプチド−DNAナノ粒子の数を増加することの影響を示す。ナノ粒子12.3nmペプチド/ペプチド−DNA:40nmDNAの割合=100:1(図24、1,0%と同一パーセントのペプチド−DNA)。12.3nmペプチドナノ粒子の濃度が上昇すると、それらは、今度は40nmHS−DNA粒子を完全に、効果的に囲み、ブリッジングを阻止する。
以下の実験は、HS−DNAナノ粒子のみが使用された場合に見られるタイプの大きな
凝集体を作る。予想通り、融解温度よりも高くに凝集体を加熱することは、DNAハイブリダイゼーション駆動型の凝集を逆にする。
凝集体を作る。予想通り、融解温度よりも高くに凝集体を加熱することは、DNAハイブリダイゼーション駆動型の凝集を逆にする。
図26は、10.0%のペプチド−DNA及びナノ粒子12.3nmペプチド/ペプチド−DNA:40nmDNAの比率=1:1を示す。今回のペプチド−DNAナノ粒子は、ほぼ90の原子価を有し、この点において、それらは、40nmのHS−DNAナノ粒子を有する大きな凝集体を形成し、これは、明らかな周期性を有する。
図27は、10.0%のペプチド−DNAとナノ粒子12.3nmペプチド/ペプチド−DNA:40nmDNAの比率=10:1を示す。12.3nmのペプチド−DNAナノ粒子の数を増加することは、凝集体の見かけの“密度”を増加する。
図28は、官能化されたエクステンションとしてのStrepTagIIとビオチンの使用を図示する。ビオチンは、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン等に結合し、一方でStrepTagII配列は、ストレプトアビジン及びストレプトアクチンのみに結合する。A、B,ストレプトアビジンで覆われた小さな5nmナノ粒子及び10%のCALNNK(ビオチン)GGでの13nmナノ粒子のアセンブリのTEM(ここでビオチンは、リジン残基の側鎖のεアミノ基上である)及び12.3nmナノ粒子がCALNNのみを有するコントロール。C,D ストレプトアクチン−ペルオキシダーゼによる12.3nmナノ粒子上のStreptTagIIの認識。ブロット“D”は、CALNNのみを有する12.3nmナノ粒子によるストレプトアクチンペルオキシダーゼの検出可能な非特異的結合がないことを示す。
図29は、紫外可視吸光度によって測定されたストレプトアビジンによってビオチン又はStrepTagIIで官能化された12.3nmナノ粒子の凝集を示す。凝集パラメーターは、Levy et al.,(J. Am. Chem. Soc. 2004)に規定される通りである。ビオチンとストレプトアビジンの相互作用は、より高い親和性であり、StrepTagIIのものよりも速い反応論で進行する。従って、凝集体を作るナノ粒子:ストレプトアビジンの比率は異なる。
図30は、人工的な物質を認識するように選択されたペプチドエクステンションの例を示す。ペプチド“ナノール(nanol)”の配列は、単壁のカーボンナノチューブを特異的に認識すると同定された。10%のCALNN−nanolを有するナノ粒子(12.3nm)は、単壁のカーボンナノチューブに特異的に結合する。
実施例13
多用途の“グリココンジュゲート(glycoconjugates)”を生成するために水銀付加物の形成を介して、チオール誘導体化タンパク質様金ナノ粒子を調製するための実験が行われた。実験は、本発明に従ったナノ粒子コンジュゲートを生産するための代替的なアプローチを示し、これは、リアーゼを用いたGAGの酵素分解によって得られるオリゴ糖の高収率の誘導化、及び非還元末端のウロン酸中に結果生じる不飽和結合の水銀塩による攻撃、並びに後の安定なグリココンジュゲートを形成するためのキャリア分子又は表面のチオール基への水銀付加物の付着に依存する。該アプローチは、ヘパラン硫酸−金ナノ粒子コンジュゲートの調製によって説明される。
多用途の“グリココンジュゲート(glycoconjugates)”を生成するために水銀付加物の形成を介して、チオール誘導体化タンパク質様金ナノ粒子を調製するための実験が行われた。実験は、本発明に従ったナノ粒子コンジュゲートを生産するための代替的なアプローチを示し、これは、リアーゼを用いたGAGの酵素分解によって得られるオリゴ糖の高収率の誘導化、及び非還元末端のウロン酸中に結果生じる不飽和結合の水銀塩による攻撃、並びに後の安定なグリココンジュゲートを形成するためのキャリア分子又は表面のチオール基への水銀付加物の付着に依存する。該アプローチは、ヘパラン硫酸−金ナノ粒子コンジュゲートの調製によって説明される。
Au−CALNN−Metの調製のための典型的な反応は、ボルテックスしながら、50μLのEDC(1M)を400μLのAu−CALNN(OD〜0.32)に添加することを必要とし、反応チューブは、15分間静置された。次いで、50μLのMET(0.33M)が反応混合物に添加され、1時間放置された。過剰な試薬は、1Lのリン酸バッファー中で、Slide−A−Lyser透析カセット(Pierce)における一晩の透析によって除去された。
このHF(1mL、1/1(v/v)2時間、40℃、Hg(OAc)2(1mg、3μmol)を用いて)中で反応された。
Au−CALNN−Met−S...Hg−糖の調製は、1μlのDP6−Hgを100μlのAu−CALNN−Metに加えることにより、反応は30分の後実施例において、Hg−糖の調製のために、ヘパリチナーゼ(heparitinase)酵素消化によってヘパラン硫酸から誘導され、非還元末端に不飽和の4,5ウロン酸を有する重合度6(DP6:0.25mg、0.63μモル)と称されるモデルヘキササッカライド(hexaccharide)が水/THF(1mL、1/1(v/v)中2時間、40℃、Hg(OAc)2(1mg、3μmol)を用いて)と反応された。
Au−CALNN−Met−S...Hg−糖の調製は、1μLのDP6−Hgを100μLのAu−CALNN−Metに加えることにより、反応は30分後にモニターされた。
実験の結果は、以下の表に列挙される(表3):
実験の結果は、以下の点に要約され得る。
1.高収率のHS糖の水銀付加物が作られた−構造は、MALDI−MS(図6)、1H及び13C NMRによって確認された(これも、付着したHgを示す(>95%純度)。
2.CALNN及びCALNNMetで覆われたAuNPの調製。Cysも使用され得るが、そのチオールは、metのチオエーテルよりも一般的に反応性がある(どちらもHg2+と等しく反応するが)。
3.AuNP−CALNN−Met−S...Hg−DP6の形成についての証拠が図7に示される。カップリングの前、Hg−DP6は、EDTA(100ml)の存在下で、キレートフリーのHg2+イオンに対し2回精製された。AuNP−CALNNとAuNP−CALNNMetS...Hg−DP6のスペクトルの比較は、粒子の凝集の特徴である強度の低下と共に2nmのλmaxにおける違い及びより長い波長における増加した吸光度を示す。
4.AuNP又はAuNP−CALNNとHgイオン、糖及びHg−糖の全ての他の組合せのコントロール実験は、紫外線−可視スペクトルにおける如何なる変化も示さなかった。表3は、Hg(OAc)2の存在下におけるAu−CALNN−Metとヘパリン間の相互作用の存在を示す。これは、Hgイオンとヘパリンの硫酸基との相互作用に起因するのかもしれない。結果として、Hg−DP6コンジュゲートから遊離Hgイオンを除去するために、EDTAが使用された。これは、光学的特性における変化がHg−DP6の存在に特異的であり、Au表面上のMetを介したそれのペプチドへの付着と一致することを確証する。
5.これらの実験の結果から、多くの用途のためのヘパラン硫酸プロテオグリカンの類似物の生成は可能となる(例えば、成長因子のシグナリング、宿主細胞のヘパラン硫酸への病原微生物の結合の多価インヒビター、及びヘパラン硫酸オリゴ糖のシーケンスのための新規な戦略。
1.高収率のHS糖の水銀付加物が作られた−構造は、MALDI−MS(図6)、1H及び13C NMRによって確認された(これも、付着したHgを示す(>95%純度)。
2.CALNN及びCALNNMetで覆われたAuNPの調製。Cysも使用され得るが、そのチオールは、metのチオエーテルよりも一般的に反応性がある(どちらもHg2+と等しく反応するが)。
3.AuNP−CALNN−Met−S...Hg−DP6の形成についての証拠が図7に示される。カップリングの前、Hg−DP6は、EDTA(100ml)の存在下で、キレートフリーのHg2+イオンに対し2回精製された。AuNP−CALNNとAuNP−CALNNMetS...Hg−DP6のスペクトルの比較は、粒子の凝集の特徴である強度の低下と共に2nmのλmaxにおける違い及びより長い波長における増加した吸光度を示す。
4.AuNP又はAuNP−CALNNとHgイオン、糖及びHg−糖の全ての他の組合せのコントロール実験は、紫外線−可視スペクトルにおける如何なる変化も示さなかった。表3は、Hg(OAc)2の存在下におけるAu−CALNN−Metとヘパリン間の相互作用の存在を示す。これは、Hgイオンとヘパリンの硫酸基との相互作用に起因するのかもしれない。結果として、Hg−DP6コンジュゲートから遊離Hgイオンを除去するために、EDTAが使用された。これは、光学的特性における変化がHg−DP6の存在に特異的であり、Au表面上のMetを介したそれのペプチドへの付着と一致することを確証する。
5.これらの実験の結果から、多くの用途のためのヘパラン硫酸プロテオグリカンの類似物の生成は可能となる(例えば、成長因子のシグナリング、宿主細胞のヘパラン硫酸への病原微生物の結合の多価インヒビター、及びヘパラン硫酸オリゴ糖のシーケンスのための新規な戦略。
Claims (33)
- 実質的に類似するアミノ酸配列の複数のペプチドに結合したナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートであって、該ペプチドは、システイン(C)残基によって該ナノ粒子に結合し、且つ該ナノ粒子コンジュゲートは、該ペプチドに付着したリガンドを更に含む、ナノ粒子コンジュゲート。
- 該システイン(C)残基がそのチオール及び/又はアミノ基によって該ナノ粒子に結合する、請求項1に記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ペプチドの遠位末端がカルボキシル基で終結し、又は該ペプチドがカルボキシル基によって該リガンドに結合する、請求項1又は2のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該リガンドから独立した該ペプチドが配列CALNN又はCCALNNを有する、請求項1〜3のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ペプチドが、CXn(リガンド)、CCXn(リガンド)、CXn(リガンド)Xn、又はCCXn(リガンド)Xnの一般配列を有する(ここでXは、任意のアミノ酸残基を表し、nは、アミノ酸残基の任意の長さを表す)、請求項1〜4のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該システイン残基が、該ペプチドの中央領域に位置する、請求項1〜3のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ペプチドの中央領域に位置する2つ以上のシステイン残基が存在する、請求項6に記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該システイン残基のいずれかの側の該ペプチド配列が実質的に対称的である、請求項6又は7のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ペプチドが、(リガンド)XnCXn(リガンド)、Xn(リガンド)XnCXn(リガンド)Xn、(リガンド)XnCCXn(リガンド)又はXn(リガンド)XnCCXn(リガンド)Xn(ここでXは,任意のアミノ酸残基を表し、nは、アミノ酸残基の任意の長さを表す)の一般配列を有する、請求項6〜8のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該リガンドから独立した該ペプチドが、配列NNLACACLNN又はNNLACCALNNを有する、請求項9に記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ナノ粒子コンジュゲートが、該ペプチドまたは該リガンドに結合した同定手段を更に含む、請求項1〜5のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ナノ粒子コンジュゲートが、該ペプチド又はリガンドに結合した官能基を更に含む、請求項1〜12に記載のナノ粒子コンジュゲート。
- アミノ酸残基のさらなる配列が、該リガンドと該同定手段及び/又は官能基の間、及び/又は該リガンド、若しくは同定手段、若しくは官能基の後に配置される、請求項11又は12のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該更なる配列が、2つ以上のグリシン残基を含む、請求項13に記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ナノ粒子コンジュゲートが、ペプチドの異なるサブグループを含む、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 異なるリガンド及び必要に応じて異なる同定手段/官能基がペプチドの異なるサブグループに結合される、請求項15に記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ナノ粒子コンジュゲートが、少なくとも1つの他のナノ粒子コンジュゲートに結合することができ、又はナノ粒子コンジュゲートアセンブリを形成するために少なくとも1つの他のナノ粒子コンジュゲートに結合する、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ナノ粒子が、以下の材料;金属材料、磁性材料、または半導体材料の1つから作られる、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- ナノ粒子が、金、銀、コバルト、ニッケル、プラチナ、カドミウムセレニド又は硫化亜鉛から作られる、請求項1〜18のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該同定手段及び/又は官能基及び/又はリガンドが、以下:ビオチン及び/又はアビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン、ヒスチジンタグ、NTA、放射性ラベル、抗原、エピトープド、タンパク質、受容体の部分、若しくは目的分子、糖、多糖並びに脂質、の1つ以上から選択される、請求項11〜19のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 薬学的に活性のある塩の化合物又は化合物の一部が、さらに該ナノ粒子に結合される、又は該ペプチドに結合される、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ナノ粒子が、1〜100nmの範囲の直径を有する、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該複数のペプチドが、該ナノ粒子の周りにシェルを提供するために、該ナノ粒子の表面を実質的に覆う、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該シェルが、複数のナノ粒子のためのカップリング効果を含む該ナノ粒子の光学的検出を可能にする、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- ナノ粒子毎に、約500〜1500ペプチドの範囲のペプチドが存在する、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- nm2毎に約1.0〜3.2のナノ粒子が存在する、請求項1〜24に記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 診断アッセイの生産、タンパク質の分離及び/又は精製、又は治療薬剤の生産における使用のための、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲート。
- 該ナノ粒子コンジュゲートが、以下の技術:クロマトグラフィー、ELISA、凍結乾燥、FISH、ISH、SDS PAGE、フローサイトメトリー、免疫組織化学、タンパク質精製、ウェスタンプロッティング、細胞遺伝学的分析、分子相互作用アッセイ、固定され且つ生きた細胞/組織上の組織化学及び高スループットスクリーニングのいずれかで使用される、請求項1〜26に記載のナノ粒子コンジュゲート。
- リン酸緩衝生理食塩水又は溶媒/電解質の他の組合せ中の複数のペプチドを有する安定化溶液中で安定化されたナノ粒子を水中でインキュベートすることによって前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲートを製造する方法。
- 該ナノ粒子を用いたインキュベーションの前、又は該インキュベーションの間に、1つ以上のリガンド及び必要に応じて1つ以上の同定手段及び/又は官能基が該ペプチドに結合される、請求項22に記載の方法。
- 1つ以上のリガンド及び必要に応じて1つ以上の同定手段及び/又は官能基を含む複数のペプチドを該ナノ粒子の合成時に含むことによって、請求項1〜21のいずれかに記載のナノ粒子コンジュゲートを製造する方法。
- 該ナノ粒子コンジュゲートが、保存のために凍結乾燥される、請求項22〜24のいずれかに記載の方法。
- ここにおいて上記に記載の図面及び実施例を参照して、請求項1〜28及び29〜33に各々記載のナノ粒子コンジュゲート及びナノ粒子コンジュゲートを製造する方法。
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