JP5059312B2 - 高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、様々な機能性分子と結合した分散性の良好な高分散性無機化合物ナノ粒子及びその製造方法に関する。

近年、ナノテクノロジーの研究が盛んに行われ、様々な産業分野において、材料となる物質の微粒子化（ナノ粒子化）が研究されている。ナノ粒子化した物質は、流動性の向上、表面積の増大、表面での反応性を顕著化させるなどの性質を示すため、このような物性の変化を応用することによって、例えば、圧縮成型時の密度向上、吸着容量の増大、化学反応触媒としての機能向上、他の物質との複合化などを容易に達成できるようになる。他材料との混合および複合化による機能付与は、例えば、塗料、表面改質材料、化粧品、高屈折率ガラス、セラミックス、強磁性材料、半導体材料などに多く利用されている。

このように、物質をナノ粒子化することは、極めて重要な技術であり、化学、生化学、分子生物学、医学分野への応用も有望である。最近では例えば、微小な粒子に標識化合物を結合させて特定の分子構造を同定、検出、定量、可視化することが試みられている。粒子としては、保存時の安定性が非常に優れ、生体に無害なリン酸カルシウム系化合物、シリカなどが用いられている。このような粒子をナノ粒子化して用いることができれば、より多くの標識化合物分子と結合させることができ、感度の大幅な向上を実現できると考えられる。
たとえば、タンパク質は一部の有色タンパク質などの特殊な例を除くと、溶液中では透明であるため目視することはできない。また、多くの物質が混在している状態で特定のタンパク質のみを検出することも困難である。このため、タンパク質に特異的な光特性を持った色素分子を結合する、放射性同位元素で標識する、あるいは他の酵素などを結合するといった解決手段が開発され、混合物中の目的タンパク質の検出、定量がなされている。上記の解決手段はタンパク質のみならず、ＤＮＡやＲＮＡ、糖類などが混在する溶液系や生体内部環境などにおける目的物質の同定、検出、定量を目的として多用されている。
これら標識された分子が特異的な分子構造を認識するような抗原や抗体タンパク質、糖類、受容体、リガンド、ヌクレオチドなどである場合、これらの物質は特定の分子構造を同定、検出、定量、可視化するためにも利用される。特に標識物質を分光学的に検出、定量する場合は、以前は放射性同位元素による標識が盛んに行われていたが、近年では色素が多用されている（色素標識法）。標識物質の濃度が低い場合には酵素などで標識し、少量の酵素で基質の転換反応を長時間行わせることにより検出を可能としている（酵素標識法）。
さらには、より最近の傾向として、微小な粒子を用いた標識法が注目されている。これは微小な粒子を用いることで、色素などの標識化合物を粒子に高濃度で蓄積させることが可能となるからである。
しかしながら、無機化合物のナノ粒子は溶液中の凝集性が強く、その粒子表面を標識物質で被覆すると、より凝集性が強くなるため、粒子が粗大化し、感度の低下を招くという問題があった。

本発明は従って、標識物質で被覆しても、無機化合物ナノ粒子の凝集性が低く、分散性の良好な高分散性無機化合物ナノ粒子を提供するとともに、その効率の良い製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、ポリアミン化合物が無機化合物粒子に対して強い吸着性を有し、分散性向上効果を奏するという知見に基づいてなされたものである。
本発明は、機能性分子と、
一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基のうち少なくとも２個のアミノ基を有する高分子窒素化合物と、
上記アミノ基の少なくとも１個に結合する無機化合物ナノ粒子と、
からなり、上記高分子窒素化合物が上記機能性分子で修飾され、上記無機化合物ナノ粒子が上記機能性分子修飾高分子窒素化合物で被覆されていることを特徴とする機能性分子で修飾された高分散性無機化合物ナノ粒子を提供するものである。

本発明に用いる高分子窒素化合物は、数平均分子量が８００〜１０００００であることが好ましく、分子内に一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基が繰り返し構造単位内に存在することが好ましい。

高分子窒素化合物は、直鎖状のポリアミン化合物、枝分れ状のポリアミン化合物、及び環状のポリアミン化合物の単体又は混合物であることが好ましい。
これらのポリアミン化合物のうち、ポリエチレンイミンが特に好適である。

無機化合物ナノ粒子は、リン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物のナノ粒子であることが好ましい。リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイトが特に好適である。
また、金属酸化物としては、アルミナ、シリカ、酸化マグネシウム、あるいは、酸化鉄（ヘマタイト）などが挙げられ、酸化マグネシウムが特に好適である。

本発明において、機能性分子としては、有機化合物色素、無機化合物色素（顔料）、蛍光色素あるいは化学発光原子団を有する化学的に同定可能な分子、又は酵素、抗体、細胞刺激性因子、コラーゲン、ウイルス外皮タンパク質、細胞結合性リガンド、有色タンパク質、蛍光タンパク質、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、金属貯蔵タンパク質、単糖類、オリゴ糖、多糖類などの生体に由来し、特定の機能を有する分子が挙げられる。

本発明による高分散性無機化合物ナノ粒子の製造方法は、機能性分子を一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基のうち少なくとも２個のアミノ基を有する高分子窒素化合物と反応させ、生成した機能性分子修飾高分子窒素化合物を含む溶液と無機化合物ナノ粒子とを混合し、超音波処理した後、遠心分離し、上清を採取し、乾燥することを特徴とする。

本発明の高分散性無機化合物ナノ粒子を製造する際には、上記の高分子窒素化合物溶液の溶媒としては、水又は有機溶媒を用いることができ、有機溶媒としては、例えばアルコール類（例えば、エタノール、イソプロパノールなど）を用いることができる。

本発明によれば、無機化合物ナノ粒子の表面を改質し、水溶液中における良好な分散性を有する、様々な機能性分子で被覆された高分散性無機化合物ナノ粒子を提供することができる。また、本発明の高分散性無機化合物ナノ粒子は、様々な標識化合物を初めとする機能性分子で被覆されているため、化学、生化学、医学分野などにおける応用が期待できる。

本発明の高分散性無機化合物ナノ粒子は、機能性分子と高分子窒素化合物とを反応させて得られた機能性分子修飾高分子窒素化合物によって無機化合物ナノ粒子が被覆されている。
機能性分子としては、特に制限はなく、有機化合物色素、無機化合物色素（顔料）、蛍光色素あるいは化学発光原子団を有する化学的に同定可能な分子、又は酵素、抗体、細胞刺激性因子、コラーゲン、ウイルス外皮タンパク質、細胞結合性リガンド、有色タンパク質、蛍光タンパク質、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、金属貯蔵タンパク質、単糖類、オリゴ糖、多糖類などの生体に由来し、特定の機能を有する分子が挙げられる。
また、高分子窒素化合物は、分子内に一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基のうち少なくとも２個のアミノ基を有するものであればよく、例えば、ポリアミン化合物を用いることができる。ポリアミン化合物は、直鎖状、枝分れ状、及び環状のいずれであってもよく、分子内に一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基が繰り返し構造単位内により多数存在すると、無機化合物ナノ粒子との結合サイトが増えるため好ましい。

また、ポリアミン化合物としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジンなどを用いることができ、特にポリエチレンイミン（図２）であることが好適である。ポリエチレンイミンは、エチレンイミン（図１）の重合体であり、重合に関与するアミノ基によって分子構造が異なる。図３は、一級アミノ基と二級アミノ基のみからなるポリエチレンイミンの分子構造を模式的に示し、図４は、一級アミノ基と三級アミノ基のみからなるポリエチレンイミンの分子構造を模式的に示している。

ポリアミン化合物（高分子窒素化合物）の数平均分子量は、８００〜１０００００であることが好ましい。数平均分子量が８００未満であると、ポリアミン化合物が無機化合物ナノ粒子を完全に覆うことが困難となり、粒子同士の結合のため良好な分散性を得ることが困難になる。また、数平均分子量が１０００００を超えると、ポリアミン化合物同士の結合により、大きな凝集塊を作ってしまうため良好な分散性を得ることが困難になる。

本発明の高分散性無機化合物ナノ粒子は、無機化合物粒子の固体酸点（電子対受容体）で高分子窒素化合物のアミノ基の少なくとも１個に結合することによって、高分子窒素化合物で被覆されている。無機化合物としては、リン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物が挙げられる。
リン酸カルシウム系化合物は、Ｃａ／Ｐ比１．０〜２．０のものであればよく、例えば、ハイドロキシアパタイト、フッ素アパタイトなどの各種のアパタイト、第一リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウムなどが挙げられ、これらは単独または混合物として用いることができる。
また、金属酸化物としては、酸化アルミニウム、二酸化珪素、酸化マグネシウム、酸化チタン、酸化鉄（ヘマタイト）などが挙げられる。

本発明に用いる無機化合物のナノ粒子は、２ｎｍから１０００ｎｍ（１μｍ）の平均粒子径のものであるのが好ましい。平均粒子径が２ｎｍより小さいナノ粒子は、産業上利用できる程度に多量に製造するのは困難であり、１０００ｎｍを越えるものは、あまり凝集せず、それ自体でも比較的に分散性が良好である。

本発明に原料として用いる無機化合物ナノ粒子は、微粒子にナノ粒子が付着した状態のもの、ナノ粒子が凝集した状態のもの等であってよく、任意の方法で製造されたものであってよい。
一例として、本発明者らが開発したリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法を次に説明する。すなわち、リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子は、リン酸カルシウム系化合物を熱処理し、得られたリン酸カルシウム系化合物粒子を有機溶媒に分散させ、解砕処理し、得られたリン酸カルシウム系化合物分散液を遠心分離し、上清を採取し、必要に応じて乾燥することによって製造することができる。この製造方法において解砕処理前に、熱処理済みリン酸カルシウム系化合物粒子をボールミル処理することもできる。

上記方法に原料として使用するリン酸カルシウム系化合物は、公知の方法で合成し、熱処理する前に乾燥し、必要に応じて造粒することが好ましい。造粒は、公知の方法によって行うことができるが、スプレードライ法によって体積比が７０％以上の多孔体にすることが好ましい。
上記方法では、まず、リン酸カルシウム系化合物を公知の加熱手段で熱処理して熱履歴を与える。熱処理温度に制限はないが、４００℃から１０５０℃の温度範囲で熱処理されることが好ましい。４００℃よりも低温であると、十分な強度が得られず、使用強度が低下してしまう。１０５０℃より高温であると、一部または全部が焼結してしまい、ナノ粒子の収率が低下する。

熱処理後、例えば、超音波処理、ホモジナイザー、振とう器、乳鉢などの解砕処理によって有機溶媒に分散させる。有機溶媒としては、極性有機溶媒が好ましく、例えば、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールなど）、エーテル（例えば、２−エトキシエタノールなど）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどを用いることができる。

解砕処理前に、リン酸カルシウム系化合物粒子をボールミル装置によって処理することもできる。ボールミル装置は、通常、摺り運動によって試料を解砕するボール（メディア）を用いるが、ボールを用いずに処理を行うと、球状の（アスペクト比が１に近い）ナノ粒子を高い収率で得ることができる。このとき、有機溶媒等を介在させない（ポット内にリン酸カルシウム系化合物粒子のみが入れられた）ドライ状態（以下、ドライミル処理と称する）であることがよい。

このように得られたリン酸カルシウム系化合物分散液を遠心分離し、有機溶媒相に分散されたリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子を含む上清とそれより粒径の大きい粒子の沈殿とに分画する。その後、上清の有機溶媒を蒸発させ、リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子を得る。

本発明の高分散性無機化合物ナノ粒子は、機能性分子を一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基のうち少なくとも２個のアミノ基を有する高分子窒素化合物と反応させ、生成した機能性分子修飾高分子窒素化合物を含む溶液と無機化合物ナノ粒子とを混合し、超音波処理した後、遠心分離し、上清を採取し、乾燥することによって製造することができる。
高分散性無機化合物ナノ粒子の分散性は、本発明に使用する機能性分子と高分子窒素化合物との反応溶液の溶媒の種類によっては大きな差異はないため、溶媒としては、使用する高分子窒素化合物が可溶性の溶媒であれば任意のものを用いることができる。高分子窒素化合物が、例えば、ＰＥＩである場合には、溶媒として、水又はアルコール類（例えば、エタノール、イソプロパノールなど）を用いることができる。

また、機能性分子の濃度については、使用目的などに応じて適宜決定することができる。
さらに、使用する高分子窒素化合物溶液の濃度についても、被覆すべき無機化合物ナノ粒子の種類、量、表面積などにより左右され、一義的に定めることはできない。しかし、高分子窒素化合物の濃度が薄すぎると、高分子窒素化合物は粒子と結合するが、完全に被覆することはできないため、粒子同士の結合により凝集が起こってしまう。高分子窒素化合物の濃度が高すぎると、高分子窒素化合物は粒子と結合するが、高分子窒素化合物同士でも結合してしまうため、大きなミセルを作ってしまい、結果として凝集作用を引き起こしてしまう。そのため、その都度被覆すべき無機化合物ナノ粒子の種類、量、表面積などに応じて適宜選定することが好ましい。

さらに、無機化合物ナノ粒子に対する高分子窒素化合物の好適な被覆量は、被覆すべき無機化合物ナノ粒子の種類や表面積、使用する高分子窒素化合物の種類、分子量などによって変動し、一義的に決定することはできないが、例えば、ハイドロキシアパタイトナノ粒子をポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと略記する）で被覆する場合には、ＰＥＩ／ナノ粒子重量比を１〜１００ｍｇ／ｇとするのが好ましく、１０〜５０ｍｇ／ｇとするのがより好ましい。
酸化マグネシウムナノ粒子をＰＥＩで被覆する場合には、ＰＥＩ／ナノ粒子重量比を０．１〜１０ｍｇ／ｇとするのが好ましく、１ｍｇ／ｇとするのが特に好ましい。また、酸化アルミニウム、二酸化珪素、酸化チタン又は酸化鉄（ヘマタイト）のナノ粒子をＰＥＩで被覆する場合には、ＰＥＩ／ナノ粒子重量比を１〜１００ｍｇ／ｇとするのが好ましく、５０ｍｇ／ｇとするのが特に好ましい。

無機化合物ナノ粒子は、凝集しやすいので、高分子窒素化合物溶液と混合した後、超音波処理する。超音波処理により、無機化合物ナノ粒子を機械的に分散させることと同時に高分子窒素化合物を無機化合物ナノ粒子に均一に効率よく被覆することが可能になる。
上記のリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法を使用する場合には、熱処理済み粒子を解砕処理（超音波処理）する前に高分子窒素化合物溶液と混合してもよい。

このように得られた高分子窒素化合物被覆無機化合物ナノ粒子分散液を遠心分離し、この被覆無機化合物ナノ粒子を含む上清を採取し、乾燥することによって、高分子窒素化合物で被覆された無機化合物ナノ粒子を得ることができる。
超音波処理時には、分散・被覆効果を高めるために高濃度の無機化合物ナノ粒子溶液に調整している。そのため、上記の遠心分離前には、必要に応じて蒸留水を加えて希釈してもよい。

次に、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

以下の実施例で得られた高分子窒素化合物被覆無機化合物ナノ粒子は、下記の方法で評価した。
（ａ）粒子の形状
被覆ナノ粒子の形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察した。透過型電子顕微鏡には、株式会社日立製作所製Ｈ−７６００を使用した。
（ｂ）蛍光顕微鏡写真
機能性分子修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）被覆ナノ粒子及びＰＥＩ被覆ナノ粒子について、蛍光顕微鏡により観察した。これらの観察には株式会社Leica製正立顕微鏡ＤＭＲを使用し、ＢＰ４８０/４０の励起フィルター、ＢＰ６００/４０の吸収フィルターを用いた。上記ナノ粒子をスライドガラスに適量を滴下し、油浸レンズにて撮影を行った。
（ｃ）粒度分布
被覆ナノ粒子分散液について、粒度分布を測定した。これらの粒度分布の測定には、ベックマン・コールター株式会社製サブミクロン粒子アナライザーＮ５を使用し、動的散乱法で行った。各実施例および比較例には３回測定した結果を示す。なお、各粒度分布図の縦軸は、ピーク強度（％）を示している。縦軸の目盛は、下側から順に２０、４０、６０、８０、及び１００が印されている。また、横軸は、Ｌｏｇ対数で表したナノ粒子の粒子径（ｎｍ）を示している。横軸の目盛は、左側から順に２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４、及び２０４８が印されている。グラフは、青色が１回目、赤色が２回目、緑色が３回目の測定結果を示している。
（ｄ）蛍光強度
一般に蛍光とは、蛍光物質がそれぞれに応じた特定波長の光エネルギーを吸収することで安定な基底状態から不安定な励起状態へと移り、再び基底状態に戻る時に放出するエネルギーの一部が光となったものである。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−４−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（以下ＦＩＴＣと略す）の場合、４９５ｎｍの光を吸収し、５２０ｎｍの蛍光を発する。したがって、４９５ｎｍ付近での吸光スペクトルによりＦＩＴＣの有無が確認できる。
そこで、ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆ナノ粒子分散液について、吸光スペクトルを測定した。吸光スペクトルの測定には、島津製作所製紫外可視分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ−１６００を使用した。

ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩのハイドロキシアパタイトナノ粒子（以下ＨＡナノ粒子と略す）へのコーティングおよび光特性
（１）ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液の調製
蒸留水１００mｌに溶解したＦＩＴＣ５．４ｍｇとＰＥＩ（和光純薬社製Ｐ−７０；平均分子量７００００）１００ｍｇとを混合し、さらに１．７５ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン濃度となるように蒸留水で希釈し、ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液を調製した。
（２）ハイドロキシアパタイト粒子の作製
リン酸塩水溶液とカルシウム塩水溶液とを混合し、ハイドロキシアパタイトを含有するスラリーを得た。このハイドロキシアパタイト含有スラリーをスプレードライ装置を用いて２００℃で乾燥して、造粒した。さらに、分級して平均粒径１０ｕｍとした。得られたハイドロキシアパタイト粒子を電気炉に入れて熱処理した。熱処理は、５０℃／ｈｒにて８５０℃まで昇温し、８５０℃で４時間保持して行い、ハイドロキシアパタイト粒子（以下HA粒子と略す）を得た。
（３）ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆ハイドロキシアパタイトナノ粒子の作製
上記（２）のとおり作製して得られたＨＡ粒子１．０ｇを内容量４５ｍｌのポット（ジルコニア製）に入れ、遊星型ボールミル（フリッチュ社製；Ｐ−７）によって、回転数８００ｒｐｍで３時間のドライミル処理を行った。なお、ドライミル処理は、遊星型ボールミルのポット内にメディアを入れずに行った。ドライミル処理後のＨＡ粒子を回収し、ドライミルＨＡ粒子を得た。
ドライミルＨＡ粒子１０ｇを、上記（１）のように調製したＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液３０ｍｌを加え分散させ、超音波発生装置（ＴＡＩＴＥＣ社製；ＶＰ−３０Ｓ）を用いて超音波処理（出力１８０Ｗにて５分間）によりＨＡ粒子の解砕およびＨＡ粒子表面へのＦＩＴＣ修飾ＰＥＩの被覆を行った。その後、蒸留水を加えて、全量を１００ｍｌとして、４１００×ｇにて５分間、遠心分離を行った。遠心分離後の上清、すなわちＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子を採取した。

本実施例で得られたＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子の各種分析結果について以下に示す。
（ａ）粒子の形状
図５にＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子の透過電子顕微鏡写真を示す。このＴＥＭ写真に示すように、３０ｎｍ〜１７５ｎｍ程度の球状または楕円球状のＨＡナノ粒子が単分散または数個単位で集まった状態で分散していた。
（ｂ）蛍光顕微鏡写真
図６は１０００倍にて撮影した蛍光顕微鏡写真である。白色部がＦＩＴＣによる蛍光である。粒子がとても小さいため、全体的にうすぼんやりと光って見える。白の濃い部分は粒子が凝集している部分である。
（ｃ）粒度分布
図７は、ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子分散液の動的散乱法による粒度分布図であり、分散液中のナノ粒子の平均粒径は約１９２ｎｍであった。
実施例２（参考例）

ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩのアルミナナノ粒子へのコーティングおよび光特性
アルミナナノ粒子にＦＩＴＣ修飾ＰＥＩを下記の方法で被覆させた。
アルミナナノ粒子（シーアイ化成株式会社製ＮａｎｏＴｅｋ Ｐｏｗｄｅｒ；Ａｌ2Ｏ3）１ｇに、実施例１と同様に調製したＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液３０ｍｌを加え分散させ、超音波発生装置（ＴＡＩＴＥＣ社製；ＶＰ−３０Ｓ）を用いて超音波処理（出力１８０Ｗにて１分間）によりアルミナナノ粒子にＦＩＴＣ修飾ＰＥＩを被覆した。その後、蒸留水を加えて、全量を１００ｍｌとして、４１００×ｇにて５分間、遠心分離を行った。遠心分離後の上清、すなわちＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子を採取した。
本実施例で得られたＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子の各種分析結果について以下に示す。
（ａ）粒子の形状
図８にＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子の透過電子顕微鏡写真を示す。このＴＥＭ写真に示すように、５ｎｍ〜１５０ｎｍ程度の球状のナノ粒子が数個〜複数個単位で集まった状態で分散していた。
（ｂ）蛍光顕微鏡写真
図９は１０００倍にて撮影した蛍光顕微鏡写真である。白色部がＦＩＴＣによる蛍光である。粒子がとても小さいため、全体的にうすぼんやりと光って見える。白の濃い部分は粒子が凝集している部分である。
（ｃ）粒度分布
図１０は、ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子分散液の動的散乱法による粒度分布図であり、図から、分散液中のナノ粒子の平均粒径は約１９８ｎｍであった。
（ｄ）蛍光スペクトル
図１１にＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子分散液の吸収スペクトルを示す。図から５００ｎｍ付近をピークトップとしたブロードな吸収ピークが見られた。
実施例３（参考例）

ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩのシリカナノ粒子へのコーティングおよび光特性
ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子は、原料粒子にシリカナノ粒子（シーアイ化成株式会社製ＮａｎｏＴｅｋ Ｐｏｗｄｅｒ；ＳｉＯ₂）を用いた以外は実施例２と同様にして作製し、各種分析を行った。

本実施例で得られたＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子の各種分析結果について以下に示す。
（ａ）粒子の形状
図１２にはＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子の透過電子顕微鏡写真を示す。このＴＥＭ写真に示すように、９ｎｍ〜１２０ｎｍ程度の球状または楕円球状のシリカナノ粒子が単分散または複数個単位で集まった状態で分散していた。
（ｂ）蛍光顕微鏡写真
図１３は１０００倍にて撮影した蛍光顕微鏡写真である。白色部がＦＩＴＣによる蛍光である。粒子がとても小さいため、全体的にうすぼんやりと光って見える。白の濃い部分は粒子が凝集している部分である。
（ｃ）粒度分布
図１４は、ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子分散液の動的散乱法による粒度分布図であり、図から、分散液中のナノ粒子の平均粒径は約２４３ｎｍであった。
（ｄ）蛍光スペクトル
図１５にＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子分散液の吸収スペクトルを示す。図から５００ｎｍ付近をピークトップとしたブロードな吸収ピークが見られた。

ローダミン修飾ＰＥＩのＨＡナノ粒子へのコーティングおよび光特性
（１）ローダミン修飾ＰＥＩ溶液の調製
蒸留水１００mｌに溶解したローダミン（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）７．５ｍｇとＰＥＩ（和光純薬社製Ｐ−７０；平均分子量７００００）１００ｍｇとを混合し、さらに１．７５ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン濃度となるように蒸留水で希釈し、ローダミン修飾ポリエチレンイミン溶液を調製した。
（２）ローダミン修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子の作製
上記（１）のように調製したローダミン修飾ＰＥＩ溶液を用いた以外は実施例１と同様にしてローダミン修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子を作製した。

本実施例で得られたローダミン修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子の各種分析結果について以下に示す。
（ａ）粒子の形状
図１６にローダミン修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子の透過電子顕微鏡写真を示す。このＴＥＭ写真に示すように、５０ｎｍ〜１８０ｎｍ程度の球状または楕円球状のＨＡナノ粒子が単分散または数個単位で集まった状態で分散していた。
（ｂ）蛍光顕微鏡写真
図１７にローダミン修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子の蛍光顕微鏡写真を示す。撮影倍率は１０００倍であり、同一の視野をＡは位相差観察、Ｂは蛍光観察で撮影したものである。粒子がとても小さく、ローダミンによる蛍光が非常に強いため、露光時間を短くして撮影したものであるが、全体的にうすぼんやりと光って見える。特に赤色の濃い部分は粒子が凝集している部分である。
（ｃ）粒度分布
図１８は、ローダミン修飾ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子分散液の動的散乱法による粒度分布図であり、図から、分散液中のナノ粒子の平均粒径は約１８１ｎｍであった。

比較例１

ＦＩＴＣ単独での光特性
実施例１〜３と同様なＦＩＴＣ濃度となるように、ＦＩＴＣを蒸留水に溶解したＦＩＴＣ溶液について、各種分析結果を以下に示す。
（ｂ）蛍光顕微鏡写真
図１９にＦＩＴＣ溶液の蛍光顕微鏡写真を示す。撮影倍率は１００倍であり、同一の視野をＡは位相差観察、Ｂは蛍光観察で撮影したものである。写真の左側にのみ溶液を滴下した。左側のＦＩＴＣ溶液部のみ、蛍光が観察された。
（ｄ）蛍光強度
図２０にＦＩＴＣ溶液の吸収スペクトルを示す。図から２００ｎｍ付近のピークと５００ｎｍ付近をピークトップとしたブロードな吸収ピークが見られた。

比較例２

ＰＥＩとＦＩＴＣの結合の証明
ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液の調製
蒸留水１００μｌに溶解したＦＩＴＣ５．４ｍｇとＰＥＩ（和光純薬社製Ｐ−７０；平均分子量７００００）１００ｍｇとを混合し、さらに１．７５ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン濃度となるように蒸留水で希釈し、ＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液を調製した。
調製したＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液はゲルろ過クロマトにより分級を行い、過剰なＦＩＴＣを除去した。
得られたＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液について、各種分析結果を以下に示す。
（ｂ）蛍光顕微鏡写真
図２１ＡＢにＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液の蛍光顕微鏡写真を示す。撮影倍率は１００倍であり、同一の視野をＡは位相差観察、Ｂは蛍光観察で撮影したものである。写真の左側にのみ溶液を滴下した。左側の溶液部のみ、蛍光が観察された。
（ｄ）蛍光強度
図２２にＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液の吸収スペクトルを示す。参考例１と同様に２００ｎｍ付近のピークと５００ｎｍ付近をピークトップとしたブロードな吸収ピークが見られた。

エチレンイミンモノマーの分子式を示す図である。 ポリエチレンイミンの分子構造を示す図である。 一級、二級アミノ基のみからなるポリエチレンイミンの分子構造を示す模式図である。 一級、三級アミノ基のみからなるポリエチレンイミンの分子構造を示す模式図である。 実施例１で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆ハイドロキシアパタイトナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。 実施例１で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆ハイドロキシアパタイトナノ粒子の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆ハイドロキシアパタイトナノ粒子の粒度分布図である。 実施例２で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。 実施例２で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子の蛍光顕微鏡写真である。 実施例２で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子の粒度分布図である。 実施例２で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆アルミナナノ粒子の蛍光スペクトル図である。 実施例３で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。 実施例３で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子の蛍光顕微鏡写真である。 実施例３で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子の粒度分布図である。 実施例３で製造したＦＩＰＣ修飾ＰＥＩ被覆シリカナノ粒子の蛍光スペクトル図である。 実施例４で製造したローダミン修飾ＰＥＩ被覆ハイドロキシアパタイトナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。 実施例４で製造したローダミン修飾ＰＥＩ被覆ハイドロキシアパタイトナノ粒子の蛍光顕微鏡写真である。 実施例４で製造したローダミン修飾ＰＥＩ被覆ハイドロキシアパタイトナノ粒子の粒度分布図である。 比較例１で調製したＦＩＴＣ溶液の蛍光顕微鏡写真である。 比較例１で調製したＦＩＴＣ溶液の蛍光スペクトル図である。 比較例２で調製したＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液の蛍光顕微鏡写真である。 比較例２で調製したＦＩＴＣ修飾ＰＥＩ溶液の蛍光スペクトル図である。

Claims (10)

1. ポリエチレンイミンの少なくとも１個のアミノ基を介してポリエチレンイミンに結合したリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子を含み、上記ポリエチレンイミンは少なくとも１種の機能性分子によって修飾され、ポリエチレンイミンの数平均分子量が８００〜１０００００の範囲にあることを特徴とする機能性分子で修飾された高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子。
2. 前記リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトからなる請求項１記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子。
3. 前記機能性分子が有機化合物色素、無機化合物色素、蛍光色素または化学発光原子団を有する化学的に同定可能な分子である請求項１記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子。
4. 前記機能性分子が酵素、抗体、細胞刺激性因子、コラーゲン、ウイルス外皮タンパク質、細胞結合性リガンド、有色タンパク質、蛍光タンパク質、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、金属貯蔵タンパク質、単糖類、オリゴ糖及び多糖類からなる群から選択される、生体に由来し、特定の機能を有する分子である請求項１記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子。
5. ポリエチレンイミンの数平均分子量が７００００〜１０００００の範囲にある請求項１記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子。
6. 請求項１記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子を製造するため、少なくとも１種の機能性分子をポリエチレンイミンと反応させ、生成した機能性分子修飾ポリエチレンイミンを含む溶液とリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子とを混合し、混合物を超音波処理した後、遠心分離し、上清を採取し、乾燥することを特徴とする高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法。
7. 前記リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトからなる請求項６記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法。
8. ポリエチレンイミンを含む溶液の溶媒が水又は有機溶媒である請求項６記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法。
9. 前記機能性分子が有機化合物色素、無機化合物色素、蛍光色素または化学発光原子団を有する化学的に同定可能な分子である請求項６記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法。
10. 前記機能性分子が酵素、抗体、細胞刺激性因子、コラーゲン、ウイルス外皮タンパク質、細胞結合性リガンド、有色タンパク質、蛍光タンパク質、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、金属貯蔵タンパク質、単糖類、オリゴ糖及び多糖類からなる群から選択される、生体に由来し、特定の機能を有する分子である請求項６記載の高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法。

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