JP2017031014A - 複合粒子の製造方法、及び複合粒子 - Google Patents
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Abstract
【課題】高い分散性と、高い分散性に起因する小粒径を実現し、かつ生体分子の結合のための官能基を導入した複合粒子を提供する。【解決手段】チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランとをシリカナノ粒子を含有する水系分散液に添加し、前記シリカナノ粒子の表面に前記官能基と前記親水性基が結合したシェル層を形成する、複合粒子の製造方法。【選択図】なし
Description
本発明は、複合粒子の製造方法、及び複合粒子に関する。
近年、数nm〜数百μm程度のナノ粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる多孔質シリカ粒子やゼオライト粒子、顔料に用いられるカーボンブラック、金属酸化物粒子及び無機化合物粒子、導電材料に使われる金属ナノ粒子、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など、ナノ粒子の材質及び用途は多岐にわたる。また、半導体ナノ粒子や、蛍光物質を封入したシリカナノ粒子は、特にバイオ分野において、新たな蛍光標識剤として、蛍光試薬への応用が期待されている。
蛍光試薬は、蛍光粒子表面にタンパク質や、DNAが結合したものであり、結合したタンパク質やDNAが特定の生体分子と相互作用することによって、生体分子の検出、定量、染色等に利用されるものである。半導体ナノ粒子や蛍光シリカナノ粒子などの蛍光粒子は高輝度かつ高い光安定性を有する。そのため、蛍光粒子を用いた蛍光試薬の開発が注目を集めている。
蛍光シリカナノ粒子を蛍光試薬として用いるためには、下記の事項を満たす表面修飾を行うことが必要である。
(1)生体分子を結合するための官能基の導入
(2)緩衝液中での分散安定化
(3)非特異的吸着防止
以下、上記(1)〜(3)それぞれの事項について具体的に述べる。
蛍光シリカナノ粒子を蛍光試薬として用いるためには、下記の事項を満たす表面修飾を行うことが必要である。
(1)生体分子を結合するための官能基の導入
(2)緩衝液中での分散安定化
(3)非特異的吸着防止
以下、上記(1)〜(3)それぞれの事項について具体的に述べる。
(1)生体分子を結合するための官能基の導入
シリカナノ粒子と生体分子を一体化し、標識試薬として安定に機能させるためには、シリカ粒子と生体分子を不可逆的に結合させることが必要である。そのためには、イオン結合や物理化学的吸着ではなく、シリカ粒子と生体分子とを共有結合させることが必要である。
タンパク質は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等の官能基を有する。また、DNAについても、末端修飾によってアミノ基やチオール基等の官能基を付与することが可能である。よって、シリカナノ粒子にアミノ基、カルボキシル基、チオール基等の官能基を導入すれば、架橋剤や縮合剤を用いて、シリカナノ粒子と生体分子とを共有結合させることが可能である。
シリカナノ粒子と生体分子を一体化し、標識試薬として安定に機能させるためには、シリカ粒子と生体分子を不可逆的に結合させることが必要である。そのためには、イオン結合や物理化学的吸着ではなく、シリカ粒子と生体分子とを共有結合させることが必要である。
タンパク質は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等の官能基を有する。また、DNAについても、末端修飾によってアミノ基やチオール基等の官能基を付与することが可能である。よって、シリカナノ粒子にアミノ基、カルボキシル基、チオール基等の官能基を導入すれば、架橋剤や縮合剤を用いて、シリカナノ粒子と生体分子とを共有結合させることが可能である。
(2)緩衝液中での分散安定化
粒子の凝集・分散に働く引力と斥力をモデル化して表現したものとして、DLVO理論が知られている。これは粒子間の静電的反発力とファンデルワールス力で、粒子の凝集・分散を説明するものである(例えば、非特許文献1参照)。
生体分子は、生理食塩水等のイオン濃度が高い水溶液中で用いられることが多い。イオン濃度が高い水溶液中では、遮蔽効果によってイオンがシリカ粒子の静電的反発力を弱めるため、粒子の凝集が起こりやすくなる。イオン濃度が高い水溶液中でも粒子が安定に分散するためには、静電的反発力以外の反発力を付与することが必要である。
静電的反発力以外に粒子間の斥力として働くものとして、立体反発力がある。これは、自由度をもった分子の鎖が互いに反発することにより、粒子間の斥力として働くものである。従って、粒子表面に自由度の高い分子鎖を導入することにより、粒子の分散性を向上させることができる。
粒子の凝集・分散に働く引力と斥力をモデル化して表現したものとして、DLVO理論が知られている。これは粒子間の静電的反発力とファンデルワールス力で、粒子の凝集・分散を説明するものである(例えば、非特許文献1参照)。
生体分子は、生理食塩水等のイオン濃度が高い水溶液中で用いられることが多い。イオン濃度が高い水溶液中では、遮蔽効果によってイオンがシリカ粒子の静電的反発力を弱めるため、粒子の凝集が起こりやすくなる。イオン濃度が高い水溶液中でも粒子が安定に分散するためには、静電的反発力以外の反発力を付与することが必要である。
静電的反発力以外に粒子間の斥力として働くものとして、立体反発力がある。これは、自由度をもった分子の鎖が互いに反発することにより、粒子間の斥力として働くものである。従って、粒子表面に自由度の高い分子鎖を導入することにより、粒子の分散性を向上させることができる。
(3)非特異的吸着防止
蛍光粒子が蛍光試薬として機能するためには、蛍光粒子に結合した生体分子がターゲットに対して特異的結合等により選択的に結合することが必要である。ターゲット以外の生体分子に非特異的に結合したり、基板に吸着が起きると、それだけ測定の感度や正確性が劣り、試薬としての信頼性が低下することになる。
非特異的吸着を低減させるためには、分散性向上と同様に、立体反発力の付与が必要である。
蛍光粒子が蛍光試薬として機能するためには、蛍光粒子に結合した生体分子がターゲットに対して特異的結合等により選択的に結合することが必要である。ターゲット以外の生体分子に非特異的に結合したり、基板に吸着が起きると、それだけ測定の感度や正確性が劣り、試薬としての信頼性が低下することになる。
非特異的吸着を低減させるためには、分散性向上と同様に、立体反発力の付与が必要である。
以上の観点より、蛍光粒子の応用には特別の表面修飾が必要となる。シリカナノ粒子の表面修飾の方法として、表面にチオール基を結合させたシリカ粒子に対して親水性粒子を用いた表面修飾を行い、凝集の生じにくいシリカナノ粒子にすることが、特許文献1に記載されている。また、シリカ粒子の表面に多糖を吸着させ、シリカ粒子の表面と多糖の外側に生体分子を共有結合させてなる複合粒子が、特許文献2に記載されている。
特許文献1に記載されている手法は物理吸着によりポリエチレングリコール(以下、単に「PEG」ともいう)を粒子表面に形成しているため、PEGが粒子から外れる恐れがある。そこで、シランカップリング剤の付いたPEGを使用することで、シリカ粒子とPEGの間に強固な共有結合を形成させ、安定して分散性を向上させることができ、共有結合により保存安定性の向上への効果も期待される。
上記の問題点に鑑み、本発明は、高い分散性と、高い分散性に起因する小粒径を実現し、かつ生体分子の結合のための官能基を導入した複合粒子と、その製造方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題に鑑み、PEGを分子内に有するシランカップリング剤由来のエントロピー斥力により、シリカ粒子を分散させることについて、鋭意検討を行った。その結果、チオール基などの官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、PEGなどの親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランの少なくとも2種のオルガノアルコキシシランをシリカナノ粒子と混合し、前記少なくとも2種のオルガノアルコキシシランを同時にシリカ粒子の表面に結合させることで、複合粒子の合成中に生じる粒子同士の凝集を防ぎ、高い分散性を有する複合粒子が得られることを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
(1)チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランとをシリカナノ粒子を含有する水系分散液に添加し、
前記シリカナノ粒子の表面に前記官能基と前記親水性基が結合したシェル層を形成する、複合粒子の製造方法。
(2)前記第1のオルガノアルコキシシランが、前記官能基としてチオール基を有する、前記(1)項に記載の製造方法。
(3)前記第1のオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、前記(1)又は(2)項に記載の製造方法。
(4)前記複合粒子表面に存在するチオール基数が0.001〜0.200個/nm2である、前記(2)又は(3)項に記載の製造方法。
(5)前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基の平均分子量が200〜4,000,000である、前記(1)〜(4)のいずれか1項に記載の製造方法。
(6)前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基が、アルコール性水酸基を含有する高分子、及び水溶性多糖類からなる群より選ばれる少なくとも1種の親水性基である、前記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の製造方法。
(7)前記の、アルコール性水酸基を含有する高分子が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、及びポリビニルアルコールからなる群より選ばれる、前記(6)項に記載の製造方法。
(8)前記水溶性多糖類が、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選ばれる、前記(6)項に記載の製造方法。
(9)前記第1のオルガノアルコキシシランの添加量を1とした場合、前記第2のオルガノアルコキシシランの添加量が重量比で0.1〜15000である、前記(1)〜(8)のいずれか1項に記載の製造方法。
(10)前記シリカナノ粒子の粒径が1〜500nmである、前記(1)〜(9)のいずれか1項に記載の製造方法。
(11)前記複合粒子の純水中における粒径が1〜600nmである、前記(1)〜(10)のいずれか1項に記載の製造方法。
(1)チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランとをシリカナノ粒子を含有する水系分散液に添加し、
前記シリカナノ粒子の表面に前記官能基と前記親水性基が結合したシェル層を形成する、複合粒子の製造方法。
(2)前記第1のオルガノアルコキシシランが、前記官能基としてチオール基を有する、前記(1)項に記載の製造方法。
(3)前記第1のオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、前記(1)又は(2)項に記載の製造方法。
(4)前記複合粒子表面に存在するチオール基数が0.001〜0.200個/nm2である、前記(2)又は(3)項に記載の製造方法。
(5)前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基の平均分子量が200〜4,000,000である、前記(1)〜(4)のいずれか1項に記載の製造方法。
(6)前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基が、アルコール性水酸基を含有する高分子、及び水溶性多糖類からなる群より選ばれる少なくとも1種の親水性基である、前記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の製造方法。
(7)前記の、アルコール性水酸基を含有する高分子が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、及びポリビニルアルコールからなる群より選ばれる、前記(6)項に記載の製造方法。
(8)前記水溶性多糖類が、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選ばれる、前記(6)項に記載の製造方法。
(9)前記第1のオルガノアルコキシシランの添加量を1とした場合、前記第2のオルガノアルコキシシランの添加量が重量比で0.1〜15000である、前記(1)〜(8)のいずれか1項に記載の製造方法。
(10)前記シリカナノ粒子の粒径が1〜500nmである、前記(1)〜(9)のいずれか1項に記載の製造方法。
(11)前記複合粒子の純水中における粒径が1〜600nmである、前記(1)〜(10)のいずれか1項に記載の製造方法。
(12)コアシェル構造の複合粒子であって、
シリカナノ粒子がコア構造を構成し、
前記シリカナノ粒子の表面に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランが結合し、これらのオルガノアルコキシシランがシェル構造を構成してなる、複合粒子。
(13)前記第1のオルガノアルコキシシランが、前記官能基としてチオール基を有する、前記(12)項に記載の複合粒子。
(14)前記第1のオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、前記(12)又は(13)項に記載の複合粒子。
(15)前記複合シリカナノ粒子表面に存在するチオール基数が0.001〜0.200個/nm2である、前記(13)又は(14)項に記載の複合粒子。
(16)前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基の平均分子量が200〜4,000,000である、前記(12)〜(15)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(17)前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基が、アルコール性水酸基を含有する高分子、及び水溶性多糖類からなる群より選ばれる少なくとも1種の親水性基である、前記(12)〜(16)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(18)前記の、アルコール性水酸基を含有する高分子が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、及びポリビニルアルコールからなる群より選ばれる、前記(17)項に記載の複合粒子。
(19)前記水溶性多糖類が、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選ばれる、前記(17)項に記載の複合粒子。
(20)前記シリカナノ粒子の粒径が1〜500nmである、前記(12)〜(19)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(21)前記複合粒子の純水中における粒径が1〜600nmである、前記(12)〜(20)に記載の複合粒子。
(22)前記(12)〜(21)のいずれか1項に記載の複合粒子を分散媒に分散させた、複合粒子の分散液。
シリカナノ粒子がコア構造を構成し、
前記シリカナノ粒子の表面に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランが結合し、これらのオルガノアルコキシシランがシェル構造を構成してなる、複合粒子。
(13)前記第1のオルガノアルコキシシランが、前記官能基としてチオール基を有する、前記(12)項に記載の複合粒子。
(14)前記第1のオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、前記(12)又は(13)項に記載の複合粒子。
(15)前記複合シリカナノ粒子表面に存在するチオール基数が0.001〜0.200個/nm2である、前記(13)又は(14)項に記載の複合粒子。
(16)前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基の平均分子量が200〜4,000,000である、前記(12)〜(15)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(17)前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基が、アルコール性水酸基を含有する高分子、及び水溶性多糖類からなる群より選ばれる少なくとも1種の親水性基である、前記(12)〜(16)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(18)前記の、アルコール性水酸基を含有する高分子が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、及びポリビニルアルコールからなる群より選ばれる、前記(17)項に記載の複合粒子。
(19)前記水溶性多糖類が、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選ばれる、前記(17)項に記載の複合粒子。
(20)前記シリカナノ粒子の粒径が1〜500nmである、前記(12)〜(19)のいずれか1項に記載の複合粒子。
(21)前記複合粒子の純水中における粒径が1〜600nmである、前記(12)〜(20)に記載の複合粒子。
(22)前記(12)〜(21)のいずれか1項に記載の複合粒子を分散媒に分散させた、複合粒子の分散液。
本発明の複合粒子は、シリカ粒子表面にエントロピー斥力を示す親水性基が結合してなるため、複合粒子間での静電的反発力を高め、分散性が向上し、高い分散性に起因する小粒径を実現できる。
また、本発明の複合粒子の製造方法は、前記複合粒子の製造に好適に用いることができ、通常複合粒子の合成中に生じる粒子同士の凝集を防ぐことができる。
また、本発明の複合粒子の製造方法は、前記複合粒子の製造に好適に用いることができ、通常複合粒子の合成中に生じる粒子同士の凝集を防ぐことができる。
本明細書において「物質」とは、化合物又は化学合成された分子の他、生体分子(タンパク質、ペプチド、核酸等)を包含する。これらは人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。
また、本明細書において「結合」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
また、本明細書において「結合」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
本発明の複合粒子は、官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、エントロピー斥力を示す親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランの少なくとも2種のオルガノアルコキシシランをシリカナノ粒子の表面に結合させてなる、コア−シェル構造を有する。本発明の複合粒子は、エントロピー斥力の作用により、通常複合粒子の合成中に生じる粒子同士の疎水性相互作用による凝集を防ぐことができ、分散性に優れる。また本発明の複合粒子は、生理食塩水等イオン強度が高い分散媒に分散させても、凝集を起こしにくい。
本発明の複合粒子のコア構造をなすシリカナノ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって蛍光シリカナノ粒子を得ることができる。例えば、Journal of Colloid and Interface Science,159,p.150-157(1993)に記載のゾル−ゲル法や、国際公開第2007/074722号に記載されたコロイドシリカ粒子の調製方法を参照することができる。
また、本発明で用いるシリカナノ粒子には、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、pH感受性色素化合物などの機能性化合物を含有させてもよい。
また、本発明で用いるシリカナノ粒子には、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、pH感受性色素化合物などの機能性化合物を含有させてもよい。
前記機能性化合物を含有するシリカナノ粒子の好ましい調製方法としては、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基などの活性エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基(例えば、アミノ基、水酸基、チオール基)を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に1種又は2種以上のシラン化合物を重縮合させることにより調製することができる。
シランカップリング剤としてアミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、シラン化合物としてテトラエトキシシラン(TEOS)を用いた場合を下記に例示する。
活性基を有する又は付加した機能性化合物の具体例として、5-(及び-6)-カルボキシテトラメチルローダミン-NHSエステル(商品名、emp Biotech GmbH社製)や、下記式でそれぞれ表されるDY550-NHSエステル又はDY630-NHSエステル(いずれも商品名、Dyomics GmbH社製)等のNHSエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、3-[2-(2-アミノエチルアミノ)エチルアミノ]プロピル−トリエトキシシラン、N-2(アミノエチル)3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、APSが好ましい。
縮重合させるシラン化合物としては特に制限はないが、TEOS、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、APS、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3-[2-(2-アミノエチルアミノ)エチルアミノ]プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはTEOSが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはMPS又はAPSが好ましい。
上述のように調製すると、球状、又は球状に近いシリカナノ粒子を調製することができる。ここで、「球状に近いシリカナノ粒子」とは、具体的には長軸と短軸の比が2以下の形状である。
本発明の複合粒子のコア構造を構成するシリカナノ粒子の平均粒径に特に制限はないが、1nm以上が好ましく、10nm以上がより好ましい。またその上限値は500nm以下が好ましく、300nm以下がさらに好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等の画像から無作為に選択した100個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から蛍光シリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した蛍光シリカナノ粒子の個数(100個)で割った値に相当する円の直径の平均値(平均円相当直径)を求めたものである。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等の画像から無作為に選択した100個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から蛍光シリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した蛍光シリカナノ粒子の個数(100個)で割った値に相当する円の直径の平均値(平均円相当直径)を求めたものである。
なお、シリカナノ粒子の平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径の蛍光シリカナノ粒子を得るためには、YM−10、YM−100(いずれも商品名、ミリポア社製)等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎる粒子、及び小さすぎる粒子を除去するか、又は適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清若しくは沈殿のみを回収することで可能である。
シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるCV値に特に制限はないが、10%以下が好ましく、8%以下がより好ましい。
所望の平均粒径の蛍光シリカナノ粒子を得るためには、YM−10、YM−100(いずれも商品名、ミリポア社製)等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎる粒子、及び小さすぎる粒子を除去するか、又は適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清若しくは沈殿のみを回収することで可能である。
シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるCV値に特に制限はないが、10%以下が好ましく、8%以下がより好ましい。
本発明の製造方法では、前記シリカナノ粒子を水系分散媒に分散させ、シリカナノ粒子を含有する水系分散液を調製する。本発明で用いる水系分散媒は特に制限しないが、例えば、水、エタノール、リン酸バッファー、ボラックスバッファーなどが挙げられる。
前記水系分散液に、後述する第1のオルガノアルコキシシランと第2のオルガノアルコキシシランを添加し、第1のオルガノアルコキシシラン及び第2のオルガノアルコキシシランをシリカナノ粒子と混合する。そして、シリカナノ粒子表面に存在するヒドロキシル基と、第1のオルガノアルコキシシラン及び第2のオルガノアルコキシシランがそれぞれ有するヒドロキシル基との間で縮合反応を行うことで、シリカナノ粒子の表面に、後述する官能基と親水性基を有するシェル構造を設け、コアシェル構造の複合粒子を作製する。
本発明で用いる第1のオルガノアルコキシシランは、その分子内に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基を有する。本発明では、前記官能基の中でも、チオール基が好ましい。また、本発明で用いる第1のオルガノアルコキシシランとしては、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランであることがより好ましい。
本発明で用いる第2のオルガノアルコキシシランは、その分子内に、親水性基を有する。本発明において、親水性基としては水に対して親水性を有するものであれば特に制限はない。
本発明で用いる親水性基は、平均分子量が200〜4,000,000である、水溶性の高分子化合物が好ましい。この平均分子量は、200〜40,000がより好ましく、200〜4,000がさらに好ましい。
(本明細書においては、特に断りのない限り、「分子量」とは重量平均分子量を意味する。高分子化合物は多分散系であり、必ずしも同一の分子量または粒子量を持たない。したがって、分子量を測定して得られた値は、なんらかの形で平均された平均分子量になる。その主なものは次の3種類である。すなわち、1)数平均分子量Mn、2)重量平均分子量Mw、3)Z平均分子量Mzであり、Mn<Mw<Mzの関係が成立する)なお、平均分子量の測定は膜浸透圧測定法により行う。
本発明で用いる親水性基の具体例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリビニルアルコールなどのアルコール性水酸基を含有する高分子、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの水溶性多糖類が挙げられる。
本発明で用いる親水性基は、平均分子量が200〜4,000,000である、水溶性の高分子化合物が好ましい。この平均分子量は、200〜40,000がより好ましく、200〜4,000がさらに好ましい。
(本明細書においては、特に断りのない限り、「分子量」とは重量平均分子量を意味する。高分子化合物は多分散系であり、必ずしも同一の分子量または粒子量を持たない。したがって、分子量を測定して得られた値は、なんらかの形で平均された平均分子量になる。その主なものは次の3種類である。すなわち、1)数平均分子量Mn、2)重量平均分子量Mw、3)Z平均分子量Mzであり、Mn<Mw<Mzの関係が成立する)なお、平均分子量の測定は膜浸透圧測定法により行う。
本発明で用いる親水性基の具体例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリビニルアルコールなどのアルコール性水酸基を含有する高分子、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの水溶性多糖類が挙げられる。
シェル構造の形成方法に特に制限はないが、シリカ粒子溶液に第1のオルガノアルコキシシランと第2のオルガノアルコキシシランを添加し、10〜60℃で10〜60分撹拌することでシェル構造を形成することが好ましい。
シリカナノ粒子を含有する水系分散液への、第1のオルガノアルコキシシランと第2のオルガノアルコキシシランの添加量に特に制限はないが、第1のオルガノアルコキシシランの添加量を1とした場合、前記第2のオルガノアルコキシシランの添加量が重量比で0.1〜15000であることが好ましい。第2のオルガノアルコキシシランの添加量は、1〜10000がより好ましく、1〜5000がさらに好ましい。
第1のオルガノアルコキシシランが有する官能基がチオール基である場合、本発明の複合粒子の表面に存在するチオール基数は、0.001〜0.200個/nm2が好ましく、0.001〜0.100個/nm2がより好ましい。ここで、複合粒子の表面に存在するチオール基数は、シリカナノ粒子を含有する水系分散液に添加する第1のオルガノアルコキシシランと第2のオルガノアルコキシシランとの比率を適宜設定することで調整することができる。なお、当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Bは、DNTB(5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸))を試薬として用いて測定することができる。DNTBを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の1例としては、リン酸緩衝液(pH7.0)に溶解した10mMのDNTBの溶液20μLと、200mg/mLに調製したシリカ粒子コロイド2.5mLとを混合し、1時間後に412nmの吸光度を測定し、標準物質としてγ-メルカプトプロピルトリメトキシシランを用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。あるいは、後述の実施例にあるように、市販のキットを用いて測定することができる。
本発明の複合粒子の純水中における粒径は、1〜600nmが好ましく、1〜500nmがより好ましく、10〜300nmがさらに好ましい。
本明細書において、複合粒子の純水中における粒径は、動的光散乱法による粒度により表される。ここで「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前述の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
本明細書において、複合粒子の純水中における粒径は、動的光散乱法による粒度により表される。ここで「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前述の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
本発明の複合粒子は、タンパク質やDNAなどの生体分子の検出用試薬に好適に用いることができる。
また本発明の複合粒子は、適当な分散媒に分散させた分散液の形態で用いてもよい。本発明で好ましく用いることができる分散媒としては、複合粒子を均一に分散するものであれば特に制限はなく、水、エタノール、PBS(リン酸緩衝食塩水)、並びにTris緩衝液、HEPES緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
また本発明の複合粒子は、適当な分散媒に分散させた分散液の形態で用いてもよい。本発明で好ましく用いることができる分散媒としては、複合粒子を均一に分散するものであれば特に制限はなく、水、エタノール、PBS(リン酸緩衝食塩水)、並びにTris緩衝液、HEPES緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例1
5質量%のアンモニア水をエタノールで1.5倍希釈して3.5mLのアンモニア水含有溶媒を調製した。該アンモニア水含有溶媒にTEOS(信越シリコーン社製)90μL(135μmol)を添加し、これを40℃で90分攪拌することでシリカ粒子(以下、「第1シリカナノ粒子」という)が形成された溶液を得た。
5質量%のアンモニア水をエタノールで1.5倍希釈して3.5mLのアンモニア水含有溶媒を調製した。該アンモニア水含有溶媒にTEOS(信越シリコーン社製)90μL(135μmol)を添加し、これを40℃で90分攪拌することでシリカ粒子(以下、「第1シリカナノ粒子」という)が形成された溶液を得た。
前記第1シリカナノ粒子の表面にチオール基及びポリエチレングリコールを導入するために、前記第1シリカナノ粒子含有溶液に、MPS(和光純薬社製)及びMeO3SiC3-EG〜45(アルテック社製、平均分子量:2000)を投入割合が1:100(質量比)になるように追添した。得られた混合液を40℃で20分攪拌し、第1シリカナノ粒子の表層にチオール基及びポリエチレングリコールとを有するシリカナノ粒子(以下、「第2シリカナノ粒子」という)を得た。その後、液置換を行い、順水中で粒子径を測定した。
比較例1
実施例1で作製した第1シリカナノ粒子の表面にチオール基のみを導入するために、前記第1シリカナノ粒子含有溶液に、MPS(和光純薬社製)を追添した。
実施例1で作製した第1シリカナノ粒子の表面にチオール基のみを導入するために、前記第1シリカナノ粒子含有溶液に、MPS(和光純薬社製)を追添した。
試験例1 シリカナノ粒子表面のチオール基の定量
実施例1及び比較例1で得られた複合粒子表面のチオール基数の定量を行った。チオール基の定量は、AmpliteTM Fluorimetric Total Thiol Quantitation Assay Kit(商品名、AAT Bioquest,Inc.製)を用いて、複合粒子2mg/mL中に含まれるチオール基の濃度を測定し、SEM画像により解析した粒度分布から単位面積当たりのSH基数を算出することにより行った。
実施例1で得られた複合粒子についての結果を図1に、比較例1で得られた複合粒子についての結果を図2に、それぞれ示す。
実施例1及び比較例1で得られた複合粒子表面のチオール基数の定量を行った。チオール基の定量は、AmpliteTM Fluorimetric Total Thiol Quantitation Assay Kit(商品名、AAT Bioquest,Inc.製)を用いて、複合粒子2mg/mL中に含まれるチオール基の濃度を測定し、SEM画像により解析した粒度分布から単位面積当たりのSH基数を算出することにより行った。
実施例1で得られた複合粒子についての結果を図1に、比較例1で得られた複合粒子についての結果を図2に、それぞれ示す。
図1に示すように、本発明の複合粒子は、MPSの添加量に関わらず分散状態が維持されていた。この結果は、分散状態が維持されたのは複合粒子のポリエチレングリコールの親水性の作用によるものであることを確認した。
これに対して、図2に示すように、チオール基数が0.05個/nm2以上となると、表面にポリエチレングリコールを有さない比較例1で得られた複合粒子は凝集物を形成し、分散させることができなかった。そのため、MPSを50mg以上添加した場合、チオール基数の定量が不可能であった。
これに対して、図2に示すように、チオール基数が0.05個/nm2以上となると、表面にポリエチレングリコールを有さない比較例1で得られた複合粒子は凝集物を形成し、分散させることができなかった。そのため、MPSを50mg以上添加した場合、チオール基数の定量が不可能であった。
試験例2 複合粒子の粒径解析
実施例1及び比較例1において、MPSを30mg添加して得られたシリカナノ粒子の粒径を測定した。粒径の測定は、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)により実施した。その結果を表1に示す。
実施例1及び比較例1において、MPSを30mg添加して得られたシリカナノ粒子の粒径を測定した。粒径の測定は、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)により実施した。その結果を表1に示す。
表1に示すように、本発明の複合粒子の平均粒径は35nmであったのに対し、比較例1で得られた複合粒子の平均粒径は104nmであった。この結果は、本発明の複合粒子が、粒子表面の親水性基の作用により、粒子同士が疎水的相互作用によって凝集することを防止していることを示している。
試験例3 複合粒子の分散性解析
実施例1で作製した複合粒子について、シランカップリング剤投入割合毎の分散性の評価を以下に示す方法により行った。
実施例1で作製した複合粒子の二次粒子径を動的光散乱法により測定した。そして、比較例1で作製した粒子の二次粒子径に対し、二次粒径が40%以下の場合を「○」とし、60〜100%の場合を「△」と定義した。その結果を表2に示す。
実施例1で作製した複合粒子について、シランカップリング剤投入割合毎の分散性の評価を以下に示す方法により行った。
実施例1で作製した複合粒子の二次粒子径を動的光散乱法により測定した。そして、比較例1で作製した粒子の二次粒子径に対し、二次粒径が40%以下の場合を「○」とし、60〜100%の場合を「△」と定義した。その結果を表2に示す。
表2より、シランカップリング剤2の添加量の割合が0.1では、比較例1で作製した粒子の二次粒子径に対する粒子径が60-100%であった。これに対して、シランカップリング剤2の添加量の割合を1以上にすることで、比較例1で作製した粒子の二次粒子径に対する粒子径が40%以下になることがわかった。このことから、特にシランカップリング剤2の添加量の割合が1以上の場合に、分散に対して効果があることが分かった。
また、共有結合によりシリカ粒子とPEGの間に強固な共有結合を形成させた実施例1は、物理吸着によりシリカにPEGを吸着させた場合に比べ、保存安定性が向上していた。
また、共有結合によりシリカ粒子とPEGの間に強固な共有結合を形成させた実施例1は、物理吸着によりシリカにPEGを吸着させた場合に比べ、保存安定性が向上していた。
Claims (22)
- チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランとをシリカナノ粒子を含有する水系分散液に添加し、
前記シリカナノ粒子の表面に前記官能基と前記親水性基が結合したシェル層を形成する、複合粒子の製造方法。 - 前記第1のオルガノアルコキシシランが、前記官能基としてチオール基を有する、請求項1に記載の製造方法。
- 前記第1のオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記複合粒子表面に存在するチオール基数が0.001〜0.200個/nm2である、請求項2又は3に記載の製造方法。
- 前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基の平均分子量が200〜4,000,000である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基が、アルコール性水酸基を含有する高分子、及び水溶性多糖類からなる群より選ばれる少なくとも1種の親水性基である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記の、アルコール性水酸基を含有する高分子が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、及びポリビニルアルコールからなる群より選ばれる、請求項6に記載の製造方法。
- 前記水溶性多糖類が、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選ばれる、請求項6に記載の製造方法。
- 前記第1のオルガノアルコキシシランの添加量を1とした場合、前記第2のオルガノアルコキシシランの添加量が重量比で0.1〜15000である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記シリカナノ粒子の粒径が1〜500nmである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記複合粒子の純水中における粒径が1〜600nmである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の製造方法。
- コアシェル構造の複合粒子であって、
シリカナノ粒子がコア構造を構成し、
前記シリカナノ粒子の表面に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基を有する第1のオルガノアルコキシシランと、親水性基を有する第2のオルガノアルコキシシランが結合し、これらのオルガノアルコキシシランがシェル構造を構成してなる、複合粒子。 - 前記第1のオルガノアルコキシシランが、前記官能基としてチオール基を有する、請求項12に記載の複合粒子。
- 前記第1のオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、請求項12又は13に記載の複合粒子。
- 前記複合シリカナノ粒子表面に存在するチオール基数が0.001〜0.200個/nm2である、請求項13又は14に記載の複合粒子。
- 前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基の平均分子量が200〜4,000,000である、請求項12〜15のいずれか1項に記載の複合粒子。
- 前記第2のオルガノアルコキシシランが有する親水性基が、アルコール性水酸基を含有する高分子、及び水溶性多糖類からなる群より選ばれる少なくとも1種の親水性基である、請求項12〜16のいずれか1項に記載の複合粒子。
- 前記の、アルコール性水酸基を含有する高分子が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、及びポリビニルアルコールからなる群より選ばれる、請求項17に記載の複合粒子。
- 前記水溶性多糖類が、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選ばれる、請求項17に記載の複合粒子。
- 前記シリカナノ粒子の粒径が1〜500nmである、請求項12〜19のいずれか1項に記載の複合粒子。
- 前記複合粒子の純水中における粒径が1〜600nmである、請求項12〜20に記載の複合粒子。
- 請求項12〜21のいずれか1項に記載の複合粒子を分散媒に分散させた、複合粒子の分散液。
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