JP5416039B2 - 標識試薬シリカナノ粒子 - Google Patents
標識試薬シリカナノ粒子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5416039B2 JP5416039B2 JP2010127619A JP2010127619A JP5416039B2 JP 5416039 B2 JP5416039 B2 JP 5416039B2 JP 2010127619 A JP2010127619 A JP 2010127619A JP 2010127619 A JP2010127619 A JP 2010127619A JP 5416039 B2 JP5416039 B2 JP 5416039B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- silica
- particles
- labeling reagent
- particle
- silica nanoparticles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Silicon Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
蛍光ナノ粒子を用いた蛍光試薬は、蛍光粒子表面にタンパク質やDNA等の生体分子が結合したものであり、このタンパク質やDNA等の生体分子が特定の生体分子と相互作用することによって、生体分子の検出、定量、染色等に利用されるものである。
以上のような問題点が、蛍光ナノ粒子を生体分子の検出、定量等に用いる上で課題となっている。
さらに、本発明は、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高く、シグナル/ノイズ比の高い、標的物質の検出方法を提供することを課題とする。
(1)シリカ粒子の表面に、生体分子及びコポリマーがそれぞれ吸着又は結合した複合粒子からなる標識試薬シリカナノ粒子であって、
前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質及びペプチドからなる群から選ばれた少なくとも1種であり、
前記標識試薬シリカナノ粒子の平均粒径が20nm〜500nmであり、
前記コポリマーが、ホスホリルコリン基を含むモノマーとビニルモノマーとのコポリマーである、
標識試薬シリカナノ粒子。
(2)前記コポリマーのHLB値が8〜19.5であり、前記コポリマーの吸着又は結合量が、標識試薬シリカナノ粒子1mgに対して、5〜100μgである、前記(1)項記載の標識試薬シリカナノ粒子。
(3)前記ホスホリルコリン基を含むモノマーが2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、前記(1)又は(2)項に記載の標識試薬シリカナノ粒子。
(4)前記ビニルモノマーが、メタクリル酸n−ブチル、アクリル酸n−ブチル、メタクリル酸メチル、アクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ペンチル、アクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、アクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、アクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、アクリル酸オクチル、メタクリル酸ドデシル、アクリル酸ドデシル、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリレート、スチレン、α−メチルスチレン、メチル核置換スチレン、クロロ核置換スチレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、エチルビニルエーテル、n−ブチルビニルエーテル、ジエチルイタコネート及びジ−n−ブチルイタコネートからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記(1)〜(3)のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子。
(5)pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が1〜70mVである、前記(1)〜(4)のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子。
(6)前記(1)〜(5)のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子を用いた、ラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子。
(8)前記(1)〜(5)のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子又は前記(6)項記載のラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子を含浸し、乾燥して得られる、ラテラルフロー用コンジュゲートパッド。
(9)前記(1)〜(5)のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子又は前記(6)項記載のラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子を含有する、イムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質及びペプチドからなる群から選ばれた少なくとも1種であり、
前記複合粒子の平均粒径が20nm〜500nmであり、
前記コポリマーが、ホスホリルコリン基を含むモノマーとビニルモノマーとのコポリマーであり、
シリカ粒子の表面に生体分子が吸着又は結合するシリカ粒子/生体分子の複合粒子のコロイドに対して前記コポリマーを0.01〜1重量%で混合し、シリカ粒子/生体分子の複合粒子の表面に前記コポリマーを吸着又は結合させる、
複合粒子の製造方法。
(11)前記(1)〜(5)のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子又は前記(6)項記載のラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子を用いて標的物質を特異的に捕捉し、標的物質を捕捉した粒子の標識を観察することで標的物質の検出を行う、標的物質の検出方法。
ここで、「非特異的な吸着」とは、特定の部位又はリガンドに対する特異的な結合以外の吸着をいい、意図する以外の吸着現象をいう。
また、「擬陽性」とは、標的物質を標識試薬シリカナノ粒子で標識することでその有無を判定する標的物質の検出方法において、標的物質が含まれないにもかかわらず判定部が標識され、陽性と判定されてしまう現象である。
本発明の標識試薬シリカナノ粒子は、シリカ粒子の表面に生体分子及びホスホリルコリン基を含むコポリマーが吸着又は結合した粒子であって、前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質及びペプチド等からなる群から選ばれた少なくとも1種であることを特徴とする。本発明の標識試薬シリカナノ粒子の表面を修飾する前記生体分子が、標的物質を特異的に認識することにより、標的物質を検出することができる。
本発明において、「吸着」とは、ケイ素原子と酸素原子の親和性に基づく化学的若しくは物理的結合、静電的引力(正電荷と負電荷間に働くクーロン力)、ファンデルワールス力又は疎水性相互作用による一体化をいう。
本発明において、国際公開2007/074722A1公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。前記機能性化合物の具体例としては、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、pH感受性色素化合物等が挙げられる。
前記機能性化合物を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した前記機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基(例えば、アミノ基、水酸基、チオール基)を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に1又は2種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、YM−10、YM−100(いずれも商品名、ミリポア社製)等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
前記重合開始剤としては、通常のラジカル重合開始剤であれば特に限定されるものではないが、例えば2,2’−アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、t−ブチルペルオキシ−2−エチルヘキサノエート、t−ブチルペルオキシジイソブチレート、過硫酸塩又は過硫酸−亜硫酸水素塩等が挙げられる。重合開始剤の使用量は、全原料モノマー100重量部に対して0.01〜10重量部が好ましく、特に0.1〜5重量部が望ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等の画像から無作為に選択した100個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から標識試薬シリカ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した標識試薬シリカ粒子の個数(100個)で割った値に相当する円の直径の平均値(平均円相当直径)を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ(商品名;マルバーン社製)が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
また、コロイド粒子がマイナスに帯電すると前記ゼータ電位は負の値となるのに対し、コロイド粒子がプラスに帯電すると前記ゼータ電位は正の値となる。
前記絶対値が小さすぎると、容易に凝集体が生じる。また、前記絶対値が大きすぎると、静電的相互作用によって非特異的吸着が増大する。
ゼータ電位測定装置としては、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)、ELS−Z1(商品名、大塚電子社製)、NICOMP 380ZLS(商品名、IBC社製)等を用いることができる。
シリカ粒子と生体分子とを吸着または共有結合により結合する方法については特に制限はないが、シリカ粒子と生体分子とを吸着させる方法については、例えば緩衝液に分散したシリカ粒子の分散液に生体分子を加え、混合または静置する方法が挙げられる。
前記シリカナノ粒子コロイドの緩衝液については特に制限はなく、前記複合粒子を均一に分散するものであればよく、PBS(リン酸緩衝食塩水)、Tris緩衝液、HEPES緩衝液等が挙げられる。
本発明の標的物質の検出方法は、毛細管現象等を利用して移動する標識試薬シリカナノ粒子を利用して、判定部で前記粒子を集積させ、判定を行う検出方法であり、例えばイムノクロマト法やマイクロ流路チップ等を利用して行うことができる。
本発明の標識試薬シリカナノ粒子はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子として好適に用いることができる。さらに、本発明の標的物質の検出方法において、ラテラルフロータイプのイムノクロマト法を利用して標的物質を検出することが好ましい。
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、
(1)試料添加用部材(サンプルパッド)と本発明の標識試薬シリカナノ粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子を含浸し、乾燥して得られる部材(コンジュゲートパッド)とが、
(2)前記コンジュゲートパッドと抗体固定化部を有するメンブレン(抗体固定化メンブレン)とが、並びに
(3)前記抗体固定化メンブレンと吸収パッドとが
相互に毛細管現象が生じるように直列連結していることが好ましい。
図1(a)は、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの好ましい一実施形態の平面図を示し、図1(b)は、図1(a)で示したイムノクロマトグラフィー用テストストリップの縦断面図を示す図である。
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ1は、サンプルパッド2、コンジュゲートパッド3、抗体固定化メンブレン4、吸収パッド5からなることが好ましい。上記各構成部材は粘着剤付きバッキングシート6により裏打ちされていることが好ましい。
本発明において、標的物質を含有する試料としては特に制限ないが、尿、血液などの液体試料が挙げられる。
1)サンプルパッド2
サンプルパッド2は標的物質を含むサンプルを滴下する構成部材である。
コンジュゲートパッド3は本発明の標識試薬シリカナノ粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子が含浸された構成部材であり、サンプルパッド2から毛細管現象により移動してきた試料に含まれる標的物質が抗原抗体反応等の特異的分子認識反応で、前記標識試薬シリカナノ粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子によって捕捉され、標識される部分である。
コンジュゲートパッド3における単位面積(cm2)当たりの前記標識試薬シリカナノ粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子の含有量は特に制限はないが1μg〜100μgが好ましい。含浸方法としては、前記標識試薬シリカナノ粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子の分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。
メンブレン4は前記標識試薬シリカナノ粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子により標識された標的物質が毛細管現象によって移動する構成部材であり、固定化抗体−標的物質−標識試薬シリカナノ粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応が行われる抗体固定化部(判定部)を有する。
前記メンブレンにおける前記抗体固定化部(判定部)の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、幅0.5〜1.5mmのライン状であることがより好ましい。
前述の抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記抗体固定化メンブレン全体をいわゆるブロッキング処理を施しておくことが好ましい。例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥する方法等が挙げられる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク(DIFCO社製)、4%ブロックエース(明治乳業社製)などが挙げられる。
吸収パッド5は、毛細管現象でメンブレンを移動してきた試料及び標識試薬シリカナノ粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための構成部材である。
前記粘着剤付きバッキングシートとしては、AR9020(商品名、Adhesives Research社製)等が挙げられる。
また、前記標識試薬シリカナノ粒子が蛍光色素を含有した蛍光シリカ粒子の場合、判定部の蛍光の発色の程度は、例えば以下に述べるイムノクロマト法用蛍光検出システムを用いて行うことができる。
前記蛍光検出システムにおいて、前記標識試薬シリカナノ粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子の部分が発する蛍光を目視等によって検出する観点から、前記励起光源が、波長200nm〜400nmの励起光を発することが好ましい。前記励起光源としては、水銀ランプ、ハロゲンランプ及びキセノンランプが挙げられる。
また、前記蛍光検出システムは、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えていることがより好ましく、さらに、蛍光のみを目視等で検出する観点から、前記励起光を除去し蛍光のみを透過するフィルタを備えていることがさらに好ましい。
前記蛍光検出システムは、前記蛍光を受光する光電子倍増管又はCCD検出器を備えることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから標的物質の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。
ここで、POCTとは、患者にできる限り近い場所で診断するための検査をいう。従来は採取した血液、尿、患部組織などの検体は、病院の中央検査室や専門の検査センターに送られデータを出すので、診断の確定までに時間がかかっていた(例えば、1日以上)。POCTによれば、瞬時に提供される検査情報をもとに迅速かつ的確な治療が可能となることから、病院での緊急検査や手術中の検査が可能になるので、最近、医療現場でニーズが高い。
5−(及び−6)−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル(商品名、emp Biotech GmbH社製)2.9mgを1mLのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。ここに1.3μLのAPSを加え、室温(23℃)で1時間反応を行った。
得られた反応液600μLと、エタノール140mL、TEOS6.5mL、蒸留水35mL及び28質量%アンモニア水15mLを混合し、室温で24時間反応を行った。
反応液を18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を4mL加え、粒子を分散させ、再度18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに2回繰り返し、シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のTEOSやアンモニア等を除去し、平均粒径169nmのシリカナノ粒子1.67gを得た。収率約95%。
図2は、得られたシリカナノ粒子のSEM写真像を示す図である。図中、白く見える球形状物質が、得られたシリカナノ粒子である。
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下MPCと称す)とメタクリル酸ブチル(以下BMAと称す)とのモノマー仕込みモル比がMPC/BMA=60/40、総モノマー濃度が1.0mol/L及び重合開始剤がモノマー濃度に対して1mol%となるように、MPC3.54g(12.0mmol)、BMA1.04g(8.0mmol)を重合用ガラス反応管に秤取し、これに重合開始剤として2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(以下AIBNと称す)0.0328g(0.2mmol)、重合溶媒としてメタノール20mlを加えた。反応管内を十分にアルゴン置換した後、400mLのジエチルエーテルに滴下することによってポリマーを沈殿させた。ついで濾別し、十分にジエチルエーテルにて洗浄した後減圧乾燥して白色粉末状ポリマー1.89gを得た。重合率は41.3%であった。また得られたポリマーのテトラヒドロフラン溶液をGPC(ゲルパーミエーションクロマトグラフィー)を用いて分析し、分子量を測定した結果、ポリスチレン換算で29000であった。更にモル組成比は元素分析の結果より、MPC/BMA=55.4/44.6であった。得られたコポリマーのHLB値を前記式(2)に基づき計算すると(ここで、親水部iはMPC(式量:295)、非親水部jはBMA(式量:142)である)、
HLB値=
20×(295×55.4)/(295×55.4+142×44.6)=14.4
であった。
5−(及び−6)−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル(商品名、emp Biotech GmbH社製)2.9mgを1mLのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。ここに1.3μLのAPSを加え、室温(23℃)で1時間反応を行った。
得られた反応液600μLと、エタノール140mL、TEOS6.5mL、蒸留水20mL及び28質量%アンモニア水15mLを混合し、室温で24時間反応を行った。
反応液を18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を4mL加え、粒子を分散させ、再度18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに2回繰り返し、シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のTEOSやアンモニア等を除去し、平均粒径260nmのシリカナノ粒子1.60gを得た。収率約92%。
前記シリカ粒子の分散液100μL(分散媒:蒸留水)と、50mM KH2PO4(pH7.0)380μLをマイクロチューブに加えて軽く撹拌した。前記マイクロチューブに抗hCG抗体(Anti−hCG clone codes/5008、Medix Biochemica社製)10μL(5.8mg/mL)を加え、室温で10分間緩やかに混合し、抗hCG抗体を前記シリカナノ粒子に吸着させた。これに、参考例2で調製したコポリマーの5重量%溶液を10μL加え軽く撹拌した。
得られたコロイド0.2mLを10000×gで5分間遠心分離し、上清を取り除いた。ここに2M NaOH水溶液を50μL加え粒子を分散させた後、80℃で1時間加熱しシリカ粒子を溶解した。これに、2M塩酸50μLを少しずつ加えた。得られた溶液に含まれるコポリマー量をHPLC(検出器:示差屈折率検出器、Waters社製)で測定した。その結果、コポリマーの濃度は60μg/mLであり、この濃度から算出した粒子1mgあたりのコポリマー結合量は12μgであった。
実施例1で用いた、濃度5mg/mlのローダミン6G含有シリカ粒子(平均粒径260nm)の分散液100μL(分散媒:蒸留水)に、蒸留水775μL、濃度10mg/mLのアルギン酸ナトリウム水溶液(重量平均分子量70000)100μL及び28重量%のアンモニア水溶液を25μL加え、室温(23℃)で1時間緩やかに混合した。得られたコロイドを12,000×gの重力加速度で30分遠心分離し、上清を除去した。ここに蒸留水を875μL加え、粒子を再分散させた。続いて、10mg/mLのアルギン酸ナトリウム水溶液を100μL加え撹拌子でよく撹拌したあと、28重量%のアンモニア水溶液を25μL加え、1時間緩やかに混合した。このコロイドを12,000×gの重力加速度で30分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を1mL加え粒子を分散させた。同様にして更に2回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、蒸留水200μLに分散させ、ローダミン6G含有シリカ粒子/アルギン酸の複合粒子(平均粒径260nm)のコロイドを得た(収量2.5mg/mL×200μL)。
得られたコロイドを12,000×gの重力加速度で10分遠心分離し、上清を除去した。ここに50mMKH2PO4(pH7.0)を370μLと抗hCG抗体(Anti−hCG clone codes/5008, Medix Biochemica社製)20μL(5.8mg/mL)を加え、室温で10分間緩やかに混合し、抗hCG抗体を前記シリカナノ粒子に共有結合させた。
混合液を12000×gで15分間遠心分離し、上清を取り除いた。ここに保存用バッファー(20mM Tris−HCl(pH 8.2)、0.05% PEG20,000、150mM NaCl、1%BSA、0.1%NaN3)を1mL加え、再度遠心分離し、上清を取り除いた。ここに蒸留水500μLと塗布バッファー(20mM Tris−HCl(pH8.2)、0.05%PEG(分子量20,000)、5%スクロース)を500μL加え、粒子を分散させ、シリカ粒子/生体分子/ホスホリルコリン基を含むコポリマーの複合粒子のコロイドを得た(0.5mg/mL×1mL)。
実施例1と同様に、得られたコロイドのpH7の純水中におけるゼータ電位は49.7mVであり、シリカナノ粒子に対するコポリマーの結合量は粒子1mgあたり15μgであった。
実施例1で得られた複合粒子のコロイド0.8mLをGlass Fiber Conjugate Pad(GFCP、MILLIPORE社製)(8×150mm)に均一に塗布した。デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥し、実施例1で得られた複合粒子を含有してなるコンジュゲートパッドを作製した。
メンブレン(丈25mm、商品名:Hi−Flow Plus120 メンブレン、MILLIPORE社製)の中央付近(端から約12mm)に、幅約1mmのテストラインとして、抗hCG抗体(alpha subunit of FSH(LH),clone code/6601、Medix Biochemica社製)を1mg/mL含有する溶液((50mMKH2PO4,pH7.0)+5%スクロース)を0.75μL/cmの塗布量で塗布した。
続いて、幅約1mmのコントロールラインとして、抗マウスIgG抗体(Anti Mouse IgG、Dako社製)を1mg/mL含有する溶液((50mMKH2PO4,pH7.0)シュガー・フリー)を0.75μL/cmの塗布量で塗布し、50℃で30分乾燥させた。なお、テストラインとコントロールラインとの間隔は4mmとした。
次に、ブロッキング処理として前記メンブレン全体をブロッキングバッファー(組成:100mMホウ酸(pH8.5)、1重量%カゼイン)中に室温で30分浸した。
前記メンブレンをメンブレン洗浄/安定バッファー(組成:10mMKH2PO4(pH7.5)、1重量%スクロース、0.1%コール酸ナトリウム)に移し室温で30分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、抗体固定化メンブレンを作製した。
なお、各構成部材は、図1(a)及び図1(b)に示すように、各々その両端を隣接する部材と2mm程度重ね合わせて貼付した(以下、同様である)。
比較例として、ホスホリルコリン基を含むコポリマーを加えないで調製したシリカ粒子/生体分子複合粒子を以下の方法で作製した。
実施例1で用いた、濃度5mg/mlのローダミン6G含有シリカ粒子(平均粒径260nm)の分散液100μL(分散媒:蒸留水)及び50mMKH2PO4(pH7.0)390μLをマイクロチューブに加えて軽く撹拌した。前記マイクロチューブに抗hCG抗体(Anti−hCG clone codes/5008,Medix Biochemica社製)10μL(5.8mg/mL)を加え、室温で10分間緩やかに混合し、抗hCG抗体を前記シリカナノ粒子に吸着させた。
混合液を12000×gで15分間遠心分離し、上清を取り除いた。ここに保存用バッファー(20mM Tris−HCl(pH 8.2)、0.05% PEG20,000、150mM NaCl、1%BSA、0.1%NaN3)を1mL加え、再度遠心分離し、上清を取り除いた。ここに蒸留水500μLと塗布バッファー(20mM Tris−HCl(pH8.2)、0.05%PEG(分子量20,000)、5%スクロース)を500μL加え、粒子を分散させ、シリカ粒子/生体分子の複合粒子のコロイドを得た(0.5mg/mL×1mL)。
50IU/LのリコンビナントhCG(ロート製薬社製)を実施例3及び比較例で作成したテストストリップのサンプルパッド部分に100μL滴下し、3時間放置後、テストストリップのサンプルパッドとコンジュゲートパッドを剥がし、メンブレンを露出させ、レーザダイオードを用いて励起を行いフォトダイオードで蛍光を受光することでメンブレンの蛍光プロファイルを取得した。得られた蛍光プロファイルからテストライン、コントロールラインの蛍光強度を評価した。
さらに、図3から分かるように、本発明のシリカナノ粒子を用いると、比較例のシリカナノ粒子に比べて、バックグラウンドレベルが低下している。この結果から、ホスホリルコリン基を含むコポリマーをシリカナノ粒子表面に吸着又は結合させることによって、標識試薬シリカナノ粒子のメンブレン全体に対する非特異的吸着が抑制され、バックグラウンドが低下していることが分かる。
以上の結果から、本発明によれば、シグナル/ノイズ比の高い極微量標的試料の高感度分析が可能となる。
実施例1で調製した本発明の標識試薬シリカナノ粒子のコロイド、比較例で調製したシリカ粒子/生体分子複合粒子のコロイド、および実施例1及び比較例で使用した、抗hCG抗体で表面修飾する前のシリカ粒子について動的光散乱法(DLS)による粒度分布の測定を行った。装置はゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)を用いた。その結果を図5に示す。図5中、Aのグラフは本発明の標識試薬シリカナノ粒子のコロイドのデータを示し、Bのグラフはシリカ粒子/生体分子複合粒子のコロイドのデータを示し、Cのグラフは抗hCG抗体で表面修飾する前のシリカ粒子のデータを示す。
この結果から、ホスホリルコリン基を含むコポリマーをシリカナノ粒子表面に吸着又は結合させることで、粒子の凝集が抑制されることが分かる。
2 サンプルパッド
3 コンジュゲートパッド
4 抗体固定化メンブレン
5 吸収パッド
6 バッキングシート
41 テストライン
42 コントロールライン
Claims (11)
- シリカ粒子の表面に、生体分子及びコポリマーがそれぞれ吸着又は結合した複合粒子からなる標識試薬シリカナノ粒子であって、
前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質及びペプチドからなる群から選ばれた少なくとも1種であり、
前記標識試薬シリカナノ粒子の平均粒径が20nm〜500nmであり、
前記コポリマーが、ホスホリルコリン基を含むモノマーとビニルモノマーとのコポリマーである、
標識試薬シリカナノ粒子。 - 前記コポリマーのHLB値が8〜19.5であり、
前記コポリマーの吸着又は結合量が、標識試薬シリカナノ粒子1mgに対して、5〜100μgである、
請求項1記載の標識試薬シリカナノ粒子。 - 前記ホスホリルコリン基を含むモノマーが2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、請求項1又は2に記載の標識試薬シリカナノ粒子。
- 前記ビニルモノマーが、メタクリル酸n−ブチル、アクリル酸n−ブチル、メタクリル酸メチル、アクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ペンチル、アクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、アクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、アクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、アクリル酸オクチル、メタクリル酸ドデシル、アクリル酸ドデシル、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリレート、スチレン、α−メチルスチレン、メチル核置換スチレン、クロロ核置換スチレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、エチルビニルエーテル、n−ブチルビニルエーテル、ジエチルイタコネート及びジ−n−ブチルイタコネートからなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子。
- pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が1〜70mVである、請求項1〜4のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子を用いた、ラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子を緩衝液に分散して得られる、シリカナノ粒子コロイド。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子又は請求項6記載のラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子を含浸し、乾燥して得られる、ラテラルフロー用コンジュゲートパッド。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子又は請求項6記載のラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子を含有する、イムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
- シリカ粒子の表面に、生体分子及びコポリマーがそれぞれ吸着又は結合した複合粒子の製造方法であって、
前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質及びペプチドからなる群から選ばれた少なくとも1種であり、
前記複合粒子の平均粒径が20nm〜500nmであり、
前記コポリマーが、ホスホリルコリン基を含むモノマーとビニルモノマーとのコポリマーであり、
シリカ粒子の表面に生体分子が吸着又は結合するシリカ粒子/生体分子の複合粒子のコロイドに対して前記コポリマーを0.01〜1重量%で混合し、シリカ粒子/生体分子の複合粒子の表面に前記コポリマーを吸着又は結合させる、
複合粒子の製造方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項記載の標識試薬シリカナノ粒子又は請求項6記載のラテラルフロー用標識試薬シリカナノ粒子を用いて標的物質を特異的に捕捉し、標的物質を捕捉した粒子の標識を観察することで標的物質の検出を行う、標的物質の検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010127619A JP5416039B2 (ja) | 2010-06-03 | 2010-06-03 | 標識試薬シリカナノ粒子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010127619A JP5416039B2 (ja) | 2010-06-03 | 2010-06-03 | 標識試薬シリカナノ粒子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011252819A JP2011252819A (ja) | 2011-12-15 |
JP5416039B2 true JP5416039B2 (ja) | 2014-02-12 |
Family
ID=45416863
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010127619A Active JP5416039B2 (ja) | 2010-06-03 | 2010-06-03 | 標識試薬シリカナノ粒子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5416039B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012133047A1 (ja) * | 2011-03-25 | 2012-10-04 | コニカミノルタエムジー株式会社 | 免疫組織染色法、およびこれを用いた抗体医薬の有効性を判定する方法 |
JP6108657B2 (ja) * | 2011-12-28 | 2017-04-05 | 日本バイリーン株式会社 | 構造体及びその製造方法 |
CN102662050B (zh) * | 2012-05-24 | 2014-02-19 | 东北师范大学 | 基于二氧化硅纳米粒子的红外吸收性质的免疫分析方法 |
JP5917693B2 (ja) * | 2012-07-09 | 2016-05-18 | 富士フイルム株式会社 | 呈色測定装置および方法 |
JP6682872B2 (ja) * | 2016-01-20 | 2020-04-15 | 日油株式会社 | 口腔用シリカ分散安定化剤およびこれを含有する歯磨剤組成物 |
JP2019069930A (ja) * | 2017-10-11 | 2019-05-09 | 小林製薬株式会社 | 口腔用組成物 |
JP2019069929A (ja) * | 2017-10-11 | 2019-05-09 | 小林製薬株式会社 | 口腔用組成物 |
JP2019069928A (ja) * | 2017-10-11 | 2019-05-09 | 小林製薬株式会社 | 口腔用組成物 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3443891B2 (ja) * | 1993-09-14 | 2003-09-08 | 日本油脂株式会社 | タンパク質吸着防止剤 |
JP4434971B2 (ja) * | 2005-01-21 | 2010-03-17 | 住友ベークライト株式会社 | 捕捉ビーズ用マイクロ粒子およびそれを用いた捕捉ビーズならびにバイオチップ |
WO2007061098A1 (ja) * | 2005-11-25 | 2007-05-31 | Japan Science And Technology Agency | 分析方法及び分析装置 |
JP5388462B2 (ja) * | 2008-03-24 | 2014-01-15 | 富士フイルム株式会社 | 担体及びその製造方法 |
JP5100541B2 (ja) * | 2008-07-04 | 2012-12-19 | 古河電気工業株式会社 | 標識粒子として、蛍光粒子と着色粒子とを含有するイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、それを用いたイムノクロマト法用テストストリップおよび検査方法 |
JP5203132B2 (ja) * | 2008-10-21 | 2013-06-05 | 古河電気工業株式会社 | 架橋性官能基を粒子表面に有するシリカ粒子の製造方法、架橋性官能基を粒子表面に有するシリカ粒子、前記シリカ粒子のコロイド、前記シリカ粒子を用いた複合粒子、及び前記複合粒子の製造方法 |
JP4382866B1 (ja) * | 2008-12-26 | 2009-12-16 | 田中貴金属工業株式会社 | クロマトグラフ媒体 |
JP4514824B2 (ja) * | 2009-02-23 | 2010-07-28 | 古河電気工業株式会社 | イムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子の製造方法、イムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造方法、及びそれを用いたイムノクロマト法用テストストリップの使用方法 |
-
2010
- 2010-06-03 JP JP2010127619A patent/JP5416039B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011252819A (ja) | 2011-12-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5416039B2 (ja) | 標識試薬シリカナノ粒子 | |
US10209249B2 (en) | Labelled silica nanoparticles for immunochromatographic reagent, immunochromatographic test strip using the same, and immunochromomatographic fluorescence-detecting system or radiation-detecting system | |
JP4514824B2 (ja) | イムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子の製造方法、イムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造方法、及びそれを用いたイムノクロマト法用テストストリップの使用方法 | |
JP5100541B2 (ja) | 標識粒子として、蛍光粒子と着色粒子とを含有するイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、それを用いたイムノクロマト法用テストストリップおよび検査方法 | |
JP5503382B2 (ja) | イムノクロマトグラフィー用複合粒子 | |
WO2014084260A1 (ja) | イムノクロマトグラフィー、これに用いられる検出装置および試薬 | |
JP5367490B2 (ja) | イムノクロマト法用テストストリップ | |
JP6734053B2 (ja) | イムノクロマトグラフィー用試験片、これに用いられる展開液、およびこれを用いたイムノクロマトグラフィー | |
JP6080164B2 (ja) | 蛍光標識粒子 | |
JP5583092B2 (ja) | イムノクロマトグラフィー用試験キット、これを用いた検出方法 | |
US10203326B2 (en) | Method of detecting target substance | |
JP5810195B1 (ja) | 紫外励起蛍光粒子、これを用いた検出方法、画像表示方法、画像表示スクリーンおよび画像表示装置 | |
TWI595009B (zh) | Identification of antibody manufacturing methods and labeling antibodies | |
JP6162370B2 (ja) | イムノクロマトグラフィー用試験片 | |
JP5480222B2 (ja) | 蛍光イムノクロマトグラフィー法、これに用いるキット及びテストストリップ | |
JP4330025B2 (ja) | 多糖を表面に有する複合粒子、複合粒子コロイド、それを用いた分析試薬、及び複合粒子の製造方法 | |
JP2017166911A (ja) | 生体分子の検出又は定量方法、及び生体分子の検出又は定量用試験キット | |
JP2017150867A (ja) | 生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬 | |
JP2015152306A (ja) | 蛍光イムノクロマトグラフィーおよびその検出装置 | |
JP2017181050A (ja) | 生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬粒子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130222 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20130523 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130604 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130802 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130802 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131029 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131114 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5416039 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |