TWI595009B - Identification of antibody manufacturing methods and labeling antibodies - Google Patents

Identification of antibody manufacturing methods and labeling antibodies Download PDF

Info

Publication number
TWI595009B
TWI595009B TW103103705A TW103103705A TWI595009B TW I595009 B TWI595009 B TW I595009B TW 103103705 A TW103103705 A TW 103103705A TW 103103705 A TW103103705 A TW 103103705A TW I595009 B TWI595009 B TW I595009B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
group
molecule
cerium oxide
thiol group
Prior art date
Application number
TW103103705A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201443082A (zh
Inventor
Nobumitsu Yamanaka
Hideki Aizawa
Michio Ohkubo
Kazutomi Miyoshi
Original Assignee
Furukawa Electric Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Furukawa Electric Co Ltd filed Critical Furukawa Electric Co Ltd
Publication of TW201443082A publication Critical patent/TW201443082A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI595009B publication Critical patent/TWI595009B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Silicon Compounds (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Pigments, Carbon Blacks, Or Wood Stains (AREA)

Description

標識抗體之製造方法及標識抗體
本發明係關於一種標識抗體之製造方法。
近年來，數nm~1μm左右之微粒被用於各種領域而受到注目。例如，用於吸附劑、觸媒等之多孔質二氧化矽粒子或沸石粒子，用於顏料之碳黑、金屬氧化物粒子、無機化合物粒子，用於導電材料之金屬奈米粒子，用於樹脂之補強劑之二氧化矽粒子等，上述微粒之材質及用途涉及多個方面。又，尤其是於生物技術之領域，半導體奈米粒子、或含有螢光色素之二氧化矽奈米粒子等作為新標識用粒子之應用備受期待。又，含有高濃度色素之二氧化矽奈米粒子具有高莫耳吸光係數，因此作為更高感度之標識用粒子之應用受到期待。
上述標識用粒子藉由使具有與特定目標分子結合之能力的生物分子(蛋白質或核酸等)鍵結於其表面，而可利用為可用於目標分子之檢測、定量、染色等之標識試劑。
本發明之課題在於提供一種用於製造標識抗體之方法，該標識抗體係抗體鍵結於含有螢光色素等功能性分子之二氧化矽奈米粒子(以下亦稱作含功能性分子之二氧化矽奈米粒子)之表面而成者，該方法係用 以製造下述標識抗體：於免疫測定中減少非特異性吸附、且提高作為檢測對象之目標抗原的捕捉效率(對目標抗原之結合效率)。
又，本發明之課題在於提供一種標識抗體，該標識抗體係使抗體鍵結於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之表面而成者，該標識抗體於免疫測定中減少非特異性吸附、且提高作為檢測對象之目標抗原的捕捉效率。
本發明人等發現，使抗體鍵結於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之表面而成的標識抗體中，其對目標抗原之結合能力(目標抗原之捕捉能力)根據抗體對該二氧化矽奈米粒子表面之鍵結方式而有較大變動。並且發現，若將使抗體之羧基與二氧化矽奈米粒子表面之硫醇基經由連接分子而鍵結之形態的標識抗體用於免疫測定，則非特異性吸附被大幅抑制，並且目標抗原之捕捉能力大幅提高。本發明係基於該等見解而完成。
本發明之課題係藉由下述手段而達成。
<1>一種標識抗體之製造方法，其包含下述步驟：a)使含有功能性分子且表面具有硫醇基之二氧化矽奈米粒子與具有順丁烯二醯亞胺基及胺基之連接分子共存於溶劑中，藉此在上述硫醇基與上述順丁烯二醯亞胺基之間形成硫醚鍵，獲得鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子，及b)使上述鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子、碳二亞胺及抗體共存於水系溶劑中，在上述連接分子所具有之胺基與上述抗體所具有之羧基之間形成醯胺鍵。
<2>如上述<1>之標識抗體之製造方法，其中，步驟a)中之溶劑係非質子性溶劑。
<3>如上述<1>或<2>之製造方法，其中，非質子性溶劑係選自二甲亞碸、環丁碸、吡啶、N-甲基吡咯啶酮、N-環己基吡咯啶酮、N,N-二甲基甲醯胺、及N,N-二甲基乙醯胺。
<4>如上述<1>~<3>中任一項之製造方法，其中，連接分子之結構係順丁烯二醯亞胺基與胺基經由2價之脂肪族基或伸芳基(arylene)或者該等之組合連結而成的結構。
<5>如上述<1>~<4>中任一項之製造方法，其中，標識抗體之平均粒徑為20~500nm。
<6>如上述<1>~<5>中任一項之製造方法，其中，功能性分子係選自由螢光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及pH敏感性分子組成之群。
<7>如上述<1>~<6>中任一項之製造方法，其中，於含有功能性分子且表面具有硫醇基之二氧化矽奈米粒子中，存在於表面之硫醇基的密度為0.002~0.2個/nm2，抗體之鍵結量受該硫醇基之量控制。
<8>一種標識抗體，其係以含有功能性分子之二氧化矽奈米粒子作為標識粒子且抗體經由連接基而鍵結於其表面而成者，上述含有功能性分子之二氧化矽奈米粒子與上述連接基藉由硫醚鍵連結，上述抗體與上述連接基之連結結構為*-C(=O)-NH-(＊表示抗體側)。
<9>如上述<8>之標識抗體，其中，連接基具有2價之脂肪族基或伸芳基或者該等之組合。
<10>如上述<8>或<9>之標識抗體，其中，平均粒徑為20~500nm。
<11>一種膠體，其係上述<8>~<10>中任一項之標識抗體於分散介質中分散而成。
<12>如上述<11>之膠體，其中，分散介質為緩衝液。
<13>一種分析試劑，其含有上述<8>~<10>中任一項之標識抗體。
藉由本發明之標識抗體之製造方法(以下亦簡單稱為本發明之製造方法)，可獲得免疫測定中之非特異性吸附被進一步抑制、且目標抗原之捕捉能力進一步提高之標識抗體。又，藉由本發明之製造方法，由於 抗體之鍵結量受含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面之硫醇基之量控制，故可更精密地控制抗體對該二氧化矽奈米粒子表面之鍵結量。
本發明之標識抗體於免疫測定中之非特異性吸附更少，另一方面，目標抗原之捕捉能力進一步提高。又，本發明之標識抗體係抗體經由連接分子而與含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面藉由共價鍵牢固且穩定地鍵結，故抗體難以自含功能性分子之二氧化矽奈米粒子脫附。
本發明之上述以及其他特徵及優點可適當參照隨附之圖式，根據下述記載而更加明瞭。
1‧‧‧試帶
2‧‧‧樣品墊
3‧‧‧結合墊
4‧‧‧抗體固定化膜片
41‧‧‧判定部(測試線)
42‧‧‧控制線
5‧‧‧吸收墊
6‧‧‧背襯片
圖1係模式性地表示實施例所使用之免疫層析裝置之試帶之結構的圖。圖1中(a)表示俯視圖，(b)表示縱剖面圖。
以下基於本發明之較佳實施態樣而對其進行詳細說明。
本發明之製造方法中使用含有功能性分子且表面具有硫醇基之二氧化矽奈米粒子。該二氧化矽奈米粒子具備作為所謂標識用粒子之性能。本發明之製造方法中，使特定之連接分子經由該二氧化矽奈米粒子表面之硫醇基而共價鍵結於上述二氧化矽奈米粒子，並進而使該抗體經由抗體所具有之羧基而共價鍵結於該連接分子之其他部位。藉此，可獲得鍵結有與上述二氧化矽粒子表面之硫醇基之量相對應之量之抗體的標識抗體。以上述方式獲得之標識抗體可用於各種診斷試劑、檢查試劑等分析試劑。
上述含功能性分子之二氧化矽奈米粒子中的「功能性分子」並無特別限制，較佳為採用分析試劑等中可成為檢測指標之標識分子。作 為該功能性分子，可例示螢光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子、pH敏感性色素分子等，可使用該等之1種或2種以上。
含功能性分子之二氧化矽奈米粒子可藉由如下方法製備：獲得藉由共價鍵、離子鍵及其他化學鍵或物理性吸附使功能性分子與矽烷偶合劑鍵結而成之生成物(鍵結有功能性分子之有機烷氧基矽烷)，使該生成物與1種或2種以上矽烷化合物(矽氧烷成分)於例如含氨水之溶劑中水解、聚縮合而形成矽氧烷鍵。
作為上述含氨水之溶劑，例如可使用於將水/乙醇以體積比計設為1/10~1/1之混合液中以氨濃度成為0.2~3wt%之方式添加例如28%左右之氨水而成之溶液。
上述矽烷化合物(矽氧烷成分)並無特別限制，例如，如四乙氧基矽烷(TEOS)或四甲氧基矽烷般之四烷氧基矽烷，除此以外，亦可使用γ-巰丙基三甲氧基矽烷(MPS)、γ-巰丙基三乙氧基矽烷、γ-胺基丙基三乙氧基矽烷(APS)、3-硫氰基丙基三乙氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基三乙氧基矽烷、3-異氰酸酯基丙基三乙氧基矽烷、3-[2-(2-胺基乙基胺基)乙基胺基]丙基三乙氧基矽烷等矽烷偶合劑。其中，可較佳地使用TEOS。
再者，若使用MPS等具有硫醇基者作為上述矽烷化合物，則所得之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子其表面存在硫醇基，因此無需後文敍述之向含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面導入硫醇基之操作。
於使功能性分子與矽烷偶合劑共價鍵結之情形時，例如，可使用具有N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯基、順丁烯二醯亞胺基、異氰酸酯基、異硫氰酸酯基、醛基、對硝基苯基、二乙氧基甲基、環氧基、氰基等活性基之功能性分子與具有可與該等活性基反應之官能基(例如，胺基、羥基、硫醇基等)之矽烷偶合劑。
具有NHS酯基之功能性分子中，作為該功能性分子為螢光 分子之情形時的較佳例，可列舉5-(及-6)-羧基四甲基若丹明-NHS酯(商品名，emp Biotech GmbH公司製造)、下式所表示之DY550-NHS酯、下式所表示之DY630-NHS酯(均為商品名，Dyomics GmbH公司製造)等具有NHS酯基之螢光色素化合物，但本發明並不限定於該等。
於功能性分子具有丁二醯亞胺基之情形時，可使其與具有胺基之矽烷偶合劑鍵結。作為具有胺基之矽烷偶合劑之具體例，可列舉γ-胺基丙基三乙氧基矽烷(APS)、3-[2-(2-胺基乙基胺基)乙基胺基]丙基三乙氧基矽烷、3-(2-胺基乙基胺基)丙基二甲氧基甲基矽烷、3-胺基丙基 三甲氧基矽烷等。其中，可較佳地使用APS。
以上述方式製備之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子其形狀為長軸與短軸之比為2以下之球狀。又，平均粒徑較佳為1~1000nm，更佳為20~500nm。
該平均粒徑係可利用圖像處理裝置求出自穿透式電子顯微鏡(TEM)、掃描式電子顯微鏡(SEM)等之圖像隨機選擇之100個標識粒子之合計投影面積中的複合粒子之佔有面積，作為相當於該合計佔有面積除以所選擇之複合粒子之個數(100個)而得之值的圓之直徑之平均值(平均圓當量徑)而算出。
所需之平均粒徑之二氧化矽奈米粒子可藉由使用YM-10、YM-100(均為商品名，Millipore公司製造)等超濾膜進行超濾而獲得。又，亦可藉由以適當之重力加速度進行離心分離並回收上清液或沈澱而獲得。
繼而對向含功能性分子之二氧化矽奈米粒子的表面導入硫醇基之方法進行說明。
向二氧化矽奈米粒子表面導入硫醇基係可藉由通常之方法而完成，例如，可採用Journal of Colloid and Interface Science,159,150-157(1993)、國際公開2007/074722A1公報所記載之方法。
例如，使含功能性分子之二氧化矽奈米粒子分散於水與乙醇之混合溶劑中，添加具有硫醇基之矽烷偶合劑與氨水並攪拌，藉此可向含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之表面導入硫醇基。
具有硫醇基之矽烷偶合劑較佳為該硫醇基經由伸烷基或伸烷氧基而鍵結於矽原子而成之結構。該伸烷基或伸烷氧基之碳數較佳為2~10，更佳為2~5，進而較佳為2~4。作為此種矽烷偶合劑，更佳為巰基烷基三烷氧基矽烷，作為其具體例，例如，可列舉3-巰丙基三甲氧基矽烷、3-巰丙基三乙氧基矽烷、3-巰丙基甲基二甲氧基矽烷、11-巰基十一烷基三甲氧基 矽烷。
上述水與乙醇之混合溶劑較佳為以體積比計將水/乙醇設為1/10~1/1。又，含有功能性分子之二氧化矽奈米粒子之最終濃度較佳為設為0.1~2wt%，所添加之具有硫醇基之矽烷偶合劑之量相對於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子1g，較佳為設為0.2~20mmol。又，氨水之添加較佳為使用例如28%左右之氨水以氨濃度成為0.2~3wt%之方式添加。
上述硫醇基導入方法由於為製備成為核之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子，將其分離清洗之後進行硫醇基導入操作，因此需花費時間與勞力。又，以高再現性導入所欲量之硫醇基亦困難。通常，為了以高再現性導入硫醇基，使具有硫醇基之矽烷化合物充分進行反應。然而，該充分反應會導致導入於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面的硫醇基之量過剩，粒子表面之疏水性提高(即ζ電位之絕對值變低)而易產生粒子彼此之凝集。
因此，較佳為使用更簡便之方法，而且可自由地、且以高再現性控制硫醇基之導入量之方法，製備具有硫醇基之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子。
作為此種製備方法，例如可列舉包含以下步驟之方法(連續法)。
(連續法)
於含有氨水之溶劑中將鍵結有功能性分子之有機烷氧基矽烷與四烷氧基矽烷混合，使該溶劑中形成含有該功能性分子之二氧化矽的核粒子而獲得該核粒子之分散液的步驟，及於上述步驟所得之分散液中添加具有硫醇基之矽烷偶合劑與四烷氧基矽烷，從而於二氧化矽之核粒子形成殼層的步驟。
藉由調節上述具有硫醇基之矽烷偶合劑與上述四烷氧基矽烷之添加比率，可自由地調節所導入之硫醇基的量。作為該四烷氧基矽烷， 較佳為TEOS。
上述連續法中，自含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之製備至硫醇基之導入可連續進行，故作業時間與勞力亦得以大幅改善。
導入有硫醇基之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子的ζ電位之絕對值較佳為20~70mV。ζ電位之絕對值處於上述範圍內之粒子係凝集得以抑制，分散性進一步提高。
ζ電位可使用Zetasizer Nano(商品名，Malvern公司製造)、ELS-Z1(商品名，大塚電子公司製造)、NICOMP 380ZLS(商品名，IBC公司製造)等進行測定。
含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面之硫醇基的量可利用後文敍述之方法以藉由鍵結於SH基上而顯色之試劑進行定量。本發明所使用之具有硫醇基之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子中之硫醇基的量較佳為以二氧化矽奈米粒子之每單位表面積之密度計，設為0.002~0.2個/nm2。若表面之硫醇基之密度小於0.002個/nm2，則經由連接分子而結合之生物分子之量少，存在作為標識試劑而難以充分發揮功能之情形。又，若表面之硫醇基之密度大於0.02個/nm2，則二氧化矽奈米粒子表面之疏水性過度提高，容易產生因疏水性相互作用引起之非特異性吸附之增加、及粒子之分散性之降低。本發明所使用之具有硫醇基之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子中之硫醇基的量更佳為二氧化矽奈米粒子之每單位表面積之密度為0.005~0.1/nm2，進而較佳為0.01~0.05/nm2。
(二氧化矽奈米粒子表面之硫醇基量之定量法)
二氧化矽奈米粒子表面之硫醇基量之定量可使用DNTB(5,5'Dithiobis(2-nitrobenzoic acid))作為試劑而進行。作為使用DNTB之硫醇基之定量法，例如，可利用Archives of Biochemistry and Biophysics,82,70(1959)之方法進行。作為具體方法之一例，可將溶解於磷酸緩衝液(pH7.0) 中而成之10mM之DNTB溶液20μL與製備為200mg/mL之二氧化矽奈米粒子膠體2.5mL混合，1小時後測定412nm之吸光度，根據使用γ-巰丙基三甲氧基矽烷(MPS)作為標準物質而製成之校準曲線對硫醇基量進行定量。
本發明所使用之連接分子只要分子內具有順丁烯二醯亞胺基與胺基，則並無特別限制，較佳為該順丁烯二醯亞胺基與胺基經由2價之脂肪族基或伸芳基或者該等之組合而連結之分子。上述2價之脂肪族基之碳數較佳為1~20之整數，更佳為2~10之整數。又，作為上述伸芳基，較佳為伸苯基。
連接分子較佳為具有順丁烯二醯亞胺基與胺基各1個。
本發明所使用之連接分子之分子量並無特別限制，較佳為150~5000。
作為分子內具有順丁烯二醯亞胺基與胺基之連接分子，例如，可列舉N-(4-胺基苯基)順丁烯二醯亞胺、N-(2-胺基乙基)順丁烯二醯亞胺鹽酸鹽、N-乙醯胺基順丁烯二醯亞胺，但本發明並不限定於該等。
本發明之製造方法中，首先，使「上述連接分子之順丁烯二醯亞胺基」與「導入於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面之硫醇基」之間形成硫醚鍵，從而獲得鍵結有連接分子之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子。
上述順丁烯二醯亞胺基與硫醇基之反應於所使用之連接分子為鹽酸鹽等鹽之情形時，可於水或緩衝液中進行。於所使用之連接分子並非鹽之情形時，於非質子性溶劑中進行。若使用質子性溶劑，則順丁烯二醯亞胺基與溶劑分子反應，其結果存在與硫醇基之反應性降低之情形，故使用非質子性溶劑時順丁烯二醯亞胺之反應性較高。上述非質子性溶劑只要為二氧化矽奈米粒子可分散者，則並無限制，較佳為極性溶劑。作為該極性非質子性溶劑，例如，可列舉二甲亞碸、環丁碸、吡啶、N-甲基吡咯啶酮、N -環己基吡咯啶酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺。其中較佳為N,N-二甲基甲醯胺。
通常，於生物化學領域，順丁烯二醯亞胺基與硫醇基之反應中，為了防止抗體等生物分子之活性降低，不得已而使用水系溶劑進行之情況較多。然而，本發明之製造方法中，只要使順丁烯二醯亞胺基與含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之硫醇基反應即可，無需使其與抗體反應，故可使順丁烯二醯亞胺基與硫醇基之反應於非質子系溶劑中極有效地進行。
上述反應中，具有硫醇基之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子於溶劑中的濃度較佳為設為0.05~2質量%，較佳為相對於具有硫醇基之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子1mg而使0.1~5mg之連接分子反應。反應溫度較佳為0~60℃，更佳為0~40℃。反應時間較佳為5分鐘以上，更佳為5~120分鐘。
藉由使抗體經由該連接基而鍵結於以上述方式製備之鍵結有連接分子的含功能性分子之二氧化矽奈米粒子，可製造鍵結有抗體之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子。具體而言，使上述抗體與後文敍述之碳二亞胺共存於水系溶劑中而使該抗體之羧基活性酯化，使該活性酯與連接分子所具有之胺基之間形成醯胺鍵。該鍵結反應亦可於水系溶劑中進行。由抗體與碳二亞胺之混合而引起之抗體所具有之羧基之活性酯化可於混合抗體與鍵結有連接分子之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子前進行，亦可於該混合後進行，亦可與該混合同時進行。
即，本發明中所謂「使鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子、碳二亞胺及抗體共存於水系溶劑中」，係用於包含下述(a)~(d)中任一形態之含義。
(a)使鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子、碳二亞胺及抗體同時於水系溶劑中混合之形態； (b)預先使抗體與碳二亞胺共存於水系溶劑中後，將其與鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子混合之形態，(c)預先使鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子與抗體共存於水系溶劑中後，將其與碳二亞胺混合之形態；(d)預先使鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子與碳二亞胺共存於水系溶劑中後，將其與抗體混合之形態。
作為上述抗體，包含免疫球蛋白(全抗體)、將其酵素分解而得之F(ab')2或Fab、經由連接基將重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)串聯連結而成之scFv或sc(Fv)2、由2個經由連接基連結VH與VL而成之單元所構成之二聚體、人工化學合成之含有VH及VL之聚胺基酸、使用大腸桿菌或酵母等作為表現體系而製作之含有VH及VL之重組蛋白質或重組聚胺基酸。即，本發明中所謂「抗體」，係指具有VH及VL之分子或單元，只要具有VH及VL，則其形態並無限定。
上述水系溶劑並無特別限制，較佳為緩衝液，可較佳地使用磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、碳酸緩衝液等通常之水系緩衝液。
作為上述碳二亞胺，並無特別限制，可採用通常用於羧基之活性酯化者。例如，可使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺等。又，亦可使N-羥基丁二醯亞胺或磺基-N-羥基丁二醯亞胺等與碳二亞胺同時共存，將由碳二亞胺產生之活性酯基衍生化為更穩定之活性酯基。
於鍵結於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面的連接分子與抗體藉由醯胺鍵而連結時，較佳為相對於鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子1mg而使抗體5~500μg共存並反應。
反應溫度較佳為0~60℃，更佳為10~40℃。又，反應時間較佳為5分鐘以上，更佳為5~600分鐘。
藉由經過上述各步驟，於水系溶劑中可獲得鍵結有抗體之含 功能性分子的二氧化矽奈米粒子、即標識抗體。
為消除上述所得之標識抗體中殘存之活性酯之反應性，亦可進而添加牛血清白蛋白或酪蛋白等並進行混合。
藉由本發明之製造方法所製造之標識抗體中，抗體鍵結於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面的量可利用通常之方法進行測定。例如，可利用UV法、Lowry法、Bradford法進行定量。
藉由本發明之製造方法所製造之標識抗體之平均粒徑較佳為1~1000nm，更佳為20~500nm。
該平均粒徑係利用圖像處理裝置而求出自穿透式電子顯微鏡(TEM)、掃描式電子顯微鏡(SEM)等之圖像隨機選擇之50個粒子之合計投影面積中的粒子之佔有面積，求出相當於該合計佔有面積除以所選擇之粒子個數(50個)而得之值的圓之直徑之平均值(平均圓當量徑)而得之值。
上述平均粒徑不包含一次粒子凝集而成之二次粒子之粒徑。
藉由本發明之製造方法所製造之標識抗體之粒度分佈的變異係數(所謂CV值)並無特別限制，較佳為10%以下，更佳為8%以下。
藉由本發明之製造方法所製造之標識抗體中，抗體於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面之鍵結量與導入於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子中之硫醇基的量呈正相關關係，故藉由控制硫醇基之導入量，可精密地控制抗體之鍵結量。例如，只要為特定之相同條件下製作之具有硫醇基之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子，則粒子表面之硫醇基之量為一定，故可獲得鍵結有始終為一定量之抗體的含功能性分子之二氧化矽奈米粒子。藉此，於將鍵結有抗體之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子用於所需之檢測試驗或分析試驗時，可大幅抑制所得之輸出值(例如螢光強度)之不均，可進行定量性及可靠性優異之試驗。又，藉由預先測定含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面之硫醇基的量，可估計抗體之鍵結量。因此， 只要預先製作多個改變硫醇基之鍵結量的含功能性分子之二氧化矽奈米粒子，即可根據目的而製備鍵結有所欲量之抗體的含功能性分子之二氧化矽奈米粒子。
本發明之製造方法中，抗體係經由自身具有之羧基而鍵結於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面。即，於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面大量存在抗體之胺基酸序列中之羧基末端(C末端)與連接分子之胺基發生醯胺鍵結者。認為藉此抗體之可變區易向與二氧化矽粒子側相反側(二氧化矽粒子之外側)配向等，目標抗原之捕捉能力提高。
目標抗原之捕捉能力之提高於使用更低分子之抗體時變得更顯著。例如，於使用F(ab')2抗體或Fab抗體等片段抗體、scFv或sc(Fv)2等單鏈抗體、含有VH及VL之聚胺基酸作為抗體之情形時更顯著。
本發明之製造方法中係使用表面具有硫醇基之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子，藉由使用該具有硫醇基之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子，方可使抗體與含功能性分子之二氧化矽奈米粒子簡便且均質地鍵結。作為使含功能性分子之二氧化矽奈米粒子與抗體經由連接分子牢固且穩定地鍵結之方法，例如亦可考慮如下方法等：向含功能性分子之二氧化矽奈米粒子的表面導入胺基而非硫醇基，使連接分子所具有之活性酯基與該胺基共價鍵結，進而使連接分子所具有之順丁烯二醯亞胺基與導入抗體之硫醇基共價鍵結。然而，實際上，表面導入有胺基之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子易凝集，實用性較差。可認為其原因在於，與表面具有硫醇基之二氧化矽奈米粒子相比，表面具有胺基之二氧化矽奈米粒子之疏水性更高。
本發明之製造方法中，作為連接分子，可選擇碳鏈之長度不同者或含有芳香環者，藉由適當選擇連接分子之結構，可更有效地發揮鍵結於含功能性分子之二氧化矽奈米粒子表面之抗體的目標抗原捕捉能力。
本發明之標識抗體可藉由上述之本發明之製造方法而獲得之粒子。本發明之標識抗體以含有功能性分子之二氧化矽奈米粒子作為標識粒子，且抗體經由連接基而鍵結於其表面。含有功能性分子之二氧化矽奈米粒子與連接基藉由硫醚鍵而連結，上述抗體與上述連接基之連結結構以*-C(=O)-NH-**(＊表示抗體側，＊＊表示連接基側)表示。
若換另一種表現，本發明之標識抗體具有「含有功能性分子之二氧化矽奈米粒子所具有之硫醇基」與「連接分子所具有之順丁烯二醯亞胺基」藉由硫醚鍵鍵結而成之結構、及「該連接分子所具有之胺基」與「抗體所具有之羧基」藉由醯胺鍵鍵結而成之結構。
具有硫醇基之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子、連接分子、抗體與上述本發明之製造方法中所說明者含義相同。
本發明之標識抗體可用作標識試劑，可使後文敍述之各種分析試劑含有其作為標識試劑。
本發明之標識抗體之目標抗原之捕捉能力優異。除此以外，並非基於抗原抗體反應之結合，即所謂非特異性吸附受到進一步抑制。使用含有本發明之標識抗體之分析試劑所得之分析結果如後文敍述之實施例所示，為高感度，且可靠性優異。
本發明之膠體係使本發明之標識抗體分散於分散介質中而成。
上述分散介質並無特別限制，只要為可使本發明之標識抗體均勻分散者即可，較佳為親水性之溶劑。作為親水性溶劑，例如，可列舉水、甲醇、乙醇、水與甲醇之混合溶劑、水與乙醇之混合溶劑、PBS(磷酸緩衝食鹽水)、Tris緩衝液、HEPES緩衝液等緩衝液。
又，就進一步防止本發明之標識抗體之非特異性吸附的觀點而言，亦可使本發明之膠體含有聚乙二醇(PEG)、血清白蛋白(BSA)等 任意阻斷劑。又，亦可含有疊氮化鈉等防腐劑。
於本發明之膠體中，本發明之標識抗體穩定地存在，可維持抗體之目標抗原捕捉能力並且進行長期保存。
本發明之膠體可用作標識試劑液。又，可用於製備分析試劑所含之標識試劑。
本發明之分析試劑含有本發明之標識抗體。本發明之分析試劑係用作：用以檢測抗體可識別之目標抗原之檢測試劑、用以對該目標抗原進行定量之定量試劑、用以分離該目標抗原之分離試劑、用以將該目標抗原單離而回收之回收試劑、標識該目標抗原之標識試劑等。
上述目標抗原並無特別限制，可列舉通常之分析、檢查、診斷中之檢測對象之分子等。作為其中一例，可列舉病毒抗原、食物過敏原、血液檢查等中之各種標記物、毒素、細胞膜蛋白質、細胞膜糖鏈、免疫球蛋白等。
作為本發明之分析試劑之較佳例，可列舉具有於結合墊(conjugate pad)保持有本發明之標識抗體之試帶的免疫層析裝置等。
[實施例]
[參考例1]具有硫醇基之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之製備-1
(含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之製備)
製備含有作為螢光分子之羧基若丹明(carboxyrhodamine)6G作為功能性分子之二氧化矽奈米粒子。
將31mg之5-(及-6)-羧基若丹明6G-丁二醯亞胺酯(succinimidyl ester)(商品名，emp Biotech GmbH公司製造)溶解於10mL之二甲基甲醯胺(DMF)中。於其中加入12μL之APS(Shin-Etsu Silicones公司製造)，於室溫(23℃)下反應1小時，而獲得5-(及-6)-羧基若丹明6G-APS複合體(5mM)。
將獲得之5-(及-6)-羧基若丹明6G-APS複合體之溶液600μL與乙醇140mL、TEOS(Shin-Etsu Silicones公司製造)6.5mL、蒸餾水20mL及28質量%氨水15mL混合，於室溫下反應24小時。
將反應液於18000×g之重力加速度下離心分離30分鐘，除去上清液。於沈澱出之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子中加入4mL蒸餾水，使該粒子分散，再次於18000×g之重力加速度下離心分離30分鐘。進而將本清洗操作重複2次，除去含螢光分子之二氧化矽奈米粒子之分散液中所含之未反應之TEOS或氨等，獲得平均粒徑271nm之含螢光分子之二氧化矽奈米粒子1.65g。產率為約94%。
(硫醇基之導入)
使上文中獲得之粒子1g分散於水/乙醇=1/4之混合液150mL中。於其中加入1.5mL之MPS(和光純藥股份有限公司製造)。繼而加入28%氨水20mL，於室溫下混合4小時。
於18000×g之重力加速度下將反應液離心分離30分鐘，除去上清液。於沈澱出之二氧化矽奈米粒子中加入10mL之蒸餾水，使粒子分散，再次於18000×g之重力加速度下離心分離30分鐘。進而將本清洗操作重複2次，將具有硫醇基之含螢光分子的二氧化矽奈米粒子之分散液中所含之未反應之MPS或氨等除去，獲得導入有硫醇基之含螢光分子之二氧化矽奈米粒子(以下稱作硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A)。
(硫醇基之定量分析)
使用上述硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A 500mg，利用DNTB進行硫醇基之定量分析。其結果，硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A之粒子表面之硫醇基的密度為0.046個/nm2。
[參考例2]具有硫醇基之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子之製備-2
利用乙醇將14質量%之氨水稀釋5倍而製備175mL之含氨水之溶劑。於該含氨水之溶劑中添加TEOS(Shin-Etsu Silicones公司製造)1.5mL(6.75mmol)與參考例1所製備之5-(及-6)-羧基若丹明6G-APS複合體(5mM)1.5mL，於40℃下攪拌30分鐘，藉此獲得形成有含有螢光分子之核粒子的溶液(以下有時稱作含核螢光粒子溶液)。
於上述含核螢光粒子溶液中進一步添加TEOS(Shin-Etsu Silicones公司製造)1.5mL(6.75mmol)、與以成為10mM之濃度之方式溶解於二甲基甲醯胺(DMF，和光純藥公司製造)中之5-(及-6)-羧基若丹明6G-APS 550μL(5.5μmol)，於40℃下攪拌30分鐘，藉此於核螢光粒子形成殼層，獲得含有含螢光分子之二氧化矽奈米粒子(以下有時稱作第1螢光二氧化矽奈米粒子)的溶液。
於上述含第1螢光二氧化矽奈米粒子溶液中進一步添加500μL(2.26mmol)之TEOS與265μL(2.65μmol)之以成為10mM之濃度之方式溶解於DMF中之5-(及-6)-羧基若丹明6G-APS，於40℃下攪拌30分鐘，獲得含有於第1螢光二氧化矽奈米粒子進一步形成有殼層之粒子(以下有時稱作第2螢光二氧化矽奈米粒子)的溶液。
為了向第2螢光二氧化矽奈米粒子之表面導入巰丙基，而於上述含第2二氧化矽奈米粒子溶液中進一步添加1mL之以表1之條件1之混合比所製備之MPS(和光純藥股份有限公司製造)與TEOS之混合液(MPS/TEOS混合液)。於室溫下攪拌30分鐘，藉此獲得含有表層具有羥基與巰丙基之含螢光分子之二氧化矽奈米粒子(以下稱作硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子B)的溶液。同樣地，亦製備含有添加以表1之條件2及3之混合比所製備之MPS/TEQS混合液所製備之含螢光分子之二氧化矽奈米粒子(以下分別稱為硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子C、硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子D)的溶液。
MPS/TEOS混合液係於即將進一步添加之前進行製備。
(硫醇基之定量分析)
分別使用500mg之以條件1~3所得之硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子B~D，利用DNTB進行硫醇基之定量分析。其結果，粒子表面之硫醇基之密度如下：硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子B為0.012個/nm2，硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子C為0.056個/nm2，硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子D為0.072個/nm2。
[比較例1]標識抗體之製造(經由抗體之胺基之鍵結-1)
於參考例1中所製作之硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A(平均粒徑260nm)之分散液(濃度25mg/ml，分散介質：蒸餾水)40μL中加入460μL之DMF，以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘。除去上清液，加入500μL之DMF並離心分離，除去上清液。再次加入500μL之DMF，使硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A分散。於其中加入1mg之作為連接分子之3-順丁烯二醯亞胺苯甲酸，混合30分鐘，藉此使上述連接分子之順丁烯二醯亞胺基與硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A之硫醇基之間形成硫醚鍵。
以15000×g之重力加速度將該反應液離心分離10分鐘，除去上清液後，加入90.6μL之蒸餾水，使粒子分散。繼而，加入0.5M之MES(2-啉 乙磺酸)(pH6.0)100μL、50mg/mL之NHS(N-羥基丁二醯亞胺)230.4μL、19.2mg/mL之EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺)75μL並混合。於其中加入4.0μL之抗A型流感核蛋白質抗體(6.2mg/ml，取自小鼠，HyTest公司製造)，混合10分鐘。
以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散。繼而以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。再次加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散而獲得膠體。
以該膠體為樣品，進行蛋白質定量。蛋白質定量係使用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific公司製造)。其結果，抗體之鍵結量為每1g鍵結有抗體之含螢光分子的二氧化矽奈米粒子(標識抗體)為8.5mg。
繼而於上述膠體中加入10μL之10%BSA並混合10分鐘。以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。加入500μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。再次加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，從而獲得分散有鍵結有抗A型流感核蛋白質抗體之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子的膠體(以下稱作比較例之膠體A)。
[比較例2]標識抗體之製造(經由抗體之胺基之鍵結-2)
使用參考例2中所製備之硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子B~D，以與比較例1相同之方式進行抗體之鍵結處理，獲得分散有粒子之各膠體。蛋白質定量之結果，每1g鍵結有抗體之含螢光分子之二氧化矽奈米粒子(標識抗體)的抗體鍵結量如下：於使用硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子B之情形時為3.7mg，於使用硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子C之情形時為9.2mg，於使用硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子D之情形時為12.8mg。
繼而，於上述各膠體中加入10μL之10%BSA並混合10分鐘。以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。加入500μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。再次加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，獲得分散有鍵結有抗A型流感核蛋白質抗體之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子的膠體(與上述硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子B~D相對應，以下稱作比較例之膠體B~D)。
[實施例1]標識抗體之製造(經由抗體之羧基之鍵結-1)
使用參考例1中所製作之硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A，利用以下方法使抗體鍵結。
於硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A之分散液(濃度25mg/ml，分散介質：蒸餾水)40μL中加入460μL之DMF，以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘。除去上清液，加入500μL之DMF並進行離心分離，除去上清液。再次加入500μL之DMF，使硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A分散。於其中加入1mg之作為連接分子之N-(4-胺基苯基)順丁烯二醯亞胺，混合30分鐘，藉此使上述連接分子之順丁烯二醯亞胺基與硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子之硫醇基之間形成硫醚鍵。
以15000×g之重力加速度將該反應液離心分離10分鐘，除去上清液後，加入90.6μL之蒸餾水，使粒子分散。繼而，加入100μL之0.5M之MES(2-啉乙磺酸)(pH6.0)、230.4μL之50mg/mL之NHS(N-羥基丁二醯亞胺)、75μL之19.2mg/mL之EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺)並混合。於其中加入4.0μL之抗A型流感核蛋白質抗體(6.2mg/ml，取自小鼠，HyTest公司製造)，混合10分鐘。
以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散。繼而以15000×g之重力加速度 離心分離10分鐘，除去上清液。再次加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散而獲得膠體。
以該膠體為樣品進行蛋白質定量。蛋白質定量係使用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific公司製造)。其結果，每1g含螢光分子之二氧化矽奈米粒子之抗體鍵結量為7.9mg。
繼而，於上述膠體中加入10μL之10% BSA並混合10分鐘。以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。加入500μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。再次加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，從而獲得分散有鍵結有抗A型流感核蛋白質抗體之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子A的膠體(以下稱作本發明之膠體A)。
[實施例2]標識抗體之製造(經由抗體之羧基之鍵結-2)
使用參考例2中所製備之硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子B~D，以與實施例1相同之方式進行抗體之鍵結處理，獲得分散有粒子之各膠體。蛋白質定量之結果，每1g鍵結有抗體之含螢光分子之二氧化矽奈米粒子的抗體鍵結量如下：於使用硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子B之情形時為4.2mg，於使用硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子C之情形時為8.8mg，於使用硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子D之情形時為11.3mg。
繼而，於上述各膠體中加入10μL之10% BSA並混合10分鐘。以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。加入500μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。再次加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，獲得分散有鍵結有抗A型流感核蛋白質抗體之含功能性分子之二氧化矽奈米粒子的膠體(與上述硫醇基導入二氧化矽奈米粒子B~D相對應，以下稱作本發明之膠體B~D)。
[式驗例1]免疫層析法試驗
(免疫層析法用試帶之製作)
藉由以下方法製作抗體固定化膜片。
於距膜片(長25mm，商品名：Hi-Flow Plus 120膜片，MILLIPORE公司製造)一端約6mm之位置，以0.75μL/cm之塗佈量塗佈以1mg/mL含有源自兔子之抗A型流感核蛋白質抗體(多株抗體，本公司製造)之溶液((50mM之KH2PO4，pH7.0)+5%蔗糖)，作為寬度約1mm之A型流感用測試線。
繼而，作為寬度約1mm之控制線，以0.75μL/cm之塗佈量塗佈以1mg/mL含有源自山羊之抗小鼠IgG抗體(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody，BioLegend公司製造)之溶液((50mM之KH2PO4，pH7.0)無糖)，於50℃下乾燥30分鐘。再者，測試線與控制線之間隔為3mm。
於背襯片(商品名AR9020，Adhesives Research公司製造)上組裝上述抗體固定化膜片、樣品墊(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)，MILLIPORE公司製造)、及吸收墊(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)，MILLIPORE公司製造)。再者，膜片係以成為A型流感用測試線為樣品墊側、控制線為吸收墊側之朝向構成。
(檢測裝置)
製作檢測裝置，該檢測裝置具備如下機構：具有由光源、濾光片及光電倍增管(PMT)構成之檢測單元，該檢測單元藉由馬達而以一定速度進行直線移動的機構；及每隔50微秒記錄一次PMT之受光強度之記錄機構。再者，檢測單元具有如下機構：光源為532nm之雷射二極體，使雷射二極體照射樣品，使反射光透過僅透過550nm以上波長之光的濾光片後以光電倍增管(PMT)接收光。
(流感核蛋白質之迅速判定)
製備如表2所示之濃度之A型流感核蛋白質之溶液(50mM KH2PO4，pH7.0)。繼而將100μL之該溶液與2μL之比較例之膠體A(2.5mg/mL)之混合液滴加於試帶之樣品墊部分。亦以同樣之方式對比較例之膠體B~D、本發明之膠體A~D實施試驗。15分鐘後，藉由上述檢測器進行測定，將線之發光強度數值化。將結果示於表2。
如表2所示，可知，若將使用相同之硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子之膠體進行比較，則不含A型流感核蛋白質之樣品(0ng/mL)中，與比較例之膠體相比，本發明之膠體之測試線強度受到抑制，非特異性吸附更少。另一方面，含有A型流感核蛋白質之樣品(20ng/mL及50ng/mL)中，與比較例之膠體相比，本發明之膠體之測試線強度得以大幅提高。
[比較例3]標識抗體之製造(經由抗體之胺基之鍵結-3)
使用參考例1中所製作之硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A作為含功能性分子之二氧化矽粒子，使用經Fab化之抗A型流感核蛋白質抗體作為抗體，以與比較例1相同之方式使二氧化矽粒子與抗體鍵結。以所得之膠體為樣品進行蛋白質定量，結果，抗體之鍵結量為每1g鍵結有抗體之含螢光分子之二氧化矽奈米粒子為7.1mg。
繼而，於上述膠體中加入10μL之10% BSA，混合10分鐘。以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。加入500μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。再次加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，獲得分散有鍵結有經Fab化之抗A型流感核蛋白質抗體的含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之膠體(以下稱作比較例之膠體A')。
[實施例3]標識抗體之製造(經由抗體之羧基之鍵結-3)
使用參考例1中所製作之硫醇基導入螢光二氧化矽奈米粒子A作為含功能性分子之二氧化矽粒子，使用與比較例3所使用者相同之經Fab化之抗A型流感核蛋白質抗體作為抗體，以與實施例1相同之方式使二氧化矽粒子與抗體鍵結。以所得之膠體為樣品進行蛋白質定量，結果，抗體之鍵結量為每1g鍵結有抗體之含螢光分子之二氧化矽奈米粒子為8.5mg。
繼而，於上述膠體中加入10μL之10% BSA，混合10分鐘。 以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。加入500μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，以15000×g之重力加速度離心分離10分鐘，除去上清液。再次加入400μL之10mM之KH2PO4(pH7.5)，使粒子分散，獲得分散有鍵結有經Fab化之抗A型流感核蛋白質抗體的含功能性分子之二氧化矽奈米粒子之膠體(以下稱作本發明之膠體A')。
[試驗例2]免疫層析法試驗
以與試驗例1相同之方式實施免疫層析試驗。將結果示於表3。
如表3所示，不含A型流感核蛋白質之樣品(0ng/mL)中，與比較例3之膠體相比，實施例3之膠體之測試線強度受到顯著抑制。並且，含有A型流感核蛋白質之樣品(20ng/mL及50ng/mL)中，與比較例3之膠體相比，實施例3之膠體之測試線強度得以大幅提高。若比較表2之結果與表3之結果，則可知，與鍵結通常之抗體(全(whole)抗體)之情形相比(表2)，於使用片段抗體之情形(表3)時，經由抗體之胺基而與二氧化矽粒子鍵結者與經由抗體之羧基而與二氧化矽粒子鍵結者之間，後者(表3)之測試線強度之差增大。一般而言，已知於以血液樣品等生物檢體為樣品之情形時，與全抗體相比片段抗體之非特異性吸附較少，檢測感度良好。因此，於使用片段抗體之情形時，更具優勢之本發明之標識抗體於實際檢查之現場可成為更有用之檢查工具。
雖說明本發明與其實施態樣，但只要本發明沒有特別指定， 則即使在說明本發明之任一細部中，皆非用以限定本發明，且只要在不違反本案申請專利範圍所示之發明精神與範圍下，應作最大範圍的解釋。
本案主張基於2013年2月4日於日本提出專利申請之特願2013-19972之優先權，本發明係參照此申請案並將其內容加入作為本說明書記載之一部份。

Claims (17)

  1. 一種標識抗體之製造方法，其包含下述步驟：a)使含有功能性分子且表面具有硫醇基之二氧化矽奈米粒子與具有順丁烯二醯亞胺基及胺基之連接分子共存於溶劑中，藉此在該硫醇基與該順丁烯二醯亞胺基之間形成硫醚鍵，獲得鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子，及b)使該鍵結有連接分子之含功能性分子的二氧化矽奈米粒子、碳二亞胺及抗體共存於水系溶劑中，在該連接分子所具有之胺基與該抗體所具有之羧基之間形成醯胺鍵；且連接分子之結構係順丁烯二醯亞胺基與胺基經由2價之脂肪族基或伸芳基(arylene)或者該等之組合連結而成的結構。
  2. 如申請專利範圍第1項之標識抗體之製造方法，其中，該抗體係選自片段抗體、單鏈抗體、及二聚體者。
  3. 如申請專利範圍第2項之標識抗體之製造方法，其中，該片段抗體係F(ab')2抗體或Fab，該單鏈抗體係scFv、sc(Fv)2、或含有重鏈可變區及輕鏈可變區之聚胺基酸。
  4. 如申請專利範圍第2或3項之標識抗體之製造方法，其中，該抗體係片段抗體。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之標識抗體之製造方法，其中，步驟a)中之溶劑為非質子性溶劑。
  6. 如申請專利範圍第5項之製造方法，其中，非質子性溶劑係選自二甲亞碸、環丁碸、吡啶、N-甲基吡咯啶酮、N-環己基吡咯啶酮、N,N-二甲基甲醯胺、及N,N-二甲基乙醯胺。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之製造方法，其中，標識抗體之平均粒徑為20~500nm。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之製造方法，其中，功能性分子係選自由螢光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及pH敏感性分子組成之群。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之製造方法，其中，於含有功能性分子且表面具有硫醇基之二氧化矽奈米粒子中，存在於表面之硫醇基的密度為0.002~0.2個/nm2，抗體之鍵結量受該硫醇基之量控制。
  10. 一種標識抗體，其係以含有功能性分子之二氧化矽奈米粒子作為標識粒子且抗體經由連接基而鍵結於其表面而成者，該含有功能性分子之二氧化矽奈米粒子與該連接基藉由硫醚鍵連結，該抗體與該連接基之連結結構為＊-C(=O)-NH-(＊表示抗體側)，且連接基具有2價之脂肪族基或伸芳基或者該等之組合。
  11. 如申請專利範圍第10項之標識抗體，其中，該抗體係選自片段抗體、單鏈抗體、及二聚體者。
  12. 如申請專利範圍第11項之標識抗體，其中，該片段抗體係F(ab')2抗體或Fab，該單鏈抗體係scFv、sc(Fv)2、或含有重鏈可變區及輕鏈可變區之聚胺基酸。
  13. 如申請專利範圍第11或12項之標識抗體，其中，該抗體係片段抗體。
  14. 如申請專利範圍第10至12項中任一項之標識抗體，其中，平均粒徑為20~500nm。
  15. 一種膠體，其係申請專利範圍第10至14項中任一項之標識抗體於分散介質中分散而成。
  16. 如申請專利範圍第15項之膠體，其中，分散介質為緩衝液。
  17. 一種分析試劑，其含有申請專利範圍第10至14項中任一項之標識抗體。
TW103103705A 2013-02-04 2014-01-29 Identification of antibody manufacturing methods and labeling antibodies TWI595009B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013019972A JP6026305B2 (ja) 2013-02-04 2013-02-04 標識抗体の製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201443082A TW201443082A (zh) 2014-11-16
TWI595009B true TWI595009B (zh) 2017-08-11

Family

ID=51262336

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW103103705A TWI595009B (zh) 2013-02-04 2014-01-29 Identification of antibody manufacturing methods and labeling antibodies

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10466234B2 (zh)
EP (1) EP2952895B1 (zh)
JP (1) JP6026305B2 (zh)
CN (1) CN104981693B (zh)
TW (1) TWI595009B (zh)
WO (1) WO2014119624A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015022914A1 (ja) * 2013-08-12 2015-02-19 古河電気工業株式会社 表面に反応性官能基を有するシリカ粒子及びその製造方法
KR20180057634A (ko) 2015-09-03 2018-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 라벨링된 생체분자를 제공하기 위한 방법 및 시스템
CN105445465A (zh) * 2015-11-16 2016-03-30 珠海国际旅行卫生保健中心 一种快速检测副溶血性弧菌的荧光纳米免疫层析试剂盒及制备方法
JP7171702B2 (ja) * 2018-03-23 2022-11-15 大塚製薬株式会社 標識化抗体分散液、ｓｐｆｓ用キット
JP7091129B2 (ja) * 2018-04-27 2022-06-27 キヤノン株式会社 粒子、及びその製造方法
WO2020148985A1 (ja) * 2019-01-18 2020-07-23 コニカミノルタ株式会社 標的物質検出用蛍光体集積ナノ粒子

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
WO2006070582A1 (ja) * 2004-12-09 2006-07-06 Techno Network Shikoku. Co., Ltd. 標識分子含有シリカ球の調製方法
WO2012147774A1 (ja) * 2011-04-26 2012-11-01 古河電気工業株式会社 生体分子を結合させた機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991007087A1 (en) * 1989-11-13 1991-05-30 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
ES2258527T3 (es) 2000-05-05 2006-09-01 Bayer Technology Services Gmbh Nanoparticulas impurificadas como biomarcadores.
US8185209B2 (en) * 2003-01-03 2012-05-22 Board Of Trustees Operating Michigan State University Methods to extend vision to infrared wavelengths
EP1949108B1 (en) * 2005-11-18 2013-09-25 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Modified cardiolipin and uses therefor
JP5400297B2 (ja) 2005-12-27 2014-01-29 古河電気工業株式会社 蛍光ナノシリカ粒子、ナノ蛍光材料、それを用いたバイオチップ及びそのアッセイ法
JP4360652B2 (ja) * 2007-06-08 2009-11-11 古河電気工業株式会社 イムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子、イムノクロマト法試薬、それを用いたイムノクロマト法用テストストリップ、及びイムノクロマト法用蛍光検出システム
EP2201374B1 (en) 2007-08-30 2015-10-07 Trustees Of Tufts College Methods for determining the concentration of an analyte in solution.
US9265729B2 (en) * 2007-12-06 2016-02-23 The University Of Tokushima Nanofunctional silica particles and manufacturing method thereof
WO2009143720A1 (en) 2008-05-27 2009-12-03 The Chinese University Of Hong Kong Nanoparticles, methods of making same and cell labelling using same
JP5203132B2 (ja) * 2008-10-21 2013-06-05 古河電気工業株式会社 架橋性官能基を粒子表面に有するシリカ粒子の製造方法、架橋性官能基を粒子表面に有するシリカ粒子、前記シリカ粒子のコロイド、前記シリカ粒子を用いた複合粒子、及び前記複合粒子の製造方法
JP5686096B2 (ja) * 2009-05-08 2015-03-18 コニカミノルタ株式会社 量子ドット内包シリカナノ粒子、その製造方法、およびそれを用いた生体物質標識剤
ES2702926T3 (es) * 2010-12-09 2019-03-06 Immunogen Inc Métodos para la preparación de agentes de reticulación cargados
JP2012198062A (ja) * 2011-03-18 2012-10-18 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 基板表面に核酸を固定する方法及び核酸が固定された基板
JP2012233878A (ja) * 2011-04-22 2012-11-29 Sysmex Corp 被検物質の電気化学的検出方法
CN103534272B (zh) * 2011-05-09 2016-05-11 株式会社英仙蛋白质科学 能够特异性识别转铁蛋白受体的抗体
WO2015022914A1 (ja) * 2013-08-12 2015-02-19 古河電気工業株式会社 表面に反応性官能基を有するシリカ粒子及びその製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
WO2006070582A1 (ja) * 2004-12-09 2006-07-06 Techno Network Shikoku. Co., Ltd. 標識分子含有シリカ球の調製方法
WO2012147774A1 (ja) * 2011-04-26 2012-11-01 古河電気工業株式会社 生体分子を結合させた機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2952895A1 (en) 2015-12-09
JP2014153057A (ja) 2014-08-25
US10466234B2 (en) 2019-11-05
EP2952895B1 (en) 2018-01-10
CN104981693A (zh) 2015-10-14
CN104981693B (zh) 2017-05-31
US20150338395A1 (en) 2015-11-26
JP6026305B2 (ja) 2016-11-16
EP2952895A4 (en) 2016-10-12
WO2014119624A1 (ja) 2014-08-07
TW201443082A (zh) 2014-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI595009B (zh) Identification of antibody manufacturing methods and labeling antibodies
JP5579343B1 (ja) イムノクロマトグラフィー、これに用いられる検出装置および試薬
JP4514824B2 (ja) イムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子の製造方法、イムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造方法、及びそれを用いたイムノクロマト法用テストストリップの使用方法
US8993345B2 (en) Method of producing functional molecule-containing silica nanoparticles on which biomolecules are bonded
US10545143B2 (en) Silica particles having reactive functional group on surface, and method of producing the same
JP5367490B2 (ja) イムノクロマト法用テストストリップ
JP2008304401A (ja) イムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子、イムノクロマト法試薬、それを用いたイムノクロマト法用テストストリップ、及びイムノクロマト法用蛍光検出システム
JP5503382B2 (ja) イムノクロマトグラフィー用複合粒子
JP5416039B2 (ja) 標識試薬シリカナノ粒子
JP5089511B2 (ja) 吸光物質含有コロイドシリカ粒子を用いた生体分子の検出ないしは定量方法
JP5810195B1 (ja) 紫外励起蛍光粒子、これを用いた検出方法、画像表示方法、画像表示スクリーンおよび画像表示装置
JP5006459B1 (ja) 標識用複合粒子
JP6605792B2 (ja) 複合標識粒子、これを用いた標的物質の検出方法、コロイド液および標識試薬、ならびに複合標識粒子の製造方法
US20220276232A1 (en) Latex agglutination reaction sensitizer, latex agglutination reagent, and method for measuring target substance in specimen by latex agglutination method using the same
JP2023085244A (ja) 生体物質標的材料として用いるシリカ被覆金属粒子

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees